專利名稱：用于預防和治療銀屑病的i型干擾素阻斷劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及I型干擾素阻斷劑用于制備預防和治療銀屑病的藥物的用途，以及用I型干擾素阻斷劑預防和治療銀屑病的方法。
背景技術：
銀屑病是一種影響人類皮膚的常見的自身免疫相關的炎性疾病。非常有說服力的證據(jù)表明與Crohn氏病和類風濕性關節(jié)炎相似，銀屑病是由于自身反應性IFN-γ分泌性T細胞的明顯的自我持續(xù)性活化。最初發(fā)作時為皮膚損傷，隨后為疾病的慢性復發(fā)，典型地由環(huán)境因素包括感染、機械應力和藥物引發(fā)。已經(jīng)提議這些損傷可通過目前仍未確認的先天性免疫應答導致致病性T細胞級聯(lián)。
由于漿細胞樣樹突狀細胞前體(PDC)在應答病毒刺激中具有分泌大量I型干擾素(IFN-α/β)的獨特能力，因而其在天然抗病毒免疫中是關鍵的效應器。暴露于病毒的PDC隨后分化為T細胞刺激性樹突狀細胞(DC)自身或通過IFN-α誘導旁觀髓樣DC的成熟，從而在先天性和獲得性抗病毒免疫之間提供了獨特的聯(lián)系。在穩(wěn)態(tài)下，PDC只在血液和淋巴器官中，然而病毒感染導致從血液主動募集PDC到原發(fā)感染的外周部位。Wollenberg等[J Invest Dermatol 2002，1191096-102]已經(jīng)表明PDC也可以在某些非感染炎性疾病的周圍組織中積累，例如過敏性接觸皮炎、皮膚紅斑狼瘡和銀屑病，然而迄今為止并不了解或證明PDC或其分泌產(chǎn)物如I型IFN的功能相關性。
I型(IFN-α、IFN-β、IFN-ω)IFN是一個細胞因子家族的成員，其包括與I型IFN表面受體結合的數(shù)個結構相關的IFN-α蛋白和單一IFN-β蛋白。I型IFN抑制病毒復制，增加NK細胞的裂解能力，增加I類MHC分子的表達，并刺激T輔助性1細胞在人體內的發(fā)育。
在過去，有一些文獻報道涉及銀屑病與I型IFN的相關性或描述IFN-α阻斷劑。Schmid等[J of IFN Res 1994，14229-234]在銀屑病表皮檢測到低水平IFN-αmRNA的表達。然而，他們未能在蛋白質水平上顯示IFN-α表達。另外，IFN-α僅發(fā)現(xiàn)于表皮區(qū)隔。盡管作者提供了在銀屑病中IFN-α系統(tǒng)被局部激活的直接證據(jù)，他們認為這可能是病毒感染或者細胞因子網(wǎng)絡失調的結果。
Van der Fits等[J Invest Dermatol 2004，12251-60]描述了在銀屑病損傷皮膚中一種活化的I型干擾素信號通路，但并沒有提示阻斷這一通路能用于預防和治療銀屑病。個例報告已經(jīng)指出在黑素瘤輔助治療或肝炎治療中全身性給予IFN-α偶爾能夠引發(fā)易感個體的銀屑病[Pauluzzi et al.，Acta Derm Venereol 1993，73395；Funk et al.，Br J Dermatol 1991，125463-5]。然而，考慮到銀屑病的高發(fā)性以及在癌癥患者和抗感染治療中頻繁使用IFN-α，這只是罕見的事例。此外，IFN-α僅僅被認為是能夠誘發(fā)銀屑病的許多因素之一。其他因素，例如身體和心理壓力、HIV感染以及包括鋰、β阻滯劑和抗瘧藥在內的多種藥物均是眾所周知的銀屑病誘因。治療性IFN-α劑量，通過外源途徑添加，有可能是數(shù)個可能的下游銀屑病誘發(fā)因素的非特異性觸發(fā)劑。
