專利名稱:抑制免疫應答或治療增生性疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本文公開了用于治療增生性疾病和用于抑制免疫系統(tǒng)應答的方法和藥用組合物,它們涉及對主體給藥某些4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物。
背景技術(shù):
磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)將磷酯酰肌醇(phosphinositide)的3-羥基磷酸化。這些酶產(chǎn)生第二信使(例如,PIP3)并且起到酪氨酸激酶受體和G蛋白偶聯(lián)受體下游的轉(zhuǎn)導物的作用。PI3K參予許多基本過程,包括細胞程序死亡、增殖、細胞運動性和粘著。(參見Walker等人,Molec.Cell,6909-919,2000)。因此,已經(jīng)開發(fā)了幾種PI3K抑制劑。
雷帕霉素(mTOR)的哺乳動物靶標為289kDa的絲氨酸蘇氨酸激酶,其亦稱FKBP-12靶-1(RAFT-1)和FKBP-12雷帕霉素相關(guān)蛋白。有幾個mTOR的保守結(jié)構(gòu)域,包括絲氨酸-蘇氨酸激酶域。T細胞模型表明,IL-2和其它因子促進mTOR活化并且隨后通過誘導新的蛋白質(zhì)合成促進細胞生長。已知mTOR促進P70S6激酶的活化,活化又催化S6的磷酸化,S6為用于活化多核糖體以驅(qū)動蛋白質(zhì)合成和mRNA翻譯所需的40S核糖體蛋白。另外,mTOR活化真核起始因子4E。因此,mTOR在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和細胞周期中起作用。認為mTOR通過感知細胞狀態(tài)和通過G1-S期調(diào)節(jié)細胞進程而起到關(guān)卡的作用。mTOR上游和下游的多種已知的效應器途徑用于調(diào)節(jié)mTOR活性。因此,通過結(jié)合于mTOR而使mTOR失活的化合物可用于調(diào)節(jié)細胞周期功能并從而調(diào)節(jié)細胞生長。隨著mTOR特異性地在淋巴細胞中起作用,mTOR的抑制還可用于改變T細胞和B細胞中的信號(參見Kirken和Want,Transplantation Proc.,35227S-23OS,2003)。
已知的mTOR抑制劑包括LY294002(2-(4-嗎啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮)和雷帕霉素(rapamycin)。雷帕霉素用于免疫抑制、化療方案中,和用于血管成形術(shù)后冠脈再狹窄的預防。LY294002阻斷蛋白激酶B的PI3K-依賴性磷酸化作用。雷帕霉素具有顯著的副作用,包括高膽甾醇血、藥物誘導性肺炎、腎毒性、高血壓、和增加易患病體質(zhì)的機會感染。
不希望有的細胞增殖是許多疾病治療方法的構(gòu)成部分。例如,不希望有的細胞生長可以引起良性腫瘤或惡性腫瘤的形成。根據(jù)theAmerican Cancer Society(美國癌癥學會),癌癥為一組以異常細胞的非受控生長和散布為特征的疾病。如果散布未受到控制,其可引起死亡。雖然癌癥經(jīng)常被稱為單一的一種病況,其實際上包括超過100種不同的疾病。這些疾病的特征在于異常細胞的非受控生長和散布。癌癥可以在許多部位產(chǎn)生并且根據(jù)其起源器官的不同而有不同表現(xiàn)。還在繼續(xù)尋找可用于治療不同類型的癌癥的藥物。
不希望有的細胞生長還是再狹窄、狹窄的再發(fā)生或矯正術(shù)后動脈狹窄的構(gòu)成部分。再狹窄在冠脈旁路術(shù)(CAB)、動脈內(nèi)膜切除術(shù)、心臟移植之后,特別是在血管成形術(shù)、斑塊切除術(shù)(atherectomy)、激光切除術(shù)或施加支架之后發(fā)生。再狹窄是由管腔開口操作過程中對血管壁造成損害所致。在一些患者中,這種損害引發(fā)在被血管成形術(shù)損傷區(qū)域中的以稱作“增生”的平滑肌細胞增殖為特征的修復反應。這種平滑肌細胞增生在幾周到幾個月內(nèi)使由血管成形術(shù)打開的管腔再狹窄,從而需要重復血管成形術(shù)或其它操作以緩解再狹窄。
在免疫應答中,T細胞和/或B細胞響應被免疫系統(tǒng)看作是“外源性物質(zhì)”的刺激物而增殖。雖然免疫應答通常是有益的,但是存在其中期望減少免疫應答的情況。例如,在自身免疫疾病中,免疫系統(tǒng)的細胞錯誤地將自身組成部分識別為外源性的,并且響應自身組成部分進行增殖。炎癥應答可以是有害的,因為其可以免疫應答對抗移植器官。
顯而易見,需要開發(fā)可以減少不希望的細胞增殖的藥物。這些藥物包括誘導免疫抑制、化療劑,和再狹窄治療劑。
發(fā)明內(nèi)容
本文公開了用于抑制主體中的免疫應答和用于治療主體中的增生性疾病的方法。這些方法包括對主體給藥治療有效量的以下結(jié)構(gòu)表示的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物,或其可藥用鹽, 式A其中R1和R2各自的存在是非必要的并且R1和R2各自獨立地選自烷基、取代的烷基、雜烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、取代的雜環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、烷氧基、鹵素、羥基、或氨基。
本文另外公開了選擇免疫抑制劑或抗增生劑的方法。該方法包括選擇試驗劑,與抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-依賴性的底物磷酸化相比,所述試驗劑優(yōu)先抑制酪蛋白激酶2和/或P70S6激酶的磷酸化。
本發(fā)明另外公開了藥用組合物,其包括2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮或其可藥用鹽、和可藥用載體。
圖1A為LY294002和LY303511的化學結(jié)構(gòu)。LY294002中的嗎啉基中的氧在LY303511中被胺代替。圖1B為數(shù)字圖像,表示其中將A549細胞在有或沒有100μm LY303511、200ng/ml的雷帕霉素、或200nM渥曼青霉素的存在下的培養(yǎng)結(jié)果(或如圖1C中表示的數(shù)字圖像和圖1D中所示的柱狀圖和數(shù)字圖像)。
將細胞與O-100μm的LY303511反應1小時,然后加入L/I,持續(xù)30分鐘并且制備細胞溶胞產(chǎn)物。通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)樣品(70μg)并且將其轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上,隨后通過蛋白質(zhì)印跡進行磷酸-p70S6激酶T389(pS6K)、磷酸-Akt S473(pAkt)、總p70 S6激酶(S6K)、總Akt(Akt)、磷酸-mTOR S2481(pmTOR)、或總mTOR(mTOR)的免疫檢測。蛋白質(zhì)標準(kDa)位于右側(cè)。對于圖1D中所示的柱狀圖和數(shù)字圖像,還圖解表示了譜帶密度測量。將pmTOR的積分譜帶密度對于總mTOR的積分譜帶密度對歸一化。將用抑制劑處理的細胞的歸一化譜帶密度表達為相對于用DMSO=1處理的細胞的歸一化譜帶密度(pmTOR/DMSO)。數(shù)據(jù)為得自五個實驗的平均值(±SEM)。*p<0.05通過Student t檢驗。所有的板條表示得自相同實驗的數(shù)據(jù)并且表示四個單獨的實驗。
圖2A為表示LY303511阻斷A549細胞中的細胞增殖、DNA合成、和細胞周期進展的柱狀圖。A.使A549細胞(每35-mm皿為80,000個細胞)在具有FBS的培養(yǎng)基中生長1天,隨后加入0.1%DMSO、100μMLY303511、雷帕霉素200ng/ml、200nM渥曼青霉素、或100μMLY294002,維持24小時。然后將細胞與胰蛋白酶培養(yǎng),收集并計數(shù)。數(shù)據(jù)為得自三次重復實驗的細胞/孔×10-4±SEM的平均值。*p<0.05通過Student t-檢驗。圖2B為使96孔板中的A549細胞(每孔4,000)在具有FBS的培養(yǎng)基中生長24小時,然后加入10mM BrDU+0-200μmLY303511,有或者沒有雷帕霉素200ng/ml、或有單獨的雷帕霉素(0-200ng/ml)時得到的結(jié)果的線形圖。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(BrDU檢測試劑盒,Roche)的原地ELISA測量BrDU結(jié)合(在490/465的吸光度)。對于每個試驗,用抑制劑培養(yǎng)的細胞中的BrDU表示為用0.2%DMSO對照處理的細胞中的BrDU的百分數(shù)(%對照)。在各個實驗中相對于對照=100%的平均吸光度測量值為0.9±0.3、0.8±0.3、和0.8±0.3。數(shù)據(jù)為得自三次重復實驗的BrDU含量±SEM的平均值。*p<0.05通過Student t-檢驗。圖2C為柱狀圖,表示LY303511通過組合的G1和G2/M抑制而抑制細胞周期。A549細胞在具有FBS的培養(yǎng)基中生長48小時,然后加入沒有或有雷帕霉素200ng/ml的0-100μM的LY303511,維持24小時。然后收獲細胞并將其與碘化丙啶培養(yǎng)2小時,然后使用Becton-Dickson FACSCalibur計數(shù)。數(shù)據(jù)為處于細胞周期的G1、S、或G2/M期的細胞百分數(shù)的平均值±SEM。通過Student t檢驗,相對于DMSO對照的*p<0.05,相對于10μM LY303511的p=0.056。
圖3A-3B為柱狀圖和數(shù)字圖像,表示LY303511對細胞周期抑制劑和細胞周期蛋白的水平的作用。使A549細胞(每100-mm皿~1×106細胞)生長48小時,然后加入0.1%DMSO、100μM LY303511、或雷帕霉素200ng/ml,維持0、12、或24小時。在所示的時間,將細胞勻質(zhì)化并儲存在-80℃。對于蛋白質(zhì)印跡分析,將通過SDS-PAGE分離的溶胞產(chǎn)物蛋白質(zhì)樣品(70μg)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上并與以下抗體反應A.磷酸-S6K T389(pS6K)、p27Kipl、p21Cipl、磷酸-Rb S807/S811、或B.細胞周期蛋白A、細胞周期蛋白B、細胞周期蛋白D、和細胞周期蛋白E。所有的印跡得自于一個實驗。下面的數(shù)據(jù)(相對密度)為,在三個實驗中,相對于DMSO對照=1.0,得自用抑制劑處理24小時的一式兩份的皿的密度測量值的平均值。通過Student t-檢驗,相對于DMSO對照的*p<0.05。
圖4A-4D為柱狀圖和數(shù)字圖像,表示LY303511抑制血清刺激的S6K和Akt的磷酸化(圖4A和4B),以及PASM細胞的增殖(圖4C和4D)。在無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時之后,將PASM細胞與沒有或有100μM LY303511、雷帕霉素200ng/ml、或200nM渥曼青霉素(圖4A)、或0-100μM LY303511(圖4B)培養(yǎng)1小時,然后加入10%FBS,維持30分鐘并制備細胞溶胞產(chǎn)物。通過SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)(20μg/凝膠體)并將其轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上,然后通過蛋白質(zhì)印跡免疫檢測磷酸-p70 S6激酶T389(pS6K)或磷酸-Akt S473(pAkt)。數(shù)據(jù)得自于五個實驗中有代表性的一個實驗。
使PASM細胞(每孔4,000個)在90-孔板中生長24小時,然后在有(圖4C)或沒有(圖4D)10%FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時。然后將細胞在沒有或有雷帕霉素200或400ng/ml的包含10%FBS、10μM BrDU、和0-100μM LY303511的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(BrDU檢測試劑盒,Roche)通過原地ELISA測量BrDU結(jié)合。對于每個試驗,用抑制劑培養(yǎng)的細胞中的BrDU含量表示為相對于用0.1%DMSO對照培養(yǎng)的細胞中的BrDU含量的百分數(shù)(%對照)。使用得自不同供體的細胞的每個實驗的平均對照(=100%)吸光度分別為圖4C和圖4D的0.22±0.06和0.24±0.06(=100%)。數(shù)據(jù)為得自一式六份試驗中3個實驗的BrDU的平均值±SEM。通過Student t檢驗,相對于DMSO對照的*p<0.05,或相對于10μM LY303511的p<0.05。
