專利名稱：抗血管生長組合物及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是申請日為1994年7月19日的中國專利申請94193379.2的分案申請，原申請的發(fā)明名稱為“抗血管生長組合物及使用方法”。
本發(fā)明涉及治療癌癥和其它血管生長依賴疾病的組合物及方法，更具體地，涉及含有抗血管生長因子和聚合載體的組合物、用這些組合物包衣的斯坦特固定模，以及使用這些斯坦特固定模和組合物的方法。
癌癥是在美國引發(fā)死亡的第二種主要原因，并且占總死亡數(shù)的五分之一強。簡而言之，癌癥以細胞群的分裂不可控制為特征，其一般導(dǎo)致形成一種或幾種腫瘤。盡管癌癥一般比過去更易于診斷，甚至更早發(fā)現(xiàn)，但其仍然不能治愈。
目前有許多方法用于治療癌癥，包括例如各種外科方法。如果單獨使用外科，很多患者(尤其是那些患有某些癌癥的患者，例如乳腺癌、腦癌、結(jié)腸癌和肝癌)會復(fù)發(fā)。除了外科，許多癌癥可以用聯(lián)合治療法治療，包括細胞毒性化療藥物(如長春新堿、長春堿、順氯氨鉑、甲氨喋呤、5-FU等)和/或放射療法。這種方法的困難在于，放療和化療藥物對正常組織也有毒性，并且經(jīng)常產(chǎn)生致命的副作用。此外，這些方法通常具有特別高的失敗/緩解率。
除了外科、化學(xué)和放射療法，有人試圖用個人的自身免疫系統(tǒng)來消除癌細胞。例如，一些人建議用細菌或病毒成分作為佐劑來刺激免疫系統(tǒng)，從而破壞腫瘤細胞。(見″PirnciplesofCancerBiotherapy，″Oldham(ed.)，RavenPress，NewYork，1987。)這些藥物通常在動物腫瘤模型中用作佐劑和非特異性刺激劑，但是還沒有證明其在人體中普遍有效。
淋巴因子也用來治療癌癥。簡而言之，淋巴因子通過各種細胞分泌，并且通常在產(chǎn)生免疫應(yīng)答中對特定細胞有作用。淋巴因子的例子有白細胞介素(IL)-1，-2，-3和-4，以及白細胞集落刺激因子如G-CSF、GM-CSF和M-CSF。近來，有人用IL-2刺激外周血細胞從而擴大并產(chǎn)生大量對腫瘤細胞有胞毒性的細胞(Rosenbergetal.，N.Engl.J.Med.3131485-1492，1985)。
另外有人建議用抗體治療癌癥。簡而言之，抗體可以識別特定的細胞表面抗原(其可以是獨特的，或者與正常細胞相比在癌細胞中占多數(shù))。這些抗體，或者稱“魔術(shù)子彈”，可以單獨或與一種毒素聯(lián)合使用，從而特異識別并殺死腫瘤細胞(Dillman，″AntibodyTherapy，″PrinciplesofCancerBiotherapy，Oldham(ed.)，RavenPress，Ltd.，NewYork，1987)。但是，困難在于大多數(shù)單克隆抗體為鼠源，這樣對鼠抗體的高度敏感性限制了其的有效性，尤其是在重復(fù)治療后。常見的副作用包括發(fā)熱、出汗和寒戰(zhàn)、皮疹、關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)麻痹。
現(xiàn)有方法的另外一個難點是，局部復(fù)發(fā)及局部疾病的控制仍然是治療惡性腫瘤的一個主要挑戰(zhàn)。特別地，每年有總數(shù)為630,000的患者(美國)在疾病出現(xiàn)時疾病已定位(沒有遠距離遷移傳播的跡象)；其代表了64％所有被診斷為惡性腫瘤的患者(不包括非黑瘤皮膚癌或原位癌)。對這些患者的大多數(shù)而言，外科切除是治愈的最主要的機會，并且的確有428,000患者在最初治療后會治愈。不幸的是，202,000位患者(即32％的患者疾病已確定)在最初治療后會復(fù)發(fā)。在這些復(fù)發(fā)者中，每年有133,000人是由于疾病的局部復(fù)發(fā)而引起的(占所有定位疾病患者的21％)。每年因疾病遠距離遷移引發(fā)的數(shù)目是68,000人(占所有定位疾病的11％)。另外102，139位患者每年將由于不能控制疾患的局部發(fā)展而死亡。
這一問題在乳腺癌中更明顯，其在美國每年影響186,000個婦女并且其的死亡率經(jīng)50年仍保持不變。通過乳房徹底切除術(shù)、修飾的基本乳房切除術(shù)或者腫塊切除術(shù)進行外科切除疾患是這種疾病的主要治療方法。不幸的是，單獨施用腫塊切除術(shù)的39％的患者會局部復(fù)發(fā)疾病，令人吃驚的是，發(fā)現(xiàn)25％的患者在切除的邊緣清楚地留有原始腫瘤(組織學(xué)上)。局部復(fù)發(fā)的90％發(fā)生在先前切除位點2厘米之內(nèi)。
類似地，1991年，單單在北美就報道了逾113,000例死亡和238,000例新型肝轉(zhuǎn)移?；加懈无D(zhuǎn)移患者在發(fā)生肝損害后的平均生存時間僅為6.6個月。對肝性轉(zhuǎn)移的非外科治療包括系統(tǒng)化療、放射化學(xué)栓塞、肝動脈化療及動脈內(nèi)化療。但是，盡管這些治療可以暫時減小肝損害灶的大小(例如，系統(tǒng)化療和肝動脈化療最初分別減小了損害的15-20％和80％)，損害在不同程度又復(fù)發(fā)。外科切除肝轉(zhuǎn)移僅代表了治愈的可能性，但是這種方法僅對5％患有癌轉(zhuǎn)移的患者以及15-20％患有原發(fā)肝癌的患者是可能的。
一種試圖治療腫瘤的具有有限成功率的方法是治療性栓塞。簡而言之，通過向血管注入一種栓塞物而將滋生腫瘤的血管完全堵塞。已嘗試了許多物質(zhì)，包括自身性物質(zhì)例如脂肪、血塊和切下的肌肉碎片以及人造物質(zhì)如棉、毛、鋼球、塑料或玻璃球、肽粉、硅酮化合物、放射性顆粒、無菌吸收性明膠海綿(Sterispon，Gelforam)、氧化纖維素(oxycel)、鋼圈、乙醇、凍干人硬腦脊膜(Lyodura)、微原纖維膠原蛋白(Avitene)、膠原纖維(Tachotop)、聚乙烯醇海綿(PVA；Ivalon)、充盈鋇劑的硅球(Biss)和可分離的氣囊。通過使用這類物質(zhì)可暫時減小肝轉(zhuǎn)移的大小，但是腫瘤一般卻以引起新的血管生長成腫瘤而作為應(yīng)答。
與腫瘤形成有關(guān)的一個問題是形成抑制物質(zhì)通過體內(nèi)通道(如膽管、氣管、食管、脈管系統(tǒng)和尿道)的癌性阻斷。已開發(fā)了一種裝置-斯坦特固定模以固定已被腫瘤或其它物質(zhì)阻塞的開放通道。普通斯坦特固定模的代表性的例子包括Wall斯坦特固定模、Streckers斯坦特固定模、Gianturco斯坦特固定模和Palmaz斯坦特固定模。然而斯坦特固定模的主要問題是它們不能阻止腫瘤或炎性物質(zhì)通過斯坦特固定模的小間隙向內(nèi)生長。如果這種物質(zhì)到達斯坦特固定模的內(nèi)部并且損害斯坦特固定模腔，其可以導(dǎo)致插入斯坦特固定模的體內(nèi)通道的阻塞。此外，體內(nèi)存在斯坦特固定模可以誘導(dǎo)反應(yīng)性或炎性組織(例如血管、成纖維細胞和白細胞)進入斯坦特固定模腔，從而導(dǎo)致斯坦特固定模部分或全部阻塞。
本發(fā)明提供了適用于治療癌癥及其它血管生長依賴性疾病的組合物和方法，其致力于有關(guān)上述討論的問題，并且進一步提供了其它相關(guān)的優(yōu)點。
簡而言之，本發(fā)明提供了抗血管生長組合物以及使用該組合物治療癌癥和其它血管生長依賴性疾病的方法和裝置。本發(fā)明一方面提供了含有(a)一種抗血管生長因子和(b)一種聚合物載體的組合物(此后稱為“抗血管生長組合物”)。許許多多的分子可用作本發(fā)明范圍內(nèi)的抗血管生長因子，包括例如抗侵襲因子、視黃酸及其衍生物、紅豆杉醇、紅豆杉醇類似物及紅豆杉醇衍生物、包括蘇拉明、金屬蛋白酶-1的組織抑制劑、金屬蛋白酶-2的組織抑制劑、纖溶酶原抑制物激活劑-1和纖溶酶原抑制物激活劑-2。類似地，也可使用許許多多的聚合物載體，代表性的例子有與40％乙烯乙酸酯交聯(lián)的聚(乙烯乙酸乙烯酯)、聚(乳酸-聯(lián)-乙醇酸)、聚己內(nèi)酯聚乳酸、與40％乙烯乙酸酯交聯(lián)的聚(乙烯乙酸乙烯酯)及聚乳酸的共聚物和聚乳酸及聚己內(nèi)酯的共聚物。本發(fā)明的一個實例是組合物的平均粒度為15至200μm。
本發(fā)明另一方面提供了栓塞血管的方法，其包括將治療活性量的抗血管生長組合物釋入血管中(如上所述)，這樣有效地堵塞了血管。其中一個實例是，將抗血管組合物釋入滋生腫瘤的血管中。
本發(fā)明另外還提供了包括管狀結(jié)構(gòu)、表面用一種或多種抗血管生長組合物的斯坦特固定模。本發(fā)明也提供了擴充體內(nèi)通道腔的方法，其包括將斯坦特固定模插入通道，固定膜一般具有管狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的表面包衣有如上所述的抗血管生長組合物，這樣通道就被擴充。本發(fā)明的各種實例中，提供了包括將膽斯坦特固定模插入膽管而消除膽梗阻的方法；將尿道斯坦特固定模插入尿道而消除尿道梗阻的方法；將食道斯坦特固定模插入食道而消除食道梗阻的方法；將氣管/支氣管斯坦特固定模插入氣管或支氣管而消除氣管/支氣管梗阻的方法。在每一個實例中，斯坦特固定模一般為管狀結(jié)構(gòu)，其表面用如上所述的抗血管生長組合物包衣。
本發(fā)明另一方面還提供了治療腫瘤切除部位的方法，其包括將上述抗血管生長組合物施于切除腫瘤后的切除邊緣，這樣就抑制了癌癥的局部復(fù)發(fā)及該部位新血管的形成。本發(fā)明還提供了治療角膜新血管形成的方法，其包括將治療有效量的抗血管生長組合物施于上述角膜，這樣就抑制了血管的形成。其中一個實例中，抗血管組合物進一步包括一種局部皮質(zhì)甾類化合物。
本發(fā)明另一方面提供了抑制患有非致瘤性血管生長依賴疾病患者血管生長的方法，其包括對患有非致瘤性血管生長依賴性疾病的患者給予治療有效量的含有紅豆杉醇的組合物，這樣就抑制了新的血管的形成。另一方面，本發(fā)明提供了在非致瘤性血管生長依賴性疾病中使用栓塞血管的方法，其包括將治療有效量的含有紅豆杉醇的組合物轉(zhuǎn)運至血管中，這樣就有效地阻塞了血管。
本發(fā)明另一方面提供了擴充體內(nèi)通道腔的方法，其包括將斯坦特固定模插入通道中，該斯坦特固定模一般具有管狀結(jié)構(gòu)，并且結(jié)構(gòu)的表面包衣有含紅豆杉醇的組合物，這樣通道就被擴充。在本發(fā)明各種實例中，提供了包括將膽斯坦特固定模插入膽管而消除膽梗阻的方法；將尿道斯坦特固定模插入尿道而消除尿道梗阻的方法；將食道斯坦特固定模插入食道而消除食道梗阻的方法；將氣管/支氣管斯坦特固定模插入氣管或支氣管而消除氣管/支氣管梗阻的方法。在每一個實例中，斯坦特固定模一般為管狀結(jié)構(gòu)，其表面用含有紅豆杉醇的組合物包衣。
本發(fā)明另一方面還提供了治療腫瘤切除部位的方法，其包括將含紅豆杉醇的組合物施于切除腫瘤后的切除邊緣，這樣就抑制了癌癥的局部復(fù)發(fā)及該部位新血管的形成。本發(fā)明還提供了治療角膜新血管形成的方法，其包括將治療有效量的含紅豆杉醇的組合物施于上述角膜，這樣就抑制了新血管的形成。
本發(fā)明另一方面還提供了藥用產(chǎn)品，其包括(a)紅豆杉醇(在容器中)及(b)與容器有關(guān)的一個由政府機構(gòu)許可的關(guān)于藥物的生產(chǎn)、使用和銷售的通告，該通告表明有關(guān)機構(gòu)同意將紅豆杉醇用于人用或獸用來治療非致瘤性血管生長依賴性疾病。簡而言之，聯(lián)邦法律要求一種用于治療人體的藥劑必須獲得聯(lián)邦政府機構(gòu)的許可。實施職責(zé)(美國)由FoodandDrugAdministration決定，其頒布了保證這種許可的適當(dāng)規(guī)則，詳見21U.S.C.§§301-392。在42U.S.C.§262下也提供了含有來源于動物組織產(chǎn)品的生物材料的規(guī)則。大多數(shù)國家要求類似的許可，盡管每個國家的規(guī)則有所不同。
本發(fā)明的這些方面在參考了以下細節(jié)描述及附圖后會更明顯。此外，其后列出的各種參考文獻在細節(jié)上描述了某些方法或組合物，并且其作為參考。


圖1A表示第6天的無殼蛋培養(yǎng)物圖。圖1B是用立體顯微鏡對活的未染色毛細管的一個數(shù)字轉(zhuǎn)換計算機成像(1040×)。圖1C為一個腐蝕模型，其表示由較大的血管提供的CAM微脈管系統(tǒng)(箭頭；1300×)。圖1D是橫向切開CAM的一個0.5mm厚的塑性部分(光學(xué)顯微鏡水平記錄)。本圖顯示了CAM的組成，包括外部的雙層外胚層(Ec)、具有毛細管(箭頭)和散在外膜細胞的中胚層(M)以及單層內(nèi)胚層(En)(400×)。圖1E是一個電子顯微鏡水平(3500×)圖，其中顯示出典型的毛細管結(jié)構(gòu)(薄壁內(nèi)皮細胞，箭頭)和相關(guān)的外膜細胞。
圖2A、2B、2C及2D是4個不同的未染色CAM在接觸紅豆杉醇48小時后的系列數(shù)字化成像。
圖3A、3B及3C是在無血管區(qū)于3個不同位置通過紅豆杉醇處理的CAM橫向切開的0.5mm塑性部分系列圖。
圖4A。4B及4C是電子顯微攝影拍攝到的分別類似于上述圖3A、3B及3C部位的系列圖。
