專利名稱：制備白蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的而言，涉及一種制備白蛋白的方法。
背景技術(shù)：
血清蛋白又稱白蛋白。一類分子量較小，呈球狀，能溶于水的蛋白質(zhì)。主要存在于哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、霉菌和植物中。卵白蛋白、乳白蛋白、 白蛋白和血清白蛋白等都屬此類。卵白蛋白是蛋清中的一種重要蛋白質(zhì)，約占蛋清總蛋白的70%。血清白蛋白是血清中含量最豐富的蛋白質(zhì)，占血清總蛋白量的50%以上，不含糖，在飽和硫酸銨溶液中沉淀析出。血清白蛋白在血液中有重要生理功能，和維持血液正常滲透壓有關(guān)，是血液總滲透壓的主要調(diào) 節(jié)物質(zhì)，缺少該白蛋白可能導(dǎo)致機(jī)體浮腫。血清白蛋白的另一作用是作為脂肪酸的載體參與運(yùn)送脂肪酸。然而，目前制備白蛋白的方法，仍有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問題之一或至少提供一種有用的商業(yè)選擇。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提出了一種制備白蛋白的方法。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，該方法包括以下步驟(1)將血清與生理鹽水混合，并加入飽和硫酸銨溶液；(2)將步驟(I)中所得到的混合物靜置，以便形成含有沉淀的混合物；(3)從步驟(2)中所得到的含有沉淀的混合物中分離第一上清液，所述上清液含有所述白蛋白；(4)將所述第一上清液的pH調(diào)節(jié)至所述白蛋白的等電點(diǎn)，以便形成白蛋白沉淀；以及(5)收集所述白蛋白。由此，利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的制備白蛋白的方法，能夠有效地制備白蛋白。另外，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法，白蛋白的提取率高、效率高、并且白蛋白的純度高，所形成聚合物及其他雜質(zhì)的含量少，從而能夠進(jìn)一步對含有上述白蛋白的生物樣本例如血漿進(jìn)行分析，可以有效地獲得關(guān)于生物樣本的生化或者病理信息，例如可以用于疾病診斷、治療和化學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例尤其適合制備犬血清白蛋白。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以利用本發(fā)明的方法提取的白蛋白的類型不受特別限制。例如，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以提取的白蛋白的非限制性實(shí)例包括卵白蛋白和血清白蛋白。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，可以利用本發(fā)明的方法提取血清白蛋白，例如犬血清白蛋白，其中，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，為提取犬血清白蛋白，可以從犬動(dòng)脈血分離血清樣本。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，犬動(dòng)脈血中含氧量豐富，而含二氧化碳的量少，其PH值相對較低，由此易于控制體系的酸堿度，另外，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)在分離過程中，犬動(dòng)脈血中犬血清白蛋白的等電點(diǎn)穩(wěn)定性顯著高于其他血樣樣本。由此，可以提高制備白蛋白效率和白蛋白的質(zhì)量。另外，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法制備得到的犬血清白蛋白可以用于制備治療急、危、難、重、病犬的特效生物制品。用于犬失血性創(chuàng)傷性、嚴(yán)重?zé)齻C傷等引起的休克，犬腦水腫及損傷引起的顱壓升高，犬肝硬化及腎病引起的水腫或腹水和犬低蛋白血癥的防治。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，在將血清與生理鹽水混合之前，可以對血清進(jìn)行預(yù)處理，例如可以預(yù)先對血清進(jìn)行下列處理將血清進(jìn)行離心，并收集第二上清液和將第二上清液進(jìn)行過濾除菌。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)示例，收集第二上清液的方法并不受特別限制，例如，對于犬動(dòng)脈全血，可以先將犬動(dòng)脈全血在4攝氏度環(huán)境下靜置分離得到血清，然后將血清進(jìn)行離心收集得到第二上清液。由此，可以提高血清的純度，從而進(jìn)一步提高制備白蛋白純度和效果。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)示例，對第二上清液的處理過程還進(jìn)一步包括對第二血清進(jìn)行過濾除菌的步驟，由此，可以除去在樣本收集，例如采犬血過程中引入的各種細(xì)菌病毒等，進(jìn)一步可以避免引入的細(xì)菌和病毒對血清的污染，從而提聞提取白蛋白的純度。根據(jù)本發(fā)明的一些示例，在將血清與生理鹽水混合之前對血清進(jìn)行預(yù)處理的方法進(jìn)一步包括向經(jīng)過過濾除菌的第二上清液中添加防腐劑，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，可以添加的防腐劑并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用硫柳汞溶液，其中，硫柳汞的終濃度不超過0. 