專利名稱：亮菌強體護肝保健品原液的制備及改進亮菌劑型的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及了一種提高亮菌產量和改進亮菌劑型的強體護肝保健品的制備方法，屬于生物工程技術和制藥工藝領域。
背景技術：
隨著工業(yè)的發(fā)展，人類所依賴生存的環(huán)境也遭到嚴重的污染，許多有機物質對人體各個器官都有嚴重的危害，例如多種人造板材、膠粘劑、墻紙等都含有甲醛，甲醛是世界上公認的潛在致癌物，它刺激眼睛和呼吸道黏膜等，最終造成免疫功能異常、肝損傷、肺損傷及神經中樞系統(tǒng)受到影響；另外，酒精性肝病近年來在我國也達到了不容忽視的程度。酒精對于臟器損害，以肝臟最為嚴重，我國的酒民三億多人，其中酒精性肝病的發(fā)病率在百分之二十左右，如果因飲酒過度而使肝臟受到損傷，而不加以防治，其中很大部分會轉變?yōu)榫凭?，并有癌變的可能。而亮菌保健品可以通過其獨特的護肝作用對化學肝損傷患者，特別是酒精性肝病起到防護治療的作用。強體護肝保健品的開發(fā)，可以減少肝病患者的數量，增強患者的體質，具有較大的社會效益。
經研究，亮菌具有多種醫(yī)療保健功能，不僅能提高人體免疫能力，而且對化學肝損傷也有較好的療效。亮菌(假蜜環(huán)菌[Armillariella tabescens(Scop.ex Fr.)Sing])是為我國首次發(fā)現并擁有自主知識產權的一種真菌?！吨兴幋笤~典》記載亮菌為白蘑科真菌假蜜環(huán)菌的菌絲體，具有治療肝炎，膽囊炎，闌尾炎，中耳炎的主治功效。我國民間流傳作為治療急慢性肝炎及膽道疾病的中草藥。主要原因是在其發(fā)酵提取物中含有多種生物有效及活性成份，如亮菌甲、乙、丙素，亮菌多糖、多肽及氨基酸、微量元素、天然甘露醇。亮菌中含有多種不同成分的多糖，能提高機體的免疫作用，還具有輻射防護和升白作用，這是因為亮菌多糖能加速造血組織細胞DNA的合成；亮菌甲素是一種香豆素衍生物，具有消炎、解痙、止痛的功能，用于急性膽囊炎、急慢性肝炎、膽石癥和慢性淺表性、萎縮性胃炎；多肽和氨基酸提供了合理的能源底物維持氮平衡提高血漿中總蛋白、白蛋白的含量，使損傷的肝組織得以修復再生，另外氨基酸雖沒有免疫原性，但可起半抗原的作用與大分子載體結合成復合物，即可獲得免疫原性，刺激機體產生抗體或淋巴細胞，調整機體的免疫力。天然甘露醇能提高血漿滲透壓，使組織間液水分向血漿轉移而產生組織脫水作用，可使肝腹水病人迅速消除腹水。自其于二十世紀七十年代被發(fā)現以來，就一直用于治療肝炎，胃病及膽囊炎，其療效是相當肯定的。
現在市場已經有亮菌口服液出售，其產品主要采用價廉且易得的玉米粉、紅薯粉等按一定比例混合配制固體培養(yǎng)基，滅菌接種，然后在室內避光培養(yǎng)兩個月左右，取出后用熱水煮提，離心除雜質，加入輔料后制成成品。
其生產工藝流程如下培養(yǎng)基制備——亮菌接種發(fā)酵——沸水煮提——脫色除雜——加輔料分裝——成品。
但是明顯存在的問題是1.通過固態(tài)發(fā)酵無法實現工業(yè)化大規(guī)模的生產。目前以固體培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物一般只能在750毫升的菌種瓶中進行，培養(yǎng)時間較長，不易形成工業(yè)化規(guī)模的生產。2.在產品劑型上除亮菌口服液外還沒有其它相關劑型產品的出現，但是口服液具有服用劑量大，保藏期短，運輸不方便等缺點。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服上述缺點，提供一種提高亮菌的產量和改進亮菌劑型的強體護肝保健品的制備方法。
本發(fā)明是這樣實現的發(fā)明要解決的技術問題(1) 采用液體深層發(fā)酵，優(yōu)化培養(yǎng)條件，大大縮短發(fā)酵時間，在短時間內使菌絲得到充分的生長，提高了生產效率。