圖5是一個通過(10mg蘇拉明鈉結(jié)合到5％PVA中的5％ELVAX)個數(shù)表達的微球粒度條形分布圖。
圖6是一個通過(10mg蘇拉明鈉結(jié)合到5％PVA中的5％ELVAX)重量表達的微球粒度條形分布圖。
圖7表示蘇拉明鈉在1ml5％ELVAX中的包囊重量線性圖。
圖8表示蘇拉明鈉在ELVAX中的包囊百分比線性圖。
圖9表示含有10mg蘇拉明鈉(在含有10％氯化鈉的5％PVA中制備)的5％ELVAX微球粒度分布條形圖。
圖10表示含有10mg蘇拉明鈉(在含有10％氯化鈉的5％PVA中制備)的5％重量的PLL微球粒度分布條形圖。
圖11表示含有10mg蘇拉明鈉(在含有10％氯化鈉的5％PVA中制備)的5％個數(shù)的PLL微球粒度分布條形圖。
圖12表示蘇拉明鈉釋放時間線性圖。
圖13表示肝腫瘤栓塞的代表性實例圖。
圖14表示用本發(fā)明抗血管生長組合物包衣的代表性斯坦特固定模插入圖。
圖15A表示在微球聚集時EVA∶PLA混合比例的影響圖。圖15B是一個掃描電子顯微攝影圖，其表示出“小”微球的大小。圖15C是一個掃描電子顯微攝影圖，其表示出“大”微球的大小。圖15D表示于在體外紅豆杉醇從0.6％w/v裝載紅豆杉醇的50∶50EVA∶PLA聚合物混合物微球中釋放入于37℃磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4)中的時間圖。圓圈為“小”顆粒的微球，黑點是“大”顆粒的微球。圖15E是一個CAM圖，其表示紅豆杉醇從微球(“MS”)釋放的結(jié)果。圖15F是15E在放大倍數(shù)的類似圖。
圖16表示從含有1％、2％、5％或10％紅豆杉醇的聚己內(nèi)酯微球到磷酸鹽緩沖鹽水中(37℃)的釋放速率圖。圖16B表示用對照組微球處理的CAM圖。圖16C表示用裝載5％紅豆杉醇的微球處理的CAM圖。
圖17A及17B分別表示紅豆杉醇從EVA薄膜的釋放圖及殘留在同一薄膜中紅豆杉醇百分?jǐn)?shù)的時間圖。圖17C表示不含紅豆杉醇時EVA/F127薄膜膨脹的時間圖。圖17D表示不含紅豆杉醇時EVA/Span80薄膜膨脹的時間圖。圖17E表示不同EVA/F127混合物的應(yīng)力對張力曲線圖。
圖18A和18B表示PCL/MePEG聚合物混合物的熔點圖(MePEG在制劑中的％)(圖18A)，及PCL糊劑在60℃開始固化時所需時間的增加百分?jǐn)?shù)(MePEG在制劑中的重量)(18B)。圖18C表示不同PCL/MePEG聚合物混合物的脆性圖。圖18D表示不同MePEG濃度的聚合物混合物百分重量變化時間圖。圖18E表示紅豆杉醇從裝載1％紅豆杉醇的不同聚合物混合物中的釋放速率時間圖。圖18F和18G表示不同量紅豆杉醇對從20％MePEG/PCL聚合物中釋放紅豆杉醇總量的影響。圖18H表示MePEG對MePEG/PCL聚合物抗拉強度的影響。
圖19A表示CAM上的對照組熱糊(未帶有)圖。圖19B表示CAM上的帶有20％紅豆杉醇的熱糊圖。
圖20A和20B是兩個用對照組熱糊(未帶有)處理CAM腫瘤的圖。圖20C和20D表示兩個用帶有紅豆杉醇熱糊處理CAM腫瘤的圖。
圖21A表示紅豆杉醇/PCL對腫瘤生長的影響。圖21B和21C表示對照組、帶有10％及20％紅豆杉醇熱糊對腫瘤生長的影響。
圖22A表示注射PBS的關(guān)節(jié)滑膜。圖22B表示注射微球的關(guān)節(jié)滑膜。圖22C表示注射PBS的關(guān)節(jié)軟骨，圖22D表示注射微球的關(guān)節(jié)軟骨。
如上所述，本發(fā)明提供了使用抗血管生長因子的方法及組合物。簡而言之，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，抗血管生長因子應(yīng)理解為包括任何蛋白質(zhì)、肽、可用于抑制血管生長的化學(xué)或其它分子?？梢岳酶鞣N方法確定給定因子的抗血管生長活性，包括例如雞絨毛膜尿囊膜(″CAM″)測定。簡而言之，如下述實施例2A和2C中所述，除去新鮮雞受精卵的部分蛋殼，將待檢測的含有抗血管生長因子試樣的甲基纖維素盤置于膜上。幾天后(例如48小時)，待測試樣的血管生長抑制性即可通過包圍甲基纖維素盤區(qū)域的雞絨毛膜尿囊膜的顯影來確定。血管生長的抑制性也可以定量確定，例如通過將包圍甲基纖維素盤的血管的數(shù)量和大小與一個對照甲基纖維素盤比較。適用于本發(fā)明范圍內(nèi)的特別優(yōu)選的抗血管生長因子可完全抑制上述測定中新血管的形成。
也可使用各種測定方法來確定體內(nèi)抗血管生長因子的有效性，包括例如已發(fā)展用于此目的的鼠模型(見Roberstonetal.，Cancer.Res.511339-1344，1991)。此外，與本發(fā)明不同方面有關(guān)的各種代表性體內(nèi)測定詳細描述于下述實施例5至7及17至19。
如上所述，本發(fā)明提供了含有抗血管生長因子和聚合物載體的組合物。簡而言之，在本發(fā)明范圍內(nèi)可使用許許多多的抗血管生長因子。代表性的例子包括抗侵襲因子、視黃酸及其衍生物、紅豆杉醇、含有蘇拉明、金屬蛋白酶-1的組織抑制劑、金屬蛋白酶-2的組織抑制劑、纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑-1和纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑-2的物質(zhì)。這些以及其它抗血管生長因子將在下面詳細討論。
簡而言之，已知了從軟骨萃取物中制備的抗侵襲因子或者“AIF”含有抗新血管生長的成分。這些成分包括7種低分子量的蛋白質(zhì)(＜50,000)(KuettnerandPauli，“Inhibitionofneovasculizationbyacartilagefactor(通過軟骨因子抑制新血管生長)”inDevelopmentoftheVascularSystem，PitmanBooks(CibaFoundationSymposium100)，第163-173頁，1983)，其包括對各種蛋白酶有抑制作用的各種蛋白質(zhì)(Eisenteinetal，Am.J.Pathol.81337-346，1975；Langeretal.，Science19370-72，1976；andHortonetal.，Science1991342-1345，1978)。適用于本發(fā)明范圍內(nèi)的AIF可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)制備(例如Eisenteinetal，supra；KuettnerandPauli，supra；andLangeretal.，supra)。AIF的純化成分例如軟骨來源的抑制劑(“CDI”)(見Mosesetal.，Science2481408-1414，1990)在本發(fā)明范圍內(nèi)也易于制備和使用。
視黃酸改變了細胞外基質(zhì)組分的代謝，從而抑制血管生長?？梢允褂酶彼犷愃莆锏募映晌铩⒀芊€(wěn)定甾類化合物或肝素來協(xié)同增加轉(zhuǎn)視黃酸的抗血管生長作用。在本發(fā)明范圍內(nèi)也可使用視黃酸及其衍生物，其易于從商業(yè)途徑獲得，包括例如SigmaChemicalCo.(#R2625)。
紅豆杉醇是一種高度衍生化的雙萜(Wanietal.，J.Am.Chem.Soc.932325，1971)，其從成熟干燥的TaxusBrevifolia(PacificYew.)和TaxomycesAndreanaeandEndophyticFungusofthePacificYew.(Stierleetal.，Science60214-216，1993)的樹皮獲得。一般地，紅豆杉醇的作用是通過結(jié)合微管蛋白形成異常有絲分裂紡錘體來穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)?！凹t豆杉醇”(在此應(yīng)理解為包括紅豆杉醇的類似物和衍生物，例如漿果赤霉素和taxotere也可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)制備(見WO94/07882，WO94/07881，WO94/07880，WO94/07876，WO93/23555，WO93/10076，美國專利5294637，5283253，5279949，5274137，5202448，5200534，5229526和EP590267)或由各種商業(yè)途徑獲得，包括例如SigmaChemicalCo.，St.louis，Missouri(T7402-來自Taxus brevifolia)。
蘇拉明是一個聚磺化萘基脲化合物，其一般用作殺錐蟲劑。簡而言之，蘇拉明阻斷了結(jié)合各種生長因子例如血小板來源的生長因子(“PDGF”)、表皮生長因子(“EGF”)、轉(zhuǎn)化生長因子(“TGF-β”)、類胰島素生長因子(“IGF-1”)、成纖維母細胞生長因子(“βFGF”)的特異細胞表面。蘇拉明可以按照已知技術(shù)制備，或者由各種商業(yè)途徑獲得，包括例如MobayChemicalCo.，NewYork(見Gagliardietal.，CancerRes.52-5073-5075，1992；andCoffey，Jr.，etal.，J.ofCellPhys.132143-148，1987)。
金屬蛋白酶-1組織抑制劑(“TIMP-1”)分泌MPT酶的內(nèi)皮細胞分泌。TIMP為糖基化，且分子量為28.5kDa。TIMP-1通過結(jié)合到活化的金屬蛋白酶上調(diào)節(jié)血管生長，因此抑制了血管向細胞外基質(zhì)侵襲。金屬蛋白酶-2組織抑制劑(“TIMP-2”)也可用來抑制血管生長。簡而言之，TIMP-2是一個21kDa的非糖基化蛋白質(zhì)，其可以活化的或潛伏的酶原形式結(jié)合到金屬蛋白酶上。TIMP-1和TIMP-2都可以從商業(yè)途徑例如Synergen、Boulder和Colorado獲得。
纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)是一個存在于血小板中的50kDa的糖蛋白，其可通過內(nèi)皮細胞和肌細胞合成。PAI-1在內(nèi)皮的嗜堿側(cè)抑制t-PA和尿激酶纖溶酶原激活物，并且還調(diào)節(jié)纖維蛋白溶解過程。纖溶酶原激活物抑制劑-2(PAI-2)一般僅發(fā)現(xiàn)于特定情況下的血液中，例如懷孕和腫瘤存在時。簡而言之，PAI-2是由單核細胞和巨噬細胞分泌的56kDa的蛋白質(zhì)。認為其可調(diào)節(jié)纖維蛋白溶解活性，并且特別抑制尿激酶纖溶酶原激活物和組織纖溶酶原激活物，因此防止了纖維蛋白溶解。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)也可使用許許多多其它抗血管生長因子。代表性的例子包括血小板因子4(SigmaChemicalCo.，#F1358)；硫酸魚精蛋白(鯡精蛋白)(SigmaChemicalCo.，#P4504)；硫酸殼多糖衍生物(由queencrabshells制備)(SigmaChemicalCo.，#C3641；Murataetal.，CancerRes.5122-26，1991)；硫酸多糖肽聚糖配合物(SP-PG)(此化合物的功能可以通過甾類化合物如雌激素和枸櫞酸三苯氧胺的存在而加強)；Staurosporine(SigmaChemicalCo.，#S4400)；基質(zhì)代謝調(diào)節(jié)劑，包括例如脯氨酸類似物{[(L-氮雜環(huán)丁烷-2-羧酸(LACA)(SigmaChemicalCo.，# A0760))，順羥基脯氨酸，d，L-3，4-去氫脯氨酸(SigmaChemicalCo.，# D0265)，硫脯氨酸(SigmaChemicalCo.，# T0631)]，α，α-二吡啶基(SigmaChemicalCo.，# D7505)，β-氨基丙腈富馬酸(SigmaChemicalCo.，# A3134)]}；MDL27032(4-丙基-5-(4-吡啶基)-2(3H)-惡唑酮；MerionMerrelDowResearchInstitute)氨甲喋呤(SigmaChemicalCo.，# A6770；Hirataetal.，ArthritisandRheumatism321-65-1073，1989)；Mitoxantrone(PoliveriniandNovak，Biochem.Biophys.Res.Comm.140901-907)；肝素(Folkman，Bio.Phar.34905-909，1985；SigmaChemicalCo.，#P8754)；干擾素(如SigmaChemicalCo.，# 13265)；2巨球蛋白血清(SigmaChemicalCo.，# M7151)；ChIMP-3(Pavloffetal.，J.Bio.Chem.26717321-17326，1992)；抑糜蛋白酶素(SigmaChemicalCo.，# C7268；Tomkinsonetal.，BiochemJ.286475-480，1992)；β-環(huán)糊精十四硫酸酯(Tetradecasulfate)(SigmaChemicalCo.，# C4767)；Eponemycin；雌氮芥(可從Sigma得到；WangandSteamsCancerRes.486262-6271，1988)；煙曲霉素(SigmaChemicalCo.，# F6771；加拿大專利2024306號；Ingberetal.，nature348555-557，1990)；硫代蘋果酸金鈉(“GST”，SigmaG4022；MatsubaraandZiff，J.Clin.Invest.791440-1446，1987)；(D-青霉胺(“CDPT”；SigmaChemicalCo.，#P4875orP5000(HCl))；β-1-抗膠原蛋白酶-血清；α2-抗纖維蛋白溶酶(SigmaChem.Co.A0914；Holmesetal.，J.Biol.Chem.262(4)1659-1664，1987)；蒽雙咪腙(NationalCancerInstitute)；Lobenzarit二鈉(N-(2)-羧苯基-4-氯代氨茴酸二鈉或“CCA”；Takeuchietal.，AgentsActions36312-316，1992)；酞胺哌啶酮，Angiostatic甾類化合物，AGM-1470，羧氨基咪唑，金屬蛋白酶抑制劑例如BB94和肽CDPGYIGSR-NH2(SEQUENCEIDNO.1)(IwakiGlass，Tokyo，Japan)。
