專利名稱：修飾的安卡拉牛痘病毒(mva)突變體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及MVA突變體及其在免疫治療和疫苗接種以抵抗多種疾病中的用途，尤其是在預(yù)防和治療癌癥和傳染性疾病中的用途。
背景技術(shù)：
牛痘病毒(VV)屬于痘病毒科的正痘病毒(Orthopoxvirus)屬。牛痘病毒的某些毒株被用作活疫苗以對天花產(chǎn)生免疫已有多年，例如英國Lister研究院的Elstree毒株。由于疫苗接種可能引起并發(fā)癥(Schr，Zeitschr.fürPrventivmedizin 18，41-44 )，并且1980年WHO宣布天花已被根除，因此現(xiàn)在只有高危人群材接種天花疫苗。
牛痘病毒也被用作載體生產(chǎn)和輸送外源抗原(Smith等，Biotechnologyand Genetic Engineering Reviews 2，383-407 )。這需要將編碼外源抗原的DNA序列(基因)通過DNA重組技術(shù)導(dǎo)入牛痘病毒基因組。若基因整合到病毒DNA的一個位點上，而該位點不是病毒的生命周期所必須的，那么新產(chǎn)生的重組牛痘病毒可能具有侵染性，也就是說能夠侵染外源細胞并能夠表達該整合的基因(歐洲專利申請No.83,286和No.110,385)。這種方法得到的重組牛痘病毒一方面可以作為預(yù)防侵染的活疫苗，另一方面也可用于在真核細胞中生產(chǎn)異源蛋白。
牛痘病毒是最具廣闊價值的活載體之一，具有支持它作為重組疫苗用途的特殊性質(zhì)高度穩(wěn)定、生產(chǎn)低廉、容易實施、還能容納大量的外源DNA。它有誘導(dǎo)抗體和細胞毒性反應(yīng)的優(yōu)點，可以以一種更為自然的方式向免疫系統(tǒng)提供抗原，并在多種動物模型中它被成功的用作載體疫苗以免于感染性疾病。另外，牛痘載體是很有價值的研究工具，用于分析重組蛋白的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系、確定體液和細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的耙標、研究預(yù)防特定疾病所需要的免疫防御類型。
然而牛痘病毒對人有侵染性，并且出于安全性的考慮和規(guī)章制度，牛痘病毒作為表達載體在實驗室中的使用受到了影響。此外，重組牛痘病毒將來可能的應(yīng)用，例如生產(chǎn)用于人類的新的治療或預(yù)防方法的重組蛋白或重組病毒粒子，將由于重組牛痘病毒載體多產(chǎn)的復(fù)制而受到阻礙。文獻中報道的大多數(shù)重組牛痘病毒都是基于牛痘病毒的西里瑟夫(Western Reserve，WR)毒株。然而該毒株的高度神經(jīng)毒性是周知的，因而是不適合用于人和動物的(Morita等，Vaccine 5，65-70 )。
標準牛痘病毒毒株安全性的考慮已經(jīng)通過從高度弱化的病毒毒株開發(fā)的疫苗載體而提出，這些高度弱化毒株的特征在于，在體外有限的復(fù)制能力和在體內(nèi)是無毒的。很久以來人們已經(jīng)知道對病毒毒株進行特別的培養(yǎng)以避免負作用。這樣通過長期的在雞胚成纖維細胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)牛痘病毒的安卡拉毒株(CVA)可培養(yǎng)出一種修飾的安卡拉牛痘病毒(Modified vacciniavirus Ankara，MVA)毒株(參見Mayr，A.，Hochstein-Mintzel，V.和Stickl，H.(1975)Infection 3，6-14；瑞士專利No.568392)。該MVA病毒按照布達佩斯條約的要求于1987年12月15日在CNCM(法國國家微生物保藏中心，Institut Pasteur，Collectione Nationale de Cultures de Microorganisms，25，ruede Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15)進行保藏，保藏號為I-721。
修飾的安卡拉牛痘病毒(MVA)是一株雞細胞適應(yīng)的牛痘病毒。由于它對動物接種后的無毒性，以及在大多數(shù)哺乳動物細胞中不能產(chǎn)生大量新的病毒后代的驚人的缺陷，所以原MVA可在生物安全水平一級的實驗室條件下使用。由于MVA已經(jīng)被測試用于為超過十萬人接種疫苗預(yù)防天花而沒有引起顯著的負作用，因此MVA是具有高度安全性的表達重組基因的有效載體病毒(Sutter & Moss 1992)和候選重組疫苗，幾個MVA載體疫苗已進入臨床評估(McConkey等2003，Cosma等2003)。最近，與傳統(tǒng)的牛痘病毒毒株相比較，MVA被重新評估作為預(yù)防天花的候選第二代疫苗(Drexler等2003，Belyakov等2003)。
如前所述，MVA是通過在雞胚成纖維細胞上長期的連續(xù)傳代培養(yǎng)而得到的，其結(jié)果是使大量的基因組遺傳信息丟失，包括很多調(diào)節(jié)病毒-宿主關(guān)系的基因(Meyer等1991，Antoine等1998)。一些編碼識別豆病毒免疫逃逸分子(請參見Moss & Shisler 2001，Alcami 2003)的MVA異性基因被丟失或片段化，這些分子包括病毒干擾素I型和II型受體、白介素轉(zhuǎn)化酶抑止劑SPI-2、牛痘補體結(jié)合蛋白、牛痘semaphorin、35kDa趨化因子結(jié)合蛋白或腫瘤壞死因子α受體。有趣的是在MVA基因組中一些具有免疫調(diào)節(jié)功能的基因被保留下來，這些基因與基于MVA疫苗應(yīng)用的可能的關(guān)系還有待確定。其中一個例子是在MVA中高度保守的病毒白介素1β受體(IL1βR)的編碼序列被保留。白介素1是一種細胞因子，它在炎性過程的調(diào)節(jié)和寄主對侵染因子的原初免疫反應(yīng)中起重要作用。與其細胞對應(yīng)物不同，可溶的病毒IL1βR只對IL1β，主要的內(nèi)原熱原，(Alcami & Smith 1996)有特異親合性(Alcami & Smith Cell 1992)。在牛痘病毒對小鼠的侵染過程中，IL1βR顯示出通過與IL1β相互作用而防止發(fā)燒。另外，牛痘病毒中IL1βR基因的缺失加速鼻內(nèi)侵染小鼠病癥的顯現(xiàn)和死亡，說明牛痘病毒對IL1β的阻斷可減弱侵染引起的全身急性期反應(yīng)，調(diào)節(jié)疾病的嚴重程度(Alcami & Smith1996)。
IL1βR基因失活的MVA突變體已被Staib等在“遺傳工程對MVA病毒的瞬時寄主范圍選擇”BioTechniques 281137-1148(June 2000)中報道。缺失的IL1βR基因序列被稱為并相當(dāng)于開放性閱讀框(ORF)184R。MVA的整個基因組被Antoine等在病毒雜志(1998)中公開，該文在此引入作為參考。然而關(guān)于該突變體可能在多種疾病的預(yù)防或治療中顯示其潛在作用的免疫原性或其它性質(zhì)還沒見報道。
總之，在將MVA用作疫苗時，考慮到MVA的免疫原性和/或其保護作用，現(xiàn)存的MVA毒株還需改進。
因此本發(fā)明的一個目的就是提供MVA突變體，它有較少的不希望的免疫反應(yīng)，同時在對幾種疾病長期處理時具有優(yōu)異的免疫原性。