圖5A-5B為柱狀圖,表示LY303511通過引起組合的G1和G2/M抑制而抑制細胞周期,并且LY303511抑制CK2活性。對于圖5A中所示的數(shù)據(jù),PASM細胞在具有FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時,然后加入沒有或有雷帕霉素400ng/ml的O-100μM的LY303511,維持24小時。然后收獲細胞并將其與碘化丙啶培養(yǎng)2小時,然后使用Becton-DicksonFACSCalibur計數(shù)。數(shù)據(jù)為一式兩份試驗的三個實驗中細胞周期的G1、S、或G2/M期中細胞百分數(shù)的平均值(±SEM)。通過Student t檢驗,相對于DMSO對照的*p<0.05,相對于10μM LY303511的p<0.05。圖5B為柱狀圖,表示LY303511或LY294002體外抑制CK2。根據(jù)生產(chǎn)商的指導(Upstate Biotechnologies),將0或100ng的重組CK2與具有1%DMSO或所示抑制劑的CK2底物肽和32P-γ-ATP培養(yǎng)10分鐘。數(shù)據(jù)是具有抑制劑的樣品的值(以相對于對照的百分數(shù)表示)的平均值,對照為(平均±SEM)0.2±0.03pmol磷酸酯/100ng蛋白質(zhì)/10分鐘。數(shù)據(jù)得自于一式兩份進行的三個實驗。以DMSO作對照進行Student t檢驗時,*p<0.05。
圖6A-6B為柱狀圖,表示LY303511抑制裸鼠中前列腺腺癌細胞(PC-3)的生長。將LY303511以10mg/kg/d腹膜內(nèi)給藥,以減弱裸鼠中PC-3腫瘤生長。生長抑制程度與用LY303511治療的持續(xù)時間成正比。LY303511(LY3)的20天療程與10天療程在抑制腫瘤生長方面同樣有效。圖6C表示Kaplan-Mieir存活分析圖。該分析包括當腫瘤達到300mm3時發(fā)生事件的假定。Y軸描述腫瘤尺寸小于300mm3的概率。應該指出的是,第4組具有早期事件,其很可能表示異常值(例如,動物沒有接受完全劑量的藥物)。
圖7A-F為柱狀圖,表示LY303511抑制初生小鼠腹膜巨噬細胞或A549細胞中脂多糖(LPS)誘導的細胞因子生成或STAT1活性。使用得自Jackson(Jac)和Taconic(Tac)的野生型小鼠。在用巰基乙醇酸酯注射三天之后收獲腹膜巨噬細胞。將細胞在2%FCS RPMI中培養(yǎng)三天。在用有或者沒有LY 303511(1~100μm)的LPS 1μg/ml或DMSO刺激24小時之后收集上清液。測量細胞上清液中的細胞因子(白細胞介素(IL)-12p70、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ、MCP-1、IL-10、IL-6)。結(jié)果顯示,LY303511引起所有六種細胞因子的劑量依賴性降低(參見圖7A-F)。加入100μM的LY303511引起類似于背景水平的細胞因子分泌。因此,顯而易見,LY303511可以減少細胞因子表達,并且具有抗炎作用。
圖8A-B為一組柱狀圖,其表示LY303511對由LPS/IFN-γ誘導的STAT1舌性的抑制。將A549細胞用表達由STAT1(GAS-luc,Clontech)驅(qū)動的熒光蟲熒光素酶的報道基因載體瞬時轉(zhuǎn)染,并且在沒有或有100μM的LY303511、雷帕霉素200ng/ml、或兩者的情況下培養(yǎng)1小時,然后加入LPS/IFN-γ,維持6小時。在細胞溶胞產(chǎn)物(RLU)中測量STAT1活性(熒光素酶活性)。給出的數(shù)據(jù)為一式三份樣品±SEM,并且代表兩個獨立的實驗。如圖4A和4B所示,LY303511通過兩種炎癥遞質(zhì)LPS/IFN-γ抑制STAT1活化。
幾個實施例的詳細說明為了便于理解,以下更具體地描述用于本文中的以下術(shù)語化學術(shù)語“烷基”是指只包含碳和氫的環(huán)狀的、支鏈的、或直鏈的烷基,并且除非另作說明,其通常包含一到十二個碳原子。這個術(shù)語另外由以下基團舉例說明甲基、乙基、正丙基、異丁基、叔丁基、戊基、新戊酰、庚基、金剛烷基、和環(huán)戊基。烷基可為未取代的或被一種或多種如下所述的取代基取代。
“取代的烷基”是指其中上述烷基中的一個或多個氫或碳原子被另一個基團如鹵素、芳基、取代的芳基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、及其組合代替的烷基。示例性的取代的烷基包括芐基、三氯甲基等。
“雜烷基”是指其中上述烷基中的一個或多個氫或碳原子被雜原子如N、O、P、B或S代替的烷基。被雜環(huán)烷基、取代的雜環(huán)烷基、雜芳基、取代的雜芳基、烷氧基、芳氧基或氨基取代的烷基也被包括在“雜烷基”內(nèi)。示例性的雜烷基包括氰基、苯甲酰基、2-吡啶基、2-呋喃基等。
“環(huán)烷基”是指具有單環(huán)或多稠環(huán)的飽和或不飽和的非芳香環(huán)狀烴基。示例性的環(huán)烷基包括環(huán)戊基、環(huán)己基、雙環(huán)辛基等。
“取代的環(huán)烷基”是指其中上述環(huán)烷基中的一個或多個氫或碳原子被另一個基團如鹵素、芳基、取代的芳基、烷氧基、芳氧基、氨基、及其組合代替的環(huán)烷基。
“雜環(huán)烷基”是指其中上述環(huán)狀基團中的一個或多個碳原子被雜原子如N、O、P、B或S代替的環(huán)烷基。示例性的雜環(huán)烷基包括例如哌嗪基、嗎啉基、四氫吡喃基、四氫呋喃基、哌啶基、吡咯烷基、唑啉基等。
“取代的雜環(huán)烷基”是指其中上述雜環(huán)烷基中的一個或多個氫或碳原子被另一個基團如鹵素、芳基、取代的芳基、烷氧基、芳氧基、氨基、及其組合代替的雜環(huán)烷基。
“芳基”是指芳香族取代基,其可為單一芳香環(huán)或稠和在一起、共價連接的或連接于共用基團如亞甲基或乙烯部分的多芳香環(huán)。共用連接基團也可為羰基,如在二苯酮中;或為氧,如在二苯醚中;或為氮,如在二苯胺中。芳香環(huán)可包括苯基、萘基、聯(lián)苯基、二苯醚、二苯胺和二苯酮,以及其它。在具體的例子中,芳基具有1到20個碳原子。
“取代的芳基”是指其中上述芳基中的一個或多個氫或碳原子被一個或多個官能團如烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、取代的雜環(huán)烷基、鹵素、烷基鹵代、羥基、氨基、烷氧基、和硫基代替的芳基。示例性的取代的芳基包括氯代苯基、3,5-二甲基苯基、2,6-二異丙基苯基等。
“雜芳基”是指其中芳香環(huán)中的一個或多個碳原子被雜原子如N、O、P、B或S代替的芳香環(huán)。雜芳基是指可為單一芳香環(huán)、多芳香環(huán)、或結(jié)合于一個或多個非芳香環(huán)的一個或多個芳香環(huán)。示例性的雜芳基包括例如噻吩、吡啶、異唑、phthalidimide、吡唑、吲哚、呋喃等。
“取代的雜芳基”是指其中上述雜芳基中的一個或多個氫或碳原子被一個或多個官能團如烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、取代的雜環(huán)烷基、鹵素、烷基鹵代、羥基、氨基、烷氧基、和硫基代替的雜芳基。
“烷氧基”是指-OZ基團,其中Z選自烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、取代的雜環(huán)烷基、及其組合。示例性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、芐氧基、和叔丁氧基。相關(guān)的術(shù)語為其中Z選自芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、及其組合的“芳氧基”。示例性的烷氧基包括苯氧基、取代的苯氧基、2-吡啶氧基、8-喹啉氧基等。
“氨基”是指基團-NZ1Z2,其中Z1和Z2各自獨立地選自氫、烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、取代的雜環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、烷氧基、芳氧基、及其組合。
“硫基”是指基團-SZ1Z2,其中Z1和Z2各自獨立地選自氫、烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、取代的雜環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、烷氧基、芳氧基、及其組合。
“鹵素”是指氟、溴、氯、或碘取代基。
本發(fā)明公開的化合物的“可藥用鹽”包括從陽離子如鈉、鉀、鋁、鈣、鋰、鎂、鋅形成的那些鹽;和從堿如氨、乙二胺、N-甲基-谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、膽堿、N,N′-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、二乙醇胺、普魯卡因、N-芐基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羥甲基)甲胺、和氫氧化四甲銨形成的那些鹽。這些鹽可通過標準方法制備,例如通過將游離酸與適當?shù)挠袡C堿或無機堿反應。本說明書中敘述的任何化合物都可以作為其可藥用鹽給藥?!翱伤幱名}”還包括游離酸、堿、兩性離子的形式。對于適當?shù)目伤幱名}的說明可以在Handbook ofPharmaceutical Salts,Properties,Selection and Use,Wiley VCH(2002)中找到。
“藥劑”或“藥物”是指能夠在適當?shù)貙χ黧w給藥時誘導所需的治療或預防效果的化合物或組合物。
其它術(shù)語“AKT”是指已經(jīng)表現(xiàn)出響應生長因子、細胞因子、和致癌Ras調(diào)節(jié)細胞存活信號的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。AKT經(jīng)由磷酸肌醇-3-OH激酶(PI3K)途徑被活化并且通過其它上游激酶活化。AKT通過直接使細胞程序死亡中涉及的蛋白質(zhì)(包括Bad、procaspase 9、和叉頭(forkhead)轉(zhuǎn)錄因子家族的成員)磷酸化和失活而抑制細胞死亡途徑。AKT又稱蛋白激酶B(PKB,GenBank登錄號Nu 005154)。
“動物”為有生命的多細胞脊椎動物生物體,其包括例如哺乳動物和鳥類。“哺乳動物”包括人類和非人類哺乳動物?!爸黧w”包括人類和動物主體。
“抗增生劑”是指減少增殖、或引起細胞死亡的藥物。抗增生劑包括化療劑。
“動脈粥樣硬化”是指血管隨時間而發(fā)生的進行性狹窄和硬化。動脈粥樣硬化是在大動脈和中等尺寸動脈的內(nèi)膜和內(nèi)部介質(zhì)中形成的包含膽固醇、類脂物質(zhì)、和噬脂細胞的微黃色斑塊(粉瘤)的動脈硬化的常見形式。
“自身免疫性疾病”為其中免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對抗作為正常寄主的一部分的抗原(即,自身抗原)的免疫應答(如,B細胞或T細胞應答)并隨后損害組織的疾病。自身抗原可來自于寄主細胞,或者可來自于通常位于粘膜表面上的共生生物體如微生物(已知為共生生物體)。
影響哺乳動物的示例性的自身免疫疾病包括類風濕性關(guān)節(jié)炎、幼年寡關(guān)節(jié)炎(juvenile oligoarthritis)、膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎、佐劑誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎、合格倫綜合征、多發(fā)性硬化、實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎(experimental autoimmune encephalomyelitis)、炎癥性腸病(如,克隆病、潰瘍性結(jié)腸炎)、自身免疫性胃萎縮、尋常天皰瘡、銀屑病、白癜風、I型糖尿病、非肥胖性糖尿病、重癥肌無力、格雷夫斯病、橋本氏甲狀腺炎、硬化性膽管炎、硬化性涎腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性血小板減少性紫癜、古德帕斯丘綜合征、艾迪生病、系統(tǒng)性硬化、多肌炎、皮肌炎、自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血等。
