專利名稱：與白蛋白樣物質(zhì)相連的新glp－1類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新穎的GLP-1化合物、包含這些化合物的藥物組合物以及所述化合物用于治療與糖尿病相關(guān)的疾病的用途。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種利用葡萄糖的能力部分或完全喪失的代謝障礙。所有人中約5％患有糖尿病并且該障礙接近流行性比例。自從20世紀(jì)20年代引進(jìn)胰島素以來，人們持續(xù)努力以改善對糖尿病的治療。
一種預(yù)期在糖尿病治療中將變得十分重要的肽是胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)。人GLP-1是源于尤其在遠(yuǎn)端回腸、胰腺和腦中的L-細(xì)胞中合成的前胰高血糖素原的37個氨基酸殘基肽。GLP-1是一種在葡萄糖代謝和胃腸分泌以及新陳代謝中具有調(diào)節(jié)功能的重要的胃腸激素。GLP-1以葡萄糖依賴方式刺激胰島素分泌、刺激胰島素生物合成、促進(jìn)β-細(xì)胞救援(cell rescue)、減少胰高血糖素分泌、胃排空和食物攝取。人GLP-1水解為GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)-酰胺，兩者都是促胰島素肽。可用一個簡單的體系來描述該肽的片段和類似物。因此，例如，[Gly8]GLP-1(7-37)指通過用甘氨酸取代位置8中天然出現(xiàn)的氨基酸殘基(丙氨酸)在形式上源于GLP-1(7-37)的GLP-1(7-37)類似物。類似地，(Nε34-十四烷酰)[Lys34]GLP-1(7-37)指其中在位置34的Lys殘基的ε-氨基已經(jīng)十四烷酰化的GLP-1(7-37)。PCT公開WO 98/08871和WO 99/43706公開了GLP-1類似物的具有親脂性取代基的穩(wěn)定衍生物。這些GLP-1類似物的穩(wěn)定衍生物與相應(yīng)的GLP-1類似物相比具有延長的作用曲線(profile)。
在最近十年里已從毒蜥蜴(鈍尾毒蜥(Heloderma suspectum)和珠毒蜥(Heloderma horridum))的毒液中分離出許多肽。Exendin-4是一種從鈍尾毒蜥毒液中分離的39個氨基酸殘基肽，并且該肽與GLP-1(7-37)在重疊區(qū)具有52％的同源性。Exendin-4是一種有效的GLP-1受體激動劑，已經(jīng)顯示當(dāng)將其注射入狗時該受體激動劑能刺激胰島素釋放并隨之降低血糖水平。exendin-4(1-39)、其某些片段、其類似物及其衍生物是有效的促胰島素試劑。最重要的是exendin-4(1-39)、其促胰島素片段、其促胰島素類似物及其促胰島素衍生物。
包括exendin化合物的一系列GLP-1化合物已經(jīng)得以合成和研究，特別是研究了其血漿半衰期。低血漿半衰期可能是由于對肽酶(主要是二肽基氨肽酶IV)的化學(xué)穩(wěn)定性及腎清除率引起的。然而，促胰島素肽的這些變體迄今還未顯示出超過對每日一次施用給患者的產(chǎn)物足夠的延長效果。需要第二代GLP-1化合物，所述的這種化合物可以每周只施用于患者一次或以更少的頻率施用。
US 6,329,336公開了將高活性的GLP-1肽注射入血漿中，在血漿中該肽將與血液組分如血清白蛋白發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。
WO 02/46227公開了GLP-1化合物和人血清白蛋白的融合蛋白。
WO 2003/103572公開了GLP-1類似物和血液組分的綴合物。
本發(fā)明的一個目的是提供包括連接至在人血漿中具有長半衰期的蛋白的exendin肽的GLP-1類似物，從而便于對患者進(jìn)行每周一次的治療。提供較小傾向聚集的GLP-1肽也是本發(fā)明的目的，聚集是與胰高血糖素樣肽相關(guān)的熟知問題。較小傾向聚集有利于經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)過程以及能使得該化合物能通過醫(yī)療輸注泵施用。
定義在本說明書中，下面術(shù)語具有表明的意義如在此使用的術(shù)語“多肽”和“肽”指由至少五個經(jīng)肽鍵連接的組成氨基酸組成的化合物。組成氨基酸可來自由遺傳密碼編碼的氨基酸并且它們可以是不是由遺傳密碼編碼的天然氨基酸以及合成氨基酸。不由遺傳密碼編碼的天然氨基酸是如羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、鳥氨酸、磷酸絲氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成氨基酸包括通過化學(xué)合成制造的氨基酸，即由遺傳密碼編碼的氨基酸的D-異構(gòu)體例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(α-氨基異丁酸)、Abu(α-氨基丁酸)、Tle(叔丁基甘氨酸)、β-丙氨酸、3-氨甲基苯甲酸、鄰氨基苯甲酸。
如此處使用的涉及多肽的術(shù)語“類似物”指經(jīng)修飾的肽，其中所述的肽的一個或多個氨基酸殘基已經(jīng)由其它氨基酸殘基置換和/或其中一個或多個氨基酸殘基已經(jīng)從該肽中刪除和/或其中一個或多個氨基酸殘基已經(jīng)從肽中刪除和或其中一個或多個氨基酸殘基已經(jīng)加入至該肽。這種氨基酸殘基的添加或缺失可在肽的N-末端和/或在肽的C-末端發(fā)生。常用一種簡單的體系描述類似物例如[Arg34]GLP-1(7-37)Lys指GLP-1(7-37)類似物，其中在位置34的天然出現(xiàn)的賴氨酸已經(jīng)用精氨酸取代并且其中一個賴氨酸已經(jīng)添加至末端氨基酸殘基，即添加至Gly37。其旋光異構(gòu)體未經(jīng)說明的所有氨基酸可理解為指L-異構(gòu)體。
如此處使用的有關(guān)肽的術(shù)語“衍生物”指經(jīng)化學(xué)修飾的肽或其類似物，其中至少一個取代基不存在于未經(jīng)修飾的肽或其類似物中，即已經(jīng)經(jīng)共價修飾的肽。通常的修飾是酰胺、碳水化合物、烷基、?；Ⅴヮ惖?。GLP-1(7-37)衍生物的實(shí)例是Nε26-((4S)-4-(十六酰氨基)-丁酰基)[Arg34，Lys26]GLP-1-(7-37)。
如此處使用的術(shù)語“GLP-1激動劑”指在包含人GLP-1受體的合適培養(yǎng)基中刺激cAMP的形成的化合物。GLP-1激動劑的效力按下面描述的通過從劑量-反應(yīng)曲線計(jì)算EC50值來測定。
將表達(dá)克隆的人GLP-1受體的幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞(BHK-467-12A)在加入了100IU/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、5％胎牛血清和0.5mg/mL遺傳霉素G-418(Life Technologies)的DMEM培養(yǎng)基中生長。在磷酸鹽緩沖鹽水中洗滌該細(xì)胞兩次并用依地酸收集。在緩沖液1(20mM HEPES-Na，10mM EDTA，pH 7.4)中用Ultraturrax勻漿而從該細(xì)胞制備質(zhì)膜。于4℃將勻漿以48,000xg離心15分鐘。通過勻化使沉淀懸浮于緩沖液2(20mM HEPES-Na，0.1mM EDTA，pH 7.4)中，隨后將其于4℃以48,000xg離心15分鐘。將洗滌步驟再次重復(fù)一次。最終的沉淀懸浮于緩沖液2中并立即將其用于測試或于-80℃存儲。
通過測量作為對促胰島素試劑刺激的反應(yīng)的環(huán)腺苷酸(cAMP)進(jìn)行功能受體檢測法。通過AlphaScreenTMcAMP試劑盒(Perkin ElmerLife Sciences)定量形成的cAMP。在總體積為50μL的緩沖液3(50mM Tris-HCl，5mM HEPES，10mM MgCl2，pH7.4)中在half-area 96孔微量滴定板中進(jìn)行溫育，所述緩沖液3中添加以下物質(zhì)1mM ATP、1μM GTP、0.5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、0.01％Tween-20、0.1％BSA、6μg膜制劑、15μg/mL受體微珠、用6nM生物素基-cAMP預(yù)溫育的20μg/mL供體微珠。在緩沖液3中溶解和稀釋將要進(jìn)行激動劑活性檢測的化合物。為每個試驗(yàn)新鮮制備GTP。于室溫在黑暗中緩慢振蕩地溫育板3小時，隨后將其在FusionTM儀器(Perkin ElmerLife Sciences)中計(jì)數(shù)。繪制各個化合物的濃度-反應(yīng)曲線并用Prismv.4.0(GraphPad，Carlsbad，CA)用4-參數(shù)對數(shù)模型估計(jì)EC50值。
如此處使用的術(shù)語“GLP-1肽”指GLP-1(7-37)(SEQ ID No2)、GLP-1(7-37)類似物、GLP-1(7-37)衍生物或GLP-1(7-37)類似物的衍生物。在一個實(shí)施方案中GLP-1肽是一種促胰島素試劑。
如此處使用的術(shù)語“exendin-4肽”指exendin-4(1-39)(SEQ IDNo3)、exendin-4(1-39)類似物、exendin-4(1-39)衍生物或exendin-4(1-39)類似物的衍生物。在一個實(shí)施方案中exendin-4肽是一種促胰島素試劑。
如此處使用的涉及多肽的術(shù)語“DPP-IV保護(hù)的”指一種多肽，該多肽已經(jīng)經(jīng)化學(xué)修飾以便使所述化合物能抵抗血漿肽酶二肽基氨肽酶-4(DPP-IV)。已知血漿中的DPP-IV酶涉及多種肽激素如GLP-1、GLP-2、Exendin-4等的降解。因此，正做出相當(dāng)?shù)呐θラ_發(fā)易受DPP-IV介導(dǎo)的水解作用影響的多肽的類似物和衍生物以便減小DPP-IV降解率。在一個實(shí)施方案中，DPP-IV保護(hù)的肽比GLP-1(7-37)或Exendin-4(1-39)更耐受DPP-IV。
肽對二肽基氨肽酶IV降解的抗性可通過下面的降解檢測法測定在100μL的0.1M pH 7.4的三乙胺-HCl緩沖液中于37℃將肽的等分樣品(5nmol)與相當(dāng)于5mU酶活性的1μL純化二肽基氨肽酶IV溫育10-180分鐘。通過加入5μL10％的三氟乙酸終止酶反應(yīng)，并使用HPLC分析法分離和定量肽降解產(chǎn)物。用于實(shí)施該分析的一種方法是根據(jù)Siegel等，Regul.Pept.1999；7993-102和Mentlein等，Eur.J.Biochem.1993；214829-35，將混合物上樣至Vydac C18widepore(30nm小孔，5μm微粒)250×4.6mm柱上并以1ml/分鐘流速用0.1％三氟乙酸中的乙腈的線性階式梯度(0％的乙腈3分鐘，0-24％的乙腈17分鐘，24-48％的乙腈1分鐘)洗脫。肽和其降解產(chǎn)物可通過它們在220nm(肽鍵)或280nm(芳香族氨基酸)的吸光度監(jiān)測，并通過將它們與那些標(biāo)品相關(guān)的峰面積積分而定量。在導(dǎo)致少于10％的肽被水解的溫育時間估計(jì)二肽基氨肽酶IV對肽的水解率。
如此處使用的術(shù)語“C1-6-烷基”指具有1-6個碳原子的飽和的、支鏈、直鏈或環(huán)狀烴基團(tuán)。代表性實(shí)例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、叔戊基、正己基、異己基、環(huán)己烷等。
如此處使用的術(shù)語“可藥用”指適合于正常的藥學(xué)應(yīng)用，即在患者中不產(chǎn)生不良事件等。
如此處使用的術(shù)語“賦形劑”指通常加入至藥物組合物的化學(xué)化合物，例如緩沖劑、張度劑、防腐劑等。
如此處使用的術(shù)語“有效量”指與不治療相比足以有效治療患者的劑量。
如此處使用的術(shù)語“藥物組合物”指包含活性化合物或其鹽與藥物賦形劑如緩沖劑、防腐劑和任選地張度調(diào)節(jié)劑和/或穩(wěn)定劑一起的產(chǎn)品。因而藥物組合物在本領(lǐng)域也稱為藥物制劑。
如此處使用的術(shù)語“疾病的治療”指管理和照顧已經(jīng)發(fā)生疾病、病癥或障礙的患者。治療的目的是對抗疾病、病癥或障礙。治療包括施用活性化合物以消除或控制疾病、病癥或障礙以及減輕與疾病、病癥或障礙相關(guān)的癥狀或并發(fā)癥。
發(fā)明描述在一方面本發(fā)明涉及具有式(I)結(jié)構(gòu)的化合物
GLP-1激動劑-L-RR-延遲蛋白(I)其中GLP-1激動劑是為人GLP-1受體激動劑的多肽，L是連接所述GLP-1激動劑的氨基酸側(cè)鏈或所述GLP-1激動劑的C末端氨基酸殘基與RR的接頭，RR是已經(jīng)與延遲蛋白的氨基酸殘基形成共價鍵的反應(yīng)性殘基的剩余部分，而延遲蛋白(protraction protein)是具有至少5kDa摩爾重量、在人血漿中具有至少24小時血漿半衰期的蛋白，并且所述的延遲蛋白通過非哺乳動物生物體合成或合成性合成。
通過下面圖解闡明包含于式(I)的化合物
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中延遲蛋白是重組人血清白蛋白(SEQID NO1)。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中延遲蛋白是人血清白蛋白變體。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中當(dāng)與人血清白蛋白對銅和鎳的相應(yīng)的結(jié)合親和力相比時所述人血清白蛋白變體對銅和鎳的結(jié)合親和力降低。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中延遲蛋白是人血清白蛋白的N-末端片段或其類似物。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中延遲蛋白是包含Asp-Ala-His-LysN-末端序列的修飾的人血清白蛋白變體。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中延遲蛋白在三個N-末端氨基酸殘基Asp-Ala-His之中包含至少一處缺失。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中延遲蛋白包含N-末端延伸，例如Glu-3，Ala-2Glu-1，Phe0-HSA(1-585)或其N-末端片段。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中人血清白蛋白(HSA)變體選自HSA(2-585)、HSA(3-585)、HSA(4-585)、Asp-Ala-HSA(4-585)、Xaa3-HSA(1-585)及其N-末端片段，其中所述的Xaa3是已取代在天然HSA中占據(jù)位置3的His殘基的氨基酸殘基。