本發(fā)明的抗血管生長組合物可另外含有除抗血管生長因子和聚合物載體以外的許多化合物。例如，本發(fā)明的抗血管組合物也可以(在本發(fā)明的某些實例中)含有一種或幾種抗生素、抗炎劑、抗病毒劑、抗真菌劑和/或抗原蟲劑。在此所述組合物中抗生素的代表性例子包括青霉素；頭孢菌素如頭孢羥氨芐、頭孢唑啉、頭孢氯；氨基糖甙類如慶大霉素和妥布霉素；磺胺類如新諾明；和滅滴靈?？寡讋┑拇硇岳影ㄧ揞惢衔锶鐝姷乃?、強的松龍、氫化可的松、促腎上腺皮質(zhì)激素和柳氮磺胺吡啶；非甾類抗炎藥(“NSAID”)如阿司匹林、布洛芬、萘普生、苯氧苯丙酸、消炎痛和保泰松?？共《緞┑拇硇岳影o環(huán)鳥苷、ganciclovir和zidovudine。抗真菌劑的代表性例子包括致霉菌素、酮哌惡咪唑、氟胞嘧啶、雙氯苯咪唑和克霉唑。抗原蟲劑的代表性例子包括羥乙磺酸戊烷脒、奎寧、氯喹和甲氟喹。
本發(fā)明抗血管生長組合物也可含有一種或幾種激素例如甲狀腺激素、雌激素、去氫表雄酮、可的松和/或生長素，其它生物活性分子例如胰島素及TH2(如白細胞介素-2，-12和-15)，γ干擾素或TH2(如白細胞介素-4，和-10)細胞因子。
本發(fā)明的抗血管組合物也可含有其它成分例如表面活性劑(親水或疏水，見實施例13)、抗腫瘤或化療藥物(例如5-氟尿嘧啶、長春堿、doxyrubicin、阿霉素和三苯氧胺)，放射性藥物(例如Cu-64，Ga-67，Ga-68，Zr-89，Ru-97，Tc-99m，Rh-105，Pd-109，In-111，I-123，I-125，Re-186，Re-188，Au-198，Au-199，Pb-203，At-211，Pb-212和Bi-212)或者毒素(例如蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、白喉毒素、霍亂毒素、gelonin、美洲商陸抗病毒蛋白、tritin、志賀菌屬毒素和假單胞菌屬外毒素A)。
如上所述，本發(fā)明的抗血管生長組合物包括一種抗血管生長因子和一種聚合物載體。除了以上討論的許多抗血管生長因子和其它化合物外，本發(fā)明的抗血管生長組合物還包括各種聚合物載體，例如包括生物可降解的和生物不可降解的組合物。生物可降解的組合物的代表性例子包括白蛋白、明膠、淀粉、纖維素、葡聚糖、多糖、血纖維蛋白原、聚(d，l丙交酯)、聚(d，1-丙交酯-co-乙交酯)、聚(乙交酯)、聚(羥丁酸)、聚(碳酸烷基酯)和聚(原酸酯)(見Illum，L.，Davids，S.S.(eds.)″PolymersincontrolledDrugDelivery″Wright，Bristol，1987；Arshady，J.ControlledRelease4155-0180，1986)。非降解聚合物的代表性例子包括EVA共聚物、硅氧烷橡膠和聚(甲基丙烯酸甲酯)。特別優(yōu)選的聚合物載體包括EVA共聚物(例如ELVAX40，與40％乙烯基乙酸酯交聯(lián)的聚(乙烯乙酸乙烯酯)；DuPont)，聚(乳酸-聯(lián)-乙醇酸)、聚己內(nèi)酯、聚乳酸、與40％乙烯基乙酸酯和聚乳酸交聯(lián)的聚(乙烯乙酸乙烯酯)共聚物以及聚乳酸和聚己內(nèi)酯的共聚物。
可以使用各種形式的聚合物載體，包括例如毫微球或微球、棒型裝置、丸、板或膠囊(見如Goodelletal.，Am.J.Hosp.Pharm.431454-1461，1986Langeretal.，″大分子從聚合物中的控釋″，inBiomecicalpolymers，Polymericmaterialsandpharmaceuticalsforbimedicaluse，Goldberg，E.P.，Nakagim，A.(eds.)AcademicPress，pp.11-137，1980；Rhineetal.，J.Pharm.Sci.69265-270，1980；Brownetal.，J.Pharm.Sci.721181-1185，1983；andBawaetal.，J.ControlledReleasel259-267，1985)。
優(yōu)選地，本發(fā)明抗血管生長組合物(包括一種或多種抗血管生長因子和聚合物載體)可以以適用于預(yù)想用途的方式使用。在本發(fā)明優(yōu)選的實例中，抗血管生長組合物應(yīng)是生物相容性的，并且經(jīng)幾周至月余的時期應(yīng)釋放一種或多種的抗血管生長因子。此外，本發(fā)明的抗血管生長組合物優(yōu)選經(jīng)數(shù)月應(yīng)是穩(wěn)定的，并且能在無菌條件下生產(chǎn)和保留。
在本發(fā)明某些方面，抗血管生長組合物的粒度范圍可以按照特殊需要從毫微球到微球不等(例如從0.1μm至500μm)。例如，當(dāng)用于腫瘤栓塞時(如下討論)，一般優(yōu)選抗血管生長組合物為15至500μm之間的毫微球，優(yōu)選15至200μm，更優(yōu)選25至150μm。這種毫微粒易用作“噴霧劑”，其固化為膜或包衣。毫微粒(也稱作“毫微球”)可以制備成不同的粒度，例如從0.1μm至3μm，從10μm至30μm，以及從30μm至100μm(見實施例8)。
如本文所公開的，抗血管生長組合物也可以制備成其它用途。例如，為了將抗血管生長組合物用于角膜，本發(fā)明的組合物可以結(jié)合到聚合物中成為毫微粒(見kreuterJ.ControlledRelease 16169-176，1991；Couvreurand Vauthier，J.ControlledRelease17187-198，1991)。這種毫微粒易用作“噴霧劑”，其固化為膜或包衣。毫微粒(也稱作“毫微球”)可以制備成不同的粒度，例如從0.1μm至3μm，從10μm至30μm，以及從30μm至100μm(見實施例8)。
本發(fā)明抗血管生長組合物也可以制備成各種“糊劑”或凝膠型。例如，本發(fā)明的一個實例提供了在一定溫度(例如高于37℃的溫度，如40℃、45℃、50℃、55℃或60℃)液化并且在另一溫度(如體溫或低于37℃的任意溫度)固化或半固化的抗血管生長組合物。這種“熱糊劑”可通過本文的公開易于制備(見實施例10和14)。
本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的抗血管生長組合物可以形成膜。優(yōu)選地，這種膜的厚度一般小于5，4，3，2或1mm，更優(yōu)選厚度小于0.75mm或0.5mm，尤為優(yōu)選厚度小于500μm至100μm。這種膜優(yōu)選具有良好抗拉強度(如大于50，優(yōu)選大于100，更優(yōu)選大于150或200N/cm2)的柔韌性，良好的粘合性(即，易于粘合到潮濕或濕表面上)，并且可以控制滲透性。這種膜的代表性實例見下面的實施例(如實施例13)。
將抗血管生長組合物結(jié)合到聚合物載體上的代表性實例詳見下面的實施例3，4和8-15。
動脈栓塞除了上述的組合物，本發(fā)明還提供了使用上述抗血管生長組合物的各種方法。特別地，本發(fā)明其中一方面提供了栓塞血管的方法，其包括將治療有效量的抗血管生長組合物(如上所述)釋入血管中，這樣就有效地阻塞了血管。適于阻塞血管的治療有效劑量可以通過如下的公開確定，如實施例6所述。在一個特別優(yōu)選的實例中，將抗血管生長組合物釋入滋養(yǎng)腫瘤的血管中(見圖13)。
簡而言之，有許多需要對器官或區(qū)域減少或切斷血液供給的臨床情況(如出血、腫瘤生長)。正如下面詳細描述的那樣，其通過一種選擇性定位導(dǎo)管將本發(fā)明抗血管生長組合物注射到所需血管中而實現(xiàn)(見圖13)。組合物通過血流直到其楔入脈管系統(tǒng)，因此物理(或化學(xué))阻塞了血管。對選擇區(qū)域減少或切斷血流導(dǎo)致了梗塞(細胞由于氧和養(yǎng)料供應(yīng)不足而死亡)或者從受損血管減少血液流失。
為了用于栓塞治療，本發(fā)明抗血管生長組合物優(yōu)選為無毒、可形成血栓并易于沿血管導(dǎo)管注射、不透射線、迅速及持久的作用、無菌并在生產(chǎn)中可以是不同的形狀或大小。此外，組合物優(yōu)選可緩慢(理想為經(jīng)過幾周至月余的時間)釋放抗血管生長因子。特別優(yōu)選的抗血管生長組合物在注入血管后應(yīng)具有15-200μm的粒度。優(yōu)選地，其在溶液中或注射時不應(yīng)聚結(jié)成大顆粒。此外，優(yōu)選的組合物在使用前的貯存過程中不應(yīng)改變形狀或物理性質(zhì)。
栓塞治療以至少3種基本方式用于腫瘤的治療(1)腫瘤的絕對治療(通常為良性)；(2)術(shù)前栓塞；及(3)治標(biāo)栓塞。簡而言之，良性腫瘤有時通過單獨栓塞治療即可成功治愈。這種腫瘤的例子包括血管源的簡單腫瘤(如血管瘤)，內(nèi)分泌腫瘤例如甲狀旁腺瘤和良性骨瘤。
對于其它腫瘤而言(例如腎腺癌)，在手術(shù)切除前數(shù)小時或數(shù)天應(yīng)施用術(shù)前栓塞以減少手術(shù)性失血、縮短手術(shù)時間并且減少由于對腫瘤的外科手術(shù)而造成的活惡性細胞擴散的危險。許多腫瘤可以成功地進行術(shù)前栓塞，例如鼻咽瘤、頸靜脈球瘤、腦脊膜瘤、化學(xué)感受器瘤和迷走神經(jīng)瘤。
栓塞也可用作治療不宜手術(shù)惡性腫瘤的主要方式來延長晚期患者的生命。栓塞可通過減輕不良癥狀如出血、靜脈阻塞和氣管壓迫而顯著改善惡性腫瘤患者的生活質(zhì)量。遭受惡性內(nèi)分泌瘤體液影響(其中來自類癌瘤及其它內(nèi)分泌瘤如胰島素瘤和胰高血糖素瘤的轉(zhuǎn)移瘤可緩慢生長，從而導(dǎo)致由于其產(chǎn)生的內(nèi)分泌綜合癥的巨大痛苦)的患者最受益于治標(biāo)腫瘤栓塞。
一般地，使用本發(fā)明抗血管生長組合物的栓塞治療不論其部位通常以相似的方法進行。簡而言之，通過沿插入照射X射線的動脈或靜脈(依栓塞部位而定)的導(dǎo)管注入不透射線的造影劑首先進行預(yù)栓塞區(qū)域的血管造影術(shù)(血管圖)。導(dǎo)管可以經(jīng)皮或者手術(shù)插入。然后通過從導(dǎo)管回流本發(fā)明抗血管生長組合物栓塞血管，直至觀察到停止流動。通過重復(fù)血管造影照片確證閉塞。
栓塞治療通常導(dǎo)致含抗血管生長因子的組合物分布在待治療腫瘤或血管團塊的小間隙。阻塞動脈腔的栓塞顆粒塊導(dǎo)致了供血閉塞。除此之外，抗血管生長因子的存在阻止了供給腫瘤或血管團塊的新血管的形成，提高了切斷血液供應(yīng)的失活作用。
因此，很明顯許許多多的腫瘤可用本發(fā)明組合物栓塞。簡而言之，腫瘤一般可分為兩類良性和惡性。在良性腫瘤中，細胞保持其各自特征，并且不以完全不能控制的方式分化。而且，腫瘤可定位同時不遷徙。在惡性腫瘤中，細胞變得無差異，對機體生長和激素信號不應(yīng)答，并且以不可控制的方式增殖；腫瘤具有侵害性而且可傳播到遠部位(遷徙)。
本發(fā)明的一個方面，肝轉(zhuǎn)移瘤(繼發(fā)性腫瘤)可利用栓塞療法治療。簡而言之，導(dǎo)管經(jīng)骨肱動脈插入并在熒光屏檢查下通過動脈系統(tǒng)深入肝動脈。導(dǎo)管盡可能地深入到肝動脈樹中以完全阻斷供給腫瘤的血管，同時盡可能多地剩出供給正常結(jié)構(gòu)的動脈分支。理想的是其為肝動脈分支，但是需要阻斷的也可以是末端為胃十二指腸動脈開端的整個肝動脈，或者甚至是許多分離的動脈，其依腫瘤的大小及其單獨的血液供應(yīng)而定。當(dāng)達到了所需的導(dǎo)管位置，經(jīng)動脈導(dǎo)管注入抗血管生長組合物(如上所述)栓塞動脈直至需阻斷動脈的血流停止，優(yōu)選觀察5分鐘后。經(jīng)導(dǎo)管注入不透射線的造影劑確證動脈閉塞，并通過熒光屏檢查或X射線膠片證明先前充滿造影劑的血管不再如此。
如上所述，良性及惡性腫瘤都可以用本發(fā)明組合物栓塞。良性肝腫瘤的代表性例子包括肝細胞腺瘤、海綿狀血管瘤和灶性小結(jié)增生(FocalNodularHyperplasia)。其它少見的通常沒有臨床表現(xiàn)的良性腫瘤也可以治療。其包括膽管腺瘤、膽管囊腺瘤、纖維瘤、脂肪瘤、平滑肌瘤、間皮瘤、畸胎瘤、粘液瘤和小結(jié)退化性增生(NodularRegenerativeHyperplasia)。