01重量％。由此，可以避免在制備白蛋白的過程中蛋白質(zhì)腐敗變性，導(dǎo)致白蛋白含量降低，產(chǎn)生附加雜質(zhì)等不利影響。因此，添加適量的防腐劑可以有效的提高白蛋白提取效率和純度，避免血漿的浪費(fèi)。另外，上述方法獲得的經(jīng)過除菌和加入防腐劑的第二上 清液，可以直接作為血清樣品進(jìn)行后續(xù)處理，以便獲得白蛋白。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在步驟(I)中，所采用的生理鹽水的量并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以將血清與生理鹽水按照等體積進(jìn)行混合。由此，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，可以通過添加生理鹽水，優(yōu)選地按照等體積將血清與生理鹽水進(jìn)行混合，可以防止在后續(xù)加入飽和硫酸銨溶液進(jìn)行處理時(shí)，防止白蛋白與其他蛋白同時(shí)沉淀出來，即通過添加生理鹽水，可以防止“共沉淀”現(xiàn)象，從而可以有效地提高制備白蛋白的效率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在將血清與生理鹽水混合之后，可以向所得到的混合物中添加飽和硫酸銨，從而可以將血清中所包含的除白蛋白以外的蛋白質(zhì)有效地沉淀出來。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所添加的飽和硫酸銨溶液的量并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的飽和硫酸銨溶液的pH值為7. 2^7. 4，并且所添加飽和硫酸銨溶液的體積為血清體積的兩倍。由此，可以有效地提聞利用硫酸按溶液沉淀蛋白質(zhì)的效率，進(jìn)而可以提聞白蛋白提取率的和提取效果，使得提取的白蛋白的效率更高。另外，本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，隨著攪拌，優(yōu)選磁力攪拌，向血清和生理鹽水的混合物中加入飽和硫酸銨溶液，由此，可以避免因血清中加入的飽和硫酸銨溶液后局部飽和硫酸銨溶液濃度過高而產(chǎn)生白蛋白共沉淀現(xiàn)象。由此，可以進(jìn)一步有效地將血清中除白蛋白以外的其他蛋白質(zhì)以沉淀的形式與白蛋白進(jìn)行分離，從而提高提取白蛋白的純度。同時(shí)，本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，優(yōu)選，緩慢地(例如加入飽和硫酸銨溶液的速度可以為20滴/分鐘)向血清和生理鹽水的混合物中加入飽和硫酸銨溶液,例如，向血清和生理鹽水的混合物中滴加飽和硫酸銨溶液，可以避免氣泡的產(chǎn)生。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通常在體系中蛋白質(zhì)沉淀不均勻的情況下，攪拌的過程中會(huì)產(chǎn)生氣泡，緩慢加入飽和硫酸銨溶液可以避免。由此，可以進(jìn)一步提高制備白蛋白的純度。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，將血清中白蛋白進(jìn)行沉淀后所得到的混合物在4攝氏度下靜置6 12小時(shí)，例如靜置過夜。由此，在該條件下可以使得血清中除白蛋白以外的其他蛋白得到充分沉淀，進(jìn)而與白蛋白充分分離，從而提高制備白蛋白的提取率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，飽和硫酸銨的制備方法并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，可以通過下列步驟獲得飽和硫酸銨溶液將500ml蒸餾水加熱到70 80°C，在攪拌下加入450g硫酸銨，攪拌20min，使之全部溶解，趁熱過濾后,將濾液室溫放置過夜，當(dāng)部分硫酸銨結(jié)晶析出時(shí)，即得到飽和硫酸銨溶液，再用28重量％的NH4OH調(diào)至溶液pH為7.4 7.2。由此，得到的飽和硫酸按溶液，可以進(jìn)一步提聞沉淀蛋白的效率，提聞制備白蛋白的效率。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所采用的飽和硫酸銨溶液不含金屬離子，例如通過采用純硫酸銨制備得到的飽和硫酸銨溶液，由此，可以避免硫酸銨溶液中含有的金屬離子與白蛋白結(jié)合。由于金屬離子的存在會(huì)與白蛋白結(jié)合，進(jìn)而影響白蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在添加飽和硫酸銨溶液后，可以使得除白蛋白以外的蛋白質(zhì)形成沉淀，從而可以得到含有沉淀的混合物。接下來，可以從所得到的混合物中分離第一上清液，該第一上清液中含有白蛋白。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，從混合物中分離第一上清液的方法并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的一些示例，可以將混合物在3，SOOrpm離心20分鐘的條件下進(jìn)行分離，獲得第一上清液，第一上清液中含有白蛋白。由此，可以將血清中除白蛋白以外的其他蛋白質(zhì)與白蛋白進(jìn)行有效地分離，得到含有白蛋白的第一上清液，從而進(jìn)一步提聞制備白蛋白的效率。 