重組人血清白蛋白變體可從New Century Pharma購得，其名為Albagen。Albagen是HSA(2-585)，并且由于單個N-末端缺失引起的改變的金屬結(jié)合特性，Albagen是低變應(yīng)原性的。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述的延遲蛋白包含60-200個氨基酸殘基如100-150個氨基酸殘基的氨基酸序列，并且所述的氨基酸序列與SEQ ID NO1的片段相同或與有一處或兩處氨基酸置換和/或缺失的SEQ ID NO1的片段相同。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，延遲蛋白是免疫球蛋白的Fc部分、其類似物或片段。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，GLP-1激動劑與GLP-1(7-37)(SEQID NO 2)或Exendin-4(1-39)(SEQ ID NO3)有至少50％的氨基酸同源性。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，GLP-1激動劑與GLP-1(7-37)(SEQID NO 2)或Exendin-4(1-39)(SEQ ID NO 3)具有至少80％的氨基酸同源性。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，GLP-1激動劑包含式(II)的氨基酸序列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46式(II)(SEQ ID No4)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、Nα-乙?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；Xaa8是Ala、D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(1-氨基環(huán)戊基)羧酸、(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸；Xaa16是Val或Leu；Xaa18是Ser、Lys或Arg；Xaa19是Tyr或Gln。
Xaa20是Leu或Met；Xaa22是Gly、Glu或Aib；Xaa23是Gln、Glu、Lys或Arg；Xaa25是Ala或Val；Xaa26是Lys、Glu或Arg；Xaa27是Glu或Leu；Xaa30是Ala、Glu或Arg；Xaa33是Val或Lys；Xaa34是Lys、Glu、Asn或Arg；Xaa35是Gly或Aib；Xaa36是Arg、Gly或Lys；Xaa37是Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、酰胺或不存在；Xaa38是Lys、Ser、酰胺或不存在。
Xaa39是Ser、Lys、酰胺或不存在；Xaa40是Gly、酰胺或不存在；
Xaa41是Ala、酰胺或不存在；Xaa42是Pro、酰胺或不存在；Xaa43是Pro、酰胺或不存在；Xaa44是Pro、酰胺或不存在；Xaa45是Ser、酰胺或不存在；Xaa46是酰胺或不存在；條件是如果Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45或Xaa46不存在，則下游每個氨基酸殘基也不存在。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，GLP-1激動劑包含式(III)的氨基酸序列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38式(III)(SEQ ID No5)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、Nα-乙?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；Xaa8是Ala、D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(1-氨基環(huán)戊基)羧酸或(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸；Xaa18是Ser、Lys或Arg；Xaa22是Gly、Glu或Aib；Xaa23是Gln、Glu、Lys或Arg；Xaa26是Lys、Glu或Arg；Xaa30是Ala、Glu或Arg；Xaa34是Lys、Glu或Arg；Xaa35是Gly或Aib；
Xaa36是Arg或Lys；Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys；Xaa38是Lys、酰胺或不存在。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述的GLP-1激動劑是二肽基氨肽酶IV保護(hù)的。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，GLP-1激動劑被DPP-IV的水解率低于采用此處公開的DPP-IV水解檢測法測得的GLP-1(7-37)的水解率。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，GLP-1激動劑是一種位置8類似物，即相對于GLP-1(7-37)序列(SEQ ID No2)的位置8的丙氨酸殘基已經(jīng)由另一個氨基酸殘基取代。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，GLP-1激動劑在相對于GLP-1(7-37)序列(SEQ ID No2)的位置8處包含Aib殘基。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，在GLP-1肽位置7(N-末端)處的氨基酸殘基選自D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、Nα-乙?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，與GLP-1(7-37)(SEQ ID No2)或Exendin-4(1-39)(SEQ ID No3)相比，GLP-1激動劑包含不多于12個經(jīng)交換、添加或缺失的氨基酸殘基。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，與GLP-1(7-37)(SEQ ID No2)或Exendin-4(1-39)(SEQ ID No3)相比，GLP-1激動劑包含不多于6個經(jīng)交換、添加或缺失的氨基酸殘基。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，與GLP-1(7-37)(SEQ ID No2)或Exendin-4(1-39)(SEQ ID No3)相比，GLP-1激動劑包含不多于4個經(jīng)交換、添加或缺失的氨基酸殘基。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，GLP-1激動劑包含不多于4個不是由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，與GLP-1(7-37)(SEQ ID No2)或Exendin-4(1-39)(SEQ ID No3)相比，GLP-1激動劑包含不多于2個經(jīng)交換、添加或缺失的氨基酸殘基。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，GLP-1激動劑選自[Arg34]GLP-1(7-37)、[Arg26、34]GLP-1(7-37)Lys、[Lys36Arg26、34]GLP-1(7-36)、[Aib8、22、35]GLP-1(7-37)、[Aib8，35]GLP-1(7-37)、[Aib8，22]GLP-1(7-37)、[Aib8，22，35Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Ala37]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Ala37]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22Ala37]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Lys37]GLP-1(7-37)、[Aib8，35Lys37]GLP-1(7-37)和[Aib8，22Lys37]GLP-1(7-37)。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，GLP-1激動劑是Exendin-4(1-39)(SEQ ID No.3)。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，GLP-1激動劑是ZP-10，即[Ser38Lys39]Exendin-4(1-39)LysLysLysLysLys-酰胺(SEQ ID No.4)。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，GLP-1激動劑通過在相對于氨基酸序列SEQ ID No2(GLP-1(7-37))的位置23、26、34、36或38(對應(yīng)于相對于氨基酸序列SEQ ID No3(Exendin-4(1-39))的位置17、20、28、30或32)處的氨基酸殘基的側(cè)鏈連接至以下部分-L-RR-延遲蛋白。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，GLP-1激動劑通過C末端氨基酸殘基的側(cè)鏈連接至以下部分-L-RR-延遲蛋白。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，GLP-1激動劑通過選自精氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、組氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的氨基酸殘基的側(cè)鏈連接至以下部分-L-RR-延遲蛋白。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，GLP-1激動劑通過半胱氨酸殘基的側(cè)鏈連接至以下部分-L-RR-延遲蛋白。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，接頭L選自二價連接化學(xué)基團(tuán)酰胺-C(O)-NR-，其中R是氫或C1-6-烷基，胺-NR-，其中R是氫或C1-6-烷基，硫醚-S-、-S-(CH2)2-SO2-或 醚-O-，尿烷-N(R1)-CO-N(R2)-，其中R1和R2獨(dú)立地是氫或C1-6-烷基，氨基甲酸酯-O-CO-N(R)-，其中R是氫或C1-6-烷基，肼 其中R是氫或C1-6-烷基，肟-O-N＝C(-R)-，其中R是氫或C1-6-烷基，唑烷或噻唑烷 R＝H或CH3，X＝S或O和 在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，通式(I)化合物選自GLP-1激動劑-C(＝O)CH2O(CH2)2O(CH2)2-RR-延遲蛋白、GLP-1激動劑-C(＝O)(CH2)n(OCH2CH2)m-RR-延遲蛋白、GLP-1激動劑-S(＝O)2(CH2)n(OCH2CH2)m-RR-延遲蛋白、GLP-1激動劑-CH2(CH2)n(OCH2CH2)m-RR-延遲蛋白、GLP-1激動劑-C(＝O)O(CH2)n(OCH2CH2)m-RR-延遲蛋白，其中n是0-10的整數(shù)，并且m是0-100的整數(shù)。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，通式(I)化合物選自GLP-1激動劑-L-NC(＝O)CH2-延遲蛋白中的半胱氨酸殘基中的硫、GLP-1激動劑-L-S(＝O)2(CH2)2-延遲蛋白中的半胱氨酸殘基中的硫、GLP-1激動劑-L-NC(＝O)CH2-延遲蛋白中的半胱氨酸殘基中的硫，和
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，通式(I)化合物選自S-γ34-(1-{2-[2-(2-([D-Ala8，Lys37]-GLP-1-(7-37)酰胺-Nε37-基)乙酰氧基乙氧基)乙基氨甲酰基]乙基}-2，5-二氧代-吡咯烷-3-基)Albagen S-γ34-(1-{2-[2-(2-([Aib8，22，25，Lys37]-GLP-1-(7-37)酰胺-Nε37-基)乙酰氧基乙氧基)乙基氨甲酰基]乙基}-2，5-二氧代-吡咯烷-3-基)Albagen 和S-γ34-((1-{2-[2-(2-([Aib8，Arg26，34，Glu22，23，30]-GLP-1-(7-37))Lys酰胺-Nε-基)乙酰氧基乙氧基)乙基氨甲?；鵠乙基}-2，5-二氧代-吡咯烷-3-基)Albagen
本發(fā)明化合物可通過經(jīng)典的肽合成如用t-Boc或Fmoc化學(xué)的固相肽合成法或其它經(jīng)很好地確立了的技術(shù)而制備，見例如Green和Wuts，“Protecting Groups in Organic Synthesis”，John Wiley & Sons，1999。當(dāng)促胰島素試劑是包含非天然氨基酸殘基的肽時這些方法是優(yōu)選的。
當(dāng)促胰島素試劑是只包含由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基的多肽時，該多肽也可通過這樣的方法生產(chǎn)包括在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中于允許肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)含有編碼多肽的DNA序列并能表達(dá)多肽的宿主細(xì)胞，之后從培養(yǎng)物中回收產(chǎn)生的肽并然后將其衍生為式(I)化合物。
用于培養(yǎng)該細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何適于培育宿主細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)基，如包含適當(dāng)添加物的基本培養(yǎng)基或復(fù)合培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)廠商獲得或可根據(jù)公開的處方(如在美國模式培養(yǎng)物保藏所的目錄中)制備。細(xì)胞產(chǎn)生的肽然后可通過常規(guī)方法從培養(yǎng)基回收，包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離宿主細(xì)胞。對于胞外產(chǎn)物，取決于考慮的多肽的類型，上清液的蛋白質(zhì)成分可通過過濾、柱層析或沉淀，如微濾、超濾、等電沉淀，用多種色譜方法的純化，如離子交換色譜、疏水作用色譜、凝膠過濾色譜、親和色譜等分離。對于胞內(nèi)或胞質(zhì)產(chǎn)物，將從培養(yǎng)基中分離的細(xì)胞破裂或透化并經(jīng)提取以回收產(chǎn)物多肽或其前體。