(2) 篩選出獨特的培養(yǎng)基配方，使亮菌經過代謝轉化的有效成分對提高免疫力和防治化學肝損傷更加有效。
(3) 通過有機溶劑沉淀、濃縮制備亮菌粉料，使其容易改造成不同劑型的保健品。
(4) 改進亮菌劑型，克服以前亮菌口服液的種種弊端，例如有效成分含量少，起效慢，不易運輸，難儲藏等。
所涉及的工藝流程包括亮菌——斜面培養(yǎng)——液體種子培養(yǎng)——發(fā)酵培養(yǎng)——收集(菌球并提煉和發(fā)酵液)——合并提取液和發(fā)酵液——脫色——成品(沖劑、片劑、膠囊)。所述工藝流程中的制作方法為
1亮菌各級菌種的制備a、菌種斜面培養(yǎng)將菌種無菌接于PDA斜面，放入28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)10-15天。
b、液體種子培養(yǎng)基為土豆汁20％、葡萄糖2％、磷酸二氫鉀0.3％、硫酸鎂0.15％、Vb1少量，PH 6.0。按常規(guī)方法配置，分裝轉入三角瓶中，加塞密封，蒸汽加壓至121℃滅菌，保壓30min后冷卻至25-28℃，接入斜面種子進行液體種子培養(yǎng)。
c、發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖3％、土豆汁14％、玉米粉5％、豆芽汁3％、氯化銨0.5％、磷酸二氫鉀0.05％、氯化鈣0.3％，PH 6.0。按常規(guī)方法配置，分裝轉入三角瓶中，加塞密封，蒸汽加壓至121℃滅菌，保壓30min后冷卻至25-28℃，接入液體種子進行發(fā)酵。
2接種方法和接種量的要求a、試管斜面采用接種針挑取菌絲接種；液體種子搖瓶接種是將培養(yǎng)好的斜面菌種割取1cm2，然后接種于250ml或500ml裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中；發(fā)酵培養(yǎng)接種采用直接取10％的搖瓶種子無菌操作轉入的方法。
b、各級種子培養(yǎng)條件各級種子培養(yǎng)制備的溫度28℃，液體種子搖瓶和擴大發(fā)酵140rpm搖床中振蕩避光培養(yǎng)6天。
3亮菌保健品原液的制備a、從發(fā)酵液中收集亮菌菌絲球，用沸水回流煮提兩次，合并兩次濾液。
b、將提取液和發(fā)酵液合并后離心除雜質。將上清液加熱至50℃，加入脫色劑攪拌5h脫色后，離心去雜質得亮菌保健品原液。
4保健品劑型的制備a、亮菌沖劑的制備在原液中加入淀粉30％、糊精20％、蔗糖粉10％等輔料，混勻后，將上述漿液進行噴霧干燥，噴霧干燥的進口溫度為110-150℃，出口溫度50-60℃。過篩40-60目，分裝。
b、亮菌片劑的制備將亮菌原液濃縮至1/10，加入75％的三倍乙醇沉淀過夜，收集沉淀，再用丙酮、乙醚連續(xù)洗滌，得干燥的粉末。按重量比亮菌粉末40、淀粉30、糊精20、蔗糖10混勻后以95％乙醇為濕潤劑，過20目篩網制成濕顆粒，于60℃烘箱中干燥至水分含量為5％，整粒(20目)，加3％滑石粉壓片。
c、亮菌膠囊的制備將亮菌原液濃縮至1/10，加入75％的三倍乙醇沉淀過夜，收集沉淀，再用丙酮、乙醚連續(xù)洗滌，得干燥的粉末。按重量比亮菌粉末40、淀粉35、糊精25混勻后以95％乙醇為濕潤劑，過40目篩網制成濕顆粒，于60℃烘箱中干燥至水分含量為5％，干燥的粉末過80-120目篩得膠囊內容物，填充膠囊即得亮菌膠囊。
本發(fā)明的有益效果在于1.生產工藝上采用液體深層發(fā)酵法，優(yōu)點在于培養(yǎng)基配方廉價，培養(yǎng)條件適宜亮菌的生長，大大縮短發(fā)酵時間，在短時間內使菌絲得到充分的生長，提高了生產效率。
2.獨特的培養(yǎng)基配方，經亮菌轉化后產生大量的生物活性物質，對提高免疫力和防治化學肝損傷更加有效。
3.首次發(fā)現并證明亮菌經發(fā)酵后的產物對化學肝損傷有預防和恢復的作用。