“化學治療”是指給藥稱為“化療劑”的一種化合物或多種化合物的組合,以殺死或減慢迅速繁殖細胞的繁殖?;焺┌ū绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的那些,包括但不限于5-氟尿嘧啶(5-FU)、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、抗代謝物(如氟達拉濱)、抗腫瘤藥(如依托泊苷、多柔比星、甲氨蝶呤、和長春新堿)、卡鉑、順鉑和紫杉烷如紫杉醇。雷帕霉素也被用作化療劑。
“移植物抗宿主病”是指其中供體骨髓移植物中的T細胞攻擊和進攻宿主組織的骨髓移植物的并發(fā)癥。移植物抗宿主病(GVHD)在其中血液骨髓供體與患者無關(guān)或當供體與患者相關(guān)但不完全匹配的情況中最常見。有兩種GVHD形式早期形式被稱為急性GVHD,其在移植不久以后在白細胞升高時出現(xiàn);和晚期形式,被稱為慢性GVHD。
急性GVHD通常在移植后的前三個月內(nèi)出現(xiàn)并且可以影響到皮膚、肝、胃、和/或腸。早期征候通常為手、腳和臉上的看似曬傷一樣散布的皮疹。急性GVHD伴有的嚴重問題可包括皮膚上的水皰、伴有腹部絞痛的水性或便血性腹瀉、和反映肝臟受到牽連的黃疸(皮膚和眼睛變黃)。
慢性GVHD通常在移植后的2-3個月出現(xiàn)并且引起類似于自身免疫疾病如狼瘡和硬皮病的癥狀。患者發(fā)展出現(xiàn)干燥發(fā)癢的皮疹并且看似鱷魚皮一樣。還可發(fā)生毛發(fā)喪失、皮膚出汗減少、和毛發(fā)過早灰白??诟蔀槌R姲Y狀。其可發(fā)展為食物性過敏,并且辛辣和酸性食物可引起刺痛。眼睛也可受到牽連而變得干燥和感覺受刺激并變紅。幾乎任何器官都可以受到慢性GVHD的影響。
“免疫應答”是指免疫系統(tǒng)的細胞如B細胞、T細胞、巨噬細胞或多形核細胞對刺激的響應。免疫應答可以包括宿主防御反應中所牽涉的身體的任何細胞,如分泌細胞因子的上皮細胞。細胞因子包括但不限于白細胞介素(如IL-12(參見Quesniaux,Research Immunology,143385-400,1992)、腫瘤壞死因子(TNF)-α(參見Aggarwal和Vilcek(eds),“Tumor necrosis factorstructure,function,and mechanism of action”,Marcel Dekker Inc.1992),干擾素(IFN)-y(參見Farrar和Schreiber,Ann.Rev.of Immunol.,11571-611,1993)、單核細胞趨化蛋白(MCP)-1(參見Yoshimura和Leonard,Cytokines,4131-52,1992)、IL-10(參見Zlotnik和Moore,Cytokines,3366-71,1991)、和IL-6(參見Van Snick,Ann.Rev.Immunol.,8253-78,1990)。需要指出的是,對細胞因子的描述包括它們的蛋白質(zhì)序列、核酸序列和對它們功能性描述可在國際互聯(lián)網(wǎng)上得到例如在COPECytokines Online Pathfinder Encyclopaedia網(wǎng)址上。免疫應答(例如先天性的、獲得性的)包括但不限于對病毒感染或細菌感染的應答、先天性免疫應答、對自體抗原或炎癥的應答。
“免疫抑制”是指細胞和/或體液免疫的非特異性的無反應性。免疫抑制是指當T和/或B細胞數(shù)目耗竭或其反應性、脹大或分化受到抑制時出現(xiàn)的免疫應答的阻止或減少。免疫抑制可起因于特異性或非特異性T細胞如Treg細胞的由響應輻射的細胞因子信號所活化、或由對T和B細胞具有通用免疫抑制作用的藥物所活化。
“免疫抑制劑”是指可以減少免疫應答如炎性反應的分子如化合物、小分子、類固醇、核酸分子、或其它生物劑。免疫抑制劑包括但不限于關(guān)節(jié)炎治療劑(抗關(guān)節(jié)炎劑)。免疫抑制劑的具體的非限制性例子為非甾體抗炎藥、環(huán)孢素A、FK506和抗-CD4。在另外的例子中,免疫抑制劑為生物應答改變劑,如Kineret(阿那白滯素)、Enbrel(依那西普)、或Remicade(英利昔單抗);緩解疾病的抗風濕性藥物(DMARD)如Arava(來氟米特);非甾體抗炎藥(NSAID);具體地為環(huán)氧化酶-2(COX-2)抑制劑,如Celebrex(塞來昔布)和Vioxx(羅非昔布);或其它制品如Hyalgan(玻尿糖苷)和Synvisc(hylan G-F20)。雷帕霉素為免疫抑制劑的另一個例子。
“炎癥”或“炎癥過程”是指一系列的復雜事件,包括小動脈、毛細血管和小靜脈擴張,伴隨有滲透性和血流量增加、流體滲出,包括血漿蛋白質(zhì)和白細胞移動到炎性病灶中。炎癥可通過本領(lǐng)域中公知的多種方法測量,如白細胞數(shù)、多形核白細胞嗜中性粒細胞(PMN)數(shù)、PMN活化程度如腔內(nèi)(luminal)增強的化學發(fā)光的測量、或細胞因子存在量的測量。
“抑制”或“治療”疾病是指抑制例如處于某種疾病(如自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、或移植組織或器官排斥)危險下的主體中疾病或狀況的全面發(fā)展。“治療”是指改善疾病的征候或癥狀或開始發(fā)展之后的病理學狀況的治療性干預。如本文中使用的,關(guān)關(guān)疾病或病理學狀況的術(shù)語“改善”是指治療的任何可觀察到的有益效果。有益效果可以通過例如以下方面得以證實易感主體中疾病的臨床癥狀的延遲發(fā)病、疾病的一些或所有臨床癥狀的嚴重程度減輕、疾病的進展減慢、疾病的復發(fā)次數(shù)減少、主體的總體健康或良好狀態(tài)的改善、或通過本領(lǐng)域中公知的針對具體疾病具有特異性的其它參數(shù)。
“激酶”是指催化磷酸基從一個分子轉(zhuǎn)移到另一個分子的酶?!敖z氨酸蘇氨酸激酶”將磷酸基轉(zhuǎn)移到多肽中的絲氨酸和/或蘇氨酸的羥基?!癙70 S6激酶”為將核糖體的40S亞單位(小亞基)的S6蛋白磷酸化的激酶。GenBank登錄號JE0377表示人P70S6激酶的示例性氨基酸序列?!傲字<〈?-激酶”是指將肌醇脂質(zhì)在肌醇環(huán)的D-3位磷酸化以產(chǎn)生3-磷酸肌醇、磷脂酰肌醇3-磷酸[PtdIns(3)P]、磷脂酰肌醇3,4-二磷酸[PtdIns(3,4)P2]和磷脂酰肌醇3,4,5-三[PtdIns(3,4,5)P3]的酶。GenBank登錄號AAB53966表示人磷脂酰肌醇3-激酶的催化性亞單位的示例性氨基酸序列?!袄业鞍准っ?”(genbank登錄號NP 001887)是指優(yōu)先磷酸化酸性蛋白質(zhì)如酪蛋白的酶。GenBank登錄號NP001887表示酪蛋白激酶2的示例性氨基酸序列。酪蛋白激酶2底物的例子包括p53(GenBank登錄號CAA25652)、BH3相互作用結(jié)構(gòu)域死亡激動劑(Bid;選擇性轉(zhuǎn)錄本的登錄號為NP_001187.1、NP_932070.1、NP_932071.1)、DNA拓撲異構(gòu)酶II(NP 001058)。激酶的“優(yōu)先”抑制是指與抑制第二種激酶如PI3K的活性相比,更大程度地降低一種激酶如P70S6激酶的活性。
“白細胞”是指血液中的細胞,也稱為“白血球”,其參予防護身體免受感染性生物體和外來物質(zhì)的威脅。白細胞在骨髓中產(chǎn)生。有五種主要類型的白細胞,其再分成兩個主要的組多形核白細胞(嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞)和單核白細胞(單核細胞和淋巴細胞)。
“巨噬細胞”是指負責多種內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定過程、免疫過程和炎癥過程的無處不在的單核吞噬細胞群。它們的廣泛的組織分布使得這些細胞非常適合于在白細胞侵入之前提供對抗外來物質(zhì)的立即性防御。炎性巨噬細胞存在于多種滲出物中,并且可通過多種特異性的標識物表征,如過氧化物酶活性和細胞因子表達,并且得自共享類似性質(zhì)的單核細胞。“活化的巨噬細胞”是指具有特異性地增加的功能活性的巨噬細胞。分化過程與巨嗜細胞“活化”不同,其為分化的巨噬細胞獲得增加的執(zhí)行特異性功能的能力的過程。通常,未活化的巨噬細胞為相對免疫靜止的,具有低的耗氧量、低的主要組織相容性復合體(MHC)II類基因表達水平,并且有很少的或幾乎沒有細胞因子分泌。一旦被活化,巨噬細胞不能增殖并且具有高的耗氧量。另外,活化的巨噬細胞能夠殺死寄生物質(zhì)和/或細胞溶解腫瘤細胞,并且分泌細胞因子如TNF-α、IL-1和IL-6。
“雷帕霉素哺乳動物靶標標(mTOR)”是指與啤酒糖酵母(S.cerevisae)ToR1和ToR2蛋白質(zhì)共有約45%同一性的約289kDa的多肽。人、大鼠、和小鼠的mTOR蛋白共有約95%的氨基酸同一性。mTOR蛋白質(zhì)為絲氨酸-蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶(參見Hunter等人,Cell,831-4,1995;Hoekstra,Curr.Opina.Genet.Dev.,7170-175,1997)。mTOR(參見GenBank登錄號L30475)在蘇氨酸389處磷酸化P70S6激酶并且使真核翻譯起始因子的結(jié)合蛋白磷酸化和活化。
“瘤形成”是指細胞異常和非受控生長的過程。瘤形成的產(chǎn)物為瘤(腫瘤),其為由過度細胞分裂導致的組織的異常生長。不發(fā)生轉(zhuǎn)移的瘤稱為“良性腫瘤”。侵犯周圍組織和/或可以轉(zhuǎn)移的瘤稱為“惡性腫瘤”。腫瘤形成為增生性疾病的一個例子。
血液瘤的例子包括白血病,包括急性白血病(如急性淋巴細胞性白血病、急性髓細胞性白血病、急性髓性白血病、和成髓細胞性白血病、早幼粒細胞性白血病、成髓單細胞性白血病、單核細胞性白血病和紅白血病)、慢性白血病(如慢性髓細胞性(粒細胞性)白血病、慢性髓性白血病、和慢性淋巴細胞性自血病)、真性紅細胞增多癥、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(無痛形式和高級形式)、多發(fā)性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥、重鏈病、脊髓發(fā)育異常綜合征、和脊髓發(fā)育不良。
實體瘤如肉瘤和癌的例子包括纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、和其它肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、惡性淋巴瘤、胰腺癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細胞癌、鱗狀細胞癌、皮膚基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、髓樣癌、支氣管肺癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨膜癌、維耳姆斯瘤、宮頸癌、睪丸瘤、膀胱癌、和CNS癌(如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤、髓膜瘤(menangioma)、黑素瘤、成神經(jīng)細胞瘤、和視網(wǎng)膜母細胞瘤)。
“非腸道”給藥是指在腸外如不通過消化道的給藥。通常,非腸道制劑為通過除攝取之外的任何可能的方式給藥的那些。這個術(shù)語具體地是指注射,無論是以靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、動脈內(nèi)、或皮下給藥;和各種表面施用形式,包括例如鼻內(nèi)、皮內(nèi)、和局部施用。
“磷酸化”是指生成有機分子(如蛋白質(zhì)或脂質(zhì))的磷酸酯衍生物。在細胞中,這可以通過從三磷酸腺苷(ATP)轉(zhuǎn)移磷酸基而實現(xiàn)。
“增生性疾病”包括腫瘤和再狹窄。
“再狹窄”是指心臟瓣膜矯正術(shù)后狹窄的再發(fā)生、或除去或減少先前狹窄后的血管結(jié)構(gòu)(如冠狀動脈)的狹窄再發(fā)生。在多種例子中,再狹窄出現(xiàn)在放置支架之后或血管成形術(shù)之后。
“序列同一性”是指氨基酸序列之間的相似性,并且以序列之間的相似性表示,也稱為序列同一性。序列同一性通常以百分同一性(或相似性或同源性)測量得到;百分數(shù)越高,則兩個序列越相似。在使用標準方法對比時,多肽的同系物或變體具有較高程度的序列同一性。