惡性腫瘤一般分支為兩類原發(fā)性和繼發(fā)性。原發(fā)性腫瘤直接產(chǎn)生于發(fā)現(xiàn)其的組織。因此，原發(fā)性肝瘤最初源于組成肝組織的細胞(如肝細胞和膽囊細胞)?？捎脛用}栓塞治療的原發(fā)性肝癌的代表性例子包括肝細胞癌、膽管癌、血管肉瘤、囊腺癌、鱗狀細胞癌和肝胚細胞瘤。
繼發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤是一種起源于機體的其它部位但已擴散到遠器官的腫瘤。轉(zhuǎn)移瘤的一般路徑是直接生長入鄰接結(jié)構(gòu)，通過血管或淋巴系統(tǒng)擴散并沿組織平面和體內(nèi)間隙(腹膜液、腦脊液等)行進。繼發(fā)性肝癌是癌癥患者最常見的死因之一，也是最常見的肝腫瘤形式。盡管實質(zhì)上任何癌都可能遷徙到肝臟，最可能擴散到肝臟的腫瘤包括胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、黑素瘤、肺腫瘤、口咽瘤和膀胱瘤、何杰金及非何杰金淋巴瘤、乳腺瘤、卵巢瘤和前列腺瘤。上述每一種原發(fā)性腫瘤都具有許多不同的可以通過動脈栓塞治療的腫瘤類型(例如，有超過32種不同類型的卵巢癌)。
如上所述，利用本發(fā)明抗血管生長組合物的栓塞療法也可用于各種其它需要阻塞血管的臨床情況。本發(fā)明其中一方面，通過給予上述組合物之一可以治療動靜脈畸形。簡而言之，動靜脈畸形(血管畸形)是指至少一種(最常見的是許多)動脈和靜脈之間異常聯(lián)系的一類疾病，其導(dǎo)致了主要由血管組成的局部腫瘤樣團塊。這種疾病可以是天生的，也可以是后天的。
本發(fā)明的一個實例中，通過將導(dǎo)管經(jīng)股動脈或肱動脈插入并在熒光指導(dǎo)下深入喂養(yǎng)(feeding)動脈而治療動靜脈畸形。優(yōu)選導(dǎo)管盡可能地深入以完全阻斷血管畸形的供給，同時盡可能多地剩出供給正常結(jié)構(gòu)的動脈分支(理想的是其為單個動脈，但是通常需要阻斷的是許多分離的動脈，其依血管畸形的程度及其單獨的血液供應(yīng)而定)。當(dāng)達到了所需的導(dǎo)管位置，每支動脈可以用本發(fā)明抗血管生長組合物栓塞。
本發(fā)明另一方面，栓塞可以處理過量出血的情況。例如，月經(jīng)過多(行經(jīng)過多出血)可以通過子宮動脈的栓塞治療。簡而言之，子宮動脈是雙側(cè)內(nèi)髂骨動脈的分支。在本發(fā)明的一個實例中，將導(dǎo)管經(jīng)股動脈或肱動脈插入并在熒光指引下通過動脈系統(tǒng)深入每個子宮動脈。導(dǎo)管盡可能地深入以完全阻斷至子宮的血管，同時盡可能多地剩出供給正常結(jié)構(gòu)的動脈分支。理想的是將每側(cè)的子宮動脈栓塞，但是偶爾需要阻斷的是許多分離的動脈，其依單獨的血液供應(yīng)而定。當(dāng)達到了所需的導(dǎo)管位置，每支動脈可以給予上述抗血管生長組合物進行栓塞。
類似地，動脈栓塞可以在其它許多情況下進行，包括例如急性出血、血管畸形、中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙和脾機能亢進。
將抗血管生長組合物用于包衣斯坦特固定模的用途如上所述，本發(fā)明也提供了斯坦特固定模，其包括普通的管狀結(jié)構(gòu)(包括例如螺旋型)，其表面用上述的組合物包衣。簡而言之，斯坦特固定模是一種腳手架，通常為圓筒型，其可插入到由于疾病(如腫瘤向內(nèi)生長)而變窄的體內(nèi)通道內(nèi)(如膽管)，從而防止了通道的閉合或再閉合。斯坦特固定模通過物理性維持插入其的體內(nèi)通道壁的開放而發(fā)揮作用。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)可使用各種斯坦特固定模，包括例如食道斯坦特固定模、血管斯坦特固定模、膽管斯坦特固定模、胰管斯坦特固定模、輸尿管和尿道斯坦特固定模、淚管斯坦特固定模、咽鼓管斯坦特固定模、輸卵管斯坦特固定模和氣管/支氣管斯坦特固定模。
斯坦特固定模易于從市售獲得，或者按照熟知的技術(shù)制造。斯坦特固定模代表性的例子包括描述于美國專利4776337中，題為“擴張性腔內(nèi)移植片，移植擴張性腔內(nèi)移植片的方法和裝置”；美國專利5176626，題為“內(nèi)置斯坦特固定?！?；美國專利5147370，題為“用于中空體內(nèi)導(dǎo)管的鎳鈦金屬互化物斯坦特固定?！?；美國專利5064435，題為“具有穩(wěn)定軸長的自身擴張性修復(fù)術(shù)”；美國專利5052998，題為“內(nèi)置斯坦特固定模及使用方法”以及美國專利5041126，題為“血管內(nèi)斯坦特固定模及轉(zhuǎn)運系統(tǒng)”，以上所有作為本文的參考文獻。
可以用各種方法將斯坦特固定模用本發(fā)明抗血管生長組合物或抗血管生長因子包衣，包括例如(a)將抗血管生長組合物直接粘附到斯坦特固定模上(如用聚合物/藥物膜噴霧斯坦特固定模，或者將斯坦特固定模滴入聚合物/藥物溶液)，(b)用水明膠等可吸收抗血管生長組合物(或上述抗血管生長因子)的物質(zhì)包衣斯坦特固定模，(c)將抗血管生長組合物包衣的絲(或聚合物本身形成絲)織入斯坦特固定模結(jié)構(gòu)中，(d)將斯坦特固定模插入含有或用抗血管生長組合物包衣的套筒或篩網(wǎng)中，或者(e)用抗血管生長組合物制造斯坦特固定模。本發(fā)明優(yōu)選的實例中，組合物在貯存及插入時應(yīng)牢固地粘附在斯坦特固定模上，同時在其直徑由皺縮擴張至膨脹時不應(yīng)從斯坦特固定模上掉下?？寡苌L組合物優(yōu)選在貯存過程中、插入前或者在體內(nèi)膨脹后升溫至體溫時不應(yīng)降解。此外，其應(yīng)光滑、平整地包衣斯坦特固定模(抗血管生長抑制物均勻分布，同時不改變斯坦特固定模的外形)。本發(fā)明優(yōu)選的實例中，抗血管生長組合物應(yīng)均勻、可預(yù)見的、持續(xù)地將抗血管生長組合物釋放入放置斯坦特固定模周圍的組織中。對于血管斯坦特固定模而言，除了上述性質(zhì)外，組合物不應(yīng)使斯坦特固定模形成血栓(造成血栓形成)，或者在血流中引起明顯的湍流(比未包衣的斯坦特固定模更易于引起這些現(xiàn)象)。
本發(fā)明的另一方面提供了擴張體內(nèi)通道腔的方法，其包括將斯坦特固定模插入通道，斯坦特固定模一般為管狀結(jié)構(gòu)，其表面用抗血管生長組合物(或單獨的抗血管生長因子)包衣，這樣就擴張了通道。各種實例如下所述，其中體內(nèi)通道腔被擴張從而消除了膽管、食道、氣管/支氣管、尿道或血管的阻塞。另外，代表性的實施例詳述于實施例7。
一般地，斯坦特固定模不論部位或待治療的疾病都以類似的方式插入。簡而言之，一般首先進行插入前的檢查，通常為一種診斷性成像-內(nèi)成像，或者外科手術(shù)時直接觀察以確定斯坦特固定模插入的準(zhǔn)確位置。然后將一導(dǎo)線經(jīng)損傷或預(yù)插入部位深入，其上穿過一個可使斯坦特固定模以皺縮形式插入的轉(zhuǎn)運導(dǎo)管。一般地，斯坦特固定模可以壓縮，這樣其可經(jīng)小導(dǎo)管從小腔插入，然后在其預(yù)計的位置膨脹至較大的直徑。一旦膨脹后，斯坦特固定模物理性迫使通道壁分開，并維持其張開狀態(tài)。這樣，其能經(jīng)小孔插入，然而仍可以維持在較大直徑的腔或通道。斯坦特固定?？梢允亲陨砼蛎?例如Wallstent和Gianturcostent)、球膨脹(如Palmaz斯坦特固定模和Strecker斯坦特固定模)，或者通過溫度的變化移植(如鎳鈦金屬互化物斯坦特固定模)。
斯坦特固定模一般在放射性或直接的視覺控制下置入，特別小心地將斯坦特固定模準(zhǔn)確穿過待治療器官的窄口。移去轉(zhuǎn)運導(dǎo)管，使斯坦特固定模作為腳手架。通常使用X射線進行位點插入的檢查以確證準(zhǔn)確的位置。
本發(fā)明一個優(yōu)選的實例中，提供了消除膽管阻塞的方法，其包括將膽管斯坦特固定模插入膽管中，斯坦特固定模一般為管狀結(jié)構(gòu)，其表面用上述組合物包衣，這樣就消除了膽管阻塞。簡而言之，腫瘤長滿正常的膽管會導(dǎo)致危及生命的進行性膽汁椰積性黃疸。一般地，將膽汁從肝臟引流入十二指腸的膽管體系最易被(1)由膽管細胞組成的腫瘤(膽管癌)，(2)侵入膽管的腫瘤(例如胰腺癌)或者(3)對膽管施加外部壓力并壓縮其的腫瘤(腫大的淋巴結(jié))。
原發(fā)性膽管腫瘤和其它可引起膽管樹壓迫的腫瘤可以用本文所述的斯坦特固定模治療。一個原發(fā)性膽管腫瘤的例子是腺癌(當(dāng)其存在于正常肝管分支處時也稱Klatskin腫瘤)。這些腫瘤也稱作膽管癌、膽總管腺癌或者膽管系統(tǒng)腺癌。影響膽管的良性腫瘤(如膽管系統(tǒng)的腺瘤)以及少見的膽管鱗狀細胞腺癌和膽囊腺癌也可以引起膽管樹的壓迫，從而導(dǎo)致膽管阻塞。壓迫并阻塞膽管的肝和胰腫瘤是壓迫膽管樹最常見的原因。胰腺的大多數(shù)腫瘤由胰管的細胞產(chǎn)生。這是一種致命的癌癥(占癌癥死亡的5％；在美國每年有26,000例新患者)，患者的平均生存時間為6個月，生存率為1年的只有10％。當(dāng)這些腫瘤位于胰腺的上端時，其經(jīng)常會引起膽管阻塞，因而顯著降低了患者的生活質(zhì)量。所有的胰腫瘤一般都稱作“胰腺癌”，一些組織學(xué)亞型包括腺鱗癌、囊腺癌和acinar細胞癌。上述的肝腫瘤也可以引起膽管樹的壓迫，從而導(dǎo)致膽管阻塞。
本發(fā)明的一個實例中，首先將膽管斯坦特固定模以幾種方式插入膽管中自頂端穿過腹壁和肝臟將針插入(經(jīng)皮肝穿刺膽道造影或“PTC”)；自低端通過從口腔、胃或十二指腸插入的內(nèi)窺鏡插入膽管套管(內(nèi)窺鏡逆行膽管造影或“ERCP”)；或者在外科手術(shù)過程中直接切開。一般應(yīng)進行PTC、ERCP或外科手術(shù)時直接觀察等插入前的檢查以確定斯坦特固定模插入的準(zhǔn)確位置。然后將一導(dǎo)線經(jīng)損傷部位深入，其上穿過一個可使斯坦特固定模以皺縮形式插入的轉(zhuǎn)運導(dǎo)管。如果診斷檢查為PTC，導(dǎo)線和轉(zhuǎn)運導(dǎo)管經(jīng)腹壁插入；如果初始檢查為ERCP，則經(jīng)口腔置入斯坦特固定模。接著在放射、內(nèi)窺鏡或直接觀察的控制下放置斯坦特固定模(特別小心地將其穿過導(dǎo)管窄口準(zhǔn)確放置)。移去轉(zhuǎn)運導(dǎo)管，使斯坦特固定模作為腳手架維持膽管的張開狀態(tài)。再進行一次膽道造影以確證斯坦特固定模準(zhǔn)確定位。
本發(fā)明的另一實例中提供了消除食道阻塞的方法，其包括將食道斯坦特固定模插入食道中，斯坦特固定模一般為管狀結(jié)構(gòu)，其表面用上述抗血管生長組合物包衣，這樣就消除了食道阻塞。簡而言之，食道是一個將食物和液體從口腔轉(zhuǎn)運至胃的中空管道。食道癌或者被來自鄰接器官的癌(例如胃癌或肺癌)侵入會導(dǎo)致不能吞咽食物或唾液。在這一實例中，應(yīng)進行插入前的檢查，通常是吞咽鋇或者內(nèi)窺鏡檢查以確定斯坦特固定模插入的準(zhǔn)確位置。然后通過口腔置入導(dǎo)管或內(nèi)窺鏡，經(jīng)阻塞處深入導(dǎo)線。在放射或內(nèi)窺鏡控制下將斯坦特固定模轉(zhuǎn)運導(dǎo)管穿過導(dǎo)線，經(jīng)食道中的窄口小心放置斯坦特固定模。插入后的檢查，通常為鋇餐X射線應(yīng)用于確證準(zhǔn)確的定位。
本發(fā)明的另一實例中提供了消除氣管/支氣管阻塞的方法，其包括將氣管/支氣管斯坦特固定模插入氣管或支氣管中，斯坦特固定模一般為管狀結(jié)構(gòu)，其表面用上述抗血管生長組合物包衣，這樣就消除了氣管/支氣管阻塞。簡而言之，氣管和支氣管是將空氣從口鼻載入肺的通道。由于癌、被來自鄰接器官的癌(例如肺癌)侵入或者由于軟骨軟化(軟骨環(huán)削弱)導(dǎo)致的氣管或支氣管塌陷而引起的氣管阻塞會導(dǎo)致不能呼吸。本發(fā)明的這一實例中，應(yīng)進行插入前的檢查，通常是內(nèi)窺鏡檢查以確定斯坦特固定模插入的準(zhǔn)確位置。然后通過口腔置入導(dǎo)管或內(nèi)窺鏡，經(jīng)阻塞處深入導(dǎo)線。然后將轉(zhuǎn)運導(dǎo)管穿過導(dǎo)線以插入皺縮的斯坦特固定模。在放射或內(nèi)窺鏡控制下放置斯坦特固定模以使其穿過窄口準(zhǔn)確放置。接著移去轉(zhuǎn)運導(dǎo)管，使斯坦特固定模作為腳手架。插入后的檢查，通常為支氣管鏡檢查應(yīng)用于確證準(zhǔn)確的定位。
本發(fā)明的另一實例中提供了消除尿道阻塞的方法，其包括將尿道斯坦特固定模插入尿道中，斯坦特固定模一般為管狀結(jié)構(gòu)，其表面用上述抗血管生長組合物包衣，這樣就消除了尿道阻塞。簡而言之，尿道是將通過陰莖排空膀胱的通道。幾乎每個年過60的男人都會有由于前列腺肥大而導(dǎo)致的前列腺尿道外部狹窄，其可引起進行性排尿困難。在這一實例中，首先應(yīng)進行插入前的檢查，通常是內(nèi)窺鏡檢查或尿道內(nèi)徑掃描以確定斯坦特固定模插入的準(zhǔn)確位置(其在下端的外尿道括約肌上，在上端接近充盈的膀胱頸)。然后通過陰莖口置入內(nèi)窺鏡或?qū)Ч?，將?dǎo)線深入膀胱。然后將轉(zhuǎn)運導(dǎo)管穿過導(dǎo)線以插入斯坦特固定模。接著移去轉(zhuǎn)運導(dǎo)管，斯坦特固定模膨脹定位。插入后的檢查，通常為內(nèi)窺鏡或逆行尿道內(nèi)徑掃描檢查應(yīng)用于確證準(zhǔn)確的定位。