4.亮菌粉料的制備使制備劑型多，運輸方便，保存期長，也便于患者服用。
實施例實例1亮菌原液的制備1.菌種采用北京微生物菌種保藏中心的菌種[Armillariella tabescens(Scop.ex Fr.)Sing]2.菌種斜面培養(yǎng)將購的菌種無菌接于PDA斜面，放入28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)10-15天。
3.制備搖瓶液體種子割取培養(yǎng)好的斜面菌種接于250ml或500ml裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置28℃、140rpm搖床中振蕩避光培養(yǎng)7天。上述液體種子培養(yǎng)基為土豆汁20％、葡萄糖2％、磷酸二氫鉀0.3％、硫酸鎂0.15％、Vb1少量，PH 6.0。
4.亮菌發(fā)酵將液體種子按發(fā)酵培養(yǎng)基的10％接種量接種，置24℃、140rpm搖床振蕩培養(yǎng)6d。發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖3％、土豆汁14％、玉米粉5％、豆芽汁3％、氯化銨0.5％、磷酸二氫鉀0.05％、氯化鈣0.3％、PH6.0。
5.從發(fā)酵液中收集亮菌菌絲球，用沸水回流煮提兩次，合并兩次濾液6.將提取液和發(fā)酵液合并后離心除雜質。將上清液加熱至50℃，加入脫色劑攪拌5h脫色后，離心去雜質得亮菌保健品原液。
實例2亮菌沖劑的制備在原液中加入淀粉20％、糊精20％、蔗糖粉10％等輔料，混勻后，將上述漿液進行噴霧干燥，噴霧干燥的進口溫度為110-150℃，出口溫度50-60℃。過篩40-60目，分裝。主要技術指標如下有效多糖22.1％，蛋白質15.6％，多肽11.3％，水分4.3％。
實例3亮菌片劑的制備將亮菌原液濃縮至1/10，加入75％的三倍乙醇沉淀過夜，收集沉淀，再用丙酮、乙醚連續(xù)洗滌，得干燥的粉末。按重量比亮菌粉末40、淀粉30、糊精20、蔗糖10混勻后以95％乙醇為濕潤劑，過20目篩網制成濕顆粒，于60℃烘箱中干燥至水分含量為5％，整粒(20目)，加3％滑石粉壓片。每片重量0.4g。產品主要技術指標如下有效多糖26.5％，蛋白質17.8％，多肽12.1％，水分4.1％。
實例4亮菌膠囊的制備，將亮菌原液濃縮至1/10，加入75％的三倍乙醇沉淀過夜，收集沉淀，再用丙酮、乙醚連續(xù)洗滌，得干燥的粉末。按重量比亮菌粉末40、淀粉30、糊精20、蔗糖10混勻后以95％乙醇為濕潤劑，過40目篩網制成濕顆粒，于60℃烘箱中干燥至水分含量為5％，干燥的粉末過80-120目篩得膠囊內容物，填充膠囊即得亮菌膠囊。主要技術指標如下有效多糖28.6％，蛋白質16.7％，多肽11.8％，水分4.5％。
本發(fā)明的動物實驗一、動物免疫實驗實驗材料1、菌種假蜜環(huán)菌[Armillariella tabescens(Scop.ex Fr.)Sing]購自北京中科院微生物研究所。
2、動物小鼠、豚鼠由四川省中藥研究所動物實驗中心提供。
實驗方法吞噬功能實驗體液免疫功能的檢測(溶血素含量的測定)
實驗結果對小鼠RES吞噬功能的影響從表3-1中可見，亮菌多糖高劑量組與正常組相比小鼠的吞噬系數有顯著差異(P＜0.01)，吞噬系數明顯增高，但對吞噬指數和免疫器官卻沒有明顯影響。說明一定劑量的亮菌多糖可增強小鼠RES吞噬功能，但不是促進吞噬細胞的增殖。