用于比較的序列對比方法為本領(lǐng)域中公知的。多種程序和對比算法在Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.,2482,1981;Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.,48443,1970;Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,852444,1988;Higgins和Sharp,Gene,73237,1988;Higgins和Sharp,CABIOS,5151,1989;Corpet等人,Nucleic AcidsResearch 1610881,1988;和Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,852444,1988中描述。Altschul等人,Nature Genet.,6119,1994提供了序列對比方法和同源性計算的詳細討論。
NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul等人,J.Mol.Biol.,215403,1990)可得自多種來源,包括the National Centerfor Biotechnology Information(NCBI,Bethesda,MD)、和國際互聯(lián)網(wǎng)上,用于連接序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx。關(guān)于如何使用這個程序測定序列同一性的描述可在國際互聯(lián)網(wǎng)上的NCBI網(wǎng)址上得到。
多肽的“同系物”和“變體”是指使用NCBI Blast 2.0、gapped blastp設(shè)置為缺省參數(shù),與多肽的氨基酸序列進行全長對比時計算的以具有至少75%,例如至少80%、或至少90%序列同一性為特征的多肽。對于大于約30個氨基酸的氨基酸序列的比較,采用Blast 2序列函數(shù),使用設(shè)置為缺省參數(shù)的default BLOSUM62 matrix(gap existence cost為11,和per residue gap cost為1)。在對比短的肽(少于約30個氨基酸)時,使用Blast 2序列函數(shù)進行對比,采用設(shè)置為缺省參數(shù)的PAM30matrix(open gap為9,extension gap為1 penalties)。在通過這種方法評價時,具有與參考序列更大相似性的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出增加的百分同一性,如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%的序列同一性。當比較不足整個序列的序列同一性時,同系物和變體通常在10-20個氨基酸的短窗中具有至少80%序列同一性,并且可具有至少85%或至少90%或95%的序列同一性,根據(jù)它們與參考序列的相似性而定。在這種短窗中測定序列同一性的方法可在國際互聯(lián)網(wǎng)上的NCBI網(wǎng)址得到。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該理解,提供的這些序列同一性范圍只是指導性的;完全有可能得到提供超出所述范圍的非常顯著的同系物。
“移植”是指組織、細胞、或器官、或其一部分從一名主體到另一名主體、從一名主體到相同主體的另一個部分、或從一名主體到相同主體的相同部分的轉(zhuǎn)移。供體和接受者可為相同的或不是為相同的基因型。“同種異體移植”或“異種移植”是指從一個個體到另一個個體的移植,其中個體在兩個個體的序列中的一個或多個基因座上具有不同的基因。同種異體移植可以在遺傳學不同的相同種類的兩個個體之間發(fā)生、或在兩個不同種類的個體之間發(fā)生?!白泽w移植”是指組織、細胞、或其一部分從相同個體的一個位置到另一個位置的移植,或組織或其一部分從一個個體到另一個個體的移植,其中兩個個體為遺傳學相同的。
提供以上術(shù)語描述只是用于幫助讀者,不應將其解釋為是小于本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的范圍,或因此將其看作是對權(quán)利要求范圍的限制。
單數(shù)術(shù)語“a”、“an”和“the”包括復數(shù),除非上下文關(guān)系清楚地表明不是這樣。類似地,單詞“或”是指包括“和”,除非上下文清楚地指明不是這樣。單詞“包括”表示“包含”。另外,應該理解,對于化合物的所有的分子量或分子質(zhì)量值為近似值,提供目的在于說明。雖然與本文中所述方法和材料相似或等價的那些可用于本公開的實踐或試驗,適當?shù)姆椒ê筒牧厦枋鋈缦?。另外,材料、方法、和實施例只是示例性的而不是限制性的。所有的化合物都包?+)和(-)立體異構(gòu)體(以及(+)或(-)立體異構(gòu)體)、及其任何互變異構(gòu)體??s寫“mc”表示“微”,因此,“mcM”表示微摩爾,“mcL”表示微升。
使用的化合物可用于本文公開的方法和組合物中的一類4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物的一個例子為2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物,其具有下式表示的代表性結(jié)構(gòu)
式A其中R1和R2各自的存在為非必要的,并且R1和R2各個獨立地選自烷基、取代的烷基、雜烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、取代的雜環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、烷氧基、鹵素、羥基、氨基、或硫基。如果R1和/或R2存在,則在每個各自的環(huán)狀結(jié)構(gòu)上可能有一個或多個R1和/或R2取代基。
可用于本文公開的方法和組合物中的一類4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物的另一個例子為2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物,其具有下式表示的代表性結(jié)構(gòu) 式B其中R1和R2各自的存在為非必要的,并且R1和R2各自獨立地選自烷基、芳基、烷氧基、鹵素、羥基或氨基。如果R1和/或R2存在,則在每個各自的環(huán)狀結(jié)構(gòu)上可能有一個或多個R1和/或R2取代基。
具體的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物的示例性例子為2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮,其具有下式表示的結(jié)構(gòu)
式C2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮二鹽酸鹽可購自Sigma-Aldrich Corporationis,名稱為“LY 303511”。本文中所述的2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物可根據(jù)Vlahos等人,J.Biol.Chem.,2695241-5248,1994中所述的方法合成。2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮的其它鹽的形式可容易地根據(jù)已知技術(shù)合成,如在Handbook of Phazmaceutical Salts,Properties,Selection and Use,WileyVCH(2002)中描述的那些。
本發(fā)明公開的方法包括對主體給藥在藥學相容性載體中的一種或多種本發(fā)明所述的一種或多種化合物、或一種或多種化合物與一種或多種其它藥物的組合。給藥以有效抑制增生性疾病如腫瘤或再狹窄形成、或有效提供免疫抑制的量進行。雖然可以在處于顯著的這種疾病的危險下人口統(tǒng)計群體中的任何患者中進行預防性治療,也可以使用更具體的標準選擇主體,如病況的明確診斷。
在其中藥物進行遞送的介質(zhì)可以包括藥物的可藥用組合物,使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法。可將任何普通的載體如無菌鹽水或葡萄糖溶液與本文公開的藥物一起使用。給藥途徑包括但不限于口服和非腸道途徑,如靜脈內(nèi)(iv)、腹膜內(nèi)(ip)、直腸、局部、眼、鼻、和透皮。
藥物可以現(xiàn)在已知的或以后開發(fā)的適當方式在任何常規(guī)的介質(zhì)(參見以下)中給藥,如口服或靜脈內(nèi)。例如,靜脈內(nèi)注射可通過鹽水介質(zhì)進行。介質(zhì)也可包含常規(guī)的藥用輔劑,諸如例如,可藥用鹽用于調(diào)節(jié)滲透壓力,脂質(zhì)載體如環(huán)糊精、蛋白質(zhì)如血清白蛋白、親水性試劑如甲基纖維素、洗滌劑、緩沖液、防腐劑、表面活性劑、抗氧化劑(如,抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基茴香醚(BHA)、丁基羥基甲苯(BHT)和維生素E)、螯合劑、粘度調(diào)節(jié)劑、口味劑(tonicifiers)、香料、著色劑、調(diào)味劑等。對于非腸道藥用載體的更完全說明可以在RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy(第19版,1995)的第95章中找到。
其它藥用組合物的例子可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)的可藥用載體、助劑和平衡離子制備。優(yōu)選組合物為固體、半固體和液體劑型的單位劑量的形式,如片劑、丸劑、粉末劑、液體溶液或懸浮液。半固體制劑可為任何半固體制劑,包括例如凝膠劑、糊劑、霜劑、和膏劑。液體劑型可包括溶液、懸浮液、脂質(zhì)體制劑、或在有機或含水介質(zhì)中的乳劑。
抑制免疫應答或治療增生性疾病的方法本文提供了抑制主體中的免疫應答的方法,其包括對主體給藥治療有效量的本文公開的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物或其可藥用鹽。在一個具體的非限制性例子中,免疫應答可包括細胞因子的分泌,所述細胞因子例如但不限于白細胞介素(IL)-12、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ、單核細胞趨化蛋白(MCP)-1、IL-10、IL-6。在另一個具體的非限制性例子中,免疫應答包括巨噬細胞活化。
可以將治療有效量的本文公開的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物或其可藥用鹽與另外的免疫抑制劑聯(lián)合給藥。這種給藥可以任何順序同時或連續(xù)進行。免疫抑制劑包括但不限于環(huán)孢素A、FK506、或其類似物;或抗體如特異性地結(jié)合CD3(如OKT3)、CD4、或CD8的單克隆抗體。
在一個例子中,2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物和免疫抑制劑可以在溶液中或在促進這些藥物的遞送和吸收的遞送介質(zhì)如脂質(zhì)體中共同給藥。
在一個實施方案中,本文公開的方法可用于治療移植排斥。移植涉及組織或器官或其一部分從一個身體或身體的一部分到另一個身體或身體的一部分的轉(zhuǎn)移?!巴N異體移植”或“異種移植”為從供體到接受者主體的移植,其中供體和接受者具有在兩個個體的序列中的一個或多個基因座上的不同基因。接受者可能產(chǎn)生對抗供體抗原(包括供體MHC)的免疫應答;因此免疫抑制療法經(jīng)常用于治療移植接受者(如心、肺、或腎移植接受者)。本文公開了用于治療移植排斥的新方法,該方法包括給藥治療有效量的本文公開的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物或其可藥用鹽。在一個實施方案中,治療延長了供體組織的存活或改善了其功能。本文公開的方法還可以用于治療移植物抗宿主病。
本文提供治療增生性疾病的方法,該方法包括對主體給藥治療有效量的本文公開的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物。本文證明了2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物可用于抑制腫瘤細胞的增殖。因此,可對主體給藥治療有效量的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物以治療瘤。腫瘤包括良性腫瘤和惡性腫瘤。腫瘤另外包括血液瘤和實體瘤。示例性的腫瘤為皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)、肺、乳房、生殖器官、胰腺、淋巴樣細胞(包括白血病和淋巴瘤)、血液或淋巴管、和結(jié)腸的腫瘤。腫瘤包括癌、肉瘤、乳頭狀瘤、腺瘤、血癌、淋巴瘤、黑素瘤、和腺癌,以及其它。