編碼治療多肽的DNA序列可適當(dāng)?shù)貫榛蚪M或cDNA起源，可以例如根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(見，例如Sambrook，J，F(xiàn)ritsch，EF和Maniatis，T，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，1989)通過制備基因組或cDNA文庫并用合成寡核苷酸探針通過雜交篩選編碼全長或部分肽的DNA序列而獲得。編碼多肽的DNA序列也可通過建立的標(biāo)準(zhǔn)方法，如由Beaucage和Caruthers描述的phosphoamidite方法(Tetrahedron Letters22(1981)，1859-1869)或由Matthes等描述的方法(EMBO Journal3(1984)，801-805)而合成制備。該DNA序列也可使用特異性引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)制備，例如按在US4,683,202或Saiki等，Science239(1988年)，487-491中描述的。
該DNA序列可插入至任何可方便地接受重組DNA操作的載體中，并且載體的選擇通常會取決于其將被引入的宿主細(xì)胞。因此，該載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外的實(shí)體存在的載體，該載體的復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制，如質(zhì)粒。備選地，該載體可以是一種當(dāng)將其引入宿主細(xì)胞時整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組并與其已經(jīng)整合入的染色體一起復(fù)制的載體。
該載體優(yōu)選地是一種表達(dá)載體，其中編碼多肽的DNA序列可操作地連接至DNA轉(zhuǎn)錄所需的額外片段如啟動子上。啟動子可以是在選擇的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，并可源自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。用于在多種宿主細(xì)胞中指導(dǎo)編碼本發(fā)明肽的DNA的轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實(shí)例在本領(lǐng)域是熟知的，參見例如Sambrook等，如前所述。
如果需要，也可將編碼多肽的DNA序列可操作地連接至合適的終止子、多腺苷酸化信號、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列和翻譯增強(qiáng)子序列。本發(fā)明的重組載體可進(jìn)一步包含使該載體能在考慮的宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。
載體還可包含選擇標(biāo)記，如其產(chǎn)物彌補(bǔ)宿主細(xì)胞中的缺陷的基因或賦予對藥物如氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、新霉素、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性的基因。為了大規(guī)模生產(chǎn)，選擇標(biāo)記優(yōu)選地不是抗生素抗性，例如當(dāng)載體用于大規(guī)模生產(chǎn)時優(yōu)選地切除載體中的抗生素抗性基因。用于從載體中去除抗生素抗性基因的方法為本領(lǐng)域已知，見例如US 6,358,705，將其在這里通過引用作為參考。
為了指導(dǎo)本發(fā)明母體肽進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌路徑，可在重組載體中提供分泌信號序列(也稱為前導(dǎo)序列、前原序列或前序列)。在正確的閱讀框內(nèi)將分泌信號序列連接至編碼肽的DNA序列上。分泌信號序列通常位于編碼肽的DNA序列的5′端。分泌信號序列可以是通常與該肽相關(guān)的分泌信號序列或可以是來自編碼另一種分泌性蛋白質(zhì)的基因。
用于分別連接編碼本發(fā)明肽的DNA序列、啟動子和任選終止子和/或分泌信號序列并將它們插入至含有復(fù)制所需信息的合適載體的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的(參考，例如Sambrook等，如前所述)。
引入DNA序列或重組載體的宿主細(xì)胞可以是能產(chǎn)生本發(fā)明肽的任何細(xì)胞并包括細(xì)菌、酵母、真菌和高等真核細(xì)胞。本領(lǐng)域熟知并使用的合適宿主細(xì)胞的實(shí)例是但不限于大腸桿菌(E.coli)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或哺乳動物BHK或CHO細(xì)胞系。
根據(jù)本發(fā)明，含有化合物的藥物組合物可通過常規(guī)技術(shù)制備，例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences，1985或在RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，19thedition，1995中描述的技術(shù)。
本發(fā)明的一個目的是提供包含以約0.1mg/ml-約25mg/ml濃度存在的根據(jù)本發(fā)明的化合物的藥物制劑，并且其中所述制劑具有2.0-10.0的pH。該制劑可進(jìn)一步包含緩沖系統(tǒng)、防腐劑、等滲劑、螯合劑、穩(wěn)定劑和表面活性劑。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，藥物制劑是含水制劑，即包含水的制劑。這種制劑通常是溶液或混懸液。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，該藥物制劑是含水溶液。將術(shù)語“含水制劑”定義為包含至少50％w/w水的制劑。同樣，將術(shù)語“含水溶液”定義為包含至少50％w/w水的溶液，并且將術(shù)語“含水混懸液”定義為包含至少50％w/w水的混懸液。
在另一個實(shí)施方案中，該藥物制劑是一種凍干的制劑，醫(yī)師或患者在使用前向其中加入溶劑和/或稀釋劑。
在另一個實(shí)施方案中，該藥物制劑是一種現(xiàn)成使用而不需任何預(yù)先溶解的干燥制劑(例如凍干或噴霧干燥)。
在進(jìn)一步方面，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的化合物的含水溶液和緩沖劑的藥物制劑，其中所述化合物以0.1mg/ml或更高的濃度存在，并且其中所述的制劑具有約2.0-約10.0的pH。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，制劑的pH為約7.0-約9.5。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，制劑的pH為約3.0-約7.0。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，制劑的pH為約5.0-約7.5。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，制劑的pH為約7.5-約9.0。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，制劑的pH為約7.5-約8.5。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，制劑的pH為約6.0-約7.5。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，制劑的pH為約6.0-約7.0。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，制劑的pH為約3.0-約9.0，并且所述的pH是距本發(fā)明化合物的等電點(diǎn)pH至少2.0pH單位。
在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，緩沖劑選自醋酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、雙甘氨肽、組氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉和三(羥甲基)-氨基甲烷、N，N-二(羥乙基)甘氨酸、兩性離子緩沖劑(tricine)、蘋果酸、琥珀酸鹽、馬來酸、延胡索酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。這些特定的緩沖劑的每一種構(gòu)成本發(fā)明備選的實(shí)施方案。
在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，制劑進(jìn)一步包含可藥用防腐劑。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，防腐劑選自苯酚、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、對羥基苯甲酸丁酯、2-苯乙醇、苯甲醇、三氯叔丁醇和硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪脲、雙氯苯雙胍己烷、脫氫醋酸鈉、氯甲酚、對羥苯甲酸乙酯、芐索氯銨、chlorphenesine(3-對氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)或其混合物。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，防腐劑以0.1mg/ml-20mg/ml濃度存在。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，防腐劑以0.1mg/ml-5mg/ml濃度存在。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，防腐劑以5mg/ml-10mg/ml濃度存在。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，防腐劑以10mg/ml-20mg/ml濃度存在。這些特定的防腐劑的每一種構(gòu)成本發(fā)明備選實(shí)施方案。在藥物組合物中防腐劑的使用是技術(shù)人員熟知的。為方便起見，將RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，19thedition，1995作為參考。
在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，制劑進(jìn)一步包含等滲劑。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，等滲劑選自鹽(如氯化鈉)、糖或糖醇、氨基酸(如L-甘氨酸、L-組氨酸、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸)、醛糖醇(如丙三醇(甘油)、1，2-丙二醇(1，2-二羥基丙烷)、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇)聚乙二醇(如PEG400)或其混合物?？墒褂萌魏翁侨鐔翁?、二糖或多糖或水溶性葡聚糖類，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、芽霉菌糖、糊精、環(huán)糊精、可溶性淀粉、羥乙基淀粉和羧甲基纖維素-Na。在一個實(shí)施方案中，糖添加劑是蔗糖。糖醇定義為具有至少一個--OH基團(tuán)的C4-C8烴并包括例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇(galacititol)、衛(wèi)矛醇、木糖醇和阿糖醇。在一個實(shí)施方案中，糖醇添加劑是甘露醇。上面提及的糖或糖醇可獨(dú)立地使用或組合使用。對使用的量無固定限制，只要糖或糖醇可溶解于液體制劑并且對使用本發(fā)明方法達(dá)到的穩(wěn)定效應(yīng)無不利影響。在一個實(shí)施方案中，糖或糖醇的濃度在約1mg/ml和約150mg/ml之間。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，等滲劑以1mg/ml-50mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，等滲劑以1mg/ml-7mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，等滲劑以8mg/ml-24mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，等滲劑以25mg/ml-50mg/ml的濃度存在。這些特定的等滲劑的每一種構(gòu)成本發(fā)明的備選實(shí)施方案。在藥物組合物中等滲劑的使用是技術(shù)人員熟知的。為方便起見，將RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，19thedition，1995作為參考。
在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，制劑進(jìn)一步包含螯合劑。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，螯合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸和天冬氨酸的鹽及其混合物。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，螯合劑以0.1mg/ml-5mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，螯合劑以0.1mg/ml-2mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，螯合劑以2mg/ml-5mg/ml的濃度存在。這些特定的螯合劑的每一種構(gòu)成本發(fā)明的備選實(shí)施方案。在藥物組合物中螯合劑的使用是技術(shù)人員熟知的。為方便起見，將RemingtonThe Science andPractice of Pharmacy，19thedition，1995作為參考。