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，在分離第一上清液之后，可以進(jìn)一步對第一上清液中含有的白蛋白進(jìn)行提純。根據(jù)本發(fā)明的一些示例，可以通過將第一上清液的PH調(diào)節(jié)至白蛋白的等電點(diǎn)，以便形成白蛋白沉淀。從而可以有效地實(shí)現(xiàn)從第一上清液中分離白蛋白。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以利用等電點(diǎn)沉淀法分離的白蛋白的等電點(diǎn)為4. 7^4. 9，根據(jù)本發(fā)明的具體示例，可以提取的白蛋白為犬血清白蛋白，犬血清白蛋白的等電點(diǎn)為4. 7。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以通過在4攝氏度下按照下列操作將第一上清液的pH調(diào)節(jié)至白蛋白的等電點(diǎn)隨著攪拌，向第一上清液中滴加lmol/L的醋酸調(diào)節(jié)溶液pH值到白蛋白的等電點(diǎn)，由此，在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零(即正負(fù)電荷相等)，此時(shí)蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀，所以蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，其溶解度最小，最易形成沉淀物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在4攝氏度下向第一上清液中緩慢滴加lmol/L的醋酸，調(diào)節(jié)溶液pH達(dá)到4. 7時(shí)，立即停止滴加醋酸。由此，可使白蛋白在達(dá)到等電點(diǎn)時(shí)形成沉淀，進(jìn)而達(dá)到與第一上清液中的其他成分有效的分離開。從而，使得白蛋白得到進(jìn)一步純化，提高制備白蛋白的純度和質(zhì)量。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將含有白蛋白沉淀的第一上清液在3，SOOrpm離心20分鐘的條件下進(jìn)行分離，收集白蛋白沉淀。利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的制備白蛋白的方法，在得到高純度的白蛋白沉淀之后，還可以進(jìn)一步將所收集的白蛋白沉淀按照1:10的重量比與雙蒸水混合；向所得到的混合物中添加lmol/L的氫氧化鈉溶液以便將該混合物的pH調(diào)節(jié)至7. 0，獲得白蛋白的水溶液。由此，可使白蛋白沉淀溶解，得到白蛋白溶液。在將白蛋白沉淀進(jìn)行溶解的過程中，本發(fā)明的發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，先向白蛋白沉淀中加入少量雙蒸水，然后用玻璃棒攪成糊狀，再慢慢加入所需濃度的氫氧化鈉溶液適量。由此，可以提高白蛋白的溶解效率。需要說明的是，本發(fā)明的技術(shù)方案是發(fā)明人經(jīng)過大量研究實(shí)驗(yàn)，意外獲得的。由于白蛋白自身性質(zhì)的特殊性，目前常規(guī)的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)，難以有效地用于制備白蛋白，尤其是對于犬血清樣本，由于犬血清樣本成份復(fù)雜，目前常規(guī)的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)，難以有效地用于制備白蛋白，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的技術(shù)方案，能夠有效地從犬血清樣本中制備白蛋白，其可以回收血清中98%的白蛋白，而且純度可達(dá)99. 5%，另外發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的技術(shù)方案所得到的白蛋白的生物活性顯著高于其他現(xiàn)有技術(shù)。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
具體實(shí)施例方式下面通過具體的實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行說明。需要說明的是，下面的實(shí)施例僅僅是說明性的，而不以任何方式限制本發(fā)明的范圍，另外，在下面實(shí)施例中所采用的試劑和設(shè)備均為市售可得的，在下面的實(shí)施例中沒有描述的處理和制劑配制方法，則均為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行處理和配制。實(shí)施例1