可以將治療有效量的本文公開的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物或其可藥用鹽與另外的化療劑聯(lián)合給藥。這種給藥可以任何順序同時或連續(xù)進行?;焺┌ǖ幌抻诨?、抗代謝物和抗體。示例性的化療劑為多柔比星、紫杉醇、雷帕霉素和甲氨蝶呤。
本文另外證明了2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物可用于抑制平滑肌細胞的增殖。因此,可對主體給藥治療有效量的2-(4-哌嗪基)-取代的4H--1-苯并吡喃-4-酮化合物以治療血管再狹窄。
本文公開的治療用化合物可用于治療再狹窄,通過在冠脈或外周動脈血管成形術(shù)或斑塊切除術(shù)、冠脈架橋術(shù)移植體或支架手術(shù)、或外周血管手術(shù)(如,頸動脈或其它外周血管動脈內(nèi)膜切除術(shù)、血管搭橋、支架或假體移植操作)之前、過程中和/或之后將本發(fā)明的化合物對患者給藥。除了本說明書中在別處描述的給藥技術(shù)之外,苯并吡喃-4-酮可通過腔內(nèi)裝置如血管支架或移植體遞送。例如,可對支架或移植體涂布或結(jié)合苯并吡喃-4-酮化合物,用于在感興趣的血管位置控制釋放苯并吡喃-4-酮化合物。這種控制釋放可包括在所需時段內(nèi)持續(xù)地遞送化合物。
對于在本文公開的治療方法中的應用,2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物(和任選的另外的藥物)的給藥可為系統(tǒng)或局部給藥。2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物的局部給藥通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進行。例如,對個體如患有關(guān)節(jié)炎的個體的膝、臀部、和/或肩給藥的一個方法為通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射給藥。為了對膝給藥,例如,將要注射的關(guān)節(jié)用聚維酮碘溶液或其它防腐劑洗滌。將約1%鹽酸利多卡因溶液注射到皮膚和皮下組織中。使用3通旋塞閥/針頭組件,通過18-30號針頭給藥化合物。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標準旁側(cè)方法(lateral approach)將2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物局部注射到關(guān)節(jié)間隙中。隨著將針頭抽出,通過3通旋塞閥組件用1%鹽酸利多卡因清洗凈化針頭和針管道。然后使膝移動通過彎曲-伸展弧,然后以完全伸展方式被固定。然后患者臥床約24小時,使移動最小化和活性劑從關(guān)節(jié)的滲漏最小化。
在其它實施方案中,2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物的給藥為系統(tǒng)給藥??紤]了口服、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、和甚至直腸的給藥。
使用的藥理學組合物可以常規(guī)方式使用一種或多種藥理學(如,生理學或藥學)可接受的載體進行配制,包括可藥用的賦形劑以及促進將活性化合物加工為制劑的非必要助劑。適當?shù)闹苿└鶕?jù)選擇的給藥途徑而定。另外,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地選擇適當?shù)慕o藥途徑,包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)粘膜、皮下、透皮、經(jīng)鼻、吸入、和口服給藥。
因此,對于注射劑,可將活性組分配制為水溶液,優(yōu)選在生理學相容性緩沖液中。對于經(jīng)粘膜給藥,在制劑中使用適合于滲透屏障的滲透劑。這種滲透劑通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。對于口服給藥,可將活性組分與適合包括在片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠劑、糖漿劑、淤漿劑、懸浮液等中的載體組合。2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物也可被配制為用于吸入療法,例如治療患有肺炎癥的主體。對于通過吸入給藥,使用適當?shù)耐七M劑,可將存在于加壓包裝或霧化器中的活性組分方便地以氣霧劑噴射的形式遞送。
2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物可被配制為用于通過注射進行非腸道給藥,如通過彈丸注射或連續(xù)輸注。類似地,2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物可被配制為用于氣管內(nèi)給藥或用于吸入。這種組合物可為如懸浮液、溶液、或在油性或水性介質(zhì)中的乳劑形式,并且可以包含制劑用助劑如助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。其它藥理學賦形劑為本領(lǐng)域中所公知。
本發(fā)明所述化合物的治療有效劑量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員測定,目的是實現(xiàn)抗再狹窄、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤或抗免疫抑制所需的水平。化合物的相對毒性使得其可能以多種劑量范圍進行給藥。在一個例子中,化合物以單獨的或分開的劑量進行口服給藥。
對于任何特定主體的特定劑量水平和劑量頻率可能不同,并且根據(jù)多種因素而定,所述的多種因素包括特定化合物的活性、所患疾病的活性程度、年齡、體重、一般健康狀態(tài)、性別、膳食、給藥方式和時間、排泄速率、藥物組合、和經(jīng)歷治療的主體的病況的嚴重程度。
篩選本文提供用于選擇免疫抑制劑或抗增生劑的方法。該方法包括選擇試驗劑,與抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)依賴性的底物磷酸化相比,該試驗劑優(yōu)先抑制MTOR-依賴性的P70S6激酶磷酸化,從而鑒定藥學有用的免疫抑制劑或抗增生劑。在一個實施方案中,藥物還抑制一種或多種另外的激酶。例如,藥物可以抑制酪蛋白激酶2,酪蛋白激酶2為細胞增殖的調(diào)節(jié)劑。因此,該方法包括選擇試驗劑,與抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)依賴性的底物磷酸化相比,該試驗劑優(yōu)先抑制mTOR-依賴性的P70S6激酶、酪蛋白激酶2、或兩者的磷酸化,從而鑒定藥學有用的免疫抑制劑或抗增生劑。該試驗可以在細胞或細胞提取物中進行。
試驗化合物可為感興趣的任何化合物,包括化合物、小分子、多肽、或其它生物制劑(例如抗體或細胞因子)。在幾個例子中,篩選一組可能的化療劑、或一組可能的免疫抑制劑。在其它實施方案中,篩選一組多肽變體。
在使用細胞的試驗中,使細胞接觸試驗化合物。在一些實施方案中,將細胞與試驗化合物培養(yǎng)足夠的時間,從而通過PI3K實現(xiàn)底物磷酸化和抑制細胞中P70S6激酶磷酸化。將細胞胞溶并測量磷酸化P70S6激酶的量和被PI3K磷酸化的底物的量。將存在于細胞中的磷酸化P70S6激酶的量和磷酸化底物的量與沒有暴露于試驗化合物下的相同細胞進行比較。
在一些實施方案中,將蛋白質(zhì)印跡技術(shù)用于通過電泳分離的細胞蛋白質(zhì)并且使用結(jié)合于P70S6激酶、磷酸化p70S6激酶的抗體,和/或特異性地結(jié)合底物(如磷酸化S6)的抗體?;蛘撸蓪⒓毎诎派湫酝凰貥擞浀牧椎恼姿猁}的存在下培養(yǎng),并檢測磷酸化或未磷酸化的底物(如P70S6激酶)。
在一些實施方案中,在體外在37℃下在5%CO2的濕潤氣氛中將細胞用試驗化合物處理。在用試驗化合物處理之后,細胞用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗,并且如(Haldar等人,Cell Death Diff.,1109-115,1994;Haldar等人,Nature,342195-198,1989;Haldar等人,Cancer Res.,542095-2097,1994)中所述提取總蛋白質(zhì)。在另外的實施方案中,使用一系列稀釋的試驗化合物。
在一些實施方案中,使用蛋白質(zhì)印跡法和免疫檢測分析磷酸化作用,所述蛋白質(zhì)印跡法和免疫檢測使用Amersham ECL進行,AmershamECL是增強的化學發(fā)光檢測系統(tǒng)和公知方法。在一個例子中,在試驗化合物的存在下使用1mCi/ml的[p32]正磷酸(NEN)在無磷酸鹽的培養(yǎng)基(GIBCO)中進行淋巴樣細胞磷酸化6小時。p32標記的細胞提取物的免疫沉淀反應可以如例如Haldar等人,Nature,342195-198,1998中所述進行。該免疫沉淀反應采用結(jié)合感興趣的底物如P70S6激酶、酪蛋白激酶2底物(如p53、Bid、DNA拓撲異構(gòu)酶II)、或PI3K底物(如磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇4-磷酸、磷脂酰肌醇4,5-磷酸)的抗體。將免疫復合物在0.75mm厚的10%SDS-PAGE上運行。隨后,將凝膠干燥并暴露以進行自動射線照相。
如本領(lǐng)域中已知的方式進行磷酸-氨基酸分析。例如,分析可以基本上以Hunter薄層電泳系統(tǒng),HTLE700,(CBS Scientific Company Inc.,USA)操作手冊中所述方式進行。簡而言之,將p32標記的免疫沉淀物在10%SDS-PAGE凝膠上運行。從凝膠中切取所感興趣的免疫活性譜帶并用50μM的碳酸氫銨洗脫。在洗脫之后,在15%-20%TCA+載體蛋白的存在下使蛋白質(zhì)沉淀,并用乙醇洗。然后在過甲酸中將沉淀的蛋白質(zhì)氧化,并凍干。將干燥的小球再次懸浮在恒沸的HCl中,在110℃加熱,并凍干。將殘余物再次懸浮在包含磷酸-氨基酸標準的pH為1.9的緩沖液(50mcl的甲酸、156mcl的乙酸、1794mcl的H2O)中,并點樣在PEI纖維素板上。進行二維薄層色譜法,使用pH為1.9的緩沖液進行第一維色譜法,使用pH為3.5的緩沖液(100ml的乙酸、10ml的吡啶、1890ml的H2O)用于第二維色譜法。將板在65℃烘烤10分鐘,并通過對冷卻的板噴射0.25%茚三酮并將板送回到65℃烘箱中15分鐘使標準顯像。然后使板暴露于膠片下兩到四周,使用Kodak X-omat AR膠片。
在一些實施方案中,使用細胞提取物作為起始原料分析磷酸化的調(diào)節(jié)。將試驗化合物與細胞提取物合并,并檢查化合物對P70S6激酶磷酸化和對磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-依賴性磷酸化的作用。在一個例子中,將細胞提取物接觸試驗化合物,以鑒定在32P-γ-ATP的存在下試驗化合物對P70 S6激酶磷酸化的作用,或鑒定試驗化合物對bcl-2磷酸化的作用。
在示例性的方案中,使用100μg的總細胞提取物與特定濃度的試驗化合物在體外在37℃下處理細胞提取物。對于磷酸酶反應,將50μl的細胞溶胞產(chǎn)物接觸試驗化合物并將反應混合物在37℃培養(yǎng)30-60分鐘。
對于細胞提取物的磷酸化,將100μg的細胞提取物如上所述進行處理,只是向各個反應中中加入40μci的[32P]ATP(3000Ci/mmol)。通過將試管浸漬在冰中使反應終止。通過使用交聯(lián)劑二甲基庚二酸亞胺酯(dimethylpimelimidate)二鹽酸化物(50mM)將純抗體共價結(jié)合于蛋白質(zhì)-A瓊脂糖凝膠上,而將[32P]ATP標記的反應混合物吸收在由對抗P70S6激酶或PI3K底物的單克隆抗體制成的免疫親和柱上。用包含0.5%去氧膽酸鈉的0.05M二乙胺(pH 11.5)洗脫特異性結(jié)合的[32P]-標記蛋白質(zhì)。