這個目的通過獨立權(quán)利要求的主題而體現(xiàn)。本發(fā)明優(yōu)選的實施方案在從屬權(quán)利要求中列出。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明中，從MVA基因組中IL1βR基因缺失的作用被評估。MVA IL1βR基因缺失突變體的構(gòu)建使我們能夠在體外和體內(nèi)分析在MVA引起的侵染中，IL1βR合成的重要性?，F(xiàn)有資料顯示IL1βR基因的失活得益于對MVA疫苗的開發(fā)。
奇怪的是病毒白介素1β受體的失活增強了修飾的安卡拉牛痘病毒免疫引起的CD8+T細胞反應(yīng)。
進一步的，本文中顯示，缺失IL1βR基因的MVA突變體不表現(xiàn)發(fā)燒和其他病癥表現(xiàn)，即使用MVA-ΔIL1βR高劑量鼻內(nèi)侵染的小鼠也不表現(xiàn)發(fā)燒和其他病癥表現(xiàn)。這個事實是完全出乎意料的，因為在牛痘病毒中IL1βR基因的缺失(在上面已提到過)加速鼻內(nèi)侵染小鼠病癥的出現(xiàn)和死亡。
白介素-1(IL1)是寄主抵御侵染的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)者。牛痘病毒編碼一個病毒可溶的白介素-1β受體(vIL1βR)，它調(diào)節(jié)急性期寄主對侵染的反應(yīng)(發(fā)燒的誘導(dǎo))，并可能影響對病毒相關(guān)抗原的免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)。
發(fā)明人通過瞬時插入能夠精確缺失MVA基因組中vIL1βR編碼序列的選擇標記基因序列而得到vIL1βR缺陷的MVA突變體病毒。MVA突變體的分析顯示vIL1βR基因的缺失不能消除在組織培養(yǎng)擴增中MVA后代的形成。用MVA-ΔIL1βR高劑量鼻內(nèi)侵染小鼠后，動物不顯示發(fā)燒或其它病癥表現(xiàn)，說明MVA-ΔIL1βR仍然保持著無毒表型。用MVA-ΔIL1βR或非突變的MVA接種小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生相似水平的牛痘病毒特異的循環(huán)抗體。用MVA-ΔIL1βR接種小鼠產(chǎn)生稍高水平的牛痘病毒表位特異的T細胞。另外，使人吃驚的是接種后六個月檢測記憶T細胞的反應(yīng)發(fā)現(xiàn)MVA-ΔIL1βR有顯著優(yōu)異的免疫原性(p＝0.01)。進一步的，我們發(fā)現(xiàn)免疫三周后MVA-ΔIL1βR和野生型MVA具有相似的保護能力，而在六個月后MVA-ΔIL1βR能夠更好(5/5＝100％，MVA3/5＝60％)地抵抗由毒性牛痘病毒毒株西里瑟夫引起的致死呼吸道侵染挑戰(zhàn)。因此在此的數(shù)據(jù)顯示vIL1βR基因序列的缺失可以被認為是獲得用于開發(fā)具有均勻改善了免疫原性的疫苗遺傳學(xué)優(yōu)化的MVA病毒的第一步。
本發(fā)明具體指以下的方面和實施方式本發(fā)明涉及MVA突變體，該突變體的IL1βR編碼序列或功能部分優(yōu)選通過缺失或突變而失活，該突變體可被用于免疫治療和/或疫苗接種。
在這里所用的術(shù)語“其功能部分”被理解為IL1βR序列的任何部分，其丟失導(dǎo)致如本文所述IL1βR功能的失活。失活優(yōu)選通過突變或缺失而完成。正如上面提到的，功能的丟失可在抵御病毒相關(guān)的抗原的免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)中看到。因此對一個專業(yè)技術(shù)人員而言只需進行常規(guī)的實驗就可確定是否有缺失或突變。具體地，增強CD8+T細胞反應(yīng)的免疫作用采用例如實施例中所指出的方法進行評估(具體請參看圖1)，這些實施例采用了Tatsis N，Sinnathamby G，Eisenlohr LC在Methods Mol.Biol.2004；269267-288中描述的方法。
具體地，ORF184的任何缺失或突變將被認為是充分的，將引起CD8+細胞的記憶反應(yīng)，該反應(yīng)與非修飾的，如野生型的MVA比較可增強至少10％，優(yōu)選至少20％，更優(yōu)選至少30％或40％和最優(yōu)選大于50％。
一般地，IL1βR基因或其功能部分可被從病毒基因組中缺失而失活。或者，IL1βR序列功能缺陷的重組MVA也可通過序列誘突如插入誘突而產(chǎn)生，從而引起IL1βR失活。
本發(fā)明的MVA突變體可另外包括外源DNA序列，它可以是編碼治療多肽的基因，所述多肽例如分泌蛋白，例如抗體多肽、趨化因子、細胞因子或干擾素，或來源于可以優(yōu)選被用于接種目的或治療生產(chǎn)的病原物的多肽或具有科研價值的多肽。病原物被理解為病毒、細菌和引起疾病的寄生蟲，或在機體中不受限制的增生并可引起病態(tài)生長的腫瘤細胞。這樣的病原物例子被Davis，B.D.等，(Microbiology，第三版，Harper International出版)描述。優(yōu)選的病原物基因是流感病毒的基因、麻疹和呼吸合胞體病毒的基因、登革熱病毒的基因、人免疫缺陷型病毒如HIV I和HIV II的基因、人肝炎病毒如HCV和HBV的基因、皰疹病毒的基因、乳頭瘤病毒的基因、瘧疾寄生蟲惡性瘧原蟲的基因和引起結(jié)核病的分枝桿菌的基因。
另外，本發(fā)明的MVA突變體可用作疫苗接種以預(yù)防天花或正痘病毒感染引起的其他疾病。
優(yōu)選編碼腫瘤相關(guān)抗原的基因是黑色素瘤相關(guān)的分化抗原例如酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1和2的基因，睪丸癌抗原例如MAGE-1、-2、-3和BAGE的基因，在腫瘤中過量表達的非突變的共享抗原例如Her-2/neu、MUC-1和p53的基因。
為了使外源DNA序列或基因表達成為可能，在該DNA上必須有基因轉(zhuǎn)錄所需的調(diào)節(jié)序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員都知道這種調(diào)節(jié)序列(叫做啟動子)，例如像牛痘11kDa基因的啟動子的牛痘病毒特異的啟動子在歐洲專利EP-A-198,328中被描述，以及7.5kDa基因的啟動子(EP-A-110,385)或可使牛痘病毒特異轉(zhuǎn)錄的異源痘病毒啟動子，或可使牛痘病毒特異轉(zhuǎn)錄的合成的啟動子。
本發(fā)明的各組分優(yōu)選采用藥物組合物的形式使用，其中各組分以一定劑量與適合的載體或賦形劑混合以治療或減緩疾病。這樣的組合物(除了組分和載體外)還包括稀釋劑、填充劑、鹽、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑和其他本領(lǐng)域已知的物質(zhì)。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”的意思是不干擾有效成分生物學(xué)活性作用的無毒的物質(zhì)。載體的特性根據(jù)給藥途徑而定。藥物組合物還可包括能增強活性物質(zhì)的活性或可在治療中應(yīng)用的其他試劑。這些另外的因子和/或試劑可以包含在藥物組合物中產(chǎn)生協(xié)同作用或減少副作用。
直接應(yīng)用的化合物的劑型和給藥技術(shù)可在賓夕法尼亞伊斯頓的Mack出版公司出版的新版“若明頓藥劑科學(xué)(Remington’s Pharmaceutical Sciences)”中找到。只要該組合物被用于醫(yī)藥目的，它們將含有有療效劑量的有效成分。有療效的劑量進一步指諸如治療、治愈、預(yù)防或這種情況的改善的能夠改善癥狀的足夠的化合物/組分的含量。