本發(fā)明另一實例提供了消除血管阻塞的方法，其包括將血管斯坦特固定模插入血管中，斯坦特固定模一般為管狀結(jié)構(gòu)，其表面用上述抗血管生長組合物包衣，這樣就消除了血管阻塞。簡而言之，斯坦特固定模可置于各種血管(動脈和靜脈)中用以防止在失敗的血管成形術(shù)處復(fù)發(fā)狹窄，治療用血管成形術(shù)處理可能失敗的狹窄以及治療術(shù)后狹窄(如透析移植狹窄)。適當(dāng)部位的代表性例子包括髂骨、腎和冠狀動脈、上腔靜脈以及透析移植物中。其中一個實例，首先進行血管造影術(shù)以確定斯坦特固定模插入的位置。這通常通過經(jīng)插入動脈或靜脈(照射)的導(dǎo)管注射不透射線的造影劑而完成。然后經(jīng)皮或經(jīng)外科手術(shù)將導(dǎo)管插入股動脈、肱動脈、股靜脈或肱靜脈，并在熒光屏檢查下通過動脈系統(tǒng)深入確定的血管中。然后穿過血管狹窄處定位斯坦特固定模。插入后的血管造影術(shù)也可以用以確證準(zhǔn)確的定位。
抗血管生長組合物在外科手術(shù)過程中的用途如上所述，抗血管生長組合物可用于各種外科手術(shù)過程中。例如，本發(fā)明的抗血管生長組合物(如噴霧劑或膜的形式)可在去除腫瘤前用以包衣或噴霧特定區(qū)域，從而將正常的周圍組織與惡性組織隔離開來，并且/或者防止疾病向周圍組織擴散。本發(fā)明的另一方面，抗血管生長組合物(如噴霧劑形式)可以通過內(nèi)窺鏡檢查方式轉(zhuǎn)運以包衣腫瘤或者在預(yù)定部位抑制血管生長。本發(fā)明的另一方面，用本發(fā)明組合物包衣的外科手術(shù)用篩網(wǎng)可用于其可使用的任何過程。例如，本發(fā)明的一個實例中，裝滿抗血管生長組合物的外科手術(shù)用篩網(wǎng)可用于腹部癌切除手術(shù)(如結(jié)腸切除術(shù)后)以支持結(jié)構(gòu)，同時釋放一些抗血管生長因子。
本發(fā)明另一方面提供了處理腫瘤切除部位的方法，其包括將上述抗血管生長組合物施于切除后的腫瘤切除邊緣，從而抑制了癌癥復(fù)發(fā)以及該部位新血管的形成。本發(fā)明的一個實例中，將抗血管生長組合物(或單獨的抗血管生長因子)直接施于腫瘤切除部位(例如用拭抹、刷擦或其它方法用抗血管生長組合物或因子包衣腫瘤的切除邊緣)。同樣，在給藥前也可將抗血管生長組合物或因子制成已知的外科手術(shù)用糊劑。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實例中，在切除肝惡性腫瘤后及神經(jīng)外科術(shù)后施用抗血管生長組合物。
本發(fā)明的另一本方面，抗血管生長組合物(如上所述)可用于各種腫瘤的切除邊緣，包括例如乳腺瘤、結(jié)腸腫瘤、腦和肝腫瘤。例如，本發(fā)明的一個實例中，抗血管生長組合物可在切除后的神經(jīng)瘤部位施用，從而抑制了該部位新血管的形成。簡而言之，大腦是高度功能定位的，即每一特定的解剖區(qū)域執(zhí)行特定的功能。因此，大腦病理的部位通常比其類型更為重要。在關(guān)鍵區(qū)域中一個相對小的損傷比不太重要區(qū)域中較大的損傷更具有破壞性。類似地，大腦表面的損傷或許易于手術(shù)切除，但是位于大腦深層的相同腫瘤可能不能(預(yù)切除需通過太多的重要結(jié)構(gòu)才能到達)。同樣，甚至良性腫瘤由于幾種原因也可以有危險其可能長在關(guān)鍵區(qū)域而引起顯著損傷；盡管其通過手術(shù)切除可能治愈這也是不可能的；最后，如果未控制，其可能引起顱內(nèi)壓的升高。頭顱骨是一個不能擴充的封閉空間。因此，如果在某一部位有東西生長，在另外的部位就會受壓-結(jié)果頭顱骨內(nèi)的壓力就升高或者是顱內(nèi)壓升高。如果不處理這種狀況，就會壓迫重要結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致死亡。CNS(中樞神經(jīng)系統(tǒng))惡性腫瘤的發(fā)生率為每100,000人8-16。大腦早期惡性腫瘤的預(yù)后是致命的，存活中數(shù)少于一年，甚至在手術(shù)切除后。這些腫瘤，特別是神經(jīng)膠質(zhì)瘤是主要的一種手術(shù)切除后在原始病灶2公分內(nèi)復(fù)發(fā)的局部疾病。
可以用此所述組合物及方法治療的腦腫瘤的代表性例子包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤(如多形性成膠質(zhì)細胞瘤、多態(tài)惡性膠質(zhì)瘤、纖維性星性細胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、粘液乳頭室管膜瘤、亞室管膜瘤、脈絡(luò)叢乳頭瘤)；神經(jīng)瘤(例如成神經(jīng)細胞瘤、成神經(jīng)節(jié)細胞瘤、神經(jīng)節(jié)瘤和成神經(jīng)管細胞瘤)松果體腺瘤(如成松果體細胞瘤和松果體瘤)；腦脊膜腫瘤(如腦脊膜瘤、腦脊膜血管外皮細胞瘤、腦脊膜肉瘤)；神經(jīng)鞘細胞瘤(如神經(jīng)鞘瘤和神經(jīng)纖維瘤)；淋巴瘤(如何杰金及非何杰金淋巴瘤(包括各種亞型，原發(fā)性和繼發(fā)性))、變態(tài)瘤(如顱咽管瘤、表皮樣囊腫、皮樣囊腫和膠態(tài)囊腫)以及轉(zhuǎn)移瘤(其可來源于任何腫瘤，最常見的來自肺、乳腺、黑素瘤、腎及胃腸道腫瘤)。
抗血管生長組合物的其它治療性用途除了腫瘤，許多其它非致瘤性血管生長依賴疾病(其的特征為血管的異常生長)也可以用本發(fā)明的抗血管生長組合物或抗血管生長因子治療。這種非致瘤性血管生長依賴疾病的代表性例子包括角膜新生血管形成、肥大瘢痕和瘢痕瘤、增生性糖尿病視網(wǎng)膜病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動靜脈畸形(上面已討論)、動脈粥樣硬化斑、傷口愈合延遲、血友病性關(guān)節(jié)、骨不連合骨折、Osler-Weber綜合癥、牛皮癬、生膿肉芽腫、硬皮病、沙眼、痛經(jīng)(上面已討論)以及血管粘連。
特別地，本發(fā)明的其中一方面提供了治療角膜新生血管形成(包括角膜移植物新生血管形成)的方法，其包括將治療有效量的抗血管生長組合物(如上所述)給予角膜，從而抑制了血管的形成。簡而言之，角膜是一種一般缺乏血管的組織。在特定的病理狀態(tài)下，毛細管可以從角膜緣的角膜周血管叢深入到角膜。當(dāng)角膜形成血管時，其也變得模糊不清，結(jié)果患者的視力敏銳性下降。如果角膜完全混濁，則視力喪失。
血管可以以各種形式和深度進入角膜，其取決于促成新生血管形成的過程。眼科學(xué)家將這些形式傳統(tǒng)地定義為以下幾類角膜翳沙眼、角膜翳leprosus、角膜翳phylctenulosus、角膜翳變性和青光眼角膜翳。角膜基質(zhì)也可以通過睫前動脈分支而被侵襲(稱為間質(zhì)血管化)，其可引起幾種獨特的臨床損傷末端襻、刷子樣圖案、傘型、格子型、間質(zhì)連拱(從鞏膜外層血管)和迷行不規(guī)則血管。
許許多多的疾病都可以導(dǎo)致角膜新生血管形成，包括例如角膜感染(如沙眼、單純皰疹性角膜炎、利什曼病和盤尾絲蟲病)、免疫過程(如移植物排斥和Stevens-Johnxon′s綜合癥)、堿灼傷、創(chuàng)傷、發(fā)炎(任何起因)、毒性和營養(yǎng)不足狀態(tài)以及配戴隱形眼鏡引起的并發(fā)癥。
盡管角膜新生血管形成的原因有很多，但是角膜對損傷的反應(yīng)以及隨后的血管向內(nèi)生長不論什么原因都是類似的。簡而言之，只有那些位于緣重要距離內(nèi)的受傷的部位似乎很重要，其會促發(fā)血管生長應(yīng)答。這可能是由于激發(fā)血管侵襲的抗血管生長因子是在損傷部位產(chǎn)生的，其必然會擴散到最鄰近的血管(緣)以發(fā)揮其的作用。從緣越過一定距離，這就不可能發(fā)生，并且不會誘導(dǎo)緣內(nèi)皮長入角膜。一些血管生長因子可能與此過程有關(guān)，它們許多是炎性反應(yīng)的產(chǎn)物。的確，角膜新生血管的形成似乎僅發(fā)生在炎性細胞浸潤過程中，并且血管生長的程度與炎性反應(yīng)的程度成正比。角膜水腫通過松弛角膜基質(zhì)韌帶及提供“最小阻力”的毛細管生長通道而進一步助長了血管的向內(nèi)生長。
初期炎性反應(yīng)后，毛細管以其在其它組織中相同的方式長入角膜。緣毛細管和小靜脈的通常靜止性內(nèi)皮細胞受到刺激而分化并遷移。內(nèi)皮細胞從其原來的血管突出，消化周圍的基膜及其將通過的組織，并且向血管生長刺激源遷移。盲端的新芽具有了腔，然后吻合在一起形成毛細管襻。最后的結(jié)果是在角膜內(nèi)建立了血管叢。
本發(fā)明的抗血管生長組合物通過阻斷血管生長助催化劑的刺激作用、減少內(nèi)皮細胞分化、減少內(nèi)皮細胞遷移并且破壞內(nèi)皮分泌的蛋白水解酶的活性而發(fā)揮作用。
本發(fā)明特別優(yōu)選的實例中，抗血管生長因子可以在鹽水中制備成局部用藥的形式(含有通常用于眼用制劑的任何防腐劑和抗菌劑)，并且以滴眼劑的形成給藥?？寡苌L因子溶液可以其純凈形式制備，每天給藥數(shù)次。同樣，抗血管生長組合物(如上制備)也可直接用于角膜。在優(yōu)選的實例中，抗血管生長組合物用可結(jié)合到角膜的粘液附著性聚合物制備。在另外的實例中，抗血管生長因子或抗血管生長組合物可以用作常規(guī)甾類化合物治療的佐劑。
局部治療也可用于角膜損傷，角膜損傷極有可能誘導(dǎo)血管生長應(yīng)答(如化學(xué)灼燒)。在這些情況下，立即進行治療(可能與類固醇一起)可有助于防止隨后的并發(fā)癥。
在其它實例中，上述抗血管生長組合物可以在顯微鏡指引下由眼科醫(yī)生直接注射入角膜基質(zhì)。注射優(yōu)選部位可隨患者個人損傷的形態(tài)學(xué)的不同而不同，但是用藥的目的是將組合物置于脈管系統(tǒng)的前方(即，散布在血管和正常角膜間)。在多數(shù)情況下，進行角膜緣注射以“防止”角膜生長血管。這一方法也可在角膜損傷后立刻施用以預(yù)防性防止角膜新生血管形成。在這種情況下，藥物應(yīng)注射入散布在角膜損傷及其不希望的？角膜緣中。在防止毛細管侵襲移植角膜中也可類似使用這種方法。如果使用持續(xù)釋放的制劑，每年僅需注射2-3次。也可在注射液中加入類固醇以減少由注射劑本身導(dǎo)致的發(fā)炎。
本發(fā)明另一方面提供了治療肥大瘢痕和瘢痕瘤的方法，其包括將上述一種抗血管生長組合物用于肥大瘢痕或瘢痕瘤。
簡而言之，傷口的愈合及瘢痕的形成發(fā)生在三個階段中發(fā)炎，增殖和成熟。第一階段-發(fā)炎出現(xiàn)在對嚴(yán)重到？的應(yīng)答中。在這一階段(持續(xù)3到4天)，血液和組織液形成粘性凝塊和纖維網(wǎng)，其可將傷口表面連接到一起。然后是增殖階段，其中傷口邊緣的毛細管和結(jié)締組織向內(nèi)生長，并且閉合皮膚的缺陷。最后，一旦毛細管和成纖維細胞的增殖停止，成熟階段就開始，其中瘢痕收縮并且變得少細胞、少血管，并且看起來平坦和白凈。這一最后的階段要花費6至12個月。
如果產(chǎn)生了太多的結(jié)締組織并且傷口仍不斷地細胞化，瘢痕會變紅并且高出來。如果瘢痕保持在最初傷口的邊界內(nèi)，其是指肥大瘢痕，但是如果其延伸出最初的瘢痕并進入周圍的組織，則損傷是指瘢痕瘤。肥大瘢痕和瘢痕瘤產(chǎn)生于瘢痕形成的第二和第三階段。一些傷口特別容易過度的內(nèi)皮和成纖維細胞增殖，包括灼燒、開放傷口和感染傷口。隨肥大瘢痕一起，產(chǎn)生不同程度的成熟并且逐漸改善。在瘢痕瘤中，則產(chǎn)生一種能變得很大的實實在在的腫瘤。這種情況下少見自發(fā)性改善。
因此，在本發(fā)明一個實例中，如上所述的單獨的抗血管生長因子或者抗血管生長組合物直接注射入肥大瘢痕或瘢痕瘤中以防止損傷的發(fā)展。注射的頻率取決于所用聚合物(如果有的話)的釋放動力學(xué)及臨床應(yīng)答。這一治療在預(yù)防性治療(一些已知可導(dǎo)致肥大瘢痕和瘢痕瘤生長的情況(如灼燒))中尤其有用，并且優(yōu)選在增殖階段有時間進展后開始(在最初損傷后約14天)。
本發(fā)明另一方面提供了治療新生血管性青光眼的方法，其包括將治療有效量的抗血管生長組合物用于眼，這樣就抑制了血管的形成。
簡而言之，新生血管性青光眼是一種病理狀態(tài)，其中在眼虹膜中生長新的毛細管。血管生長一般源于瞳孔邊緣的血管，沿虹膜根生長并進入角膜濾簾。成纖維細胞及其它結(jié)締組織成分與毛細管的生長有關(guān)，纖維血管膜沿虹膜的前表面生長。最后，該組織到達前房角，并在此形成角膜粘連。角膜粘連依次連接、成瘢痕及收縮，直至最后閉合前房角。瘢痕的形成阻止了水樣液從前房角的充分排出及進入角膜濾簾，從而導(dǎo)致眼內(nèi)壓升高而可能失明。