在示例性的方法中,使用Amersham ECL檢測系統(tǒng)和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進行蛋白質(zhì)印跡法的免疫檢測??梢匀缋鏗aldar等人,Nature,342195-198,1989中所述進行p32標記的細胞提取物的免疫沉淀反應。將免疫復合物在0.75mm厚的10%SDS-PAGE上運行。隨后,將凝膠干燥并暴露以進行自動射線照相,使用膠片如Kodak XAR膠片的膠片。
例如,磷酸-氨基酸分析可以基本上如Hunter薄層電泳系統(tǒng),HTLE700,(CBS Scientific Company Inc.,USA)操作手冊中所述方式進行。在示例性的方法中,將p32標記的免疫沉淀物在10%SDS-PAGE凝膠上運行。從凝膠上切取P70S6激酶免疫活性譜帶并用50μM的碳酸氫銨洗脫。在洗脫之后,在15%-20%TCA+載體蛋白的存在下使蛋白質(zhì)沉淀,并用乙醇洗。然后在過甲酸中將沉淀的蛋白質(zhì)氧化,并凍干。將干燥的小球再次懸浮在恒沸的HCl中,在110℃加熱并凍干。將殘余物再次懸浮在包含磷酸-氨基酸標準的pH為1.9的緩沖液(50mcl的甲酸、156mcl的乙酸、1794mcl的H2O)中,并點樣在PEI纖維素板上。進行二維薄層色譜法,使用pH為1.9的緩沖液進行第一維色譜法,使用pH為3.5的緩沖液(100ml的乙酸、10ml的吡啶、1890ml的H2O)用于第二維色譜法。將板在65℃烘烤10分鐘,通過對冷卻的板噴射0.25%茚三酮并將板送回到65℃的烘箱中15分鐘而使標準顯像。然后將板暴露于膠片下。
酪蛋白激酶2活性的一個特異性試驗是購自UpstateBiotechnology(New York)的試劑盒。該試驗基于在30℃培養(yǎng)10分鐘的過程中由酪蛋白激酶2轉(zhuǎn)移32P-ATP的γ-磷酸的特異性底物(CK-2底物肽)的磷酸化。然后使用P81磷酸纖維素紙將磷酸化的底物與殘留的32P-ATP分離,并通過閃爍計數(shù)定量。
實施例雷帕霉素通過阻斷P70S6激酶的mTOR-依賴性調(diào)節(jié)而抑制癌癥和平滑肌細胞增殖。雷帕霉素由FDA批準用于治療移植排斥(免疫抑制作用和抗炎)、癌癥、和冠脈血管成形術(shù)后的血管再狹窄。然而,雷帕霉素的應用具有幾個缺點和副作用,并且期望鑒定mTOR依賴性信號的其它藥理學抑制劑。
與LY294002一樣,LY303511抑制mTOR和酪蛋白激酶2。與LY294002不同,LY303511不能顯著地抑制PI3K,PI3K為控制細胞死亡、胞質(zhì)分裂、和葡萄糖/脂類代謝中重要的信號酶。渥曼青霉素對PI3K有選擇性。本文公開的實施例使用LY303511作為示例性的4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物。結(jié)果證明,LY303511可用于抑制免疫應答和用于抑制細胞(包括平滑肌細胞和腫瘤細胞)的增殖。LY303511有可能在不同于雷帕霉素結(jié)合中所牽涉的位置上選擇性地抑制mTOR,而對PI3K的作用較小。LY303511可單獨使用、或與雷帕霉素或其它藥物組合,用于控制細胞增殖和免疫應答。
實施例1LY303511抑制細胞增殖這個實施例證明,LY303511阻斷P70S6激酶磷酸化和人肺上皮腺癌(A549)細胞的細胞增殖。LY303511與LY294002的不同之處在于用胺代替嗎啉基中的氧(圖1A)。
將A549細胞在沒有或有100mcM LY303511、200ng/ml雷帕霉素、或50nM渥曼青霉素的無血清培養(yǎng)基中處理1小時,然后加入大腸桿菌脂多糖(LPS)(1000mcg/ml)和干擾素(IFN)-γ(100U/ml)(LPS/IFN-y或“L/I”)。將細胞勻質(zhì)化并通過蛋白質(zhì)印跡檢測所示的蛋白質(zhì)(參見表1)。蛋白質(zhì)印跡得自相同的實驗,為三個實驗的代表。
表1抗體的描述
結(jié)果證明,LY303511阻斷P70S6激酶磷酸化(圖1B)。渥曼青霉素和雷帕霉素也阻斷磷酸化。結(jié)果證明,LY303511和雷帕霉素增加AKT的磷酸化(圖1B)。渥曼青霉素阻斷PI3K并且抑制pAKT磷酸化。因此,LY303511抑制S6的mTOR敏感性磷酸化,而不是AKT的(圖1C)。這些結(jié)果表明,LY303511為mTOR抑制劑。結(jié)果還證明,LY303511以濃度依賴性方式抑制mTOR的自磷酸化(圖1D)。與雷帕霉素不同,LY303511對S6K或mTOR的基礎(chǔ)磷酸化有極小的作用(圖1B、1D)。因此,LY303511在低至1μM的濃度下以獨立于PI3K的方式抑制LPS/IFN-γ刺激的mTOR活化和S6K的mTOR-依賴性磷酸化。
在另一個實驗中,將A549細胞以每孔4,000個細胞鋪板在96孔板上并用沒有或有所示藥理學抑制劑的溴脫氧尿苷處理24小時。通過原地ELISA(BrdU檢測試劑盒,Roche)測量溴脫氧尿苷(BrdU)吸收,作為DNA合成和細胞增殖的指示劑。
另外,使A549細胞(每孔80,000個細胞)生長24小時,然后加入抑制劑(圖2A)。在24小時之后,使用血細胞計數(shù)器計數(shù)用錐蟲藍染色的細胞。在所有條件下細胞存活率>99%(數(shù)據(jù)未表示)。在暴露于單獨介質(zhì)下的細胞中,在24小時內(nèi),細胞數(shù)增加~50%。雷帕霉素輕微地減弱細胞增殖,而LY303511具有顯著的抑制作用,幾乎等于LY294002的抑制作用。與LY303511和LY294002的獨立于PI3K的作用一致,渥曼青霉素未顯著減少A549細胞增殖。通過碘化丙啶染色細胞的流式細胞計分析測定,LY303511沒有誘導細胞程序死亡或壞死。
根據(jù)溴脫氧尿苷(BrDu)吸收所確定的,LY303511以及LY303511與雷帕霉素的組合抑制A549細胞的增殖(圖2B)。盡管雷帕霉素對DNA合成具有弱的但是統(tǒng)計學顯著的作用,LY303511的給藥引起濃度依賴性的減少(圖2B)。當LY303511與雷帕霉素組合時,沒有另外的作用。單獨的DMSO對于A549細胞增殖沒有作用。
在另一個實驗中,使A549細胞在含血清的培養(yǎng)基中生長到亞匯合和并與培養(yǎng)基、100mcM的LY303511、或雷帕霉素200ng/ml培養(yǎng)0、12、或24小時。將細胞胞溶并通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì),然后轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。將膜與對抗p27Kipl、p21 Cipl、或磷酸-P70S6激酶T389培養(yǎng)。
在處理之后的12和24小時,LY303511和雷帕霉素在T389阻斷P70 S6激酶磷酸化,與mTOR激酶活性的抑制一致(圖3A)。LY303511而不是雷帕霉素引起細胞周期停滯標識物p27Kipl、和p21 Cipl的積聚。p27 Kipl(p27)水平的LY303511依賴性增加表明類似于雷帕霉素的G1/S過渡抑制劑的作用(圖3A)。然而,與雷帕霉素相比,LY303511引起S期晚期進展的抑制劑p21 Cipl(p21)的顯著增加。LY303511而不是雷帕霉素降低細胞周期蛋白A和B的水平,它們也是S和G2/M期進展的調(diào)節(jié)劑(圖3B)。LY303511還降低Rb磷酸化,這表明細胞周期抑制的機理部分是由于E2F-依賴性基因的抑制所致。這些結(jié)果支持了LY303511-敏感性激酶在除了在G1/S過渡中之外,還在S晚期和G2/M進展中的作用。
為了證實LY303511引起G1抑制,將A549細胞用0、10、或100mcM的LY303511處理24小時,固定,并與對抗KI-67的抗體培養(yǎng)。將載波片裝在包含DAPI以染色細胞核的溶液中。使用相等的激光強度抓拍照片并放大。用LY303511而不是雷帕霉素的處理在全部細胞中引起KI-67水平的顯著降低,其也與在細胞增殖中的阻斷一致。
結(jié)果證明,LY303511在作為mTOR依賴性P70S6激酶活化的標識物的蘇氨酸(T)389(T389)處抑制P70S6激酶的基礎(chǔ)磷酸化和刺激磷酸化。另外,LY303511沒有在473位絲氨酸(S)(S473)抑制AKT的PI3K依賴性磷酸化。與雷帕霉素相似,LY303511增加AKT磷酸化。另外,LY303511在作為mTOR激酶活性標識物的2481位絲氨酸(S2481)抑制mTOR的基礎(chǔ)磷酸化和刺激磷酸化。LY303511還抑制A549細胞的增殖。該作用在使用雷帕霉素與10到100mcM劑量的LY303511時是相加的。因此,LY303511、或LY303511與雷帕霉素的組合可用于抑制腺癌細胞的生長。結(jié)果進一步證明誘導了細胞周期停滯。
實施例2LY303511抑制炎癥過程的活化這個實施例證明,LY303511抑制A549細胞中的P70S6激酶磷酸化和STAT1響應LPS和IFN-γ的活化。
將A549細胞用表達由STAT1(GAS-1uc,Clontech)驅(qū)動的熒光蟲熒光素酶的報道基因載體瞬時轉(zhuǎn)染并在沒有或有100mcM的LY303511、雷帕霉素200ng/ml、或兩者的情況下培養(yǎng)1小時,然后加入LPS/IFN-γ,維持6小時。在細胞溶胞產(chǎn)物(RLU)中測量STAT1舌性(熒光素酶活性)。圖8中的數(shù)據(jù)為一式三份樣品±SEM,并且為兩個獨立實驗的代表。LY303511通過兩種炎癥遞質(zhì)LPS/IFN-γ抑制STAT1舌化。
與轉(zhuǎn)錄因子STAT1的抑制一致,LY303511通過用LPS刺激的巨噬細胞降低由LPS誘導的細胞因子產(chǎn)生(參見實施例8)。
實施例3LY303511抑制平滑肌細胞中P70S6激酶磷酸化這個實施例證明,LY303511抑制初級人肺動脈平滑肌(HPASM)細胞中P70S6激酶磷酸化。
HPASM細胞購自Clonetics并且根據(jù)生產(chǎn)商的說明書傳代。將細胞在100mm皿中鋪板,并使其生長到接近匯合,然后血清饑餓24小時。向介質(zhì)中加入抑制劑,在1小時之后加入10%FBS,維持30分鐘。將細胞勻質(zhì)化并通過蛋白質(zhì)印跡檢測所示的蛋白質(zhì)。
LY303511抑制人肺動脈平滑肌(PASM)細胞中P70S6激酶的基礎(chǔ)磷酸化和血清刺激的磷酸化(圖4A和4B)。LY303511還抑制AKT的磷酸化,雖然比p70S6激酶的磷酸化程度更低(圖4B)。LY303511還抑制在作為mTOR激酶活性的標識物的S2481處的血清刺激的mTOR磷酸化。
在與血清培養(yǎng)并且之后加入抑制劑的PASM細胞中,雷帕霉素對增殖有很小的作用,而LY303511以濃度依賴性方式抑制(圖4C)。在沒有或有LY303511的情況下,雷帕霉素對增殖(BrDu結(jié)合)的作用當將PASM細胞在無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時然后加入FBS時得到增強(圖4D)。在沒有血清存在下,LY303511對PASM細胞增殖的作用得到增強,如同雷帕霉素一樣。10μM LY303511和雷帕霉素200ng/ml對增殖的作用相對于單獨的10μM LY303511是相加的(p<0.05,圖4C、D)。雖然Akt磷酸化作用被LY303511抑制(圖4B),渥曼青霉素沒有抑制細胞增殖,表明LY303511的這種作用與PI3K無關(guān)。
雷帕霉素和LY303511在PASM中對細胞周期的作用不如在A549細胞中的顯著(圖5A)。與雷帕霉素或無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)引起G1抑制。相比之下,LY303511通過增加G1和G2/M期的分數(shù)而降低處于S期的細胞比例。雷帕霉素+LY303511對S期細胞減少的作用是相加的。然而,響應LY303511的G1平滑肌細胞的增加是微不足道的,表明LY303511在癌細胞中比在初級細胞中作用更大。
因此,LY303511、或LY303511與雷帕霉素的組合可用于抑制初級平滑肌細胞的生長。結(jié)果進一步表明LY303511可用于誘導這些細胞的細胞周期停滯。
實施例4LY303511通過引起組合的G1和G2抑制而抑制細胞周期為了研究LY303511對細胞周期的作用,使A549細胞或肺動脈平滑肌細胞在含血清的培養(yǎng)基中生長到亞匯合,并在沒有或有雷帕霉素(200ng/ml)的情況下與介質(zhì)、10、或100mcM LY303511培養(yǎng)24小時。然后收獲細胞并用碘化丙啶染色,然后通過流式細胞計分析細胞周期。測定在每種試驗條件下處于細胞周期的G1、S、或G2/M期的細胞比例。通過碘化丙啶染色的強度門控細胞,以測定處于細胞周期的G1、S、或G2/M期中的細胞比例。與對DNA合成的作用一致,100μM的LY303511顯著地降低S期的細胞分數(shù)(圖2C)。處于G2/M期中的細胞的比例保持不變,表明細胞在G1和G2/M都受到抑制。相比之下,雷帕霉素通過降低處于S和G2/M期中的細胞比例而增加G1群。10μMLY303511和雷帕霉素對減少S期細胞的作用相對于單獨的10μMLY303511是相加的(P=0.056,圖2C)。通過向雷帕霉素中加入LY303511產(chǎn)生的S期細胞的更大減少而G2/M沒有進一步的減少表明LY303511通過另外的不同于雷帕霉素的機制阻斷細胞周期。