表3-1 亮菌多糖及亮菌口服液對小鼠RES吞噬功能的影響藥物劑量 動物數吞噬指數 吞噬系數(mg/10g·d)(只)Ka對照組- 9 0.0539±0.01616.13±0.75亮菌多糖1.8 11 0.0692±0.02327.18±0.74***P≤0.05**P≤O.01表3-2 亮菌多糖及亮菌口服液對小鼠免疫器官的影響藥物劑量肝/體重脾/體重(mg/10g)對照組- 0.05405±0.0056 0.006833±0.001861亮菌多糖組 1.80 0.05059±0.0062 0.006318±0.002129*P≤0.05**P≤0.01對小鼠溶血素抗體生成的影響與環(huán)磷酰胺組比較，亮菌多糖對于環(huán)磷酰胺所致的免疫低下的小鼠有顯著的增強免疫的作用；與正常對照組比較，亮菌多糖對正常小鼠的吞噬功能沒有顯著增強趨勢(表3-3)。
表3-3 亮菌多糖及亮菌口服液對小鼠溶血素形成的影響組別劑量動物數溶血素形成(mg/10g·d) (只) (O.D值)環(huán)磷酰胺+亮菌多糖 1.89 0.3387±0.1563*環(huán)磷酰胺組 - 9 0.1649±0.1257亮菌多糖組 1.8 10 0.2301±0.1317正常對照組 - 9 0.1948±0.0987*P≤0.05討論本實驗選用亮菌多糖作為研究對象，測定了亮菌多糖對小鼠體液免疫和細胞免疫功能的影響。通過對小鼠RES吞噬活性、血清溶血素值測定，結果表明亮菌多糖體內給藥能顯著提高小鼠的吞噬系數，激活小鼠網狀內皮系統(tǒng)，增強其吞噬功能；能顯著增強環(huán)磷酰胺所致的免疫低下小鼠的體液免疫功能。
二、動物保肝實驗實驗材料動物小鼠由四川省中藥研究所動物實驗中心提供藥品和試劑 亮菌多糖溶液(低劑量0.1g/kg；中劑量0.2g/kg；高劑量0.4g/kg)；0.1％四氯化碳(用油配)；ACP試劑盒(批號1003041)實驗方法(1)小鼠分組50只小鼠隨機分成5組(雌雄各半)，第一組為正常對照組；第二組為模型組；第三、四、五組為喂藥組(固體)，分為低劑量0.2g/kg、中劑量0.4g/kg、高劑量組0.8g/kg，每天以0.1ml/10g灌胃一次，連續(xù)喂藥7天；第六、七、八組為給藥組(液體)，分為低劑量0.2g/kg、中劑量0.4g/kg、高劑量組0.8g/kg，每天以0.1ml/10g灌胃一次，連續(xù)喂藥7天；(2)造型第7天灌胃半小時后，劑量組與模型組腹腔注射0.1％四氯化碳(0.1mg/10g)。
(3)造型后的第二天眼眶取血1-2ml，2400rpm離心15min，取血清。
(4)檢測指標血清谷丙轉氨酶(ALT)。
實驗結果藥物劑量動物數血清谷丙轉氨酶(ALT)(mg/10g·d) (只) (KarU)對照組 -1061.5318±23.4273模型組 -10181.6650±57.6920液體發(fā)酵亮菌多糖20 10120.3698±54.0843*低劑量組液體發(fā)酵亮菌多糖40 10108.4475±38.1581**中劑量組液體發(fā)酵亮菌多糖807102.5838±38.2817**高劑量組*P≤0.05**P≤0.01結果分析通過給小鼠注射四氯化碳造肝損傷模型，最后取血檢測ALT，亮菌多糖組與模型組進行比較結果表明液體發(fā)酵亮菌多糖低劑量組對化學肝損傷的預防起到了顯著效果；液體發(fā)酵亮菌多糖中劑量組和高劑量組對化學肝損傷的預防效果比低劑量組更好。
亮菌保健品的用途和使用效果亮菌作為一種藥用真菌。它可以為人們提供多種營養(yǎng)物質，在其液體發(fā)酵培養(yǎng)物的培養(yǎng)液中存在大量的多糖和蛋白質，除此之外還存有大量亮菌甲素，亮菌乙素，亮菌丙素，甘露醇，及精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、胱氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、絲氨酸等十三種氨基酸，其中含有八種人體必須但是不能自身合成的氨基酸，及其它多種有益成分，可對造成人類健康威脅的許多疾病起著預防和治療的作用。歸納起來看，亮菌保健品對人體的保健功能主要有下列一些1.提高人體免疫力2.對化學肝損傷有一定療效3.防輻射作用4.治療肝炎、胃炎、膽囊炎雖然亮菌已進入真菌藥物的市場，但是由于其制備工藝及產品劑型等原因，還未形成較大的市場，因此亮菌保健品的開發(fā)必將具有美好的前程。