Chuntharapai等[Cytokine 2001，15250-260]關注開發(fā)中和IFN-α的治療劑，亦即開發(fā)人源化抗體。尚未見提供任何試驗數(shù)據(jù)表明預防或治療任何已知的自身免疫性疾病，盡管胰島素依賴性糖尿病(IDDM)或系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)被描述為潛在的待治療疾病。在參考了已經(jīng)分析的有限數(shù)患者后，該論文質疑關于IFN-α與銀屑病或Crohn氏病之間相關性的看法。
WO 00/64936[Wieser]描述了與IFN-α2受體結合的肽同二聚體和肽異二聚體，并關注代表IFN-α2替代物的這些化合物的物理和生化活性。在最廣義上建議將這些化合物應用于炎癥和腫瘤疾病，并且疾病列表中也包含銀屑病。然而沒有指出應使用IFN-α2拮抗劑。
由于當前銀屑病的治療均受限于它們有限的效果、副作用以及不能防止新的復發(fā)，因此還需要新的銀屑病治療。盡管新藥物如抗TNF-α靶向治療能夠誘導疾病迅速緩解，但由于其高的潛在毒性而不是長期治療的選擇。
發(fā)明內容
本發(fā)明涉及I型干擾素阻斷劑，如I型IFN拮抗劑或I型IFN受體拮抗劑，用于制備預防和治療銀屑病的藥物的用途，以及用I型干擾素阻斷劑預防和治療銀屑病的方法。
具體而言，本發(fā)明涉及這樣的用途，其中I型IFN拮抗劑是IFN-α拮抗劑，例如抗IFN-α抗體或抗體片段，優(yōu)選人源化抗體、I型IFN受體融合蛋白、或者通過序列特異性靶向IFN-αmRNA來抑制IFN-α產(chǎn)生的短干擾(si)RNA或反義寡核苷酸。拮抗其他I型IFN家族成員或I型IFN組的類似試劑也是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明進一步涉及這樣的用途，其中I型IFN受體拮抗劑是抗IFN-α/β受體抗體或抗體片段、突變的I型IFN/Fc融合蛋白或特異性干擾I型IFN信號傳導的小分子。
圖1.IFN-α產(chǎn)生是銀屑病皮膚損傷發(fā)展期間的早期事件，并主要由皮膚PDC介導。
(a)在銀屑病斑塊損傷(PP，n＝24)和正常皮膚(NN，n＝11)中標準化的IFN-α和IRF-7mRNA表達。x軸(mRNA)的數(shù)字表示mRNA的相對表達。
(b)銀屑病斑塊損傷皮膚(PP，n＝8)、銀屑病患者未影響皮膚(PN，n＝4)、健康個體的正常皮膚(NN，n＝4)和特應性皮炎皮膚(AD，n＝4)樣品的冷凍切片上對MxA蛋白的免疫組化。在全部真皮和表皮細胞中MxA-陽性細胞的百分率是在400倍放大的3個隨機區(qū)域中2次獨立計數(shù)的平均值計算獲得。+＝0-25％，++＝25-50％，+++＝50-75％，++++＝75-100％，＜＝低于檢測限。
(c)在移植到AGR-/-小鼠的未受影響皮膚中自發(fā)性發(fā)生銀屑病皮膚損傷期間損傷處IFN-α表達。人IFN-αmRNA表述相對于人GAPDH mRNA(IFN-αmRNA，柱狀)的動力學與駐在CD3T細胞的擴增(CD3，實線)以及銀屑病乳頭狀瘤病的誘導(Pap，虛線)的對比。d＝移植后天數(shù)。數(shù)據(jù)表示2次獨立試驗的平均值+/-標準偏差(SD)。
(d)在來源于發(fā)展中銀屑病損傷(d-PP，銀屑病斑塊的前緣)和未受影響皮膚(PN)的皮膚單細胞懸液中細胞內IFN-α和表面BDCA-2的雙重染色。框內的數(shù)字代表％。
圖2.IFN-a/β信號對于局部T細胞擴增和銀屑病發(fā)生是關鍵的。
在施用亞型匹配的對照抗體(IgG)或抗IFN-α/β-受體mAb(α-IFN-R)之后移植前(未受影響皮膚，第0天，PN)和移植后35天(p.t.)的皮膚移植物中、或移植物供體的銀屑病斑塊(PP)中的(a)總CD3T細胞數(shù)和(b)表皮乳頭狀瘤病(Pap)。(a)中的誤差線表示標準偏差(SD)。(b)中的點表示獨立移植的小鼠。