新生血管性青光眼一般作為視網(wǎng)膜局部缺血為主的疾病的一種并發(fā)癥。特別地，患有這種疾病的約三分之一患者具有糖尿病視網(wǎng)膜疾病，28％的患者具有中心視網(wǎng)膜靜脈阻塞。其它的還有慢性視網(wǎng)膜脫落、晚期青光眼、頸動脈阻塞性疾病、晶狀體后纖維組織化、鐮刀性細胞貧血、眼內(nèi)瘤和頸動脈多孔瘺。在早期階段，新生血管性青光眼可以通過高倍縫燈生物顯微鏡診斷，即在虹膜表面出現(xiàn)了小的、膨脹的混亂毛細管(漏熒光)。后來的前房角鏡通過纖維血管帶證實了前房角的進行性閉塞。如果前房角仍是開放狀態(tài)，保留性治療會有幫助。但是，一旦前房角關(guān)閉，就需要進行手術(shù)以減輕眼內(nèi)壓。
因此，本發(fā)明的一個實例中，抗血管生長因子(單獨或者在抗血管生長組合物中，如上所述)可局部用于眼以治療早期的新生血管性青光眼。
本發(fā)明的另一實例中，抗血管生長組合物可以通過將該組合物注入前房角部位而移植。其可提供一種持續(xù)集中增加的抗血管生長因子，并防止血管長入該區(qū)域。移植或注射的抗血管生長組合物(置于虹膜的前毛細管和前房角之間)可以“保護”開放的前房角不進行新生血管化。當(dāng)毛細管不在抗血管生長組合物的明顯半徑內(nèi)生長時，即可維持前房角的開放性。另一個實例中，抗血管生長組合物也可置于任何地方，這樣抗血管生長因子就連續(xù)地釋放入水樣液中。這可以增加水樣液中抗血管生長因子的濃度，其反過來可浸泡虹膜表面及其異常的毛細管，從而提供了另一種轉(zhuǎn)運藥物的機制。這些治療形式也可用于預(yù)防，并且可與現(xiàn)有的治療方法結(jié)合。
本發(fā)明的另一方面提供了治療增生性糖尿病視網(wǎng)膜疾病的方法，其包括將治療有效量的抗血管生長組合物用于眼，從而抑制了血管的形成。
簡而言之，糖尿病視網(wǎng)膜疾病的病理學(xué)被認為與上述新生血管性青光眼類似。特別地，認為糖尿病視網(wǎng)膜疾病的背景是在視網(wǎng)膜缺氧的影響下轉(zhuǎn)化為增生性糖尿病視網(wǎng)膜疾病。一般地，新生血管組織從視神經(jīng)(通常在邊緣的10mm內(nèi))長出，以及從組織灌注缺乏部位的視網(wǎng)膜表面長出。最初，毛細管在視網(wǎng)膜內(nèi)部有限的膜及玻璃體的后表面之間生長。最后，血管長入玻璃體并穿過內(nèi)部有限的膜。當(dāng)玻璃體收縮時，牽引力施加在血管上，通常會導(dǎo)致血管斷裂并遮蔽玻璃體(由于出血)。視網(wǎng)膜中瘢痕的纖維牽引力也可產(chǎn)生視網(wǎng)膜脫落。
選擇的常規(guī)治療是全視網(wǎng)膜光凝固以減少視網(wǎng)膜組織，從而降低視網(wǎng)膜的氧需求量。盡管其最初是有效的，但是會有高的復(fù)發(fā)率(新的損傷在視網(wǎng)膜其它部位形成)。這一治療的并發(fā)癥包括周圍視覺的下降(50％的患者)、角膜的機械性磨損、激光誘導(dǎo)的白內(nèi)障形成、急性青光眼及亞視網(wǎng)膜新生血管生長的刺激(其會導(dǎo)致視力的喪失)。因此，這一方法只是在存在一些危險因素并且危險-有益的比例明顯有利于干涉治療時才進行。
因此，本發(fā)明特別優(yōu)選的實例中，增生性糖尿病視網(wǎng)膜疾病可以通過將抗血管生長因子(或抗血管生長組合物)注射入水樣液或玻璃體中以增加視網(wǎng)膜內(nèi)抗血管生長因子的濃度而進行治序。優(yōu)選地，這種治療應(yīng)在患上嚴(yán)重疾病(需要光凝固)之前開始。本發(fā)明的另一個實例中，可以栓塞供給新生血管損傷的動脈(使用如上所述的抗血管生長組合物)。
本發(fā)明的另一方面提供了治療晶狀體后纖維組織化的方法，其包括將治療有效量的抗血管生長因子(或抗血管生長組合物)用于眼，從而抑制血管的形成。
簡而言之，晶狀體后纖維組織化是一種發(fā)生在接受氧治療的早產(chǎn)嬰兒中的疾病。周圍視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)(特別是太陽穴邊)直到胎兒生命末才完全形成。過量的氧氣(甚至在分娩期為生理性的水平)及氧游離基的形成被認為是引起未成熟視網(wǎng)膜血管損傷的重要原因。這些血管收縮，然后由于暴露在氧氣中其變得結(jié)構(gòu)性阻塞。因此，周圍視網(wǎng)膜不能形成血管，結(jié)果產(chǎn)生視網(wǎng)膜局部缺血。由于局部缺血，在正常的及局部缺血的視網(wǎng)膜連接處產(chǎn)生新生血管形成。
在75％的病例中，這些血管自動退化。但是，剩下的25％仍繼續(xù)毛細管生長、纖維血管成分的收縮及血管和視網(wǎng)膜的牽引。這會導(dǎo)致玻璃體出血和/或視網(wǎng)膜脫落而引起失明。新生血管角閉合性青光眼也是這一疾病的并發(fā)癥。
確定哪種疾病會自愈及哪種將更為嚴(yán)重通常是可能的，一般僅在患有確定疾病及具有充分發(fā)展的病理學(xué)的患者中進行治療。這種“等候查看”的方法阻止了早期治療干涉，使得疾病進一步發(fā)展(25％的患者病情復(fù)雜化)。因此，本發(fā)明的一個實例中，可在嬰兒(其中該疾病的進展具有高度的危險性)中局部施用抗血管生長因子(或抗血管生長組合物，如上所述)以切斷晶狀體后纖維組織化進展的影響。另一實例中，可以進行玻璃體內(nèi)注射和/或眼內(nèi)移植抗血管生長組合物。在已確定的疾病中這些方法尤為優(yōu)選，從而減少手術(shù)的需求。
本發(fā)明的另一方面提供了治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，其包括將治療有效量的抗血管生長組合物用于關(guān)節(jié)，從而抑制了血管的形成。
簡而言之，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，關(guān)節(jié)的損傷是由于炎癥(包括白細胞和白細胞產(chǎn)物)和關(guān)節(jié)翳組織(一種由新生血管組織、結(jié)締組織和炎癥細胞組成的組織)的發(fā)展。一般地，慢性炎癥其本身不足以導(dǎo)致關(guān)節(jié)表面的損傷，但是一旦纖維血管組織消化了軟骨組織就會產(chǎn)生永久的缺陷。
本發(fā)明的一個優(yōu)選的實例中，抗血管生長因子(包括抗血管生長組合物，如上所述)可以通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射、作為外科手術(shù)用糊劑或口服制劑(例如，含有抗血管生長因子的反應(yīng)停)而應(yīng)用，從而抑制了關(guān)節(jié)內(nèi)血管的形成。這一方法代表性例子詳見下面的實施例9。
如上所述，本發(fā)明另一方面提供了含有一個合成管(其表面包衣有如上所述的抗血管生長組合物)的血管移植物。簡而言之，血管移植物是一種合成管(通常由滌綸或Gortex制得)，經(jīng)手術(shù)插入而繞過動脈阻塞，最常見的是從主動脈至股動脈，或者從股動脈至腿彎部動脈。使股動脈-腿彎部動脈旁道移植物復(fù)雜化的一個主要問題是血管壁中亞內(nèi)皮類瘢痕反應(yīng)的形成(稱為新生內(nèi)膜增生)，其可使鄰接移植物任一末端的管腔變窄，并且其可能為進行性的。包衣有或含有抗血管生長因子(或抗血管生長組合物，如上所述)的移植物可用于在移植物任一末端限制新生內(nèi)膜增生的形成。然后可以通過常規(guī)的旁道技術(shù)將移植物手術(shù)置入。
本發(fā)明的抗血管生長組合物也可以各種其它方式應(yīng)用。例如，其可以結(jié)合到手術(shù)縫線中以防止縫線肉芽瘤；移植到子宮內(nèi)(像宮內(nèi)節(jié)育器那樣)來治療痛經(jīng)或者作為一種控制女性生育的方式；作為腹膜灌注液或在治療子宮內(nèi)膜異位時用于腹膜移植；作為一種系統(tǒng)化療形式附著在對抗活化內(nèi)皮細胞的單克隆抗體上；或者附著在放射性標(biāo)記的識別活化內(nèi)皮細胞的單克隆抗體上而用于診斷性成像。
下述實施例用于說明，而非限定。
實施例實施例1抗侵襲性因子的制備切開角鯊的肩胛帶和顱骨，然后用手術(shù)刀刮以除去軟骨上所有的肌肉及相關(guān)的結(jié)締組織。然后用組織研磨機使軟骨均勻，在含有2.0M鹽酸胍和0.02MMES的溶液(pH6.0)中于室溫連續(xù)攪拌2至5天來萃取。
2至5天后，將軟骨萃取物通過網(wǎng)狀絲布除去大的成分。然后將濾液通過使用螺旋形筒的Amicon超濾器(其可切去分子量100,000)。濾液(含有分子量小于100,000道爾頓的蛋白質(zhì))在0.02MMES緩沖液(pH6)中滲析，其用Amicon超濾器保留住分子量大于3,000道爾頓的蛋白質(zhì)。通過使用這一方法可除去低分子量的蛋白質(zhì)和成分，以及過量的鹽酸胍。將滲析液濃縮至終濃度9mg/ml。
實施例2各種藥物的抗血管生長活性分析A雞絨毛膜尿囊膜(“Cam”)試驗將受精的家養(yǎng)雞胚在無殼培養(yǎng)前孵育3天。在此過程中，通過除去位于空氣中的蛋殼而倒空蛋的內(nèi)容物。然后分離里面的蛋殼膜，將蛋殼的另一末端穿孔以使蛋內(nèi)容物緩慢滑出鈍端。將蛋內(nèi)容物倒入圓底無菌玻璃碗中，用陪替氏培養(yǎng)皿蓋上。然后將其置于孵育箱(90％的相對濕度，3％CO2)中孵育3天。
將紅豆杉醇(Sigma，St.Louis，MI)在濃度為1，5，10，30mg每10ml等分試樣的0.5％含水甲基纖維素中混合。由于紅豆杉醇不溶于水，所以使用玻璃珠來產(chǎn)生細顆粒。將該溶液的10微升等分試樣在間隔膜上干燥1小時形成直徑2mm的圓盤。然后將含有紅豆杉醇的干燥圓盤小心置于孵育6天的每一CAM的生長邊緣。通過將不含紅豆杉醇的甲基纖維素圓盤放置在經(jīng)過相同時間的CAM上而獲得對照。放置2天后(孵育的第8天)，用立體顯微鏡檢查脈管系統(tǒng)。將LiposynII-一種白色不透明溶液注入CAM中以增加血管細節(jié)的可見度。用一個與攝像機接口的Zeiss立體顯微鏡(Dage-MTIInc.，MichiganCity，IN)將未染色的活雞胚的脈管系統(tǒng)成像。然后將這些視頻信號放大160倍并用影像分析系統(tǒng)(Vidas，Kontron；Etching，Germany)捕捉。然后在圖形記錄儀(Model3000；MatrixInstruments，Orangeburg，NY)上制作影像底片。
用2％戊二烯的0.1M二甲胂酸鈉緩沖液灌注8天的無殼雞胚膜；在CAM下注射另外的固定劑。10分鐘后，除去CAM并置于室溫下新鮮的固定劑中2小時。將該組織在含有6％蔗糖的二甲胂酸鹽緩沖液中洗滌過夜。將待用區(qū)域在1％的四氧化餓中于4℃再固定1.5小時。然后將該組織于分級乙醇中脫水，用氧化丙烯交換溶劑并包埋在Spurr樹脂中。用金剛刀切下薄的部分，置于銅柵上，染色，用Joel1200EX電子顯微鏡檢查。類似地，將0.5mm部分切下，用甲苯蘭染色以用于光學(xué)顯微鏡檢查。
進行11天后，將雞胚用于腐蝕澆鑄技術(shù)。用30規(guī)皮下針將Mercox樹脂(TedPella，Inc.，Redding，CA)注入CAM脈管系統(tǒng)中。澆鑄材料由2.5克MercoxCL-2B聚合物及0.05克具有5分鐘聚合時間的催化劑(55％的過氧化苯甲酰)組成。注射后，將該塑料在室溫下放置1小時，然后在65℃的烘箱中過夜。接著將CAM置于50％氫氧化鈉水溶液中以消化所有的有機成分。在蒸餾水中徹底洗滌塑料模子，空氣中干燥，以金/鈀包衣，用Philips501B掃描電子顯微鏡觀察。
上述實驗的結(jié)果如圖1-4所示。簡而言之，正常雞無殼蛋培養(yǎng)物的一般特征如圖1A所示。在孵育的第6天，在雞胚中心有一個徑向擴展的血管網(wǎng)；CAM在雞胚旁發(fā)育。這些生長的血管緊靠表面，并且用該系統(tǒng)易于觀察，其是一個研究血管生長的理想模型?；畹奈慈旧腃AM毛細管網(wǎng)可以用立體顯微鏡非侵襲性成像。圖1B表明了一種血管區(qū)，其中毛細管內(nèi)的細胞性血液元素用視頻/計算機接口記錄。這種CAM毛細管網(wǎng)的三維構(gòu)造可通過腐蝕澆鑄法顯示，并且可用掃描電子顯微鏡觀察(圖1C)。這些澆鑄顯示了伸向CAM表面的下層血管，在CAM表面其可形成單層吻合毛細管。
CAM的橫向部分顯示出由雙細胞層組成的外胚層、含有毛細管(位于外胚層下)的較寬的中胚層、外膜細胞及內(nèi)部的單內(nèi)胚層細胞層(圖1D)。在電子顯微鏡水平顯示CAM毛細管的典型結(jié)構(gòu)細節(jié)。一般地，這些血管與外胚層的內(nèi)部細胞層緊密相連(圖1E)。
置于濃度為1，5，10或30mg的紅豆杉醇48小時后，在生存條件下用配有視頻/計算機接口的立體顯微鏡檢查每一CA以評估血管生長的效應(yīng)。在放大160倍下(目的是直接觀察毛細管內(nèi)的血細胞)使用這種成像設(shè)備；這樣待查區(qū)域的血流可易于評價和記錄。對于這一研究，將血管生長的抑制定義為在直徑2-6mm的范圍內(nèi)缺少血管網(wǎng)的CAM區(qū)域。抑制區(qū)缺乏血管血流，因此只有在含有紅豆杉醇的甲基纖維素的實驗條件下才能觀察到；在不含紅豆杉醇圓盤的對照條件下，對生長的毛細管系統(tǒng)沒有作用。劑量依賴的、在不同濃度紅豆杉醇作用的實驗數(shù)據(jù)如表II所示。