權利要求
1.一種亮菌強體護肝保健品原液的制備及改進亮菌劑型的方法。所涉及的工藝流程包括 其特征在于亮菌各級菌種的制備a、菌種斜面培養(yǎng)將菌種無菌接于PDA斜面，放入28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)10-15天。b、液體種子培養(yǎng)基為土豆汁20％、葡萄糖2％、磷酸二氫鉀0.3％、硫酸鎂0.15％、Vb1少量，PH6.0。按常規(guī)方法配置，分裝轉入三角瓶中，加塞密封，蒸汽加壓至121℃滅菌，保壓30min后冷卻至25-28℃，接入斜面種子。
2.根據權利要求1所述的提高亮菌產量和改進亮菌劑型的方法。其特征在于接種方法和接種量的要求a、試管斜面采用接種針挑取菌絲接種；液體種子搖瓶接種是將培養(yǎng)好的斜面菌種割取1cm2，然后接種于250ml或500ml裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中；發(fā)酵培養(yǎng)接種采用直接取10％的搖瓶種子無菌操作轉入的方法。b、各級種子培養(yǎng)條件各級種子培養(yǎng)制備的溫度28℃，液體種子搖瓶和擴大發(fā)酵140rpm搖床中振蕩避光培養(yǎng)6天。
3.權利要求1和2所述的提高亮菌產量和改進亮菌劑型的強體護肝保健品的制備方法。其特征在于亮菌保健品原液的制備a、從發(fā)酵液中收集亮菌菌絲球，用沸水回流煮提兩次，合并兩次濾液。b、將提取液和發(fā)酵液合并后離心除雜質。將上清液加熱至50℃，加入脫色劑攪拌5h脫色后，離心去雜質得亮菌保健品原液。
4.根據權利要求1、2和3所述的提高亮菌產量和改進亮菌劑型的方法。其特征在于保健品劑型的制備a、亮菌沖劑的制備在原液中加入淀粉30％、糊精20％、蔗糖粉10％等輔料，混勻后，將上述漿液進行噴霧干燥，噴霧干燥的進口溫度為110-150℃，出口溫度50-60℃。過篩40-60目，分裝。b、亮菌片劑的制備將亮菌原液濃縮至1/10，加入75％的三倍乙醇沉淀過夜，收集沉淀，再用丙酮、乙醚連續(xù)洗滌，得干燥的粉末。按重量比亮菌粉末40、淀粉30、糊精20、蔗糖10混勻后以95％乙醇為濕潤劑，過20目篩網制成濕顆粒，于60℃烘箱中干燥至水分含量為5％，整粒(20目)，加3％滑石粉壓片。c、亮菌膠囊的制備將亮菌原液濃縮至1/10，加入75％的三倍乙醇沉淀過夜，收集沉淀，再用丙酮、乙醚連續(xù)洗滌，得干燥的粉末。按重量比亮菌粉末40、淀粉35、糊精25混勻后以95％乙醇為濕潤劑，過40目篩網制成濕顆粒，于60℃烘箱中干燥至水分含量為5％，干燥的粉末過80-120目篩得膠囊內容物，填充膠囊即得亮菌膠囊。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種亮菌強體護肝保健品原液的制備及改進亮菌劑型的方法。其工藝采用微生物液體深層發(fā)酵及現代中藥制劑方法，該方法能提高亮菌產量和改進亮菌劑型。所涉及的工藝流程除傳統(tǒng)工藝流程外還包括菌種斜面培養(yǎng)、液體種子培養(yǎng)和擴大發(fā)酵。制作方法為菌種斜面培養(yǎng)，在液體種子培養(yǎng)基中接入斜面種子，在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入液體種子發(fā)酵，通過收集發(fā)酵液及提取菌球中的有效成分，經脫色、濃縮加工為1.沖劑；2.片劑；3.膠囊。本發(fā)明有效地提高了亮菌產量和改進了亮菌的劑型。
文檔編號A61K35/66GK1569044SQ20041002248
公開日2005年1月26日 申請日期2004年5月11日 優(yōu)先權日2004年5月11日
發(fā)明者孫啟玲, 高婷, 白家峰, 何晨, 陳智, 陳詠竹 申請人:四川大學