在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，制劑進(jìn)一步包含穩(wěn)定劑。在藥物組合物中穩(wěn)定劑的使用是技術(shù)人員熟知的。為方便起見，將RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，19thedition，1995作為參考。
更特別地，本發(fā)明組合物是經(jīng)穩(wěn)定的液體藥物組合物，其治療活性成分包括在以液體藥物制劑存儲的過程中可能表現(xiàn)聚集體形成的多肽?！熬奂w形成”意指導(dǎo)致寡聚體形成的多肽分子間的物理相互作用，所述的寡聚體可保持為可溶的，或者是從溶液中沉淀的大的可見的聚集物。“存儲過程中”意指液體藥物組合物或制劑一旦制備，其不立即施用給受試者，而是在制備后將其以液體形式、冷凍狀態(tài)或以干燥的形式包裝存儲，以便以后將其重新組成液體形式或適合給受試者施用的其它形式。“干燥的形式”意指將液體藥物組合物或制劑通過冷凍干燥(即，凍干法；見例如Williams和Polli(1984)J.Parenteral Sci.Technol.3848-59)、噴霧干燥(見Masters(1991)于Spray-Drying Handbook(5th ed；Longman Scientific andTechnical，Essez，U.K.)，pp.491-676中；Broadhead等(1992)Drug Devel.Ind.Pharm.181169-1206；和Mumenthaler等(1994)Pharm.Res.1112-20)或風(fēng)干(Carpenter和Crowe(1988)Cryobiology 25459-470；和Roser(1991)Biopharm.447-53)進(jìn)行干燥。在液體藥物組合物的存儲過程中多肽的聚集體形成可不利地影響該多肽的生物學(xué)活性，導(dǎo)致藥物組合物的治療效力的損失。而且，聚集體形成可引起其它問題，例如當(dāng)采用輸注系統(tǒng)施用含有多肽的藥物組合物時引起的管道、膜或泵的阻塞。
本發(fā)明的藥物組合物可進(jìn)一步包含足夠能減少在組合物存儲過程中多肽形成聚集體的量的氨基酸堿?！鞍被釅A”意指一種氨基酸或氨基酸組合，其中任何給定的氨基酸以其游離堿形式或以其鹽的形式存在。當(dāng)使用氨基酸組合時，氨基酸可以全部以它們游離堿的形式存在，可以全部以其鹽形式存在，或者一些可以其游離堿的形式存在而另一些以其鹽的形式存在。在一個實(shí)施方案中，用于制備本發(fā)明組合物的氨基酸是那些具有帶電荷側(cè)鏈的氨基酸，例如精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。特定氨基酸(如甘氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、咪唑、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸和其混合物)的任何立體異構(gòu)體(即L、D或DL異構(gòu)體)或這些立體異構(gòu)體的組合可存在于本發(fā)明的藥物組合物中，只要該特定氨基酸以其游離堿形式或以其鹽形式存在。在一個實(shí)施方案中，使用L-立體異構(gòu)體。本發(fā)明組合物也可用這些氨基酸的類似物配制。“氨基酸類似物”意指帶來減少在本發(fā)明液體藥物組合物的存儲過程中由多肽引起的聚集體形成的期望效果的天然存在氨基酸的衍生物。合適的精氨酸類似物包括例如氨基胍、鳥氨酸和N-單乙基L-精氨酸，合適的甲硫氨酸類似物包括S-乙基高半胱氨酸和S-丁基高半胱氨酸并且合適的半胱氨酸類似物包括S-甲基-L半胱氨酸。如同其它氨基酸，將氨基酸類似物以其游離堿形式或以其鹽的形式摻入組合物中。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，將氨基酸或氨基酸類似物以足夠防止或延遲蛋白聚集的濃度使用。
在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，當(dāng)作為治療劑的多肽是含有至少一個對氧化敏感的甲硫氨酸殘基的多肽時，可加入甲硫氨酸(或其它含硫的氨基酸或氨基酸類似物)以抑制甲硫氨酸殘基氧化為蛋氨酸亞砜。“抑制”意指使甲硫氨酸氧化的種類隨時間的積聚最小。抑制甲硫氨酸氧化導(dǎo)致多肽更大程度保持其正常的分子形式?？墒褂眉琢虬彼岬娜魏瘟Ⅲw異構(gòu)體(L、D或DL異構(gòu)體)或其組合物。加入的量應(yīng)該是足夠能抑制甲硫氨酸殘基氧化的量，這樣使得蛋氨酸亞砜的量是管理機(jī)構(gòu)可接受的。通常，這意味著該組合物含有不多于約10％-約30％的蛋氨酸亞砜。一般來說，這可通過加入甲硫氨酸實(shí)現(xiàn)，使得加入的甲硫氨酸與甲硫氨酸殘基的比率為約1∶1-約1000∶1，例如10∶1-約100∶1。
在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，制劑進(jìn)一步含有選自高分子量聚合物或低分子量化合物的穩(wěn)定劑。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，穩(wěn)定劑選自聚乙二醇(如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基-/羥基纖維素或其衍生物(如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、環(huán)糊精、含硫物質(zhì)如一硫代甘油、巰基乙酸和2-甲硫基乙醇以及不同的鹽(例如氯化鈉)。這些特定的穩(wěn)定劑的每一種構(gòu)成本發(fā)明的備選實(shí)施方案。
藥物組合物還可包含額外的穩(wěn)定劑，所述的穩(wěn)定劑能進(jìn)一步增強(qiáng)其中的治療活性多肽的穩(wěn)定性。本發(fā)明特別重要的穩(wěn)定劑包括，但不限于防止多肽發(fā)生甲硫氨酸氧化的甲硫氨酸和EDTA，以及能防止多肽發(fā)生與凍融或機(jī)械剪切相關(guān)的聚集的非離子型表面活性劑。
在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，制劑進(jìn)一步包含表面活性劑。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，表面活性劑選自去污劑、乙氧基化蓖麻油、聚乙二醇化(polyglycolyzed)甘油酯、乙?；瘑嗡岣视王?、山梨糖醇酐脂肪酸酯類、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(如泊洛沙姆類如PluronicF68、泊洛沙姆188和407、Triton X-100)、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯和聚乙烯衍生物如烷化和烷氧化衍生物(吐溫類如吐溫-20、吐溫-40、吐溫-80和Brij-35)、單酸甘油酯或其乙氧基化衍生物、甘油二酯或其聚氧乙烯衍生物、醇類、丙三醇、卵磷脂和磷脂(如磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、雙磷脂酰甘油和鞘磷脂)、磷脂的衍生物(如二棕櫚酰磷脂酸)和溶血磷脂的衍生物(如棕櫚酰溶血磷脂酰-L-絲氨酸和乙醇胺、膽堿、絲氨酸或蘇氨酸的1-?；?sn-甘油-3-磷酸酯)以及溶血磷脂酰和磷脂酰膽堿的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)-衍生物，如溶血磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿的十二酰和十四酰衍生物，以及對極性頭基的修飾，即膽堿、乙醇胺、磷脂酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙三醇、肌醇和帶正電荷的DODAC、DOTMA、DCP、BISHOP、溶血磷脂酰絲氨酸和溶血磷脂酰蘇氨酸，以及甘油磷脂類(如腦磷脂)、甘油糖脂(如吡喃半乳糖苷)、鞘糖脂(如神經(jīng)酰胺，神經(jīng)節(jié)苷脂)、十二烷基磷酸膽堿、雞蛋溶血卵磷脂、夫西地酸衍生物-(例如?；嵌浞蛭鞯厮徕c等)、長鏈脂肪酸及其鹽C6-C12(例如油酸和辛酸)、?；鈮A和衍生物、賴氨酸、精氨酸或組氨酸的Nα-酰化衍生物或賴氨酸或精氨酸的側(cè)鏈?；苌铩⒑匈嚢彼?、精氨酸或組氨酸和中性或酸性氨基酸的任意組合的二肽的Nα-酰化衍生物、含有中性氨基酸和兩個帶電荷氨基酸的任意組合的三肽的Nα-?；苌?、DSS(多庫酯鈉，CAS登錄號[577-11-7])、多庫酯鈣，CAS登錄號[128-49-4])、多庫酯鉀，CAS登錄號[7491-09-0])、SDS(十二烷基硫酸鈉或月桂硫酸鈉)、辛酸鈉、膽酸或其衍生物、膽汁酸及其鹽和甘氨酸或?；撬峋Y合物、熊脫氧膽酸、膽酸鈉、去氧膽酸鈉、?；悄懰徕c、甘膽酸鈉、N-十六烷基-N，N-二甲基-3-銨-1-丙磺酸鹽、陰離子(烷基-芳基-磺酸酯)單價表面活性劑、兩性離子表面活性劑(例如N-烷基-N，N-二甲基銨-1-丙磺酸鹽、3-膽氨基-1-丙基二甲基銨-1-丙磺酸鹽)、陽離子表面活性劑(季銨堿)(例如十六烷基-三甲基溴化銨、氯化十六烷基吡啶)、非離子表面活性劑(例如十二烷基β-D-吡喃葡糖苷)、poloxamines(例如Tetronic’s)，所述的poloxamine類是四官能嵌段共聚物，源于相繼加入環(huán)氧丙烷和環(huán)氧乙烷至乙二胺，或表面活性劑可選自咪唑啉衍生物或其混合物。這些特定的表面活性劑的每一種構(gòu)成本發(fā)明的備選實(shí)施方案。
藥物組合物中表面活性劑的使用是技術(shù)人員熟知的。為方便起見，將RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，19thedition，1995作為參考。
本發(fā)明的肽藥物制劑中存在其它成分是可能的。這些額外的成分可包括潤濕劑、乳化劑、抗氧化劑、填充劑、張力調(diào)節(jié)劑、螯合劑、金屬離子、油脂性媒介物、蛋白(如人血清白蛋白、明膠或蛋白質(zhì))和兩性離子(例如，氨基酸如甜菜堿、?；撬帷⒕彼?、甘氨酸、賴氨酸和組氨酸)。當(dāng)然，這些額外的成分不應(yīng)該不利地影響本發(fā)明藥物制劑的整體穩(wěn)定性。
含有根據(jù)本發(fā)明化合物的藥物組合物可以在多個位點(diǎn)，例如在局部位點(diǎn)如皮膚和粘膜位點(diǎn)，在繞過吸收的位點(diǎn)如在動脈、靜脈、心臟中施用，以及在參與吸收的位點(diǎn)如在皮膚中、皮下、肌肉中或在腹部中施用而施用給需要這種治療的患者。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的施用可通過多種給藥途徑，例如舌的、舌下的、口腔含化的、口中的、經(jīng)口的、在胃和腸中、鼻、肺如通過細(xì)支氣管和肺泡或其組合、表皮的、真皮的、經(jīng)皮膚的、陰道的、直腸的、眼睛的(例如通過結(jié)膜)、輸尿管的和腸胃外的途徑施用給需要該治療的患者。
在一方面，本發(fā)明涉及含有根據(jù)式(I)的化合物以及可藥用賦形劑的藥物組合物。
在一個實(shí)施方案中，該藥物組合物適于肺部施用。
在另一個方面，本發(fā)明涉及使用式(I)化合物用于制備肺部藥物。
本發(fā)明組合物可以以多種劑型例如作為溶液、混懸劑、乳劑、微乳劑、多層乳劑、泡沫、油膏劑、泥膏劑、膏劑、軟膏劑、片劑、包衣片劑、沖洗劑、膠囊劑例如硬明膠膠囊劑和軟明膠膠囊劑、栓劑、直腸用膠囊劑、滴劑、凝膠劑、噴霧劑、粉劑、氣霧劑、吸入劑、滴眼劑、眼膏、眼用沖洗劑、陰道栓劑、陰道環(huán)、陰道軟膏劑、注射液、原位轉(zhuǎn)化液例如原位凝膠化、原位固定、原位沉淀、原位結(jié)晶、輸液劑和埋植劑施用。
本發(fā)明組合物可進(jìn)一步例如通過共價、疏水和靜電相互作用與藥物載體、藥物遞送系統(tǒng)和高級藥物遞送系統(tǒng)復(fù)合或連接以便進(jìn)一步增強(qiáng)化合物的穩(wěn)定性，提高生物利用率、增加溶解度、降低不利效應(yīng)、達(dá)到本領(lǐng)域那些技術(shù)人員熟知的時間治療，并且增強(qiáng)患者依從性或其任何組合。載體、藥物遞送系統(tǒng)和高級藥物遞送系統(tǒng)的實(shí)例包括但不限于聚合物如纖維素和其衍生物、多糖如葡聚糖和其衍生物、淀粉和其衍生物、聚(乙烯醇)、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物、聚乙二醇、載體蛋白如白蛋白、凝膠如熱凝膠系統(tǒng)(thermogelling system)如本領(lǐng)域那些技術(shù)人員熟知的嵌段共聚體系統(tǒng)、膠束、脂質(zhì)體、微球體、納米微粒、液晶和其分散體、L2相和其分散體(脂-水系統(tǒng)中相行為領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的)，高分子膠束、多層乳劑、自乳化、自微乳化、環(huán)糊精和其衍生物，以及樹狀高分子。
本發(fā)明組合物可用于配制用于肺部施用化合物的固體、半固體、粉末和溶液，其中肺部施用是使用例如計(jì)量劑量吸入器、干粉吸入器和噴霧器進(jìn)行，所有都是本領(lǐng)域那些技術(shù)人員熟知的裝置。
本發(fā)明的組合物可特別用于受控制的、持續(xù)、延長的、遲緩性和緩慢釋放遞藥系統(tǒng)的配制。更特別地，但不限于，組合物可用于制備本領(lǐng)域那些技術(shù)人員熟知的腸胃外控制釋放制劑和持續(xù)釋放系統(tǒng)(兩個系統(tǒng)都導(dǎo)致施用次數(shù)減少許多倍)。甚至更優(yōu)選的是經(jīng)皮下施用的控制釋放系統(tǒng)和持續(xù)釋放系統(tǒng)。不用于限制本領(lǐng)域的范圍，有用的控制釋放系統(tǒng)和組合物的實(shí)例是水凝膠、油脂性凝膠、液晶、高分子膠束、微球、納米微粒。
生產(chǎn)用于本發(fā)明組合物的控制釋放系統(tǒng)的方法包括，但不限于結(jié)晶、濃縮、共結(jié)晶、沉淀、協(xié)同沉淀、乳化、分散、高壓勻化、膠囊化、噴霧干燥、微膠囊化、凝聚、相分離、溶劑蒸發(fā)以產(chǎn)生微球、擠出和超臨界流體方法。一般參考Handbook of PharmaceuticalControlled Release(Wise，D.L.，ed.Marcel Dekker，New York，2000)和Drug and the Pharmaceutical Sciences vol.99ProteinFormulation and Delivery(MacNally，E.J.，ed.Marcel Dekker，New York，2000)。