為制備疫苗，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的MVA牛痘病毒轉(zhuǎn)變?yōu)樯韺W(xué)上可接受的形式。這可根據(jù)多年來用于接種預(yù)防天花的疫苗的制備方法(Kaplan，Br.Med.Bull.25，131-135 )來進行。典型的情況是在安瓿，優(yōu)選是在玻璃安瓿中將大約106-107個重組MVA顆粒在含有2％蛋白胨和1％人血清的100ml磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中凍干。凍干物可含有擴展劑(如甘露醇、葡聚糖、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮)或其他適合腸道外給藥的助劑(如抗氧化劑、穩(wěn)定劑等)。然后玻璃安瓿被密封儲存，優(yōu)選在低于-20℃下，可保存幾個月。
接種時，凍干物可溶于0.1至0.2ml水溶液中，最好是生理鹽水，經(jīng)非腸道如皮內(nèi)接種給藥。根據(jù)本發(fā)明的疫苗優(yōu)選采用皮內(nèi)注射。在注射部位可能會出現(xiàn)輕微紅腫，有時也可能出現(xiàn)騷癢(Stickl等，supra)。給藥模式、劑量和次數(shù)可由那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)已知的方式優(yōu)化。為了獲得抵抗外源抗原的高水平的免疫反應(yīng)，在一個長時期內(nèi)適當(dāng)進行多次疫苗接種給藥是有利的。
因此，本發(fā)明的MVA突變體可用于在需要免疫治療和/或接種(如癌癥和/或傳染病)的病人的治療方法中應(yīng)用，其特征在于給該病人施加有療效量的本發(fā)明的MVA突變體/疫苗。在任何時候醫(yī)師將根據(jù)病人的情況決定最適于個體病患的精確劑量，并且該劑量將隨特定病人的年齡、體重和反應(yīng)而改變。當(dāng)然，個別情況下更高或更低的劑量范圍是有益的，這也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
優(yōu)選，該藥物組合物適于哺乳動物，特別是人在體內(nèi)應(yīng)用。
根據(jù)另一方面，提供一種產(chǎn)生突變體MVA的方法，包括以下步驟-用編碼如上面所定義的MVA突變體的核酸侵染MVA寄主細胞，-在適合的條件下在所述寄主細胞中表達所述核酸；和
-分離表達的突變體MVA。
進一步地，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生藥物組合物的方法，包括以下步驟-用編碼如上面所定義的MVA突變體的核酸侵染MVA寄主細胞，-在適合的條件下在所述寄主細胞中表達所述核酸；-分離表達的突變體MVA；-加入藥學(xué)上可接受的載體和生產(chǎn)藥物組合物的其它成分。
根據(jù)優(yōu)選的實施方式，寄主細胞是CEF細胞、雞胚來源的LSCC-H32細胞、雞DF-1細胞或其它鳥類的細胞，如鵪鶉成纖維細胞QT6或QT35細胞。
甚至更優(yōu)選，突變體MVA基于寄主范圍的選擇方法(Staib等，“遺傳工程對MVA病毒的瞬時寄主范圍選擇(Transient Host Range Selection ForGenetic Engineering Of Modified Vaccinia Virus Ankara”，BioTechniqus281137-1148，2000年6月)通過KIL基因進行選擇。
與親代毒株比，MVA缺失了原基因組的大約15％(30,000個堿基對)，包括KIL基因的大部分。只有長度為263bp的堿基片段仍然存在于MVA基因組中。MVA KIL基因序列在MVA基因組的nt 20685-20981的ORF 022L的前263bp，如Antoine，G.F.Scheiflinger，F(xiàn).Domer和F.G.Falkner 1998所描述的。修飾的安卡拉牛痘病毒的完全基因組序列及它與其它正痘病毒的對比可在Virology 244365-396中找到。
在Staib等的文章中描述了一種簡單高效的產(chǎn)生重組MVA的方法，該方法是基于牛痘病毒寄主范圍基因KIL的瞬時表達而進行選擇。該方法是基于通過用作為嚴謹標記的牛痘病毒KIL基因瞬時寄主范圍基因表達選擇重組的MVA，使MVA在兔腎RK-13細胞內(nèi)生長。新的MVA載體質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和應(yīng)用已被描述，該質(zhì)粒載有作為瞬時可選擇標記的牛痘病毒寄主范圍基因KIL的表達框。這些質(zhì)粒允許另外的重組基因穩(wěn)定的插入MVA基因組中或精確的MVA基因組序列的靶向誘變。在非選擇生長調(diào)節(jié)下KIL基因側(cè)翼連接的重復(fù)DNA序列通過同源重組被用來去除病毒基因組中的標記基因。
上面提到的Staib等的出版物在此被全文引入。
另外，本發(fā)明提供如上面所定義的MVA突變體或藥物組合物的用途，如上所述用于免疫治療和/或接種的藥物制造中。進一步地本發(fā)明提供一種治療病人的方法，包括向需要治療的個體提供包括有療效劑量的突變體MVA或藥物組合物。至于給藥的方法和形式也請參見以上所述。本發(fā)明的MVA突變體可優(yōu)選用作預(yù)防天花或正牛痘病毒感染引起的其他疾病的疫苗接種。
在這里提到的所有出版物、專利中請、專利和其他文獻都被全文引入。在出現(xiàn)矛盾時，本說明書，包括定義將起支配作用。另外，所述的材料、方法和實施例只是說明性的，而不是要用來限制本發(fā)明。


本發(fā)明通過以下附圖進行進一步說明圖1.IL1βR缺陷MVA的構(gòu)建。上面為MVA基因組的示意圖。在MVA基因組中限制性內(nèi)切酶HindIII的位點被標出。184R ORF(IL1βR基因)的位置用箭標出。鄰近IL1βR編碼序列的MVA DNA序列(側(cè)翼184R-I，側(cè)翼184R-II)被克隆到質(zhì)粒pΔK1L中，可通過同源重組在ORF 184R的位點將K1L基因瞬時插入，結(jié)果使該基因缺失。最后的突變體病毒MVA-ΔIL1βR可通過涉及合成的重復(fù)序列(rep)的第二步同源重組去掉K1L標記基因而得到。
圖2.MVA-ΔIL1βR的體外特性。(A)PCR分析病毒DNA。從MVA-ΔIL1βR(道1)或MVA(道2)侵染的細胞提取基因組DNA模板，并與184R基因位點鄰近的寡聚核苷酸孵育以擴增特異的DNA片段。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分離。M，分子量標記。(B)病毒DNA的Southern印跡分析。從MVA-ΔIL1βR(道1)或MVA(道2)侵染的細胞提取基因組DNA，用EcoRI酶切，然后用瓊脂糖凝膠電泳分離，再轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。IL1βR基因位點特異的DNA片段被32P-dCTP標記的特異探針檢出。(C)用MVA-ΔIL1βR(道1，4)，MVA(道2，5)或?qū)φ?道3，6)侵染并放射性標記的CEF細胞的裂解液中IL1βR蛋白的放射免疫沉淀反應(yīng)。免疫沉淀用偶聯(lián)到蛋白質(zhì)A(Protein A，道1-3)上或沒有偶聯(lián)的瓊脂糖(道4-6)的抗B15R的多克隆抗體進行。箭頭指示IL1βR蛋白。(D，E)用高(D)或低(E)感染復(fù)數(shù)MVA-ΔIL1βR(■)或MVA(▲)侵染CEF細胞后病毒生長的分析。