圖3.銀屑病的發(fā)生依賴于PDC產(chǎn)生的I型IFN。
(a)施用亞型對照Ab(IgG)或抗BDCA-2mAb(α-BDCA-2)之后移植后13天(p.t.)收獲的皮膚移植物中相對于人GAPDH mRNA的總人IFN-αmRNA的表達。
在施用亞型匹配的對照抗體(IgG)、抗BDCA-2mAb(α-BDCA-2)、或抗BDCA2加人重組IFN-α2(α-BDCA-2+IFN-α)之后，移植前(未受影響皮膚，第0天，PN)和移植后35天(p.t.)的皮膚移植物中的(b)總CD3T細胞數(shù)、(c)表皮乳頭狀瘤病(Pap)和(d)棘皮癥(Ac)。
具體實施例方式
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)漿細胞樣樹突狀細胞前體(PDC)在早期銀屑病發(fā)生中是作為大量產(chǎn)生I型干擾素(IFN)的關鍵效應細胞，這一發(fā)現(xiàn)導致了本發(fā)明，即，阻斷I型IFN可用于預防和治療銀屑病。用PDC特異性抗體(抗BDCA-2)經(jīng)免疫組化和單細胞懸液流式細胞術可以顯示大量PDC浸潤銀屑病患者的銀屑病斑塊損傷以及未受影響(表現(xiàn)正常)的皮膚中。有趣的是，與未受影響皮膚中PDC的靜息表型相反，浸潤銀屑病斑塊損傷的PDC顯示活化的表型。從未受影響皮膚向銀屑病斑塊損傷皮膚的轉化過程中，PDC活化有助于銀屑病的疾病發(fā)生。
拮抗I型IFN(例如拮抗IFN-α，但使IFN-β保持完好)提供獨特的機會，特異性靶向銀屑病中I型IFN介導的自身免疫性疾病過程，而潛在地使重要的IFN-β介導的抗病毒免疫應答保持完好。拮抗IFN-α不僅能清除疾病，而且能防止復發(fā)，這已經(jīng)在相關的臨床前模型中得到證實。AGR銀屑病小鼠模型[Boyman et al.，J Exp Med 2004，199731-736]首次提供了一個平臺來證明I型IFN阻斷在預防和治療銀屑病中的有效性。這種臨床相關的銀屑病模型支持抑制I型IFN可阻斷銀屑病發(fā)生，這是預防和治療人類銀屑病的強效方式。
研究了異種移植模型中銀屑病損傷發(fā)生期間IFN-α的表達，在所述模型中將銀屑病患者的未受影響皮膚移植到AGR-/-小鼠中，在35天內自發(fā)轉化成完全成熟的銀屑病皮膚損傷。除了是RAG-/-外，AGR129小鼠還是I型(A)和II型(G)IFN受體缺陷的。在整個研究中AGR129小鼠均保持于無病原體的環(huán)境中。采用可吸收組織密封劑將未受影響皮膚的keratomes移植到小鼠背部。這種人源化小鼠模型系統(tǒng)依賴于來源于移植的前銀屑病皮膚的駐在人T細胞的局部活化和增殖。
與健康供體的正常皮膚相比，銀屑病斑塊損傷的初步篩選不表現(xiàn)出IFN-αmRNA的顯著上調。然而，銀屑病斑塊損傷、而非未受影響皮膚或正常皮膚表現(xiàn)出IRF-7表達顯著增加的IFN-α信號，和IFN-α可誘導的MxA蛋白的存在(圖1b)，所述IRF-7是IFN-α可誘導的基因(圖1a)，這提示在銀屑病表型發(fā)生期間IFN-α的產(chǎn)生較早。人IFN-α表達的分析揭示早在移植后第7天mRNA的水平就有增加，在第14天達到峰值，隨后快速降低(圖1c)。在第7天和14天IFN-α的誘導表達與駐在T細胞的局部擴增平行發(fā)生。與此相反，用表皮乳頭狀瘤病定量的疾病形成顯示延遲的動力學，在移植后第21天開始發(fā)生，在第35天達到其全面發(fā)展(圖1c)。這些數(shù)據(jù)表明IFN-α表達在銀屑病表型發(fā)生的早期階段特別重要，但對整個疾病過程具有影響。