可使用注射器任選筆式注射器通過皮下的、肌內(nèi)的、腹膜內(nèi)的或靜脈內(nèi)的注射完成腸胃外施用。備選地，腸胃外施用可通過輸注泵的方式進(jìn)行。進(jìn)一步的選擇是一種組合物，所述的組合物可以是用于以鼻或肺噴霧劑形式施用根據(jù)本發(fā)明化合物的溶液或混懸液。作為更進(jìn)一步的選擇，含有本發(fā)明化合物的藥物組合物也能適合經(jīng)皮膚施用，例如通過無針注射或通過貼劑，任選離子電滲療法藥貼，或經(jīng)粘膜如口腔含化施用。
術(shù)語“經(jīng)穩(wěn)定的制劑”指具有增強(qiáng)的物理穩(wěn)定性、增強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性或增強(qiáng)的物理和化學(xué)穩(wěn)定性的制劑。
如此處使用的術(shù)語蛋白制劑的“物理穩(wěn)定性”指該蛋白由于其暴露于熱-機(jī)械應(yīng)力下和/或與去穩(wěn)定的界面和表面如疏水表面和界面相互作用而形成生物失活和/或不溶的蛋白聚集物的傾向性。含水的蛋白質(zhì)制劑的物理穩(wěn)定性可通過在不同的溫度下將置于合適容器(如藥筒或管形瓶)中的制劑暴露于機(jī)械/物理應(yīng)力(如攪拌)下不同的時間后通過視覺檢查和/或濁度測量來評估。制劑的視覺檢查在具有黑暗背景的強(qiáng)烈聚焦的光下進(jìn)行。制劑的濁度由視覺打分分級混濁程度表征，如以0-3的等級(未顯示混濁的制劑相當(dāng)于視覺打分0，而在日光下顯示可見的混濁的制劑相當(dāng)于視覺打分3)來表征。當(dāng)制劑在日光下顯示可見的混濁度時，在蛋白聚集方面將制劑分類為物理不穩(wěn)定。備選地，制劑的濁度可通過技術(shù)人員熟知的簡單濁度測量法評估。含水蛋白質(zhì)制劑的物理學(xué)穩(wěn)定性也可通過使用蛋白構(gòu)象狀態(tài)的光譜劑(spectroscopic agent)或探針來評估。該探針優(yōu)選地為優(yōu)先結(jié)合至蛋白的非天然構(gòu)象異構(gòu)體的小分子。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的小分子光譜探針(spectroscopic probe)的一個實(shí)例是Thioflavin T。Thioflavin T是已經(jīng)廣泛用于檢測淀粉樣蛋白原纖維的熒光染料。存在原纖維以及或許其它蛋白質(zhì)構(gòu)型時，Thioflavin T在其結(jié)合至原纖維蛋白形式時產(chǎn)生在約450nm下新的激發(fā)最大值和約482nm下的增強(qiáng)發(fā)射。未結(jié)合的Thioflavin T在這些波長下基本上是無熒光的。
其它小分子可用作蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)從天然到非天然狀態(tài)的變化的探針。例如，優(yōu)先地結(jié)合至蛋白暴露的疏水斑的“疏水斑”探針。疏水斑通常是包埋于天然狀態(tài)蛋白的三級結(jié)構(gòu)中，但當(dāng)?shù)鞍组_始去折疊或變性時其變?yōu)楸┞对谕?。這些小分子光譜探針的實(shí)例是芳族的疏水染料如蒽、吖啶、二氮雜菲等。其它光譜探針是金屬氨基酸復(fù)合物例如疏水氨基酸如苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸等的鈷金屬復(fù)合物。
如此處使用的術(shù)語蛋白質(zhì)制劑的“化學(xué)穩(wěn)定性”指蛋白結(jié)構(gòu)中的化學(xué)共價變化，其中所述的這種變化導(dǎo)致具有較天然蛋白結(jié)構(gòu)潛在較小的生物學(xué)效力和/或潛在增加的免疫原特性的化學(xué)降解產(chǎn)物的形成。取決于天然蛋白的類型和性質(zhì)以及該蛋白質(zhì)暴露的環(huán)境，可形成多種化學(xué)降解產(chǎn)物?；瘜W(xué)降解的消除常常不可能完全避免并且在存儲和使用蛋白質(zhì)制劑過程中通?？梢娀瘜W(xué)降解產(chǎn)物的量增加，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。多數(shù)蛋白質(zhì)易于脫酰胺作用，即谷氨酰胺?；蛱於０孵埢械膫?cè)鏈酰胺基水解形成游離羧酸的過程。其它降解途徑包括高分子量的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的形成，其中兩個或多個蛋白分子通過轉(zhuǎn)酰胺基作用和/或二硫化物相互作用彼此共價結(jié)合導(dǎo)致形成共價結(jié)合二聚體、寡聚體和多聚體降解產(chǎn)物的形成(Stability of ProteinPharmaceuticals，Ahern.T.J.&Manning M.C.，Plenum Press，New York 1992)。氧化(例如甲硫氨酸殘基的氧化)可認(rèn)為是化學(xué)降解的另一種變體。蛋白制劑的化學(xué)穩(wěn)定性可通過在其暴露于不同的環(huán)境條件(降解產(chǎn)物的形成通常可通過例如增加溫度來加速)下后，在不同的時間點(diǎn)測量化學(xué)降解產(chǎn)物的量來評估。每種獨(dú)立的降解產(chǎn)物的量通?？筛鶕?jù)分子大小和/或電荷使用多種色譜技術(shù)(如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)分離降解產(chǎn)物而測定。
因此，按上面描述，“經(jīng)穩(wěn)定的制劑”指具有增強(qiáng)的物理穩(wěn)定性、增強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性或增強(qiáng)的物理和化學(xué)穩(wěn)定性的制劑。通常，制劑在使用和存儲過程中(按照建議的使用和存儲條件)必須是穩(wěn)定的，直到達(dá)到有效期滿。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，含有根據(jù)本發(fā)明化合物的藥物制劑對于6周以上的使用和3年以上的存儲是穩(wěn)定的。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，含有根據(jù)本發(fā)明化合物的藥物制劑對于4周以上的使用和3年以上的存儲是穩(wěn)定的。
在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，含有根據(jù)本發(fā)明化合物的藥物制劑對于4周以上的使用和2年以上的存儲是穩(wěn)定的。
在本發(fā)明更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，含有該化合物的藥物制劑對于2周以上的使用和2年以上的存儲是穩(wěn)定的。
在另一方面，本發(fā)明涉及使用根據(jù)本發(fā)明的化合物用于制備藥物。
在一個實(shí)施方案中，將根據(jù)本發(fā)明的化合物用于制備治療或預(yù)防高血糖、2型糖尿病、葡萄糖耐量降低、1型糖尿病、肥胖癥、高血壓、X綜合征、血脂異常、認(rèn)知障礙、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管障礙、中風(fēng)、炎性腸綜合征、消化不良和胃潰瘍的藥物。
在另一個實(shí)施方案中，將根據(jù)本發(fā)明的化合物用于制備延緩或預(yù)防2型糖尿病疾病進(jìn)展的藥物。
在另一個實(shí)施方案中，將根據(jù)本發(fā)明的化合物用于制備減少食物攝取、減少β-細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)β-細(xì)胞功能和增加β-細(xì)胞群和/或恢復(fù)β-細(xì)胞的葡萄糖敏感性的藥物。
使用根據(jù)本發(fā)明的化合物的治療也可與第二種或更多種藥理學(xué)活性物質(zhì)聯(lián)合，例如選自抗糖尿病劑、減肥藥、食欲調(diào)節(jié)劑、抗高血壓劑、用于治療和/或預(yù)防由糖尿病引發(fā)或與其相關(guān)的并發(fā)癥的藥物以及用于治療和/或預(yù)防由肥胖癥引發(fā)或與其相關(guān)的并發(fā)癥和障礙的藥物的藥理學(xué)活性物質(zhì)。這些藥理學(xué)活性物質(zhì)的實(shí)例是胰島素、磺脲類、雙胍類、氯茴苯酸類、葡萄糖苷酶抑制劑、胰高血糖素拮抗劑、DPP-IV(二肽基肽酶-IV)抑制劑、涉及刺激糖異生和/或糖原分解的肝酶的抑制劑、葡萄糖攝取調(diào)節(jié)劑、調(diào)節(jié)脂類代謝的化合物如抗高血脂藥物如HMG CoA抑制劑(抑制素類)、降低食物攝取的化合物、RXR激動劑和作用于β-細(xì)胞ATP-依賴性鉀通道的藥劑；消膽胺、降脂寧、降固醇酸、吉非貝齊、洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、普羅布考、右旋甲狀腺素、neteglinide、瑞格列奈；β-阻滯劑如阿普洛爾、阿替洛爾、噻嗎洛爾、吲哚洛爾、普萘洛爾和美托洛爾、ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)換酶)抑制劑如貝那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、賴諾普利、alatriopril、喹那普利和雷米普利、鈣通道阻滯劑如硝苯地平、非洛地平、尼卡地平、伊拉地平、尼莫地平、地爾硫卓和維拉帕米以及α-阻滯劑如多沙唑嗪、烏拉地爾、哌唑嗪和特拉唑嗪；CART(可卡因安非他明調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄物)激動劑、NPY(神經(jīng)肽Y)拮抗劑、MC4(黑皮質(zhì)素4)激動劑、阿立新拮抗劑、TNF(腫瘤壞死因子)激動劑、CRF(促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子)激動劑、CRF BP(促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子結(jié)合蛋白)拮抗劑、urocortin激動劑、β3激動劑、MSH(促黑激素)激動劑、MCH(黑素細(xì)胞凝集激素)拮抗劑、CCK(膽囊收縮素)激動劑、5-羥色胺重?cái)z取抑制劑、5-羥色胺和去甲腎上腺素重?cái)z取抑制劑、混合的5-羥色胺和去甲腎上腺素能化合物、5HT(5-羥色胺)激動劑、鈴蟾肽激動劑、促生長激素神經(jīng)肽拮抗劑、生長激素、生長激素釋放化合物、TRH(促甲狀腺激素釋放激素)激動劑、UCP2或3(解偶聯(lián)蛋白2或3)調(diào)質(zhì)、來普汀激動劑、DA激動劑(溴麥角環(huán)肽、doprexin)、脂酶/淀粉酶抑制劑、RXR(類維生素AX受體)調(diào)質(zhì)、TRβ激動劑；組胺H3拮抗劑。
應(yīng)該理解，根據(jù)本發(fā)明的化合物與一種或多種上面提及的化合物及任選地一種或多種另外的藥理學(xué)活性物質(zhì)的任何合適的組合可認(rèn)為是在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明通過下面的實(shí)施例進(jìn)一步闡述，然而，所述的實(shí)施例不能認(rèn)為是用作限制專利保護(hù)的范圍。在前面描述和下面的實(shí)施例中公開的特征，分別地和以其任何組合，可以是用于以其不同形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的材料。
在另一方面，本發(fā)明涉及含有根據(jù)通式(I)的化合物和可藥用防腐劑的藥物組合物。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，藥物組合物含有根據(jù)通式(I)的化合物和可藥用穩(wěn)定劑。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，藥物組合物適于腸胃外施用。
在另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)通式(I)的化合物在藥物制備中的用途。
實(shí)施例一般方法(A)一般的合成方法使用制造商提供的FastMoc UV方案，以0.25mmol規(guī)模，用Applied Biosystems 433A肽合成儀，在采用Fmoc策略進(jìn)行Fmoc保護(hù)的Rink酰胺樹脂(Novabiochem)或氯三苯甲基樹脂上合成肽，其中所述的方案采用HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基-)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽)介導(dǎo)的在N-甲基吡咯烷酮中的偶合并用紫外線監(jiān)測Fmoc保護(hù)基團(tuán)的去保護(hù)。除了非天然氨基酸如Fmoc-Aib-OH(Fmoc-氨基異丁酸)以外，使用的經(jīng)保護(hù)氨基酸衍生物是裝在適于ABI433A合成儀的預(yù)稱量藥筒中的標(biāo)準(zhǔn)Fmoc-氨基酸(Anaspec)。
側(cè)鏈和接頭連接至粗制樹脂結(jié)合的經(jīng)保護(hù)肽上的特定賴氨酸殘基是在自動合成過程中通過整合Fmoc-Lys(Dde)-OH在特定位置完成。
去除Dde-保護(hù)的方法。將樹脂(0.25mmol)置于一個手動振蕩器/過濾裝置中并用N-甲基吡咯烷酮中的2％肼(20ml，2×12分鐘)處理以除去DDE基團(tuán)并用N-甲基吡咯烷酮(4×20ml)洗滌。
將側(cè)鏈連接至賴氨酸殘基的方法。
將氨基酸(相對于樹脂4摩爾當(dāng)量)溶解于N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1，20ml)中。加入羥基苯并三唑(HOBt)(相對樹脂4摩爾當(dāng)量)和二異丙基碳二亞胺(相對樹脂4摩爾當(dāng)量)并將溶液攪拌15分鐘。將該溶液加入至樹脂并加入二異丙基乙胺(相對樹脂4摩爾當(dāng)量)。于室溫將樹脂振蕩24小時。用N-甲基吡咯烷酮(2×20ml)、N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1)(2×20ml)和二氯甲烷(2×20ml)洗滌樹脂。
去除Dde-保護(hù)的方法將樹脂(0.25mmol)置于手動振蕩器中的吸濾瓶中并用N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1)(2×20ml)和用N-甲基吡咯烷酮(1×20ml)處理，在N-甲基吡咯烷酮中的20％哌啶溶液(3×20ml，每次10分鐘)。用N-甲基吡咯烷酮(2×20ml)、N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1)(2×20ml)和二氯甲烷(2×20ml)洗滌樹脂。
將肽從樹脂裂解的方法通過于室溫將樹脂與三氟乙酸、水和三異丙基硅烷(95∶2.5∶2.5)的混合物攪拌180分鐘將肽從樹脂裂解。過濾裂解混合物并通過氮?dú)饬鲗V出液濃縮為油狀產(chǎn)物。用45ml乙醚將粗制肽從該油狀產(chǎn)物中沉淀出并用45ml乙醚洗滌3次。