圖3.在呼吸感染痘病毒小鼠模型上的病毒毒性分析。MVA，MVA-ΔIL1βR，CVA和WR侵染的特性。BALB/c小鼠(n＝10)用1×108IU MVA(◆)和MVA-ΔIL1βR(▲)，或5×105PFU CVA(■)和3×104PFU WR(-)通過鼻內(nèi)途徑接種。每日監(jiān)測體重(A)和體溫(B)并用每組的平均值表示。
圖4.疫苗誘導(dǎo)的CD8+T細胞的體外分析。用單劑量的MVA-ΔIL1βR，MVA或回復(fù)突變的病毒接種HHD小鼠。10天后脾細胞用HLA-A*0201限制的牛痘特異VP35#1(VP35#1)或流感M1 58-66(不相關(guān)對照)肽進行刺激。然后用EMA，PE-抗-CD8，APC-抗-CD62L和FITC-抗-IFNγ或-抗-NTFα或分別FITC標記的同型對照進行染色。細胞用流式細胞儀在VP35#1特異肽，激活(CD62Llow)CD8+T細胞的存在下進行分析。誘導(dǎo)的T細胞反應(yīng)的放大用在活的(EMA負)和CD8正的細胞群中分泌細胞因子的CD8+T百分率表示。分別用MVA-ΔIL1βR MVA(■)或MVA-ΔIL1βR-Rev(//)接種的每組12只小鼠用平均值表示，誤差柱表示標準誤差x1.96，p值(p＝0.07)用學(xué)生t檢驗確定。
圖5.在呼吸感染痘病毒小鼠模型上誘導(dǎo)的疫苗保護分析。BALB/c小鼠(n＝10)用104(▲)、105(-)、106(□)、107(△)IU的MVA-ΔIL1βR(A、C)或MVA(B、D)肌肉內(nèi)免疫。接種三周后的動物鼻內(nèi)用1×106PFU WR進行侵染挑戰(zhàn)。每日監(jiān)測單個動物的體重(A、B)和病癥表現(xiàn)(C、D)，并用每組平均值表示。被空白接種(◆)和空白侵染挑戰(zhàn)(■)的小鼠作為對照。
圖6.疫苗誘導(dǎo)的記憶CD8+T細胞體外分析和在HHD小鼠上疫苗誘導(dǎo)的長期保護作用分析。(A)小鼠被用108IU單劑量的MVA-ΔIL1βR或MVA進行腹膜內(nèi)接種。六個月后，脾細胞用HLA-A*0201限制牛痘特異VP35#1肽刺激或用MVA侵染以確定牛痘特異的總CD8+或CD4+反應(yīng)。細胞用EMA、PE-抗-CD8、APC-抗-CD62L和FITC-抗-IFNγ或分別FITC標記的同型對照進行染色。細胞用流式細胞儀在VP35#1肽或牛痘特異的激活的(CD62Llow)的CD8+T細胞或牛痘特異的CD4+T細胞的存在下進行分析。用MVA-ΔIL1βR 或MVA(■)接種后，6只小鼠的平均值被描述，誤差柱表示標準誤差x1.96，p值(p＝0.01)用學(xué)生t檢驗確定。(B)HHD小鼠(n＝5)用108IU的MVA-ΔIL1βR(△)或MVA(□)腹膜內(nèi)免疫。接種后的小鼠在6個月時用1×107PFU WR侵染挑戰(zhàn)。每天監(jiān)測存活狀況，并用每組鼠的存活動物百分率表示。被空白接種(◆)和空白侵染(■)的小鼠作為對照。
圖7.疫苗誘導(dǎo)的記憶CD8+T細胞體外分析和在非轉(zhuǎn)基因鼠中疫苗誘導(dǎo)的長期保護作用分析。(A)用108IU單劑量的MVA-ΔIL1βR或MVA腹膜內(nèi)接種C57BL/6小鼠。6個月后用MVA侵染脾細胞以測定牛痘特異性的總CD8+或CD4+反應(yīng)。細胞用EMA，PE-抗-CD8，APC-抗-CD62L和FITC-抗-IFNγ或分別FITC標記的同型對照進行染色。細胞通過流式細胞儀在牛痘特異的、激活的(CD62L低)的CD8+T細胞或牛痘特異的CD4+T細胞存在下進行分析。在用MVA-ΔIL1βR(■)或MVA 接種后，6只小鼠的平均值被描述，誤差柱表示標準誤差x1.96，p值(p＝0.01)用學(xué)生t檢驗確定。(B)BALB/c小鼠(n＝4)用105(▲)、106(□)或107(△)IU的MVA-ΔIL1βR或MVA鼻內(nèi)免疫。接種四個月后動物鼻內(nèi)用1×107PFU WR侵染挑戰(zhàn)。每日監(jiān)測單個動物的體重，用每組平均值表示。被空白接種(◆)和空白侵染(■)的小鼠作為對照。
具體實施例方式
下面的實施例是為了使本發(fā)明能被更好地理解。而不是給大家一個本發(fā)明只限于實施例的主題的印象。
材料和方法病毒和細胞 牛痘病毒菌株西里瑟夫、CVA和MVA(克隆的隔離群F6，在雞成纖維細胞(CEF)中傳代的第582代得到)被用于本研究。采用標準方法使病毒增殖和滴度測定。為生產(chǎn)疫苗制劑，將病毒通過蔗糖超速離心進行常規(guī)的純化，然后重溶于pH9.0的1mM Tris溶液中。CEF和兔腎RK-13(ATCCCCL-37)細胞用含有10％胎牛血清(FCS)的最低必需培養(yǎng)基(MEM)在37℃、5％CO2的條件下生長。
質(zhì)粒 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pΔK1L-184R帶有兩個DNA片段，代表MVA ORF 184R(核苷酸位置162021-163001，GenBank U94848)的兩翼序列，并被插在質(zhì)粒pΔK1L的多克隆位點1和2(Staib等2000)。標注為側(cè)翼184-1的片段由486-bp的MVA-DNA序列組成，該序列起始于ORF 184R的5’端，終止于用于ORF 184R翻譯的起始密碼子。另一個片段，側(cè)翼184-2是MVA-DNA的544-bp的PCR片段，從184R的翻譯終止密碼子延伸到184R基因的3’端的基因間的區(qū)域。
牛痘病毒MVA的遺傳修飾 如前所述，突變體MVA是通過瞬時的基于K1L寄主范圍選擇方法而得到的(Staib等2000)。簡言之，為了產(chǎn)生缺失突變病毒，1×106長滿的單層CEF細胞用每細胞0.01IU的感染復(fù)數(shù)(MOI)的MVA侵染細胞。侵染90分鐘后，細胞用1.5μg的質(zhì)粒pΔK1L-184R DNA采用制造商所推薦FUGENETM(Roche，德國曼海姆)進行轉(zhuǎn)染。侵染48小時后，收獲轉(zhuǎn)染的細胞，鋪在在單層RK-13細胞上面，進行生長選擇。突變體病毒從RK-13細胞上通過克隆分離出來，然后在CEF細胞上傳代以除去選擇標記基因K1L。
PCR和Southern印跡法分析病毒DNA 從侵染的CEF細胞分離基因組病毒DNA，用寡聚核苷酸分別在側(cè)翼區(qū)184-1和184-2(對1)或分別在側(cè)翼184-1和184R編碼區(qū)內(nèi)(對2)退火進行PCR分析(Staib等，2000)。在退火溫度為52℃(對1)或50℃(對2)下，進行30個PCR循環(huán)將特異DNA片段擴增。
另外，從病毒侵染細胞分離的總DNA用EcoRI酶解，用含0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)到Hybond TM-N膜(Amersham，德國弗賴堡)上，并與由PCR片段構(gòu)成的探針雜交，該片段來源于用[α-32P]CTP標記的184R-側(cè)翼1序列。預(yù)雜交和雜交根據(jù)Sambrook等(Southem 1975，Sambrook等，1989)的方法進行。印跡用柯達BioMax膠片曝光。
病毒侵染細胞裂解液的放射性免疫沉淀 長在6孔組織培養(yǎng)板中的CEF細胞用20復(fù)侵染單位的MVA侵染。侵染2小時后，病毒接種物被含5％透析過的胎牛血清和每毫升50μCi的[35S]甲硫氨酸的不含甲硫氨酸的最低必需培養(yǎng)基替換，并在37℃孵育過夜。細胞在含有0.15M NaCl，0.01M Tris-HCl(pH 7.4)，1％Triton X-100的RIPA緩沖液中裂解，用AcB15R兔多抗(Alcami & Smith，1992)孵育14小時，然后用50％蛋白A-瓊脂糖懸浮。免疫復(fù)合物用RIPA緩沖液洗滌，重懸于Laemmli緩沖液中，然后蛋白用10％SDS凝膠電泳分離。