細胞內IFN-α表達局限于BDCA2+細胞(圖1d)，表明在發(fā)展中的銀屑病損傷中PDC是主要的IFN-α產(chǎn)生者。與此對照，在來源于未受影響皮膚的PDC上未檢測到IFN-α的表達，在同一銀屑病患者的外周血液中也未檢測到IFN-α表達。由于PDC中含有大量I型干擾素，因此來源于PDC的IFN-α在引發(fā)銀屑病的過程中起關鍵作用。
在移植后立刻開始靜脈內注射中和性抗IFN-α/β-受體的抗體，能抑制駐在T細胞的局部活化和擴增(圖2a)，并徹底阻斷銀屑病表型的發(fā)展，并且顯著減少了乳頭狀瘤病(圖2b)，這是與接受亞型匹配對照抗體的小鼠相比較。
AGR-/-小鼠中未受影響的前銀屑病皮膚向銀屑病的自發(fā)轉化是由PDC活化和IFN-α分泌介導的。抗BDCA2抗體特異性靶向人PDC，并體外抑制PDC產(chǎn)生I型IFN。靜脈注射抗BDCA2單克隆抗體(mAb)導致在移植后第13天損傷處IFN-α減少14倍(圖3a)，抑制真皮T細胞擴增(圖3b)和銀屑病表型的發(fā)生，這通過表皮乳頭狀瘤病(圖3c)和棘皮病(圖3d)來定量。
向抗BDCA2治療的PDC-阻斷中添加外源性IFN-α，完全逆轉對T細胞擴增的抑制(圖3b)和對銀屑病發(fā)生的誘導(圖3c，d)，證實銀屑病的發(fā)生是由PDC的IFN-α生成所介導的。這些數(shù)據(jù)證明IFN-α是導致銀屑病發(fā)生的IFN類型。
特異性阻斷IFN-α可阻斷銀屑病，并使用于潛在的抗病毒免疫應答的IFN-β信號傳遞保持完好。
阻斷劑是指干擾炎性疾病中I型IFN信號傳遞和功能和/或PDC產(chǎn)生I型IFN的任意DNA、RNA(siRNA、反義分子)、肽、蛋白質(包括融合蛋白)、抗體或小分子。具體而言，這樣的阻斷劑是(i)拮抗所分泌IFN-α的人源化或人抗IFN-α全抗體或抗體片段(Fab或scFv)，(ii)抑制IFN-α產(chǎn)生的短干擾(si)RNA或反義寡核苷酸，(iii)抗IFN-α/β-受體抗體、突變I型IFN/Fc融合蛋白、I型IFN受體融合蛋白或干擾I型IFN信號傳導的小分子。
本發(fā)明的一個方面涉及銀屑病的治療方法，其包括向需要該治療的哺乳動物例如人施用能有效抗銀屑病的量的抗IFN-α抗體或抗體片段。所述治療可以用于預防或治療目的。對于施用，所述抗IFN-α抗體優(yōu)選是包含所述抗IFN-α抗體和任選地藥學可接受載體和任選輔劑的藥物制劑形式。使用有效抗銀屑病的量的抗IFN-α抗體?；钚猿煞值膭┝咳Q于物種、年齡、體重、和個體狀況、個體藥代動力學數(shù)據(jù)、施用方式、以及施用目的是預防還是治療。在個體體重約70公斤的情況下，抗IFN-α抗體的每日施用劑量為約1mg到約500mg，優(yōu)選約10mg到約100mg。
上面提及的施用其他阻斷劑也包括在本發(fā)明中，特別是施用包含抑制IFN-α產(chǎn)生的短干擾(si)RNA或反義寡核苷酸、或者抗IFN-α/β-受體抗體、突變I型IFN/Fc融合蛋白、I型IFN受體融合蛋白或干擾I型IFN信號傳導的小分子的藥物制劑。這些化合物同樣以有效抗銀屑病的量使用。根據(jù)待施用的具體化合物、個體藥代動力學數(shù)據(jù)、以及物種、年齡、體重、和個體狀況以及施用方式，由醫(yī)師來選擇劑量。
腸胃外施用如靜脈內、肌肉內或皮下施用的藥物組合物是特別優(yōu)選的。所述藥物組合物包含約1％到約95％的活性成分，優(yōu)選約20％到約90％的活性成分。