純化在填充有7μC-18硅石的20mm×250mm柱上通過半制備HPLC純化該肽粗產(chǎn)物。取決于肽，使用一個或兩個純化系統(tǒng)。
TFA干燥后，將肽粗產(chǎn)物溶解于5ml 50％乙酸水溶液中，并用H2O將其稀釋至20ml并且注射至柱上，隨后于40℃在50分鐘內(nèi)以10ml/分鐘用0.1％TFA中的40-60％CH3CN的梯度洗脫該柱。收集含有肽的級分。用水稀釋洗脫物后凍干純化的肽。
硫酸銨用在以濃H2SO4調(diào)節(jié)至pH2.5的0.05M(NH4)2SO4中的40％CH3CN平衡該柱。干燥后，將肽粗產(chǎn)物溶解于5ml 50％乙酸水溶液中，并用H2O將其稀釋至20ml并且注射至柱上，隨后于40℃在50分鐘內(nèi)以10ml/分鐘用0.05M(NH4)2SO4中的40-60％CH3CN的梯度洗脫該柱。收集含有肽的級分并用3體積水稀釋，并且使其通過已經(jīng)用0.1％TFA平衡過的Sep-PakC18柱體(Waters part.#51910)。隨后用含0.1％TFA的70％CH3CN將其洗脫并在用水稀釋洗脫物后通過凍干分離純化的肽。
獲得的終產(chǎn)物通過分析RP-HPLC(保留時間)和LCMS表征。
在214nm用UV檢測并使用于42℃以1ml/分鐘洗脫的Vydac218TP54 4.6mm×250mm 5μC-18硅柱(The Separations Group，Hesperia，USA)進(jìn)行RP-HPLC分析。使用兩種不同的洗脫條件A1在由濃H2SO4調(diào)節(jié)至pH 2.5的0.1M(NH4)2SO4組成的緩沖液中平衡該柱并在相同的緩沖液中用0％-60％CH3CN梯度洗脫50分鐘。
B1用0.1％TFA/H2O平衡該柱并用0％CH3CN/0.1％TFA/H2O-60％CH3CN/0.1％TFA/H2O的梯度洗脫50分鐘。
B6用0.1％TFA/H2O平衡該柱并用0％CH3CN/0.1％TFA/H2O-90％CH3CN/0.1％TFA/H2O的梯度洗脫50分鐘。
LCMS在由Hewlett Packard1100系列G1312A Bin Pump、HewlettPackard 1100系列柱室、Hewlett Packard 1100系列G1315A DAD二極管陣列檢測器、Hewlett Packard 1100系列MSD和經(jīng)HPChemstation軟件控制的Sedere75蒸發(fā)光散射檢測器組成的裝置中實(shí)施。HPLC泵連接至兩個洗脫劑貯液器，其中含有A水中的10mM NH4OHB90％乙腈中的10mM NH4OH于23℃通過將適當(dāng)體積的樣品(優(yōu)選為20μl)注入至用A和B的梯度洗脫的柱上進(jìn)行分析。
使用的HPLC條件、檢測器設(shè)置和質(zhì)譜儀設(shè)置在下面的表中給出。
柱Waters Xterra MS C-18X 3mm id 5μm梯度在6.5分鐘內(nèi)以1.5ml/分鐘使用5％-100％的乙腈線性梯度檢測210nm(從DAD模擬輸出)ELS(從ELS模擬輸出)MS 電離模式API-ES。掃描100-1000amu步長0.1amu基質(zhì)輔助激光解吸附電離質(zhì)譜分析(MALDI-MS)在配備有氮激光(337nm)的Voyager RP MALDI-TOF儀器(Perseptive Biosystems公司Framingham，MA)上進(jìn)行。通過延遲提取以線性模式操作該儀器，并且離子源中的加速電壓是25kV。如下完成樣品的制備將1μl樣品溶液(0.5-1.0mg/ml)與10μl基質(zhì)溶液(芥子酸溶解于乙腈∶水∶3％TFA的5∶4∶1混合物中)混合并將1μl放置于樣品板上并讓其干燥。
因?yàn)槭褂玫某Ｒ?guī)肽標(biāo)準(zhǔn)是在低分子量范圍內(nèi)并不足以確保正確測定在血清白蛋白范圍的質(zhì)量(＞60KDa)，僅進(jìn)行外部校準(zhǔn)。因此，測定的絕對質(zhì)量值只在0.2％精確度內(nèi)。
實(shí)施例1(NNC 0113-0040，KHBg)S-γ34-(1-{2-[2-(2-([D-Ala8、Lys37]-GLP-1-(7-37)酰胺-Nε37-基)乙酰氧基乙氧基)乙基氨甲酰基]乙基}-2，5-二氧代-吡咯烷-3-基)Albagen
根據(jù)制造商指導(dǎo)方針在ABI433A機(jī)器上用樹脂(Rink酰胺，0.68mmol/g Novabiochem 0.25mmol)生產(chǎn)基本序列。除位置37處使用的殘基(FmocLys(ivDde)-OH，Novabiochem)之外所有的保護(hù)基團(tuán)都是酸不穩(wěn)定的，使得該賴氨酸特定地去保護(hù)而不是任何其它賴氨酸。
步驟將樹脂(0.25mmol)置于手動振蕩器/過濾裝置中并用N-甲基吡咯烷酮中的2％肼(2×12分鐘，2×20ml)處理以去除Dde基團(tuán)。用N-甲基吡咯烷酮(4×20ml)洗滌該樹脂。將Fmoc-8-氨基-3，6-二氧雜辛酸(Neosystem FA03202)(相對樹脂4摩爾當(dāng)量)溶解于N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1，20ml)中。加入羥基苯并三唑(HOBt)(相對樹脂4摩爾當(dāng)量)和二異丙基碳二亞胺(相對樹脂4摩爾當(dāng)量)并將該溶液攪拌15分鐘。將該溶液加入至樹脂并加入二異丙基乙胺(相對樹脂4摩爾當(dāng)量)。于室溫振蕩該樹脂24小時。用N-甲基吡咯烷酮(4×20ml)洗滌該樹脂。在振蕩同時將N-甲基吡咯烷酮中的20％哌啶溶液(3×20ml，每次10分鐘)加入至該樹脂。用N-甲基吡咯烷酮(4×20ml)洗滌該樹脂。將3-馬來酰亞胺丙酸(相對樹脂4摩爾當(dāng)量)溶解于N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1，20ml)中。加入羥基苯并三唑水合物(HOBt；H2O)(相對樹脂4摩爾當(dāng)量)和二異丙基碳二亞胺(相對樹脂4摩爾當(dāng)量)并將該溶液攪拌15分鐘。將該溶液加入至樹脂并加入二異丙基乙胺(相對樹脂4摩爾當(dāng)量)。于室溫振蕩該樹脂24小時。用N-甲基吡咯烷酮(2×20ml)、N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1)(2×20ml)和二氯甲烷(2×20ml)洗滌該樹脂。通過于室溫將樹脂與三氟乙酸、水和三異丙基硅烷(95∶2.5∶2.5)的混合物攪拌180分鐘將肽從樹脂裂解。過濾裂解混合物并通過氮?dú)饬鲗V出液濃縮為油狀產(chǎn)物。用45ml乙醚將肽粗產(chǎn)物從該油狀產(chǎn)物中沉淀出并用45ml乙醚洗滌3次。在填充有7μC-18硅石的20mm×250mm柱上通過半制備HPLC純化該肽粗產(chǎn)物。將肽粗產(chǎn)物溶解于5ml50％乙酸水溶液中，并用H2O將其稀釋至20ml并且注射至柱上，隨后于40℃在50分鐘內(nèi)以10ml/分鐘用40-60％(在含有0.1％TFA的水中的CH3CN)的梯度洗脫該柱。收集含有肽的級分。用水稀釋洗脫液后凍干純化的肽得到Nε37-(2-(2-(3-(馬來酰亞胺基)丙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?[D-Ala8，Lys37]GLP-1(7-37)酰胺。
HPLC(方法B6)RT＝36.8分鐘HPLC(方法A1)RT＝35.1分鐘LCMSm/z＝931.4(M+H)4+，1241.5(M+H)3+。
計(jì)算出的(M+H)+＝3722.1將冷凍干燥的Nε37(2-(2-(3-(馬來酰亞胺基)丙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙?；?[D-Ala8，Lys37]GLP-1(7-37)酰胺溶解于10μl 10％的乙酸中，并加800μl在50mM NaPi pH 7.0+4％羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)中的40mg/ml Albagen(New CenturyPharma)，并且于周圍環(huán)境溫度攪拌2小時。隨后，緩慢加入固體硫酸銨達(dá)到2M終濃度。以總體積為1ml在ResourceTMHIC ISO上純化該綴合物。保持1ml/分鐘的流速。緩沖液50mM NaPi pH 7.0+4％HP-β-CD。用2M-0M的硫酸銨梯度經(jīng)20柱體積將Albagen從該綴合物中分離。色譜顯示兩個洗脫峰。第一個峰歸于Albagen，第二個峰含有該綴合物。濃縮該綴合物，并在centriprepTM裝置上以30,000Da的MW截?cái)嘀祵⑵鋸奈捶磻?yīng)的類似物中分離?？偖a(chǎn)率是25-35％。通過肽作圖法測定綴合位點(diǎn)為Cys-34。
MALDI得出質(zhì)量為70023Da。
綴合物的理論分子量是70046Da。
實(shí)施例2
S-γ34-(1-{2-[2-(2-([Aib8，22，25，Lys37]-GLP-1-(7-37)酰胺-Nε37-基)乙酰氧基乙氧基)乙基氨甲?；鵠乙基}-2，5-二氧代-吡咯烷-3-基)Albagen該化合物如實(shí)施例1制備。
GLP1前體的數(shù)據(jù)HPLC(方法B1)RT＝38.5分鐘HPLC(方法A1)RT＝36.9分鐘LCMSm/z＝949.0(M+H)4+，1264.9(M+H)3+。
計(jì)算出的(M+H)+＝3792.2 MALDI得出的質(zhì)量為70102Da。
綴合物的理論分子量是70116Da。
實(shí)施例3S-γ34-((1-{2-[2-(2-([Aib8，Arg26，34，Glu22，23，30]-GLP-1-(7-37))Lys酰胺-Nε-基)乙酰氧基乙氧基]乙基氨甲?；鵠乙基}-2，5-二氧代-吡咯烷-3-基)Albagen該化合物如實(shí)施例1制備。
GLP1-前體的數(shù)據(jù)HPLC(方法B1)RT＝36.5分鐘HPLC(方法A1)RT＝34.9分鐘LCMSm/z＝(M+H)3+＝1327.8計(jì)算出的(M+H)+＝3980.3
MALDI得出質(zhì)量為70208Da。
綴合物的理論分子量是70304Da。
實(shí)施例4根據(jù)實(shí)施例1中描述的方法合成的其它化合物是S-γ34-(1-{2-[2-(2-([Lys32]-exendin-(1-39)酰胺-N-ε32-基)乙酰氧基乙氧基)乙基氨甲酰基]乙基}-2，5-二氧代-吡咯烷-3-基)白蛋白。(其中白蛋白是來自New Century Pharma的重組Albagen，即重組HSA(2-585))。
S-γ34-(1-{2-[2-(2-([Lys20]-exendin-(1-39)酰胺-N-ε20-基)乙酰氧基乙氧基)乙基氨甲酰基]乙基}-2，5-二氧代-吡咯烷-3-基)白蛋白。(其中白蛋白是來自New Century Pharma的重組Albagen，即重組HSA(2-585))。
S-γ34-(1-{2-[2-(2-([Arg12，Lys27]-exendin-(1-39)酰胺-N-ε27-基)乙酰氧基乙氧基)乙基氨甲?；鵠乙基}-2，5-二氧代-吡咯烷-3-基)白蛋白。(白蛋白是來自New Century Pharma的重組Albagen，即重組HSA(2-585))。
S-γ34-(1-{2-[2-(2-([Arg12，27，Lys32]-exendin-(1-39)酰胺-N-ε32-基)乙酰氧基乙氧基)乙基氨甲?；鵠乙基}-2，5-二氧代-吡咯烷-3-基)白蛋白。(白蛋白是來自New Century Pharma的重組Albagen，即重組HSA(2-585))。
序列表<110>Novo Nordisk A/S<120>與白蛋白樣物質(zhì)相連的新GLP-1類似物<130>6790<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>585<212>PRT<213>智人(homo sapiens)<400>1Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu1 5 10 15Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln20 25 30Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu35 40 45Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu65 70 75 80Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro85 90 95Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu100 105 110Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His115 120 125Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg130 135 140Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg145 150 155 160Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala165 170 175Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser180 185 190Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu195 200 205Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro210 215 220Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys225 230 235 240Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser260 265 270Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His275 280 285Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser290 295 300Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala305 310 315 320Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg325 330 335Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr340 345 350Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu355 360 365Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro370 375 380Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu385 390 395 400Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro405 410 415Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys420 425 430Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His450 455 460Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser465 470 475 480Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr485 490 495Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp500 505 510Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala515 520 525Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu530 535 540Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys545 550 555 560Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val565 570 575Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu580 585<210>2<211>31<212>PRT<213>智人<400>2