病毒生長分析 為了確定低或高的復(fù)性生長特性，長滿的CEF細胞單層(在6孔板里生長)分別用0.05侵染單位或每細胞10IU MVA或突變體MVA侵染。在37℃病毒吸附60分鐘后，接種物被除去。細胞用RPMI 1640洗兩次，然后用含10％胎牛血清的新鮮RPMI 1640于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在侵染后多個時間點，收獲侵染的細胞，病毒通過凍融和短暫超聲而釋放。所得裂解液的連續(xù)稀釋液被鋪在生長在6孔板中的長滿的CEF細胞單層上作為兩個的重復(fù)。侵染后48小時，細胞單層用1∶1丙酮∶甲醇液簡單固定，并用抗牛痘兔多抗(IgG fraction，Biogenesis Ltd，Poole，England，Cat.No.9503-2057，1∶1000稀釋于含3％胎牛血清的PBS中)孵育60分鐘。然后用偶聯(lián)辣根過氧化酶的羊抗兔多抗(Dianova，德國漢堡，1∶1000稀釋于含3％胎牛血清的PBS中)孵育45分鐘。用PBS洗后，抗體標記的細胞用o-鄰聯(lián)二茴香胺(Sigma，德國的Taufkirchen)底物溶液染色，計數(shù)染色的細胞病灶，計算病毒滴度，記為IU/ml。
體液牛痘病毒反應(yīng) 從被MVA、突變體MVA或牛痘病毒CVA免疫了的小鼠得到的血清樣品通過ELISA和中和抗體實驗對牛痘病毒蛋白的抗體進行評價。牛痘抗原特異附著的滴度用ELISA測定，其中用蔗糖梯度離心純化的MVA(蛋白濃度為1μg/ml)包被Maxisorp板(Nunc，德國)，于37℃處理3小時，然后4℃過夜。板用含0.05％Tween 20和10％胎牛血清的PBS于37℃封閉60分鐘。血清樣品的系列稀釋液于37℃孵育60分鐘，用PBS洗5次，用堿性磷酸酶偶聯(lián)的鼠抗(1∶1000稀釋于PBS)孵育30分鐘。接著洗滌5次，板用pNPP底物(Sigma，德國)于37℃孵育20分鐘，光密度用ELISA讀數(shù)儀于405nm波長處測定。
用重組MVA-LZ通過空斑減數(shù)分析法(plaque reduction assay)測定牛痘病毒特異中和抗體。血清的兩倍系列稀釋液與200侵染單位的MVA-LZ混合于總體積為200μl的PBS中，37℃孵育2小時。然后，如前所述(Drexler等，1998)，一式兩份的長滿的CEF細胞單層(在24孔板上生長)被侵染，侵染48小時后，病毒侵染細胞的病灶用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-半乳吡喃糖苷底物(X-Gal，RocheMolecular Biochemicals，德國曼海姆)染色。對藍色病灶進行計數(shù)，并將每個血清樣品所得的數(shù)目與小鼠免疫前血清或培養(yǎng)基對照進行比較?？贵w的滴度被計算為病灶數(shù)目減少50％的系列的兩倍稀釋度。
細胞牛痘病毒反應(yīng) 為了監(jiān)測肽特異的急性期和記憶期CD8+T細胞反應(yīng)，制備來自牛痘病毒免疫的HHD小鼠的脾細胞，并與10-6M 結(jié)合A*0201肽混合孵育5小時。2小時后，加入最終濃度為1μg/ml的布雷菲德菌素A(GolgiPlugTM；PharMingen Becton Dickinson)。然后，細胞儲存于4℃冰上或直接用PBS/1％BSA/1μg/ml溴乙啡啶單疊氮溴化物(EMA；Molecular Probes)活/死細胞染色，并用結(jié)合5μg/ml純化的抗CD16/CD32(Fc BlockTM；PharMingenBecton Dickinson)非特異的FcγIII和-II介導(dǎo)的受體封閉，4℃作用20分鐘。用PE-抗-CD8(53-6.9)和APC-抗-CD62L(Mel-14)對細胞表面染色，4℃作用30分鐘。透化(Cytofix/CytopermTMKit，PharMingen Becton Dickinson)細胞后，用FITC-抗-IFNγ(XMG 1.2)或FITC-抗-TNFα(MP6-XT22)或分別FITC標記的IgG1同型對照(R3-34)(均為PharMingen Becton Dickinson出品)染胞內(nèi)細胞因子，4℃作用30分鐘。脾細胞用四色流式細胞儀(FACSCaliburTM)和CellQest軟件(二者均為Becton Dickinson出品)進行分析。
動物模型 接種實驗采用6-8周雌性轉(zhuǎn)基因HHD+/+β2m-/-Db-/-小鼠(HHD)(Pascolo等，1997)或6-8周雌性BALB/c或C57BL/6小鼠。用0.5ml病毒疫苗腹膜內(nèi)接種HHD小鼠，免疫后10天或180天監(jiān)測限制的HLA-A*0201T細胞反應(yīng)。為進行保護分析實驗，動物用0.1-0.5ml病毒疫苗經(jīng)肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi)接種。免疫后3周或6個月，麻醉動物，用30μl磷酸鹽緩沖液稀釋的西里瑟夫牛痘病毒鼻內(nèi)侵染動物。然后，如前所述，每天測定個體體重、對病癥表現(xiàn)記分以監(jiān)測發(fā)病率和死亡率，至少監(jiān)測3周。將有嚴重的全身性感染和30％體重下降的動物處死。將體重的平均變化計算為感染后每天每組動物平均體重的百分率。用電子實驗動物監(jiān)測系統(tǒng)(BioMedic Data Systems，Marywood，NJ)監(jiān)測動物體溫，該系統(tǒng)用皮下植入的微芯片無電池的發(fā)射機應(yīng)答器和DAS-5004袖珍掃描儀采集數(shù)據(jù)。體溫的平均變化通過從每個隨后的時間點的體溫減去感染前(-3到0)每組基礎(chǔ)體溫而得到。
結(jié)果從MVA基因組缺失IL1βR編碼序列 為了分析在MVA侵染過程中IL1βR基因表達的可能作用，我們構(gòu)建了缺失開放閱讀框(ORF)184R(IL1βR)的MVA敲出突變體。在MVA基因組中病毒IL1βR的編碼序列和它的假定啟動子序列是MVA基因組中很保守的序列。等同于以前表征的牛痘病毒毒株西里瑟夫的IL1βR，預(yù)測的MVA多肽以99％的一致性水平含326個氨基酸(2、5、34)。用PCR方法，我們擴增了184R編碼序列的上游和下游的DNA片段，并將這些片段插入到缺失載體pΔK1L中(圖1)，該載體含有牛痘病毒K1L基因作為選擇標記。用pΔK1L-184R轉(zhuǎn)染MVA侵染的細胞，通過同源重組184R翼區(qū)允許K1L標記基因插入，和同時在MVA基因組中的IL1βR基因編碼序列缺失。所得的病毒在RK-13細胞上選擇，其中K1L的功能對于MVA的生長是必需的。克隆純化的突變體病毒分離后，K1L標記框通過在CEF細胞上傳代而除去，從而得到最后的突變體病毒MVA-ΔIL1βR(圖1)。