對于腸胃外施用，優(yōu)選使用上面提及的抗IFN-α抗體或其他I型IFN阻斷劑的混懸液或分散體，尤其是等滲水溶液，例如，其可在臨用前配制。所示藥物組合物可進行滅菌和/或可包含賦形劑，例如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑和/或乳化劑、增溶劑、增粘劑、調節(jié)滲透壓的鹽和/或緩沖劑，并可用原本已知的方式制備，例如通過常規(guī)的溶解和凍干工藝。
可用于本發(fā)明的抗體可通過標準方法制備。人源化抗體和抗體片段通過先前描述的重組技術獲得[綜述見Dall′Acqua et al.，Curr Op Struct Biol1988，8443-50]。作為替代，全人抗體可采用噬菌體展示技術[綜述見Winteret al.，Annu Rev Immunol 1994，12433-55]或將部分人重鏈和輕鏈基因簇插入其染色體組的轉基因“人”小鼠[綜述見Brüggeman et al.，Curr OpBiotechnol 1997，8503-8]來獲得。si RNA或反義寡核苷酸的制備同樣采用標準技術。
以上提及的抗IFN-α抗體或其他I型IFN阻斷劑可以單獨施用，或與一種或多種其他治療劑聯(lián)合施用，可能的聯(lián)合療法采取本發(fā)明阻斷劑與銀屑病治療中已知的一種或多種治療劑的固定聯(lián)合的形式，可以錯開施用或彼此獨立施用，或以固定聯(lián)合的形式施用。
可以考慮的聯(lián)合伙伴是局部用皮質類固醇、紫外光、維生素A類、甲氨喋呤、靶向于銀屑病中改變免疫系統(tǒng)的其他生物劑或維生素D3衍生物。
以下實施例用于舉例說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。
實施例實時定量PCR.如先前所述從勻漿皮膚樣本中提取總RNA并逆轉錄[Boyman et al.，J Exp Med 2004，199731-736]。用設計針對大多數(shù)人IFN-α序列(購于Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，加拿大)和針對人IRF-7(左，TCCCCACGCTATACCATCTACCT-3′；右，ACAGCCAGGGTTCCAGCTT-3′)的引物，通過實時PCR定量分析互補DNA來分析IFN-α和IRF-7轉錄本的表達。用18S核糖體RNA進行標準化。在人源化小鼠模型中，用識別大多數(shù)人IFN-α基因但不識別其小鼠對應物的引物試劑盒(購于Search-LC，Heidelberg，德國)進行IFN-α定量。用人特異性引物(左，ATTGCCCTCAACGACCACTTTG-3′；右，TTGATGGTACATGAAAGGTGAGG-3′)對人GAPDH mRNA的水平進行定量，并用于標準化。
動物和移植操作。除了是RAG-2-/-外，AGR129小鼠還具有I型(A)和II型(G)IFN受體缺陷，其在整個研究中均置于無病原體的環(huán)境中。如前所述，采用可吸收組織密封劑將無癥狀的前銀屑病皮膚的keratomes移植到小鼠背部[Boyman et al.，loc.cit.]。移植后35天將移植皮膚取出并快速冷凍進行組織學或mRNA表達分析。如先前公開，組織學測定CD3+T細胞計數(shù)、棘皮病和乳頭狀瘤病指數(shù)[Boyman et al.，loc.cit.]。CD3+T細胞值代表兩名獨立研究者用400倍放大評估的3個隨機視野的平均細胞計數(shù)。所指示的乳頭狀瘤病和棘皮病數(shù)值代表每個樣品10個隨機區(qū)域的平均。