表II紅豆杉醇的血管生長抑制作用紅豆杉醇濃度μg 雞胚的評價 ％抑制(陽性/總數(shù))30 31/3110010 16/2176
5 18/25 721 6/1540對照 0/300用中心放置有直徑為6mm的無血管區(qū)的透明的甲基纖維素圓盤中顯示典型的紅豆杉醇處理的CAM(圖2A和2B)。在稍高的倍數(shù)，這種無血管區(qū)的邊界非常明顯(圖2C)；周圍的功能性血管通常從紅豆杉醇源改向(圖2C和2D)。在正常條件下從未觀察到這種血流的多角改向。紅豆杉醇作用的另一特征是在無血管區(qū)形成血液島，其表示血細胞的聚集。
用紅豆杉醇處理CAM的相關(guān)形態(tài)學(xué)改變在光學(xué)及電子顯微鏡下很明顯。為方便起見，顯示出從正常轉(zhuǎn)變到無血管狀態(tài)的3個不同階段。在靠近無血管區(qū)的邊緣，通過所有三個胚層內(nèi)的有絲分裂細胞將CAM標(biāo)記(圖3A和4A)。這種增加的有絲分裂也可連續(xù)觀察毛細管內(nèi)皮細胞。但是，內(nèi)皮細胞仍保持連接完整，沒有血細胞的外滲。進一步降解后，CAM便以毛細管的破裂和溶解為特征(圖3B和4B)。假想的內(nèi)皮細胞(一般在有絲分裂中抑制)仍然保持與血細胞的緊密空間聯(lián)系，并且位于外胚層下；但是，這些細胞沒有連接。無血管區(qū)的最中心處為加厚的外胚層和內(nèi)胚層(圖3C和4C)。盡管這些層加厚了，細胞連接處仍保持完整，同時各層仍保持其結(jié)構(gòu)特征。在中胚層內(nèi)充滿散在的有絲分裂抑制的細胞，這些細胞沒有顯示出前一階段觀察到的內(nèi)皮細胞極化作用。同時，在整個無血管區(qū)常見降解的細胞，其為電子密集的液泡和細胞碎片(圖4C)。
概括而言，本項研究證實了對CAM使用紅豆杉醇48小時后抑制了血管生長。血管抑制作用形成了一個無血管區(qū)，其由紅豆杉醇作用的3個轉(zhuǎn)變階段代表。無血管區(qū)中心最受影響的區(qū)域含有外滲紅細胞的破裂的毛細管；其表明在內(nèi)皮細胞間沒有了細胞內(nèi)的連接。內(nèi)胚層細胞和外胚層細胞保留了其的細胞內(nèi)連接，因此這些胚層是完整的；但是其稍微加厚了。接近正常血管區(qū)，血管保持了其連接復(fù)雜性，因此也是完整的。在紅豆杉醇處理區(qū)的邊緣，進一步的血管生長受到抑制，其特征是血管典型的改向或者是“彎頭”作用(圖24D)。
紅豆杉醇處理的無血管區(qū)也呈現(xiàn)出CAM所有3個胚層的大量細胞在有絲分裂中的抑制；這是紅豆杉醇所特有的，因為以前的研究沒有說明這一現(xiàn)象。由于在有絲分裂中受到抑制，內(nèi)皮細胞不能進行其正常的血管生長代謝功能。相比而言，由蘇拉明和醋酸可的松形成的無血管區(qū)在CAM中不產(chǎn)生有絲分裂抑制的細胞；其只是阻止了血管進一步長入處理過的區(qū)域。因此，盡管都是抗血管生長的藥物，血管生長過程的靶位有許多位點。
同時也花費了48小時的時間觀察紅豆杉醇的作用，并且注意到血管生長的抑制發(fā)生在用藥后9小時。組織學(xué)部分表明了如48小時無血管區(qū)第一個轉(zhuǎn)變階段出現(xiàn)的類似的形態(tài)學(xué)(如圖3a和4a所示)。同樣，觀察到了先前觀察的無血管區(qū)重新血管化過程。已發(fā)現(xiàn)由肝素和血管穩(wěn)定性類固醇形成的無血管區(qū)在用藥后60小時重新血管化。本項研究中，用紅豆杉醇處理的無血管區(qū)在用藥后至少7天未發(fā)生重新血管化，其表明了一種更有力的長期作用。
實施例3蘇拉明的包囊將1毫升5％ELVAX(與5％乙烯基乙酸酯交聯(lián)的聚(乙烯乙酸乙烯酯))的二氯甲烷(“DCM”)與固定重量的蘇拉明鈉亞微細粒粉末混合。將該混合物注入30ml平底試管中的5ml5％聚乙烯醇(“PVP”)水溶液中。然后將含有不同重量藥物的試管懸浮在40℃自動攪拌的多試樣水浴中90分鐘。移去混合物，將微球試樣用于粒度分析。將試管在1000g離心5分鐘。除去PVA上清液，留作分析(未包囊藥物)。然后在5ml水中洗滌(漩渦)微球并重新離心。5ml洗液留作分析(表面結(jié)合的藥物)。然后在50ul甲醇中潤濕微球，在1mlDCM中渦旋以溶解ELVAX。接著將微球升溫至40℃，攪拌下緩緩加入5ml50℃的水。此過程導(dǎo)致DCM迅速蒸發(fā)，因此使蘇拉明鈉釋放入5ml水中。然后將所有5ml試樣用于測定藥物含量。
蘇拉明鈉在λmax312nm吸收紫外/可見光。該吸收在0至100ug/ml的范圍內(nèi)(水及5％PVA中)成線性。藥物在312nm的最大激發(fā)波長處及400nm的最大發(fā)射波長處有強烈的熒光。這種熒光在0至25ug/ml的范圍內(nèi)可定量。
結(jié)果如圖5-10所示。簡而言之，微球的粒度分布似乎不受DCM中藥物內(nèi)含物的影響(見圖5和6)。在20至60um范圍內(nèi)可獲得很好的微球產(chǎn)率。
蘇拉明的包囊非常低(＜1％)(見圖8)。但是，隨著DCM中藥物重量的增加，包囊藥物的總量也增加，盡管包囊的百分?jǐn)?shù)下降。如圖7所示，在50mgELVAX中可包囊50ug藥物。蘇拉明鈉在含有10％NaCl的5％PVA中的包囊如圖9-10所示。
實施例4紅豆杉醇的包囊將500毫克的紅豆杉醇或漿果赤霉素(一種紅豆杉醇類似物，可從InflazymePharmaceuticalsInc.，Vancouver，BritishColumbia，Canada獲得)溶于1ml50∶50的ELVAX∶聚乳酸混合物(dcm)中。然后在溶解器(六錠子溶解測試儀，VanKillIndustriesInc.，U.S.A.)中以200轉(zhuǎn)/分的速率于42℃制備3份微球(3小時)。所制得的微球在水中洗滌兩次，于顯微鏡上測定大小。
在紫外/可見試驗(紫外/可見λmax237nm，在激發(fā)波長237及發(fā)射波長325nm處進行熒光試驗熒光結(jié)果用方括號[]表示)下確定紅豆杉醇的包囊。使用上述的方法，58ug(+/-12ug)[75ug(+/-25ug)]的紅豆杉醇可從500ug起始材料中包囊。其表示12％(+/-2.4％)[15％(+/-5％)]的原始重量，或者1.2％(+/-0.25％)[1.5％(+/-0.5％)]重量的聚合物。在烘箱中于37℃轉(zhuǎn)動18小時后，10.3％(+/-10％)[6％(+/-5.6％)]總量的紅豆杉醇從微球中釋放出。
對于漿果赤霉素而言，100+/-15ug[83+/-23ug]的漿果赤霉素可從500ug總量的起始材料中包囊。其表示20％(+/-3％)[17％(+/-5％)]的漿果原始重量，及2％(+/-0.3％)[1.7％(+/-0.5％)]重量的聚合物。在烘箱中于37℃轉(zhuǎn)動18小時后，55％(+/-13％)[60％(+/-23％)]的漿果赤霉素從微球中釋放出。
實施例5含有抗血管生長組合物的手術(shù)用糊劑的分析將重量約為300克的Fisher大鼠麻醉，橫向切開1cm的上腹部。將十分之二毫升含有1×106活的9L神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤(在用于組織培養(yǎng)前立即洗脫)的鹽水注入2個肝葉中(共5個，通過將一個27規(guī)針穿入肝囊1cm處)。用6.0吸收縫線和皮膚鉗閉合腹部傷口，并用全身麻醉劑終止。
2周后，腫瘤沉積處約有1cm。這時，切除肝腫瘤，并且將止血藥施于肝暴露的邊緣。大鼠分為兩組一半單獨給予聚合物載體，另一半接受抗血管生長組合物。
肝切除后2，7，14，21及84天處死大鼠。特別地，將Euthanyl注入尾背靜脈而使大鼠安樂死去。除去肝、脾及肺，進行組織學(xué)分析以研究腫瘤作為抗血管生長活性的證據(jù)。
實施例6大鼠動脈的栓塞將重量約為300克的Fisher大鼠麻醉。在無菌條件下，橫向切開1cm的上腹部。將十分之二毫升含有一百萬活的9L神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤(在用于組織培養(yǎng)前立即洗脫)的鹽水分別注入5個肝葉中(通過將一個27規(guī)針穿入肝囊1cm處)。在退出針時，將十分之一毫升普通鹽水注入針中以確保沒有溢出的細胞流入腹膜腔中。把一個明膠海綿小拭子置于每個穿針部位以止血。用6.0吸收縫線和皮膚鉗閉合腹部傷口，并用麻醉劑終止。使大鼠返回到動物房，進行14天標(biāo)準(zhǔn)飲食，此時測得腫瘤沉積處的直徑為1cm。用Wester大鼠及一種結(jié)腸癌細胞系(RadiologicOncologyLab，M.D.Anderson，Houston，Texas)重復(fù)同樣的步驟。在這種情況下，注射后需3周的時間測得每個腫瘤沉積處的直徑為1cm。
2或3周后，進行相同的全身麻醉并沿腹中線切開(由大鼠的種類而定)。翻出十二指腸，識別胃十二指腸動脈并使之活動。在胃十二指腸動脈(GDA)切口的上方和下方結(jié)扎，利用手術(shù)顯微鏡將0.038英寸的聚乙烯管逆行引入該動脈。插入點下方的線會結(jié)扎動脈，而上方的線可將導(dǎo)管固定住。經(jīng)導(dǎo)管注入0.5ml60％的不透射線的造影劑(X射線照射)施行血管造影術(shù)。然后通過從胃十二指腸動脈導(dǎo)管回流15-200um的顆粒而栓塞肝動脈，直到觀察(通過手術(shù)顯微鏡)到停止流動至少30秒為止。通過GDA導(dǎo)管重復(fù)血管造影照片以確證肝動脈的阻塞。使用這一方法，一半的大鼠接受單一的15-200um的聚合物顆粒，另一半接受15-200um的聚合物-抗血管生長因子組合物顆粒。撤出導(dǎo)管時，系緊GDA上部的結(jié)扎線以阻塞GDA并止血，肝動脈(盡管栓塞)仍是完整的。用6.0吸收縫線及手術(shù)鉗閉合腹部。
栓塞后2，7，14，21及84天時處死大鼠以確定抗血管生長因子的效應(yīng)。簡而言之，進行全身麻醉，使用無菌預(yù)防措施，施行中線切開。再一次活動GDA，在接近GDA與肝動脈連接處(即，先前切口的正上方)放置一結(jié)扎線后，經(jīng)血管切口插入0.038英寸的聚乙烯管，施行血管造影術(shù)。然后通過將Euthanyl注入尾背靜脈使大鼠安樂死去。確證安樂死后，除去整個肝臟，連同胃、脾和兩肺。
在一個用蘇木紫和曙紅(“H和E”)染色的制備幻燈上進行組織學(xué)分析。簡而言之，將肺在1cm間隔處切開以評價栓塞物質(zhì)通過肝靜脈進入右側(cè)循環(huán)的通道。同樣也切開胃和脾以評價從顆粒回流入副循環(huán)的腹腔入口的非特意固定術(shù)。
實施例7大鼠膽管斯坦特固定模移植術(shù)將300克Fisher大鼠進行全身麻醉。在上腹部切開一個橫向切口，識別肝臟。在其最上面的一葉，將0.2ml含有一百萬活的9L神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤(在使用前立即從組織培養(yǎng)物中洗脫)的鹽水用一個27規(guī)針注入1cm深的肝囊處。在退出針后，將一個明膠海綿小拭子置于穿針部位以止血。在退出針時，注射鹽水以確保沒有溢出的細胞流入腹膜腔中或者沿針眼溢出。用全身麻醉終止，將動物返回到動物房，進行正常飲食。
2周后，施用全身麻醉，采用無菌預(yù)防措施，通過中線切口識別含有腫瘤的肝葉。然后將一個16規(guī)血管造影術(shù)用針經(jīng)肝囊插入腫瘤，把一個0.038英寸的導(dǎo)線穿過針，在導(dǎo)線上方退出針。將一5號French擴張器穿過導(dǎo)線進入腫瘤并退出。然后再將一5號French轉(zhuǎn)運導(dǎo)管穿過含有自身膨脹性不銹鋼Wall斯坦特固定模(直徑5mm，長1cm)的導(dǎo)線。將斯坦特固定模深入腫瘤，除去導(dǎo)線轉(zhuǎn)運導(dǎo)管。1/3的大鼠是將常規(guī)用不銹鋼斯坦特固定模插入腫瘤，1/3的大鼠是一包衣有聚合物的斯坦特固定模，另外1/3的為一種用聚合物-抗血管生長因子化合物包衣的斯坦特固定模。用全身麻醉終止，將大鼠返回到動物房中。
第2天用普通腹部X射線照射以評價斯坦特固定模張開的程度。插入斯坦特固定模后第2，7，14，28及第56天時注射Euthanyl處死大鼠，一旦確證安樂死后，將肝臟整個移去。于福爾馬林中固定48小時后，在每0.5mm間隔處切開肝臟(包括用一個新刀片橫向切開斯坦特固定模)。然后分析H和E染色的組織學(xué)部分，評價腫瘤長入斯坦特固定模腔的程度。
實施例8微球的制備生產(chǎn)微球的優(yōu)選設(shè)備如下所述200ml水夾套燒杯(Kimax或Pyrex)，Haake循環(huán)水浴，直徑為2英寸的架空攪拌器和控制器(4葉，螺旋槳型不銹鋼攪拌器-Fisher牌)，500ml玻璃燒杯，熱板/攪拌器(Coming牌)，4×50ml聚丙烯離心管(Nalgene)，塑料插入蓋的玻璃閃爍瓶，臺式離心機(GPRBeckman)，高速離心機-落地式(JS21Beckman)，Mettler分析天平(AJ100，0.1mg)，Mettler數(shù)字頂加載天平(AE163，0.01mg)，自動吸量管(Gilson)。試劑包括聚己內(nèi)酯(“PCL”-分子量10,000到20,000，Polyscience，WarringtonPennsylvania，USA)，“洗滌后”的乙烯乙酸乙烯(“EVA”，洗滌是為了除去抗氧劑BHT)，聚(DL)乳酸(“PLA”-分子量15,000到25,000，Polyscience)，聚乙烯醇(“PVA”-分子量124,000到186,000，99％水解；AldrichChemicalCo.，MilwaukeeWI，USA)，二氯甲烷(“DCM”；HPLCgradeFisherscentific)及蒸餾水。