突變體病毒MVA-ΔIL1βR的分子特性和完全的體外復(fù)制性 分離MVA缺失突變體后，我們首先希望確定在基因水平IL1βR編碼序列被正確除去。我們用鄰近IL1βR基因位點的MVA基因組序列特異的寡聚核苷酸引物通過PCR方法對被野生型或突變型MVA侵染的細胞抽提的病毒DANN進行分析。PCA從野生型MVA模板特異擴增2.1-kb DNA片段，而在從MVA-ΔIL1βR侵染的細胞分離的DNA擴增得到1.1-kb的PCA產(chǎn)物，這與缺失ORF 184R后期望的分子量降低是一致的(圖2A)。進一步的，用限制性內(nèi)切酶EcoR I酶解病毒DNA，用Southern印跡法分析揭示含有IL1βR基因位點的DNA片段。為了確定該PCR數(shù)據(jù)，我們在缺失突變體MVA-ΔIL1βR的基因組DNA中找出了一個約1.3kb較低分子量的EcoR I酶切片段(圖2B)，再次確定了目標ORF 184R序列的正確缺失。在第二步中，我們希望證明在MVA侵染過程中IL1βR蛋白的產(chǎn)生，并證明產(chǎn)生的突變體不能合成該肽。因此，我們用被MVA或MVA-ΔIL1βR侵染的，代謝標記的CEF細胞裂解物，用IL1βR特異的多抗做免疫沉淀實驗(圖2C)。在用野生型MVA侵染的細胞裂解物中抗血清沉淀一個45kDz的特異蛋白，與牛痘病毒W(wǎng)R侵染的細胞中發(fā)現(xiàn)的IL1βR多肽的糖基化產(chǎn)品相當(dāng)(2)然而該病毒沒有在空侵染或MVA-16ΔIL1βR侵染的細胞中發(fā)現(xiàn)，說明所產(chǎn)生的缺失突變不能產(chǎn)生IL1βR產(chǎn)物。下一步我們希望評估與野生型MVA比突變體MVA-ΔIL1βR的復(fù)制能力。在侵染CEF細胞后，我們發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)?shù)男虏《竞蟠a(chǎn)生，一步(圖2D)和多步(圖2E)病毒生長動力學(xué)特性是一致的。這些數(shù)據(jù)清楚的表明MVA ORF184R的失活病毒在體外的繁殖。
MVA-ΔIL1βR高劑量呼吸侵染小鼠的無毒性 一個重要的問題是不能生產(chǎn)病毒IL1βR蛋白是不是影響在體內(nèi)MVA的侵染結(jié)果。以前用牛痘病毒W(wǎng)R毒株缺失突變體在小鼠上的研究工作顯示，或者是鼻內(nèi)侵染后呼吸疾病的增強(2)，或者是顱內(nèi)侵染后降低毒力(34)。更嚴重的呼吸侵染顯示與發(fā)燒反應(yīng)的誘導(dǎo)和IL-1βR作為主要內(nèi)源熱源中和病毒IL-1β的功能性活性相關(guān)(3)。因此我們用小鼠鼻內(nèi)侵染測試了突變體病毒MVA-ΔIL1βR。在這種小鼠模型上疾病的嚴重程度反應(yīng)在體重的變化和疾病的特異癥狀的出現(xiàn)(3，12，28，29，43)。另外由于發(fā)熱反應(yīng)可能出現(xiàn)，所以我們希望監(jiān)測體溫的變化。我們將芯片發(fā)射機應(yīng)答儀植于BALB/c小鼠皮下以便計算機讀取數(shù)據(jù)，一周后用108IU MVA或MVA-ΔIL1βR或5×105PFU復(fù)制完全的牛痘病毒CVA或3×104PFU西里瑟夫(WR)作為對照侵染動物，并且每天監(jiān)測動物，持續(xù)3周(圖3)。用MVA或突變體MVA-ΔIL1βR侵染沒有引起任何顯著病癥表現(xiàn)。然而用復(fù)制完全的病毒CVA或WR侵染引起顯著的體重降低(圖3A)和嚴重的病癥表現(xiàn)，也反映在體溫的降低(圖3B)。用MVA侵染的動物在整個監(jiān)測期體溫保持穩(wěn)定。以上這些數(shù)據(jù)顯示MVA基因組中IL1βR基因的缺失保留了MVA減毒的表型。
接種MVA-ΔIL1βR引起的早期免疫反應(yīng) 有特別的興趣評估缺失免疫調(diào)節(jié)基因IL1βR在MVA免疫產(chǎn)生性方面會有哪些可能的影響。首先，我們用單劑量的MVA或缺失突變體接種HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因鼠并直接體外監(jiān)測急性期免疫反應(yīng)，用正痘病毒特異的LA-A*0201限制肽抗原決定部位VP35#1檢測牛痘病毒特異的CD8+T細胞誘導(dǎo)反應(yīng)(12)。用FACS分析從接種動物新鮮制備的脾細胞，我們能夠測得在用MVA-ΔIL1βR免疫后0.4-2.45％的激活的CD8+T細胞，而用MVA免疫的動物的IFNγ釋放的CD8+T細胞的水平為0.16-0.82％。我們對每組12只鼠進行了VP35#1特異T細胞誘導(dǎo)分析，其中一組是用回復(fù)突變病毒MVA-IL1βRRev接種的。圖4描述了這幾組接種動物間的不同，雖然在統(tǒng)計沒有顯著地顯示出MVA-ΔIL1βR能引起較高水平的T細胞免疫產(chǎn)生的趨勢(p＝0.07)。重要的是用回復(fù)突變病毒MVA-IL1βRRev接種引起的T細胞反應(yīng)與MVA野生型引起的反應(yīng)相當(dāng)。
MVA-ΔIL1βR免疫的保護能力 在發(fā)現(xiàn)MVA-ΔIL1βR突變體病毒能引起稍高水平的VP35#1特異肽CD8+T細胞反應(yīng)后，我們希望確定MVA和MVA缺失突變體在保護能力方面可能的不同。為此，我們采用了最近建立的小鼠模型，用不同劑量的MVA疫苗肌肉內(nèi)對每組小鼠接種，在免疫后3周用牛痘病毒W(wǎng)R進行致死的鼻內(nèi)侵染挑戰(zhàn)(圖5)(12)。侵染后每天監(jiān)測動物的體重(圖5A、B)和癥狀(圖5C、D)，持續(xù)3周。兩種MVA疫苗在105或更高劑量下免疫時能完全保護所有小鼠，而在104或更小劑量下所有動物死亡。此模型的優(yōu)點是所用疫苗的施加劑量引起的接種保護作用可用不同組的平均體重變化來表示。這里我們得到用MVA或MVA-ΔIL1βR疫苗免疫的不同組小鼠具有非常相似的體重曲線(圖5A、B)。當(dāng)我們監(jiān)測侵染后典型病癥表現(xiàn)時(圖5C、D)這些結(jié)果得到進一步證實，隨著劑量的增加在相應(yīng)的組中病癥表現(xiàn)有相似的減弱。因此，在免疫接種后3周內(nèi)MVA和MVA-ΔIL1βR顯示相似的引起免疫保護反應(yīng)的能力，與我們發(fā)現(xiàn)的急性階段免疫反應(yīng)相似的結(jié)果是一致的。
MVA-ΔIL1βR接種改善T細胞記憶反應(yīng)和長期保護能力 對IL-1系統(tǒng)不同成分缺陷的小鼠研究顯示，在體內(nèi)炎癥細胞因子IL1β的成熟形式具有多種功能(33)。IL1功能研究的一個熱點領(lǐng)域是闡明在保護T細胞免疫方面細胞因子可能的重要作用，包括呈現(xiàn)細胞和記憶T細胞專用抗原的激活(16，17)。為了研究病毒IL1βR的失活是否影響記憶T細胞反應(yīng)的形成，我們用108IUMVA-ΔIL1βR或MVA接種HIA-A*0201轉(zhuǎn)基因(HHD)鼠，并在初免疫后監(jiān)測其病毒特異T細胞6個月以上。免疫后的后幾次用我們的ICS/FACS標準方法可以檢測到較低水平(0.30-0.60％)的VP35#1特異記憶T細胞(11)。一種用刺激脾細胞的肽過夜孵育的改進的方法可以注意到在急性反應(yīng)期更顯著的抗原特異的CD8+T細胞數(shù)量，該數(shù)量常常超過用我們常規(guī)的方法檢測到的激活T細胞量。這里，在用MVA-ΔIL1βR免疫的動物中，我們測得明顯的較高水平(達5.8％)的反應(yīng)的VP35#1以及IFN-γ釋放脾臟CD8+T記憶細胞，而與之相比，在用非重組MVA免疫的動物中只達到1.6％抗原決定部位特異的分泌的IFN-γCD8+T細胞(圖6A)。這種有利于MVA-ΔIL1βR的免疫的區(qū)別存在統(tǒng)計的顯著差異(p＝0.01)，有趣的是來源于這組免疫動物的脾細胞也含有更多的牛痘特異的CD8+記憶T細胞，而源于MVA-ΔIL1βR和MVA接種的動物的CD4+T細胞的平均水平是相當(dāng)?shù)?。