結(jié)果證明,LY303511在轉(zhuǎn)化細胞和肺動脈平滑肌細胞中都引起細胞周期停滯。因為,與雷帕霉素不同,LY303511引起G2/M期中的細胞增加,該結(jié)果還暗示出,將有用于LY303511的另外的mTOR非依賴性細胞靶(如,酪蛋白激酶2)。
實施例5LY303511抑制酪蛋白激酶2(CK2)活性已經(jīng)進行了微陣列基因表達分析,其中將A549細胞在沒有或有LY294002、或渥曼青霉素的情況下培養(yǎng)1小時,然后加入L/I,維持6小時。通過細胞反饋機制,在該藥物的存在下,被藥理學藥物直接抑制的mRNA編碼蛋白質(zhì)的水平可能增加。為了鑒定用于LY294002的另外的PI3K非依賴性激酶靶,通過過濾和統(tǒng)計學分析,從數(shù)據(jù)集鑒定被LY294002而不是被渥曼青霉素增加的mRNA。不出所料,在LY294002的存在下,mTOR mRNA的水平增加(1.7倍),,而不是被渥曼青霉素增加。被LY294002增加的其它激酶的mRNAs包括編碼CK2α′的那些(1.8倍;GenBank登錄號55268)。因為CK2可以調(diào)節(jié)G1和G2/M細胞周期過渡,評價了LY294002和LY303511對CK2活性的作用。
使用酪蛋白激酶2活性試劑盒(Upstate Biotechnology,產(chǎn)品編號17-132)測量酪蛋白激酶2(CK2)活性(每分鐘計數(shù)),通過將在50mcl試驗緩沖液中的重組100ng CK2、鎂/ATP雞尾酒(10mcCi32P-γ-ATP、0.675微摩爾的MgCl2、4.5nmoles的ATP)和10微摩爾的肽底物(氨基酸序列RRRDDDSDDD(SEQ ID NO1)在沒有或有所示濃度的DMSO(1%)、LY294002、LY303511、或雷帕霉素存在下在30℃培養(yǎng)10分鐘。用20mcl的40%三氯乙酸終止試驗,并將25mcl點樣在P81磷酸纖維素方格紙上,然后用0.75%磷酸洗滌3次,并且用丙酮洗滌一次。通過使用Packard 100Tri-Carb液體閃爍計數(shù)器在5ml閃爍流體中計數(shù)磷酸纖維素方格而檢測底物肽上的32P結(jié)合。
重組CK2與LY303511或LY294002的培養(yǎng)引起濃度依賴性抑制CK2活性(圖5B)。LY294002的近似IC50(10μM)為LY303511的十分之一。渥曼青霉素和雷帕霉素都不影響CK2活性。因為已知CK2調(diào)節(jié)完整細胞中的G1和G2進展,CK2代表了用于LY303511的另外的激酶靶。因此,LY303511以10到100mcM的IC50抑制酪蛋白激酶2。與抑制PI3K相比,LY303511優(yōu)先抑制P70S6激酶和酪蛋白激酶2。
LY303511和LY294002在體內(nèi)抑制CK2的能力提出了第二種mTOR非依賴性和PI3K非依賴性機制,這些抑制劑可通過這種機制阻斷細胞增殖。這些結(jié)果確立了可用于治療腫瘤疾病的新的一族化合物。
LY303511和LY294002阻斷CK2活性的發(fā)現(xiàn)提出了用于這類藥物的新的替代靶,并且與用于抑制細胞增殖和細胞周期調(diào)節(jié)的mTOR非依賴性機制一致。CK2為普遍存在的并且是細胞生存需要的高度保守性絲氨酸-蘇氨酸激酶。通常,腫瘤細胞表現(xiàn)出高水平的CK2活性,CK2過量產(chǎn)生能夠在缺乏p53的小鼠中誘導腫瘤發(fā)生。CK2通過直接磷酸化蛋白質(zhì)如p53、只含BH3的促凋亡蛋白(BID)、β-連環(huán)蛋白、或Fas相關(guān)因子(FAF1)而保護細胞免于細胞程序死亡。另外,CK2通過G0/G1、G1/S、和G2/M關(guān)卡調(diào)節(jié)進展。LY303511誘導的細胞周期蛋白A和B水平降低、以及p21和p27水平增加(圖3)與CK2依賴性的細胞周期阻斷一致。LY303511對增殖和細胞周期的相加作用表明,除了抑制S6K的mTOR磷酸化之外,LY303511可以通過抑制不同于S6K的途徑如CK2而克服對雷帕霉素的耐受性。
mTOR和PI3K屬于蛋白質(zhì)的磷脂酰肌醇3-和4-激酶家族(interpro家族PI3 PI4激酶,編號IPR000403,參見可得自國際互聯(lián)網(wǎng)的InterPro數(shù)據(jù)庫)。這個家族包括具有用于PI3K結(jié)構(gòu)域的特異性特征序列的247個蛋白質(zhì)。LY294002抑制PI3K和mTOR,而其它類似物(如LY303511)可以優(yōu)先抑制這個家族中的亞型激酶。已知mTOR中PI3K催化域與PI3K之間的結(jié)構(gòu)同源性,LY303511還可以抑制具有PI3K樣結(jié)構(gòu)域的其它激酶,這些包括以下
實施例6磷酸化抑制的IC50的測定在A549細胞中,通過pS6K熒光印記(phosphoblots)的光密度分析,LY303511介導的在受刺激細胞中S6K磷酸化抑制的IC50為約10mcM。當A549細胞接觸藥物時,LY303511不抑制Akt的磷酸化,即使在100mcM下。在肺動脈平滑肌細胞中,通過光密度測定法,LY303511介導的S6K磷酸化抑制的IC50為約1mcM。通過光密度測定法,LY303511介導的Akt磷酸化抑制的IC50為10到100mcM(參見圖8A-D)。
實施例7LY303511單獨、或LY303511與多柔比星的組合在體內(nèi)模型系統(tǒng)中對前列腺癌的作用對雄性成年裸鼠喂養(yǎng)標準飲食并圈養(yǎng)在普通籠子中。每個試驗組包括五只小鼠,總共100只小鼠。為每只小鼠皮下接種在包含20%matrigel的PBS中的1×106細胞PC-3(前列腺癌)細胞。在腫瘤達到~200mm3大小之后,每天給藥介質(zhì)(0.2%DMSO或鹽水)或藥物一次,持續(xù)5天,并且每2天測量腫瘤體積,持續(xù)33天,然后處死或通過二氧化碳吸入無痛處死小鼠。
如下為每個試驗組分配五只小鼠
多柔比星或介質(zhì)只在第一天給藥。雷帕霉素或LY303511每天給藥,如前所述在第1-5天腹膜內(nèi)給藥(參見Grunwald等人,Cancer Res 626141,2002)。給藥方案在藥物治療開始之后的33天結(jié)束。在無痛處死或處死小鼠之后,切除腫瘤用于組織學分析、免疫組織化學、和蛋白質(zhì)印跡法。
體內(nèi)評價LY303511對腫瘤生長的作用。將人前列腺腺癌細胞(PC-3細胞,ATCC No.CTL-1435)體外培養(yǎng),然后收獲并植入。對于每只小鼠,通過皮下注射到側(cè)腹中植入在MatrigelTM(基質(zhì))中的1×106細胞。將小鼠再分成六個組,每組十只。在腫瘤達到約150mm3時開始治療方案(第1天),在所示時間點測量腫瘤體積(=卡尺長度×寬度2/2),維持三十天。對于每個試驗組和時間點,數(shù)據(jù)表示為平均腫瘤體積+/-SEM。數(shù)據(jù)表示在圖6A和6B中。(在每個時間點進行組間比較,通過單向ANOVA,*p<0.05)。圖6C為Kaplan-meier分析,表示在任何給定時間點腫瘤體積小于300mm3的概率(組間比較,通過對數(shù)-秩檢驗,p<0.001)。
為每個組指派以下處理
LY303511抑制裸鼠中前列腺腺癌細胞(PC-3)細胞的生長。腹膜內(nèi)給藥10mg/kg的LY303511用于減弱裸鼠中PC-3腫瘤生長。生長抑制程度與治療持續(xù)時間成正比。LY303511(LY3)的20天療程與十天療程同樣有效抑制腫瘤生長(參見圖6C)。在21天之后,超過15%的小鼠因為過度腫瘤生長需要無痛處死,并且平均腫瘤體積測量變得太易變。
結(jié)果證明,LY303511、或LY303511與多柔比星的組合降低腫瘤負荷(圖6A和6B)。因此,LY303511和/或與另外的化療劑組合的LY303511可用于治療增生性疾病,如癌癥。LY303511也可以與雷帕霉素組合用于腫瘤治療。
實施例8LY303511用于抑制免疫應答的應用包括多發(fā)性硬化(MS)、類風濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、自身免疫葡萄膜炎、移植排斥、慢性鈹塵病和移植物抗宿主病的多種人類疾病的發(fā)病機理看起來是由T細胞介導的免疫應答。本文公開的化合物可用于治療這些疾病。
表2人類自身免疫疾病的例子
有幾個基于動物的自身免疫模型可用于試驗本文公開的化合物用于治療自身免疫疾病的應用。表2列舉了可使用肽/MHC絡合物治療的幾種示例性的免疫介導疾病。例如,非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠模型為其中動物隨年齡增加而發(fā)生糖尿病的動物模型系統(tǒng)。為了試驗具體化合物的效力,將糖尿病前期的動物組(最大為4周)用例如LY303511、或LY303511與另外的免疫抑制劑的組合處理。然后分析發(fā)生糖尿病的動物數(shù)、和動物發(fā)生糖尿病的速率。類似地,在Hashimoto小鼠模型系統(tǒng)中,為了試驗疫苗的效力,將發(fā)生癥狀之前的動物組用例如LY303511、或LY303511與另外的免疫抑制劑的組合處理。然后分析發(fā)生該疾病的動物數(shù)、和動物發(fā)生該疾病的速率。
在NOD模型或在Hashimoto模型、或在任何其它模型系統(tǒng)中,與未經(jīng)處理的動物相比,LY303511、或LY303511與另外的免疫抑制劑的組合延遲疾病的進展,或提供免于發(fā)生該疾病的保護。
為了證明LY303511對免疫應答的作用,使用得自Jackson(Jac)和Taconic(Tac)的野生型小鼠。在巰基乙醇酸酯注射三天之后收獲腹膜巨噬細胞。將細胞在2%FCS RPMI中培養(yǎng)三天。在用有或者沒有LY303511(1~100μM)或DMSO的LPS 1μg/ml刺激24小時之后收集上清液。測量細胞上清液中的細胞因子(白細胞介素(IL)-12p70、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)γ、單核細胞趨化蛋白(MCP)-1、IL-10、IL-6)。結(jié)果證明,LY303511在所有六種細胞因子中引起劑量依賴性降低(參見圖7A-F)。加入100μM的LY303511引起與背景水平相似的細胞因子分泌。因此,顯而易見,LY303511可以減少細胞因子表達,并且具有抗炎作用。
實施例9材料和方法以下提供用于上述實施例的材料和方法的概要;提供這個部分用于與單個章節(jié)中的信息合并。
細胞培養(yǎng)物A549細胞(CCL 185,American Type CultureCollection(ATCC);Manassas,VA),為人類肺泡II型上皮細胞樣肺腺癌細胞系,在37℃下在5%CO2下在補充有10%胎牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺、青霉素(100單位/ml)、和鏈霉素(100μg/ml)的Ham′s F-12K培養(yǎng)基中生長,上述都得自Biofluids(Rockville,MD)。根據(jù)生產(chǎn)商的指導說明使人肺動脈平滑肌(PASM)細胞(Cambrex;Rockland,ME)在37℃下在5%CO2下在補充有5%FBS、胰島素、成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、和慶大霉素/兩性霉素B的SMG2培養(yǎng)基中生長。
藥理學抑制劑和抗體LY303511、雷帕霉素、LY294002、和渥曼青霉素購自Biomol(Plymouth,PA)或Calbiochem(San Diego,CA)并溶解于DMSO中。對抗磷酸-S6K T389、磷酸-Akt S473、磷酸-mTOR S2481、磷酸-Rb S807/S811、S6K、和Akt的抗體購自Cell SignalingTechnologies(Beverly,MA)。對抗mTOR(RAFT1)、細胞周期蛋白A、細胞周期蛋白B、細胞周期蛋白D、細胞周期蛋白E、p27 Kip1、和p21Cip1的單克隆抗體購自BD Transduction Laboratories(San Diego,CA)。