中和研究.基于先前用抗其它細胞表面分子的抗人單克隆抗體的數(shù)據(jù)推出抗體施用的劑量和方案，并如下施用(i)自移植后第0天開始，每周2次，持續(xù)35天，靜脈注射30μg中和性抗人IFN-α/β受體鏈2(CD118)mAb(克隆MMHAR-2，購于PBL BiomedicalLabortories)；(ii)自移植后第0天開始，每周2次，持續(xù)35天，靜脈注射30μg抗BDCA-2mAb(Miltenyi Biotech)。對于IFN-α重構實驗，皮下施用30,000IU重組人IFN-α2a(RoferonA，RochePharma AG，Reinach，瑞士)，每周3次，持續(xù)35天。該劑量對應人8Mio IU的治療劑量，是根據(jù)前述異種計量(allometric)法推出的[Boyman et al.，loc.cit.]。
序列表<110>弗蘭克·O·內斯特爾米歇爾·吉列<120>用于預防和治療銀屑病的I型干擾素阻斷劑<130>UZ-06/167<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>23<212>DNA<213>人工<220>
<223>IRF-7的引物，左<400>1tccccacgct ataccatcta cct23<210>2<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>IRF-7的引物，右<400>2acagccaggg ttccagctt19<210>3<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>GAPDH的引物，左<400>3attgccctca acgaccactt tg22<210>4<211>23<212>DNA<213>人工<220>
<223>GAPDH的引物，右<400>4ttgatggtac atgaaaggtg agg 2權利要求
1.I型干擾素阻斷劑用于制備預防和治療銀屑病的藥物的用途。
2.根據(jù)權利要求1的用途，其中I型干擾素阻斷劑是I型干擾素拮抗劑。
3.根據(jù)權利要求2的用途，其中I型干擾素拮抗劑是IFN-α拮抗劑。
4.根據(jù)權利要求3的用途，其中IFN-α拮抗劑是抗IFN-α抗體或抗體片段。
5.根據(jù)權利要求1的用途，其中I型干擾素阻斷劑是I型干擾素受體融合蛋白。
6.根據(jù)權利要求1的用途，其中I型干擾素阻斷劑是抑制IFN-α產(chǎn)生的短干擾(si)RNA或反義寡核苷酸。
7.根據(jù)權利要求1的用途，其中I型干擾素阻斷劑是I型干擾素受體拮抗劑。
8.根據(jù)權利要求7的用途，其中I型干擾素受體拮抗劑是抗IFN-α/β-受體抗體、突變的I型IFN/Fc融合蛋白或特異性干擾I型IFN信號傳導的小分子。
9.根據(jù)權利要求7的用途，其中I型干擾素受體拮抗劑是抗IFN-α/β-受體抗體或抗體片段。
10.根據(jù)權利要求4或9的用途，其中抗體是人源化抗體。
11.用I型干擾素阻斷劑預防和治療銀屑病的方法。
全文摘要
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)漿細胞樣樹突狀細胞前體(PDC)在早期銀屑病發(fā)生中是作為大量產(chǎn)生I型干擾素(IFN)的關鍵效應細胞，這一發(fā)現(xiàn)導致了本發(fā)明，即，阻斷I型IFN可用于預防和治療銀屑病。本發(fā)明涉及I型干擾素阻斷劑，如I型IFN拮抗劑(例如抗IFN－α抗體)或I型IFN受體拮抗劑，用于制備預防和治療銀屑病的藥物的用途，以及用I型干擾素阻斷劑預防和治療銀屑病的方法。
文檔編號A61K39/395GK101056654SQ200580033920
公開日2007年10月17日 申請日期2005年9月30日 優(yōu)先權日2004年10月7日
發(fā)明者米歇爾·吉列, 弗蘭克·O·內斯特爾 申請人:蘇黎士大學