為了監(jiān)測記憶T細胞反應(yīng)的不同是否引起保護作用的改變，我們用108IU MVA-ΔIL1βR或MVA單次腹膜內(nèi)接種HHD小鼠，6個月后用107PFU牛痘病毒西里瑟夫毒株鼻內(nèi)侵染(圖B)。結(jié)果侵染8天內(nèi)，空白免疫對照的動物出現(xiàn)呼吸道病癥狀、體重降低和死亡。用野生型MVA免疫的動物也出現(xiàn)呼吸道病癥狀和明顯的體重降低。但這些動物被部分保護，因為有3/5的動物免于死亡。明顯地，用MVA-ΔIL1βR免疫的動物都受到保護(5/5)，從較少的體重減少和較輕的病癥表現(xiàn)也很好地反映了這一點(數(shù)據(jù)沒有顯示)。這些結(jié)果顯示用MVA-ΔIL1βR進行免疫確實對保護免疫反應(yīng)的持久性有影響。HHD小鼠模型使我們能夠?qū)乖瓫Q定部位特異的限制的HLA-A*0201的CD8+T細胞反應(yīng)進行方便的分析，然而，可能由于它們是鼠MHC類型I敲除表型，這些鼠產(chǎn)生相當(dāng)?shù)偷目侰D8+T細胞(但產(chǎn)生正常的CD4+T細胞水平)(11)。因為這種表型可能影響總的牛痘特異T細胞反應(yīng)的分析，我們用MVA-ΔIL1βR或MVA接種正常的C57BL/6小鼠，并測定其誘導(dǎo)的總CD8+記憶T細胞(圖7A)。再次地與常規(guī)MVA接種比較，我們在用MVA-ΔIL1βR免疫的動物中發(fā)現(xiàn)顯著(p＝0.001)更多的牛痘特異CD8+T細胞。這些數(shù)據(jù)強烈顯示MVA-ΔIL1βR能夠更好的誘導(dǎo)或保持牛痘病毒特異CD8+T細胞記憶。為了更細致的研究MVA-ΔIL1βR免疫的長期有效性，我們決定再用已經(jīng)很好建立的非轉(zhuǎn)基因BALB/c小鼠的模型進行免疫測試(5，11)。我們選用鼻內(nèi)接種作為MVA免疫的途徑，與肌肉內(nèi)免疫或腹膜免疫比較，結(jié)果產(chǎn)生較低水平的循環(huán)病毒特異抗體，當(dāng)我們分析T細胞免疫的潛在保護能力時這可能是一種優(yōu)勢。我們用105至107IU MVA-ΔIL1βR或MVA接種BALB/c鼠。免疫4個月后我們用107PFU的牛痘病毒西里瑟夫毒株呼吸侵染動物(圖7B)。重要的是所有接受MVA-ΔIL1βR疫苗的動物在用病毒侵染后均存活下來，并且接種107IU MVA-ΔIL1βR的這組動物體重平均降低小于15％，病癥表現(xiàn)也很輕(數(shù)據(jù)沒有顯示)。相反觀察到用105IU MVA免疫的動物對嚴重的疾病沒有保護作用而全部死亡(Fisher精確檢驗p＝0.029)，用更高劑量(106，107IU)的MVA免疫時能可保護動物不死，但引起大于20％的體重降低和嚴重的病癥表現(xiàn)(數(shù)據(jù)沒有顯示)。
MVA ORF 184R編碼一個牛痘病毒的可溶IL-1β的受體，該受體可能具有阻止侵染引起的發(fā)炎和熱源寄主反應(yīng)的功能。從病毒基因組中去除假定的免疫逃逸基因是一種可能的進一步闡述這些調(diào)節(jié)病毒蛋白在活體內(nèi)病毒生活周期中的作用的方法(1)。此外，對諸如MVA的適合作用活體病毒疫苗的病毒研究的應(yīng)用可能直接導(dǎo)致具有適合改進特性的第二代疫苗的產(chǎn)生。即使分子工程技術(shù)能夠得到精確的突變(35，36)，但突變病毒的表型是不可預(yù)測的，MVA IL1βR基因的失活可作為進一步的例子。我們發(fā)現(xiàn)184R ORF的失活對MVA突變體病毒在體外的復(fù)制能力沒有影響，這應(yīng)該是相當(dāng)不意外的，因為沒有源于牛痘病毒W(wǎng)R的突變體生長缺陷型被報道過(2)。而高水平擴增的能力是病毒可能作為疫苗產(chǎn)品的最重要的特性。另外應(yīng)該注意到在另一個表達病毒干擾素反應(yīng)基因E3L缺陷的MVA突變體中，我們最近在適合MVA疫苗培養(yǎng)的CEF中發(fā)現(xiàn)一個非常不希望的寄主范圍表型(15)。當(dāng)然研究在體內(nèi)MVA-ΔIL1βR的性質(zhì)更有意思。用MVA-ΔIL1βR侵染引起IL1β的活性不被阻止可能引起更強的炎癥反應(yīng)和發(fā)熱反應(yīng)，結(jié)果使接種起到反作用。一個更樂觀的方案中我們預(yù)測IL1β活性可能是局部受限的，并可能以輔助的方式影響MVA免疫的潛力。用MVA-ΔIL1βR鼻內(nèi)侵染BALB/c鼠，即使用高劑量，并且盡管該鼠模型系統(tǒng)顯示出非常適合于評估病毒侵染引起的炎癥反應(yīng)潛在致病的結(jié)果，我們也沒有檢測到呼吸病癥狀(3，28，30)。用MVA-ΔIL1βR侵染后我們沒有檢測到致病作用可能是其它牛痘病毒調(diào)節(jié)或免疫調(diào)節(jié)基因被片段化或缺失的特定MVA基因型的結(jié)果(5)。也可能是用牛痘病毒IL1βR缺失突變體免疫情況下所觀察到的疾病的增強要求鼻內(nèi)侵染后病毒的體內(nèi)復(fù)制活性。正如最近的資料證實MVA不能在小鼠(27)或獼猴(39)中大量復(fù)制，我們的資料顯示用MVA-ΔIL1βR瞬時一步侵染可能不足以由IL1β活性引起不利的全身發(fā)燒或炎癥反應(yīng)。在第一個免疫反應(yīng)實驗中我們發(fā)現(xiàn)在早期總的抗牛痘病毒抗體或T細胞反應(yīng)方面MVA和MVA-ΔIL1βR具有相同的特性。數(shù)據(jù)很好地證實接種3周后用致死的牛痘病毒進行侵染挑戰(zhàn)，兩種病毒對動物具有幾乎同樣的保護能力。特別有趣的是當(dāng)監(jiān)測牛痘病毒抗原決定部位特異的T細胞反應(yīng)時，我們證明了MVA-ΔIL1βR的免疫優(yōu)勢。H3L基因產(chǎn)品產(chǎn)生的抗原決定部位VP35#1是一個免疫支配的HLA-A*0201限制T細胞特征的靶標，并可用于在抗原決定部位特異方式中檢測病毒特異的CD8+T細胞誘導(dǎo)(10，12)。相反，總的牛痘病毒特異反應(yīng)的大量分析提供一幅基于大量不同T細胞特征的典型圖畫，但可能不能評價單個T細胞群活性的微秒變化。猜測在T細胞激活方面的可能作用，我們也選擇評估VP35#1特異T細胞記憶反應(yīng)，該反應(yīng)我們以前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因鼠接種6個月后仍然能夠檢測到(12)。確實，我們在MVA-ΔIL1βR接種后觀察到一個更顯著的VP35#1特異T細胞反應(yīng)的增強(p＝0.01)。此外，我們進一步的發(fā)現(xiàn)顯示MVA-ΔIL1βR免疫確實具有長期有益作用。在轉(zhuǎn)基因HHD鼠中我們第一次注意到增加的總CD8+T細胞反應(yīng)，更重要的是免疫非轉(zhuǎn)基因C57BL/6鼠后我們觀察到顯著增強的總CD8+T細胞(p＝0.001)。另外，在HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因鼠和正常BALB/c鼠中我們發(fā)現(xiàn)了對抵抗牛痘病毒W(wǎng)R的致死呼吸侵染具有更高的保護能力。在IL1β功能的前后關(guān)系中怎樣解釋增強的免疫作用？有趣的是，兩篇最近的研究Leishmania major侵染易感或抗性小鼠的研究結(jié)果顯示，樹突細胞(DC)分泌IL1α或IL1β的能力與保護的Th1免疫的誘導(dǎo)間特異相關(guān)(13，42)。另外最近的證據(jù)顯示IL1β是誘導(dǎo)鼠科動物DC成熟的，F(xiàn)as配體的主要調(diào)節(jié)者(14)。