蛋白質(zhì)磷酸化的測量將A549細胞在沒有或有抑制劑的無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)1小時,如所示的,然后與LPS,100μg/ml(Sigma;St.Louis,MO)和IFN-γ,100U/ml(Roche;Nutley,NJ)的混合物培養(yǎng)30分鐘。將PASM細胞在沒有或有抑制劑的無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時,如所示的,然后與10%FBS培養(yǎng)30分鐘。將A549或PASM細胞用冷的PBS洗滌一次并在溶胞緩沖液(20mM的Tris,pH 8.0、1%的Nonidet P-40、1mM的EDTA、5mM的芐脒、抑肽酶10μg/ml、亮肽素10μg/ml、胰蛋白酶大豆抑制劑、1mM的PMSF、50mM的氟化鈉、100μM的原釩酸鈉、和1∶100的Sigma磷酸酶抑制劑組合I,包含斑蝥素、微囊藻素LR和bromotetramizole)中在冰上培養(yǎng)15分鐘。在凍融之后,將溶胞產(chǎn)物在16,000xg離心30分鐘,然后測量蛋白質(zhì)并儲存在-80℃。通過SDS-PAGE分離總蛋白質(zhì)的等份并將其轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上,然后如所示進行初級抗體的免疫印跡法。將膜用連接于辣根過氧化酶的抗兔IgG或抗小鼠IgG抗體(Promega;Madison,WI)處理,使用增強的化學發(fā)光檢測試劑盒(SuperSignal West Pico,Pierce;Rockford,IL)展開,并暴露于X線膠片下,膠片使用Epson Expression 636掃描器掃描。使用Scion Imageβ 3b軟件定量積分譜帶密度。
細胞增殖的測量使用原地5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(BrDU)檢測試劑盒,根據(jù)生產(chǎn)商的指導說明(Roche Diagnostics;Nutley,NJ)評價細胞增殖或DNA合成。簡而言之,將A549或PASM細胞(4,000/孔)接種在96孔板中并在血清的存在下生長24小時。在沒有或有所示抑制劑的存在下加入10mM BrDU,維持24小時。在一些實驗中,將PASM細胞在無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)另外的24小時,然后加入BrDU和抑制劑。將細胞固定并使用過氧化物酶結(jié)合的抗BrDU抗體檢測BrDU。將在用抑制劑處理的細胞中測量的吸光度數(shù)據(jù)相對于用DMSO對照處理的那些數(shù)據(jù)歸一化(%對照)。
細胞周期的測量將A549或PASM細胞生長到80%匯合,然后加入所示的抑制劑,維持24小時。通過溫和的胰蛋白酶處理收獲細胞并用PBS洗滌三次,然后加入0.5ml的Vindalov′s碘化丙啶(10mM的Trizma堿、10mM的NaCl、0.05mg/ml的碘化丙啶、0.7U/ml的核糖核酸酶、0.1%的Nonidet P40),維持至少2小時。在FACSCalibur流式細胞儀(BD Biosciences;San Diego,CA)上進行細胞周期分析。得自氬氣激光器的488-nm線用于碘化丙啶的激發(fā),并且使用585-nm譜帶通濾波器(FL2)收集發(fā)射的熒光。使用Cell Quest Software在線性刻度上收集Listmode數(shù)據(jù)。通過流式細胞計計數(shù)碘化丙啶染色的細胞,并測定處于G1、S、或G2/M期中的細胞百分數(shù)。
酪蛋白激酶2(CK2)活性的測量使用CK2活性試劑盒(Upstate,Charlottesville,VA)測量CK2活性(每分鐘計數(shù)),通過將沒有或有所示濃度的在1%DMSO中的LY294002、LY303511、渥曼青霉素或雷帕霉素的存在下的50μl試驗緩沖液(20mM的MOPS,pH 7.2、5mM的EGTA、25mM的β-磷酸甘油、1mM的原釩酸鈉、1mM的二硫蘇糖醇)中的100ng的重組CK2、鎂/ATP雞尾酒(10μCi32P-γ-ATP、0.675μmol的MgCl2、4.5nmol的ATP)、和10摩爾肽底物(氨基酸序列RRRDDDSDDD)在30℃下培養(yǎng)10分鐘。使用20μl的40%三氯乙酸終止試驗,并將上清液的樣品(25μl)應用于P81磷酸纖維素紙方格上,然后將其用0.75%磷酸洗滌三次,用丙酮洗滌一次。使用Packard 100Tri-Carb液體閃爍計數(shù)器在5ml的閃爍流體中定量磷酸纖維素方格上的底物肽中的32P?;钚员硎緸槊?0分鐘結(jié)合的pmol磷酸酯。在抑制劑的存在下測量的CK2活性除以在DMSO對照存在下測量的CK2活性(=100%對照)。
已經(jīng)說明和描述了公開的組合物和方法的原則,顯而易見,這些組合物和方法可在構(gòu)建和細節(jié)上進行改進而不脫離這種原則。
權(quán)利要求
1.抑制主體中的免疫應答的方法,包括對主體給藥治療有效量的具有式A所示結(jié)構(gòu)的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物或其可藥用鹽, 式A其中R1和R2各自的存在是非必要的并且R1和R2各自獨立地選自烷基、取代的烷基、雜烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、取代的雜環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、烷氧基、鹵素、羥基、或氨基。
2.權(quán)利要求1的方法,其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物包括具有式B所示結(jié)構(gòu)的2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物, 式B其中R1和R2各自的存在是非必要的并且R1和R2各自獨立地選自烷基、芳基、烷氧基、鹵素、羥基或氨基。
3.權(quán)利要求1的方法,其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物包括2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮。
4.權(quán)利要求1的方法,其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物抑制雷帕霉素或酪蛋白激酶2的哺乳動物靶標,但是不顯著抑制磷脂酰肌醇3-激酶。
5.權(quán)利要求1的方法,其中主體患有自身免疫疾病。
6.權(quán)利要求1的方法,其中主體具有炎癥應答。
7.權(quán)利要求1的方法,其中主體患有移植物抗宿主疾病。
8.權(quán)利要求1的方法,其中主體是移植接受者,并且其中免疫應答是移植體的排斥。
9.權(quán)利要求1的方法,進一步包括對主體給藥治療有效量的另一種免疫抑制劑。
10.抑制細胞增殖的方法,包括使細胞接觸有效量的具有式A所示結(jié)構(gòu)的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物或其可藥用鹽, 式A其中R1和R2各自的存在是非必要的并且R1和R2各自獨立地選自烷基、取代的烷基、雜烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、取代的雜環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、烷氧基、鹵素、羥基、或氨基。
11.權(quán)利要求10的方法,其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物包括具有式B所示結(jié)構(gòu)的2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物, 式B其中R1和R2各自的存在是非必要的并且R1和R2各自獨立地選自烷基、芳基、烷氧基、鹵素、羥基或氨基。
12.權(quán)利要求10的方法,其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物包括2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮。
13.權(quán)利要求10的方法,其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物抑制雷帕霉素或酪蛋白激酶2的哺乳動物靶標,但是不顯著抑制磷脂酰肌醇3-激酶。
14.權(quán)利要求10的方法,進一步包括使細胞接觸有效量的化療劑。
15.權(quán)利要求10的方法,其中細胞在體內(nèi)。
16.權(quán)利要求10的方法,其中細胞在體外。
17.抑制主體中的增生性疾病的方法,包括對主體給藥治療有效量的具有式A結(jié)構(gòu)所示的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物或其可藥用鹽, 式A其中R1和R2各自的存在是非必要的并且R1和R2各自獨立地選自烷基、取代的烷基、雜烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、取代的雜環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、烷氧基、鹵素、羥基、或氨基。
18.權(quán)利要求17的方法,其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物包括具有式B所示結(jié)構(gòu)的2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物 式B其中R1和R2各自的存在是非必要的并且R1和R2各自獨立地選自烷基、芳基、烷氧基、鹵素、羥基或氨基。
19.權(quán)利要求17的方法,其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物包括2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮。
20.權(quán)利要求17的方法,其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物抑制P70 S6激酶的磷酸化,但是不顯著抑制磷脂酰肌醇3-激酶。
21.權(quán)利要求17的方法,其中增生性疾病包括再狹窄。
22.權(quán)利要求17的方法,其中增生性疾病是腫瘤。
23.權(quán)利要求22的方法,其中腫瘤是肺癌或前列腺癌。
24.選擇免疫抑制劑或抗增生劑的方法,包括選擇試驗劑,與抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)依賴性的底物磷酸化相比,該試驗劑優(yōu)先抑制酪蛋白激酶2和P70 S6激酶的磷酸化,從而鑒定藥學有用的免疫抑制劑或抗增生劑。
25.權(quán)利要求24的方法,其中底物為蛋白激酶B(PKB)。
26.權(quán)利要求24的方法,其中試驗劑在389位絲氨酸抑制P70 S6激酶的磷酸化。
27.權(quán)利要求24的方法,其中選擇免疫抑制劑。
28.權(quán)利要求23的方法,其中選擇抗增生劑。
29.藥用組合物,包括2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮或其可藥用鹽、和可藥用載體。
30.權(quán)利要求1的方法,其中免疫應答包括巨噬細胞活化。
31.權(quán)利要求1的方法,其中免疫應答包括一種或多種細胞因子的分泌。
32.權(quán)利要求31的方法,其中細胞因子為白細胞介素(IL)-12、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ、單核細胞趨化蛋白(MCP)-1、IL-10、IL-6。
33.權(quán)利要求22的方法,進一步包括對主體給藥另外的化療劑。
34.權(quán)利要求33的方法,其中化療劑為5-氟尿嘧啶(5-FU)、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、氟達拉濱、依托泊苷、多柔比星、甲氨蝶呤、長春新堿、卡鉑、順鉑、紫杉醇、雷帕霉素、或其組合。
全文摘要
本文公開了用于抑制主體中的免疫應答、治療主體中的腫瘤、或治療主體中纖維增生性血管病的方法,包括對主體給藥治療有效量的具有式(A)所示結(jié)構(gòu)的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮類化合物或其可藥用鹽,其中R
文檔編號A61P37/06GK1889958SQ200480036665
公開日2007年1月3日 申請日期2004年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月9日
發(fā)明者約埃爾·莫斯, 阿諾爾德·克里斯托夫 申請人:美國政府健康及人類服務部