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>3<211>39<212>PRT<213>鈍尾毒蜥(heloderma suspectum)<220>
<221>MOD_RES<222>(39)..(39)<223>羧基酰胺化<400>3His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>4<211>40<212>PRT
<213>合成構(gòu)建體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>1位的Xaa為L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，N-α-乙?；?組氨酸，α-氟甲基-組氨酸，α-甲基-組氨酸，3-吡啶基丙氨酸，2-吡啶基丙氨酸，或4-吡啶基丙氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>2位的Xaa為Ala，D-Ala，Gly，Val，Leu，Ile，Lys，Aib，(1-氨基環(huán)丙基)羧酸，(1-氨基環(huán)丁基)羧酸，(1-氨基環(huán)戊基)羧酸，(1-氨基環(huán)己基)羧酸，(1-氨基環(huán)庚基)羧酸或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>10位的Xaa為Val或Leu.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>12位的Xaa為Ser，Lys或Arg.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>13位的Xaa為Tyr或Gln.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>14位的Xaa為Leu或Met.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>16位的Xaa為Gly，Glu或Aib.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>17位的Xaa為Gln，Glu，Lys或Arg.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>19位的Xaa為Ala或Val.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(20)..(20)<223>20位的Xaa為Lys，Glu或Arg.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(21)..(21)<223>21位的Xaa為Glu或Leu.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(24)..(24)<223>24位的Xaa為Ala，Glu或Arg.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(27)..(27)<223>27位的Xaa為Val或Lys.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(28)..(28)<223>28位的Xaa為Lys，Glu，Asn或Arg.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(29)..(29)<223>29位的Xaa為Gly或Aib.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(30)..(30)<223>30位的Xaa為Arg，Gly或Lys.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(31)..(31)<223>31位的Xaa為Gly，Ala，Glu，Pro，Lys，酰胺或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(32)..(32)<223>32位的Xaa為Lys，Ser，酰胺或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(33)..(33)<223>33位的Xaa為Ser，Lys，酰胺或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(34)..(34)<223>34位的Xaa為Gly，酰胺或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(35)..(35)<223>35位的Xaa為Ala，酰胺或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(36)..(36)<223>36位的Xaa為Pro，酰胺或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(37)..(37)<223>37位的Xaa為Pro，酰胺或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(38)..(38)
<223>38位的Xaa為Pro，酰胺或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(39)..(39)<223>39位的Xaa為Ser，酰胺或不存在.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(40)..(40)<223>40位的Xaa為酰胺或不存在.
<400>4Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa1 5 10 15Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40<210>5<211>32<212>PRT<213>合成構(gòu)建體
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>1位的Xaa為L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基-組氨酸，2-氨基-組氨酸，β-羥基-組氨酸，高組氨酸，N-α-乙酰基-組氨酸，α-氟甲基-組氨酸，α-甲基-組氨酸，3-吡啶基丙氨酸，2-吡啶基丙氨酸，或4-吡啶基丙氨酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>2位的Xaa為Ala，D-Ala，Gly，Val，Leu，Ile，Lys，Aib，(1-氨基環(huán)丙基)羧酸，(1-氨基環(huán)丁基)羧酸，(1-氨基環(huán)戊基)羧酸，(1-氨基環(huán)己基)羧酸，(1-氨基環(huán)庚基)羧酸或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>12位的Xaa為Ser，Lys或Arg.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>16位的Xaa為Gly，Glu或Aib.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)
<223>17位的Xaa為Gln，Glu，Lys或Arg.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(20)..(20)<223>20位的Xaa為Lys，Glu或Arg.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(24)..(24)<223>24位的Xaa為Ala，Glu或Arg.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(28)..(28)<223>28位的Xaa為Lys，Glu或Arg.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(29)..(29)<223>29位的Xaa為Gly或Aib.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)<223>30位的Xaa為Arg或Lys.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(31)..(31)<223>31位的Xaa為Gly，Ala，Glu或Lys.
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(32)..(32)<223>32位的Xaa為Lys，酰胺或不存在.
<400>5Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Xaa Tyr Leu Glu Xaa1 5 10 15Xaa Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Xaa Trp Leu Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30
權(quán)利要求
1.通式(I)化合物GLP-1激動劑-L-RR-延遲蛋白 (I)其中GLP-1激動劑是為人GLP-1受體激動劑的多肽，L是連接所述GLP-1激動劑的氨基酸側(cè)鏈或所述GLP-1激動劑的C末端氨基酸殘基與RR的接頭，RR是已經(jīng)與延遲蛋白的氨基酸殘基形成共價鍵的反應(yīng)性殘基的剩余部分，并且延遲蛋白是一種具有至少5kDa摩爾重量、在人血漿中具有至少24小時血漿半衰期的蛋白，并且所述的延遲蛋白通過非哺乳動物生物體合成或合成性合成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的延遲蛋白是重組人血清白蛋白(SEQ ID NO 1)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的延遲蛋白是人血清白蛋白變體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物，其中當(dāng)與人血清白蛋白對銅和鎳的相應(yīng)結(jié)合親和力相比時所述人血清白蛋白變體對銅和鎳的結(jié)合親和力降低。
5.根據(jù)權(quán)利要求3-4任意之一所述的化合物，其中所述的延遲蛋白是人血清白蛋白的N-末端片段或其類似物。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任意之一所述的化合物，其中所述的延遲蛋白是包含Asp-Ala-His-Lys N-末端序列修飾的人血清白蛋白變體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的化合物，其中所述的延遲蛋白在三個N-末端氨基酸殘基Asp-Ala-His之中包含至少一處缺失。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的化合物，其中所述的延遲蛋白包含N-末端延伸，例如Glu-3，Ala-2Glu-1，Phe0-HSA(1-585)或其N-末端片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-7任意之一所述的化合物，其中所述的人血清白蛋白(HSA)變體選自HSA(2-585)、HSA(3-585)、HSA(4-585)、Asp-Ala-HSA(4-585)、Xaa3-HSA(1-585)及其N-末端片段，其中所述的Xaa3是已置換在天然HSA中占據(jù)位置3的His殘基的氨基酸殘基。
10.根據(jù)先前權(quán)利要求任意之一所述的化合物，其中所述的延遲蛋白包含60-200個氨基酸殘基如100-150個氨基酸殘基的氨基酸序列，并且所述的氨基酸序列與SEQ ID NO 1的片段或與有一處或兩處氨基酸置換和/或缺失的SEQ ID NO 1的片段相同。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的延遲蛋白是免疫球蛋白的Fc部分、其類似物或片段。
12.根據(jù)先前權(quán)利要求任意之一所述的化合物，其中所述的GLP-1激動劑與GLP-1(7-37)(SEQ ID NO 2)或Exendin-4(1-39)(SEQ IDNO 3)具有至少50％的氨基酸同源性。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的化合物，其中所述的GLP-1激動劑與GLP-1(7-37)(SEQ ID NO 2)或Exendin-4(1-39)(SEQ ID NO 3)具有至少80％的氨基酸同源性。