同一研究證明鼠科動物DC的成熟可被IL1β中和抗體的應(yīng)用而完全消除，該中和抗體可能以與可溶牛痘病毒IL1βR分子相似的作用方式行使功能。因此，用MVA-ΔIL1βR免疫使IL1β的中和能力失去可能導(dǎo)致改善的DC作為抗原呈現(xiàn)細胞的功能，這可能導(dǎo)致更好的T細胞記憶反應(yīng)。相似的用IL1β刺激內(nèi)皮細胞導(dǎo)致ICOS-L介導(dǎo)的記憶T細胞的激活(17)。IL1β的這種活性可能是我們發(fā)現(xiàn)的MVA-ΔIL1βR免疫出現(xiàn)廣泛的改善記憶T細胞反應(yīng)的功能基礎(chǔ)。另外在免疫的早期，我們沒有發(fā)現(xiàn)MVA野生型或突變型疫苗在體內(nèi)保護能力方面的不同。這可能也表明在去除抗病毒記憶T細胞反應(yīng)方面病毒IL1βR可能具有特別作用。不然我們可能不能在對可能的免疫誘導(dǎo)T細胞反應(yīng)的峰值水平進行早期體外分析時測得病毒IL1βR在病毒特異T細胞免疫表達方面更普遍的作用，并且我們不能確定保護能力的不同可能是由于免疫后早期幾周時高水平抗體介導(dǎo)的免疫的影響。在保護用有毒的牛痘病毒進行致死呼吸侵染挑戰(zhàn)中病毒特異抗體的重要作用已被清楚地闡明(6)，在B細胞缺乏的小鼠中完全保護的MVA免疫表明T細胞免疫可能對免疫病毒特異抗體反應(yīng)的缺乏有補償作用(44)。病毒IL1βR能夠顯著特異地下調(diào)抗病毒CD8+T細胞記憶反應(yīng)的能力在最近的一篇對人類(用常規(guī)的野生型牛痘病毒接種后)免疫病毒特異記憶T細胞的反應(yīng)的數(shù)據(jù)中顯得很誘人，在人類CD4+細胞較CD8+T細胞顯現(xiàn)出更好的持久性(4)。總之，我們的分析使我們將病毒IL1βR基因的缺失作為開發(fā)新一代基于MVA的疫苗的第一步。在體外繁殖缺失突變體MVA-ΔIL1βR可能獲得高病毒滴度，并且沒有證據(jù)顯示在體內(nèi)侵染中高劑量的MVA-ΔIL1βR在耐受性方面比野生型病毒差。我們對于MVA-ΔIL1βR具有改善的疫苗特性的發(fā)現(xiàn)是特別有前途的，因為它為通過合理的基因工程技術(shù)獲得更有效的MVA疫苗的可能性提供了第一證據(jù)。
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權(quán)利要求
1.一種MVA突變體，其中IL1βR編碼序列或其功能部分被失活，優(yōu)選通過缺失或突變，用于免疫治療和/或接種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MVA突變體，其中該MVA突變體進一步包括編碼外源蛋白質(zhì)或其功能部分的DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的MVA突變體，其中所述外源蛋白質(zhì)是來源于由治療性多肽和病原體的多肽以及它們的功能部分所組成的組中的異源蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的MVA突變體，其中所述治療性多肽來源于由分泌蛋白質(zhì)，例如抗體多肽、趨化因子、細胞因子或干擾素所組成的組中。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的MVA突變體，其中所述病原體來源于由病毒、細菌、原生動物和寄生蟲，以及腫瘤細胞或與腫瘤細胞相關(guān)的抗原和它們的功能部分所組成的組中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的MVA突變體，其中所述病毒選自由流感病毒、麻疹和呼吸道合胞體病毒、登革熱病毒、人類免疫缺陷病毒、人類肝炎病毒、皰疹病毒或乳頭狀瘤病毒所組成的組中。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的MVA突變體，其中所述原生動物是惡性瘧原蟲。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的MVA突變體，其中所述細菌是引起結(jié)核病的分枝桿菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的MVA突變體，其中與腫瘤細胞相關(guān)的抗原選自由與黑色素瘤相關(guān)的分化抗原，例如酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)的蛋白質(zhì)1和2；睪丸癌抗原，例如MAGE-1、-2、-3和BAGE；和在腫瘤上過度表達的未突變的共享抗源，例如Her-2/neu、MUC-1和p53所組成的組中。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中的一項或多項所限定的MVA突變體用于抗癌治療或傳染疾病的預(yù)防。
11.一種藥物組合物，包括權(quán)利要求1-9中所述的一種或多種MVA突變體和藥學(xué)上可接受的載體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的藥物組合物，該組合物適合在體內(nèi)用于哺乳動物，優(yōu)選為人類。
13.一種產(chǎn)生突變體MVA的方法，包括以下步驟-用編碼權(quán)利要求2-9中所述的一種或多種MVA突變體的核酸侵染MVA的寄主細胞，-在所述寄主細胞中在適合的條件下表達所述核酸；和-分離表達的突變體MVA。
14.一種產(chǎn)生藥物組合物的方法，包括以下步驟-用編碼權(quán)利要求1-9中所述的一種或多種MVA突變體的核酸侵染MVA的寄主細胞，-在所述寄主細胞中在適合的條件下表達所述核酸，-分離表達的突變體MVA；-加入藥學(xué)上可接受的載體和生產(chǎn)藥物組合物的其它成分。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述寄主細胞是CEF細胞、來源于雞胚的LSCC-H32細胞、雞DF-1細胞或其它鳥類的細胞，如鵪鶉成纖維QT6或QT35細胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求13-15中的一項或多項所述的方法，其中突變體MVA是通過基于寄主范圍選擇方法的K1L基因而選擇的。
17.權(quán)利要求1-9中的一項或多項所限定的MVA突變體或權(quán)利要求11或12所述的藥物組合物在免疫治療和/或接種中的用途。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途，是在接種預(yù)防天花或由正痘病毒侵染引起的其他疾病中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及MVA病毒突變體及其在免疫治療和接種抵抗多種疾病中的用途，尤其是在預(yù)防和治療癌癥和感染性疾病中的用途。MVA IL1βR缺失突變體的構(gòu)建允許在體外和體內(nèi)分析MVA侵染引起的IL1βR合成的重要性。目前的資料顯示IL1βR基因的失活對MVA疫苗的開發(fā)是有益的。
文檔編號A61K39/285GK1842602SQ200480024419
公開日2006年10月4日 申請日期2004年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月29日
發(fā)明者卡羅琳·斯塔波, 格雷德·薩特, 斯格里德·凱斯林, 沃克·艾弗勒 申請人:蓋斯福研究中心健康和環(huán)境有限公司