器械5000ml三角燒瓶X 10、試管、玻璃棒、燒杯、磁力攪拌器、超濾器。試劑(NH4)2S04、BaCl2、NaHC03、NaOH, HgI2、K1、NH40H、醋酸。制備飽和硫酸銨將500ml蒸餾水，加熱到70 80°C，在攪拌下加入450g硫酸銨，攪拌20min，使之全部溶解，趁熱過濾后，將濾液室溫放置過夜，部分硫酸銨結(jié)晶析出，得到飽和硫酸銨溶液，此飽和硫酸銨溶液的pH值約為5，再用28%的NH4OH調(diào)至溶液pH為7. 4或者7. 2。納氏試劑制備將70ml的10重量％的NaOH、15ml雙碘化物溶液(配制方法見后)和15ml蒸餾水混合得到納氏試劑。雙碘化物溶液的制備稱取5. 75g的HgI2和4g的KI置于25ml蒸懼水中，再加入25ml的6mol/L NaOH溶液，即得雙碘化物溶液，將其存于棕色的瓶中備用。實(shí)施例2成年健康犬在控食不控水8h后深度麻醉，用四聯(lián)采血袋、16號針頭從股動(dòng)脈采血，采血量以體重的3%為上限量。放入4°C冰箱中靜置48h，以便血清自然析出，在3，600rpmX20min條件下離心，分離血清，再用0. 22 y m的濾膜對得到的血清進(jìn)行過濾除菌，加入0. 01%的硫柳汞防腐，硫柳汞的終濃度不超過0. 01重量％。取IOOml經(jīng)過處理后的血清,加入生理鹽水100ml，電磁攪拌下,緩慢加入pH7. 2飽和硫酸銨200ml，使體系中硫酸銨的飽和度達(dá)到50%。將上述體系放入4°C環(huán)境靜置過夜，使其充分沉淀。沉淀完全后以3，800rpm離心20min獲得沉淀和上清液。將上清液在4°C環(huán)境中邊攪拌邊滴加lmol/L的冰醋酸，并實(shí)時(shí)測定體系的PH值，當(dāng)pH值達(dá)到4. 7時(shí)立即停止滴加醋酸，此時(shí)已達(dá)到犬血清白蛋白的等電點(diǎn)并繼續(xù)攪拌30min。然后放入4°C環(huán)境中，使白蛋白充分沉淀。將上一步所得的白蛋白沉淀以1:10的比例置入雙蒸水中，在10°C的環(huán)境中，緩慢滴加經(jīng)滅菌的lmol/L的NaOH溶液，調(diào)節(jié)體系的pH達(dá)到7. O。此時(shí)體系澄清透明，并呈棕黃色，即為所提取的犬血白蛋白溶液。結(jié)果根據(jù)本實(shí)施例的方法，可獲取血清中98%的白蛋白，而且純度可達(dá)99. 5%。在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。術(shù)語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個(gè)或者更多個(gè)該特征。在本發(fā)明的描述中，“多個(gè)”的含義是兩個(gè)或兩個(gè)以上，除非另有明確具體的限定。
盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。
權(quán)利要求
1.一種制備白蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)將血清與生理鹽水混合，并加入飽和硫酸銨溶液； (2)將步驟(I)中所得到的混合物靜置，以便形成含有沉淀的混合物； (3)從步驟(2)中所得到的含有沉淀的混合物中分離第一上清液，所述上清液含有所述白蛋白； (4)將所述第一上清液的pH調(diào)節(jié)至所述白蛋白的等電點(diǎn)，以便形成白蛋白沉淀；以及 (5)收集所述白蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述白蛋白為犬血清白蛋白，所述血清是從犬動(dòng)脈血分離的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在將血清與生理鹽水混合之前，預(yù)先對血清進(jìn)行下列處理 將所述血清進(jìn)行離心，并收集第二上清液；將所述第二上清液進(jìn)行過濾除菌； 向經(jīng)過過濾除菌的第二上清液中添加硫柳汞，其中，所述硫柳汞的終濃度不超過O. Ol重量％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將所述血清與所述生理鹽水按照等體積混合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述飽和硫酸銨溶液的pH值為7.2 . 4，并且所述飽和硫酸銨溶液的體積為所述血清體積的兩倍。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中，將步驟(I)中所得到的混合物在4攝氏度下靜置6 12小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將所述步驟(2)中所得到的含有沉淀的混合物，在3800rpm下離心20分鐘，以便獲得第一上清液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述白蛋白為犬血清白蛋白，所述白蛋白的等電點(diǎn)為4. 7。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，將所述第一上清液的pH調(diào)節(jié)至所述白蛋白的等電點(diǎn)是通過在4攝氏度下，隨著攪拌，向所述第一上清液中滴加IM的醋酸而完成的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括 將所收集的白蛋白按照1: 10的重量比與雙蒸水混合； 向所得到的混合物種添加lmol/L的NaOH以便將該混合物的pH調(diào)節(jié)至7. O,以便獲得所述白蛋白的水溶液。
全文摘要
本發(fā)明給提供了一種制備犬血清白蛋白的方法，該方法包括(1)將血清與生理鹽水混合，并加入飽和硫酸銨溶液；(2)將步驟(1)中所得到的混合物靜置，以便形成含有沉淀的混合物；(3)從步驟(2)中所得到的含有沉淀的混合物中分離第一上清液，該上清液含有目標(biāo)白蛋白；(4)將上述第一上清液的pH調(diào)節(jié)至目標(biāo)白蛋白的等電點(diǎn)，以便形成白蛋白沉淀；以及(5)收集目標(biāo)白蛋白。通過該制備方法能夠有效制備白蛋白。
文檔編號C07K1/30GK103012581SQ20121049741
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月28日
發(fā)明者李英俊, 臧麗, 徐新萍, 鞠錄欣, 李蘇超, 劉江靜, 金越紅, 張叢茹, 孫靜文, 許寧, 李光健 申請人:李英俊