14.根據(jù)先前權(quán)利要求任意之一所述的化合物，其中所述的GLP-1激動劑包含式(II)的氨基酸序列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46式(II)(SEQ ID No4)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、Nα-乙?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；Xaa8是Ala、D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(1-氨基環(huán)戊基)羧酸、(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸；Xaa16是Val或Leu；Xaa18是Ser、Lys或Arg；Xaa19是Tyr或Gln。Xaa20是Leu或Met；Xaa22是Gly、Glu或Aib；Xaa23是Gln、Glu、Lys或Arg；Xaa25是Ala或Val；Xaa26是Lys、Glu或Arg；Xaa27是Glu或Leu；Xaa30是Ala、Glu或Arg；Xaa33是Val或Lys；Xaa34是Lys、Glu、Asn或Arg；Xaa35是Gly或Aib；Xaa36是Arg、Gly或Lys；Xaa37是Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、酰胺或不存在；Xaa38是Lys、Ser、酰胺或不存在。Xaa39是Ser、Lys、酰胺或不存在；Xaa40是Gly、酰胺或不存在；Xaa41是Ala、酰胺或不存在；Xaa42是Pro、酰胺或不存在；Xaa43是Pro、酰胺或不存在；Xaa44是Pro、酰胺或不存在；Xaa45是Ser、酰胺或不存在；Xaa46是酰胺或不存在；條件是如果Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45或Xaa46不存在，則下游每個氨基酸殘基也不存在。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的化合物，其中所述的GLP-1激動劑包含式(III)的氨基酸序列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38式(III)(SEQ ID No5)其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、Nα-乙酰基-組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；Xaa8是Ala、D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基環(huán)丙基)羧酸、(1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(1-氨基環(huán)戊基)羧酸或(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸；Xaa18是Ser、Lys或Arg；Xaa22是Gly、Glu或Aib；Xaa23是Gln、Glu、Lys或Arg；Xaa26是Lys、Glu或Arg；Xaa30是Ala、Glu或Arg；Xaa34是Lys、Glu或Arg；Xaa35是Gly或Aib；Xaa36是Arg或Lys；Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys；Xaa38是Lys、酰胺或不存在。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15任意之一所述的化合物，其中所述的GLP-1激動劑是二肽基氨肽酶IV保護(hù)的。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的化合物，其中所述的GLP-1激動劑是一種位置8類似物，即相對于GLP-1(7-37)序列(SEQ ID No2)的位置8的丙氨酸殘基已經(jīng)由另一個氨基酸殘基置換。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的化合物，其中所述的GLP-1激動劑在相對于GLP-1(7-37)序列(SEQ ID No2)的位置8上包含Aib殘基。
19.根據(jù)先前權(quán)利要求任意之一所述的化合物，其中在所述的GLP-1肽位置7(N-末端)的氨基酸殘基選自D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、Nα-乙?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸。
20.根據(jù)先前權(quán)利要求任意之一所述的化合物，其中與GLP-1(7-37)(SEQ ID No2)或Exendin-4(1-39)(SEQ ID No3)相比，所述的GLP-1激動劑包含不多于12個經(jīng)交換、添加或缺失的氨基酸殘基。
21.根據(jù)先前權(quán)利要求任意之一所述的化合物，其中與GLP-1(7-37)(SEQ ID No2)或Exendin-4(1-39)(SEQ ID No3)相比，所述的GLP-1激動劑包含不多于六個經(jīng)交換、添加或缺失的氨基酸殘基。
22.根據(jù)先前權(quán)利要求任意之一所述的化合物，其中與GLP-1(7-37)(SEQ ID No2)或Exendin-4(1-39)(SEQ ID No3)相比，所述的GLP-1激動劑包含不多于四個經(jīng)交換、添加或缺失的氨基酸殘基。
23.根據(jù)先前權(quán)利要求任意之一所述的化合物，其中所述的GLP-1激動劑包含不多于4個不是由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-22任意之一所述的化合物，其中與GLP-1(7-37)(SEQ ID No2)或Exendin-4(1-39)(SEQ ID No3)相比，所述的GLP-1激動劑包含不多于兩個經(jīng)交換、添加或缺失的氨基酸殘基。
25.根據(jù)先前權(quán)利要求任意之一所述的化合物，其中所述的GLP-1激動劑選自[Arg34]GLP-1(7-37)、[Arg26、34]GLP-1(7-37)Lys、[Lys36Arg26、34]GLP-1(7-36)、[Aib8、22、35]GLP-1(7-37)、[Aib8，35]GLP-1(7-37)、[Aib8，22]GLP-1(7-37)、[Aib8，22，35Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Ala37]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Ala37]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22Ala37]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Lys37]GLP-1(7-37)、[Aib8，35Lys37]GLP-1(7-37)和[Aib8，22Lys37]GLP-1(7-37)。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-13任意之一所述的化合物，其中所述的GLP-1激動劑是Exendin-4(1-39)(SEQ ID No.3)。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-13任意之一所述的化合物，其中所述的GLP-1激動劑是ZP-10，即[Ser38Lys39]Exendin-4(1-39)LysLysLysLysLys-酰胺(SEQ ID No.4)。
28.根據(jù)先前權(quán)利要求任意之一所述的化合物，其中所述的GLP-1激動劑通過在相對于氨基酸序列SEQ ID No2(GLP-1(7-37))的位置23、26、34、36或38(對應(yīng)于相對于氨基酸序列SEQ ID No3(Exendin-4(1-39))的位置17、20、28、30或32)上的氨基酸殘基的側(cè)鏈連接至以下部分-L-RR-延遲蛋白。
29.根據(jù)先前權(quán)利要求任意之一所述的化合物，其中所述的GLP-1激動劑通過C末端氨基酸殘基的側(cè)鏈連接至以下部分-L-RR-延遲蛋白。
30.根據(jù)先前權(quán)利要求任意之一所述的化合物，其中所述的GLP-1激動劑通過選自精氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、組氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的氨基酸殘基的側(cè)鏈連接至以下部分-L-RR-延遲蛋白。
31.根據(jù)先前權(quán)利要求任意之一所述的化合物，其中所述的GLP-1激動劑通過半胱氨酸殘基的側(cè)鏈連接至以下部分-L-RR-延遲蛋白。
32.根據(jù)先前權(quán)利要求任意之一所述的化合物，其中所述的接頭L選自二價連接化學(xué)基團(tuán)酰胺-C(O)-NR-，其中R是氫或C1-6-烷基，胺-NR-，其中R是氫或C1-6-烷基，硫醚-S-，-S-(CH2)2-SO2-或 醚-O-，尿烷-N(R1)-CO-N(R2)-，其中R1和R2獨(dú)立地是氫或C1-6-烷基，氨基甲酸酯-O-CO-N(R)-，其中R是氫或C1-6-烷基，肼 其中R是氫或C1-6-烷基，肟-O-N＝C(-R)-，其中R是氫或C1-6-烷基，唑烷或噻唑烷 R＝H或CH3，X＝S或O和
33.根據(jù)先前權(quán)利要求任意之一所述的化合物，其選自GLP-1激動劑-C(＝O)CH2O(CH2)2O(CH2)2-RR-延遲蛋白，GLP-1激動劑-C(＝O)(CH2)n(OCH2CH2)m-RR-延遲蛋白，GLP-1激動劑-S(＝O)2(CH2)n(OCH2CH2)m-RR-延遲蛋白，GLP-1激動劑-CH2(CH2)n(OCH2CH2)m-RR-延遲蛋白，GLP-1激動劑-C(＝O)O(CH2)n(OCH2CH2)m-RR-延遲蛋白，其中n是0-10的整數(shù)，并且m是0-100的整數(shù)。
34.根據(jù)先前權(quán)利要求任意之一所述的化合物，其選自GLP-1激動劑-L-NC(＝O)CH2-延遲蛋白中的半胱氨酸殘基中的硫、GLP-1激動劑-L-S(＝O)2(CH2)2-延遲蛋白中的半胱氨酸殘基中的硫、GLP-1激動劑-L-NC(＝O)CH2-延遲蛋白中的半胱氨酸殘基中的硫，和
35.根據(jù)先前權(quán)利要求任意之一所述的化合物，其選自S-γ34-(1-{2-[2-(2-([D-Ala8，Lys37]-GLP-1-(7-37)酰胺-Nε37-基)乙酰氧基乙氧基)乙基氨甲酰基]乙基)-2，5-二氧代-吡咯烷-3-基)Albagen S-γ34-(1-{2-[2-(2-([Aib8，22，25，Lys37]-GLP-1-(7-37)酰胺-Nε37-基)乙酰氧基乙氧基)乙基氨甲?；鵠乙基}-2，5-二氧代-吡咯烷-3-基)Albagen S-γ34-((1-{2-[2-(2-([Aib8，Arg26，34，Glu22，23，30]-GLP-1-(7-37))Lys酰胺-Nε-基)乙酰氧基乙氧基)乙基氨甲?；鵠乙基}-2，5-二氧代-吡咯烷-3-基)Albagen
36.根據(jù)權(quán)利要求1-34任意之一所述的化合物，其選自S-γ34-(1-{2-[2-(2-([Lys32]-exendin-(1-39)酰胺-N-ε32-基)乙酰氧基乙氧基)乙基氨甲?；鵠乙基}-2，5-二氧代-吡咯烷-3-基)白蛋白(其中白蛋白是來自New Century Pharma的重組Albagen，即重組HSA(2-585))、S-γ34-(1-{2-[2-(2-([Lys20]-exendin-(1-39)酰胺-N-ε20-基)乙酰氧基乙氧基)乙基氨甲?；鵠乙基}-2，5-二氧代-吡咯烷-3-基)白蛋白(其中白蛋白是來自New Century Pharma的重組Albagen，即重組HSA(2-585))、S-γ34-(1-{2-[2-(2-([Arg12，Lys27]-exendin-(1-39)酰胺-N-ε27-基)乙酰氧基乙氧基)乙基氨甲?；鵠乙基}-2，5-二氧代-吡咯烷-3-基)白蛋白(其中白蛋白是來自New Century Pharma的重組Albagen，即重組HSA(2-585))和S-γ34-(1-{2-[2-(2-([Arg12，27，Lys32]-exendin-(1-39)酰胺-N-ε32-基)乙酰氧基乙氧基)乙基氨甲酰基]乙基}-2，5-二氧代-吡咯烷-3-基)白蛋白(其中白蛋白是來自New Century Pharma的重組Albagen，即重組HSA(2-585))。
37.一種藥物組合物，其含有根據(jù)先前權(quán)利要求任意之一所述的化合物和藥用防腐劑。
38.一種藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1-36任意之一所述的化合物和藥用穩(wěn)定劑。
39.根據(jù)權(quán)利要求37-38任意之一所述的藥物組合物，其適于腸胃外施用。
40.根據(jù)權(quán)利要求1-36任意之一所述的化合物在制備藥物中的用途。
41.根據(jù)權(quán)利要求1-36任意之一所述的化合物在制備藥物中的用途，其中所述的藥物用于治療或預(yù)防高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐量降低、1型糖尿病、肥胖癥、高血壓、X綜合征、血脂障礙、認(rèn)知障礙、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管病癥、中風(fēng)、炎性腸綜合征、消化不良和胃潰瘍。
42.根據(jù)權(quán)利要求1-36任意之一所述的化合物在制備藥物中的用途，其中所述的藥物用于延緩或預(yù)防2型糖尿病的疾病進(jìn)展。
43.根據(jù)權(quán)利要求1-36任意之一所述的化合物在制備藥物中的用途，其中所述的藥物用于減少食物攝取、減少β-細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)β-細(xì)胞功能和增加β-細(xì)胞群和/或恢復(fù)β-細(xì)胞的葡萄糖敏感性。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有式(I)結(jié)構(gòu)的化合物GLP－1激動劑－L－RR－延遲蛋白(I)，其中GLP－1激動劑是為人GLP－1受體激動劑的多肽，L是連接所述GLP－1激動劑的氨基酸側(cè)鏈與RR的接頭，RR是已經(jīng)與延遲蛋白的氨基酸殘基形成共價鍵的反應(yīng)性殘基的剩余部分，且延遲蛋白是一種具有至少5kDa摩爾重量、在人血漿中具有至少24小時血漿半衰期的蛋白，并且所述的延遲蛋白通過非哺乳動物生物體合成或合成性合成。
文檔編號A61P3/00GK1893980SQ200480037741
公開日2007年1月10日 申請日期2004年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月18日
發(fā)明者T·K·漢森, M·尊德爾, K·邁德森, A·斯文德森, C·B·施奧德, J·勞 申請人:諾沃挪第克公司