A5％(重量/體積，w/v)聚合物溶液的制備依賴于預(yù)制備的聚合物溶液，稱重1.00g的PCL或PLA，或者0.50g的PLA及洗滌后的EVA，將其直接倒入20ml玻璃閃爍瓶中。然后加入20毫升DCM，蓋緊瓶。將此瓶于室溫下(25℃)貯存1小時(可以偶爾振搖)，或者直至所有的聚合物都溶解了(溶液應(yīng)澄清)。將溶液于室溫貯存至少兩周。
B5％(重量/體積)儲備液的制備稱重25克PVA，直接倒入600ml玻璃燒杯中。加入500毫升蒸餾水及涂有3英寸特氟隆的攪拌條。用玻璃罩蓋上燒杯以減少蒸發(fā)，并且放入盛有300ml水的2000ml玻璃燒杯中(作為水浴)。將PVA在300轉(zhuǎn)/分下于85℃攪拌(Corning熱板/攪拌器)2小時或者至完全溶解。PVA的溶解可以觀察確定，溶液應(yīng)澄清。然后將溶液轉(zhuǎn)入一個玻璃螺旋塞的容器中，在4℃最長可貯存2個月。但是該溶液在使用或稀釋前應(yīng)升至室溫。
C生產(chǎn)微球的步驟基于預(yù)制備微球的粒度(見表1)，將100mlPVA溶液(濃度如表III所示)放入200ml的水夾套燒杯中。Haake循環(huán)水浴與該燒杯連接，將內(nèi)容物在27℃(+/-10℃)平衡10分鐘?；陬A(yù)制備微球的粒度(見表III)，調(diào)節(jié)架空攪拌器的初始速率，將架空攪拌器的槳葉置于PVA溶液的中間。然后開啟攪拌器，接著用5ml自動吸量管經(jīng)2分鐘將10ml聚合物溶液(使用的聚合物溶液基于預(yù)制備微球的類型)滴加到攪拌著的PVA中。3分鐘后，調(diào)整攪拌速率(見圖III)，繼續(xù)攪拌溶液2.5小時。然后從微球制劑溶液中移去攪拌槳葉，用10ml蒸餾水漂洗以使漂洗液并入微球制劑溶液中。然后將微球制劑液倒入500ml燒杯中，用70ml蒸餾水洗滌夾套水浴，將其也并入微球制劑溶液中。然后用玻璃棒攪拌180ml的微球制劑溶液，分別等量倒入四個50ml聚丙烯離心管中。然后蓋好離心管，離心10分鐘(離心力見表1)。用5ml的自動吸量管或者真空吸管將微球丸中45ml的PVA溶液吸掉。
表IIIPVA濃度，攪拌速率及用于微球不同直徑范圍的離心力制備階段微球直徑范圍30um至 10um至0.1um至100um 30um 3umPVA濃度 2.5％(w/v)( 5％(w/v)(即 3.5％(w/v)(即，用蒸餾水稀釋， 未稀釋的儲備即，用蒸餾水稀釋的5％儲備液) 液) 的5％儲備液)初始攪拌速 500轉(zhuǎn)/分 500轉(zhuǎn)/分 3000轉(zhuǎn)/分率 +/-50轉(zhuǎn)/分 +/-50轉(zhuǎn)/分 +/-50轉(zhuǎn)/分調(diào)節(jié)后的攪 500轉(zhuǎn)/分 500轉(zhuǎn)/分 2500轉(zhuǎn)/分拌速率 +/-50轉(zhuǎn)/分 +/-50轉(zhuǎn)/分 +/-50轉(zhuǎn)/分離心力 1000g+/- 1000g+/- 10000g+/-100g(臺式) 100g(臺式) 1000g(高速式)
將5毫升蒸餾水分別加入每個離心管中，然后將其渦旋以再懸浮微球。將四種微球懸浮液連同20ml蒸餾水一起倒入一個離心管中，再離心10分鐘(離心力見表1)。另外重復(fù)兩次這一過程.總共洗滌3次。然后最后一次離心微球，于10ml蒸餾水中再懸浮。最后洗滌后，將微球制劑轉(zhuǎn)入一個事先稱重的玻璃閃爍瓶中。塞好瓶，于室溫(25℃)放置過夜以使微球在重力作用下沉降。粒度范圍是0.1um至3um的微球不會在重力作用下沉降，因此其留在10ml的懸浮液中。
D直徑為10um至30um或者30um至100um微球的干燥微球在室溫下放置過夜后，用5ml的自動吸量管或真空吸管吸去沉降后微球的上清液。在抽屜中的一個敞口瓶中將微球干燥1星期或者直至其完全干燥(瓶恒重)?？梢酝ㄟ^將敞口瓶放置在通風(fēng)櫥中緩慢流動的氮氣流(流速約為10ml/分鐘)下以加速干燥。當(dāng)完全干燥后(瓶恒重)，稱重瓶，蓋上塞。將標(biāo)記好的加塞瓶于室溫下存放在抽屜中。微球一般保存期不超過3個月。
E直徑為0.1um至3um微球的干燥這一范圍內(nèi)的微球不會沉降下來，因此其可以在4℃懸浮4周。為確定10ml懸浮液中微球的濃度，將200ul懸浮液試樣吸入1.5ml事先稱重的微型離心管中。然后在10,000g離心(Eppendorf臺式微型離心管)，除去上清液，將離心管在50℃放置過夜。然后再稱重離心管以確定管中干燥微球的重量。
F裝有紅豆杉醇微球的制備為制備含有微球的紅豆杉醇，將適量的稱重紅豆杉醇(基于預(yù)包囊紅豆杉醇的百分比)直接放入20ml玻璃閃爍瓶中。然后向含有紅豆杉醇的瓶中加入10毫升適當(dāng)?shù)木酆衔锶芤?，使之渦旋直至紅豆杉醇溶解。
然后如上述步驟(C)至(E)制備含有紅豆杉醇的微球。
實施例9斯坦特固定模包衣的制備用于下述實驗的試劑和設(shè)備包括(從許多生產(chǎn)商獲得的醫(yī)用級斯坦特固定模，如“Stecker”斯坦特固定模)固定裝置，20ml帶塞玻璃閃爍瓶(塑料插入型)，TLC噴霧器，氮氣缸，玻璃試管(1ml以上的不同刻度)，玻璃燒杯(各種型號)，Pasteur吸量管，鑷子，聚己內(nèi)酯(“PCL”-分子量10,000到20,000，Polyscience)，紅豆杉醇(SigmaChemicalCo.，St.，Louis，Mo.，95％純度)，乙烯乙酸乙烯(“EVA”，洗滌，見前)，聚(DL)乳酸(“PLA”-分子量15,000到25,000，Polyscience)，二氯甲烷(“DCM”；HPLCgradeFisherscentific)。
A噴霧斯坦特固定模的制備下面描述了使用長約3cm的3mm卷曲直徑隔離金屬線斯坦特固定模的典型方法。如果是較大直徑的斯坦特固定模，則用大容積的聚合物/藥物溶液。
直接稱重足量聚合物到20ml玻璃閃爍瓶中，加入足量DCM而得到2％w/v的溶液。蓋好瓶，混合溶液以溶解聚合物(用手振搖)。用一塊尼龍并把斯坦特固定模放在曲頸瓶中而將其置于垂直方向。將此斯坦特固定模固定裝置放在距通風(fēng)櫥底6至12英寸的一個適當(dāng)?shù)闹С治锷?例如，倒扣的2000ml玻璃燒杯)以進行水平噴霧。用一自動吸量管將適量(最少5ml)2％聚合物溶液轉(zhuǎn)入另外一個20ml玻璃閃爍瓶中。將適量紅豆杉醇加入溶液中，手搖帶塞瓶以溶解之。
開始噴霧時，拿下瓶蓋，將TLC噴霧器的吸管(僅此)浸入聚合物溶液中。注意在本過程中不需使用噴霧器的儲蓄器20ml的玻璃瓶作為儲蓄器。將氮氣缸連接到噴霧器的氣體入口。逐漸增加壓力直至開始噴霧。記錄這一壓力，并且在此整個過程中都使用該壓力。用5秒種振動噴霧(每次噴霧間有15秒種的干燥時間)來噴霧斯坦特固定模。噴霧5次后，將斯坦特固定模旋轉(zhuǎn)90°后噴霧該部分。重復(fù)直至已噴霧斯坦特固定模所有的面。干燥期間，用手指卷曲氣體線以避免浪費噴霧。繼續(xù)噴霧直至在斯坦特固定模上沉積了適量(基于用于體內(nèi)的特定斯坦特固定模)的聚合物。為確定該數(shù)量，完成噴霧及干燥斯坦特固定模后稱重斯坦特固定模。從終重減去斯坦特固定模的初始重量即為斯坦特固定模上聚合物的量(加紅豆杉醇)。在密封容器中貯存包衣好的斯坦特固定模。
B浸漬斯坦特固定模的制備下面描述了使用長約3cm的3mm卷曲直徑隔離金屬線斯坦特固定模的典型方法。如果是較大直徑的斯坦特固定模，則用大號試管的聚合物/藥物溶液。
直接稱重2gEVA到20ml玻璃閃爍瓶中，加入足量20mlDCM。蓋好瓶，放置2小時以溶解(不斷用手振搖瓶以幫助溶解)。直接稱重已知重量的紅豆杉醇到1ml玻璃試管中，加入0.5ml聚合物溶液。用一個玻璃Pasteur吸量管輕輕抽吸聚合物溶液以溶解紅豆杉醇。紅豆杉醇溶解后，將試管放在近乎水平的地方(粘稠的聚合物溶液不會流出)。用鑷子將斯坦特固定模插入試管的底部。傾斜試管口于水平面下以使聚合物溶液幾乎流至管口，然后再將試管稍稍傾斜到水平面上。一邊緩緩轉(zhuǎn)動試管中的斯坦特固定模，一邊緩緩移去斯坦特固定模(約30秒種)。
在垂直位置干燥斯坦特固定模。一些封閉的孔可能會爆裂，因此在聚合物連續(xù)層中會有一個洞。其可以通過重復(fù)前面的浸漬步驟而修復(fù)，但是重復(fù)步驟也可能導(dǎo)致進一步爆裂及產(chǎn)生不平整的聚合物。一般地，最好就浸漬斯坦特固定模一次，切下沒有爆裂孔的斯坦特固定模。在密閉容器中貯存浸漬斯坦特固定模。
實施例10手術(shù)用“糊”的生產(chǎn)如上所述，本發(fā)明提供了各種含有聚合物的藥物組合物，其可用于各種臨床情況。例如，可以制備如下的組合物(1)作為“熱糊”以液態(tài)形式用于所需部位，在特定溫度下(如體溫)硬化成所需形狀的固態(tài)；(2)作為噴霧劑(即“毫微噴霧劑”)直接或通過一個特殊裝置(如內(nèi)窺鏡)噴在所需部位，隨后硬化成固體，其可以粘附在施用其的組織上；(3)作為一種粘附、柔韌、彈性的血管生長抑制劑聚合物膜直接或通過一個特殊裝置施用于所需部位，并且其優(yōu)選粘附在施用其的部位上；及(4)作為一種在適當(dāng)載體介質(zhì)中由微球懸浮液組成液體的直接或通過一個特殊裝置施用于所需部位，并且其可以在施用部位留下一微球?qū)?。上述實例的代表性例子如下詳述?br> A生產(chǎn)熱糊的方法用于下述實驗的試劑和裝置包括無菌玻璃注射器(1ml)，Corning熱板/攪拌器，20ml玻璃閃爍瓶，塑模(如50ulDSC盤或50ml離心管的塞內(nèi)部分)，手術(shù)刀和鑷子，聚己內(nèi)酯(“PCL”-分子量10,000至20,000；Polysciences，Warrington，PennsylvaniaUSA)，及紅豆杉醇(Sigma級，至少95％的純度)。
直接稱重5.00g聚己內(nèi)酯到20ml玻璃閃爍瓶中。將瓶放在一個含有50ml水的600ml燒杯中。緩緩加熱燒杯至65℃，在此溫度下放置20分鐘。其可使聚合物熔化。于65℃徹底將已知重量的紅豆杉醇或其它血管生長抑制劑混合到熔化的聚合物中。在傾倒過程中可借助一刮鏟。冷卻塑模以使聚合物固化。將聚合物切成小塊(大小約為2mm)。這些小塊必須和1ml玻璃注射器匹配。從1ml玻璃注射器外抽柱塞(不要抽去塞頭)，使之平衡。調(diào)零。
直接稱重0.5g小塊到注射器的開口端。在65℃(corning熱板)將玻璃注射器朝上放置(塞端朝下)在含有蒸餾水的500ml玻璃燒杯中，這樣水不會加入注射器。10分鐘內(nèi)聚合物在該裝置中完全熔化。當(dāng)聚合物小塊熔化后，將注射器移出水浴，水平放置，拔去塞。把柱塞插入注射器中，在注射器末端將熔化的聚合物壓成粘稠團。塞好注射器，于室溫冷卻。
當(dāng)使用時，需再將注射器加熱至60℃，以液體形式用藥，其可在冷至體溫時固化。
B生產(chǎn)毫微噴霧劑的方法毫微噴霧劑是已知鹽水中的小微球。如果微球非常小(即直徑在1um以下)，其形成膠體，一次懸浮液在重力作用下不會沉降。正如下面的詳述，可以制備適用于通過指泵氣溶膠沉積在組織上的0.1um至1um微粒的懸浮液。用于生產(chǎn)毫微噴霧劑的設(shè)備及材料包括200ml水夾套燒杯(Kimax或Pyrex)，Haake循環(huán)水浴，直徑為2英寸的架空攪拌器和控制器(4葉，螺旋槳型不銹鋼攪拌器-Fisher牌)，500ml玻璃燒杯，熱板/攪拌器(Corning牌)，4×50ml聚丙烯離心管(Nalgene)，塑料插入蓋的玻璃閃爍瓶，臺式離心機(GPRBeckman)，高速離心機-落地式(JS21Beckman)，Mettler分析天平(AJ100，0.1mg)，Mettler數(shù)字頂加載天平(AE163，0.01mg)，自動吸量管(Gilson)、無菌吸量管頭、泵氣溶膠(Pfeifferpharmaceuticals)20ml、層流通風(fēng)櫥、聚己內(nèi)酯(“PCL”-分子量10,000到20,000，Polyscience，WarringtonPennsylvania，USA)，“洗滌后”(見前)的乙烯乙酸乙烯(“EVA”)，聚(DL)乳酸(“PLA”-分子量15,000到25,000，Polyscience)，聚乙烯醇(“PVA”-分子量124,000到186,000，99％水解；AldrichChemicalCo.，MilwaukeeWI，USA)，二氯甲烷(“DCM”；HPLCgradeFisherscentific)、蒸餾水及無菌鹽水(BectonandDickensonorequivalent)。
1.5％(w/v)聚合物溶液的制備依賴于預(yù)制備的聚合物溶液，稱重1.00g的PCL或PLA，或者0.50g的PLA及洗滌后的EVA，將其直接倒入20ml玻璃閃爍瓶中。然后用量筒加入20毫升DCM，蓋緊瓶。將此瓶于室溫下(25℃)放置1小時或者直至所有的聚合物都溶解(可以偶爾振搖)。聚合物的溶解可以觀察確定，溶液應(yīng)澄清。標(biāo)記溶液的名稱和生產(chǎn)日期。將溶液于室溫貯存，于兩周內(nèi)使用。
2.3.5％(w/v)儲備液的制備可以通過下述的步驟制備溶液，或者通過稀釋用于制備微球的5％(w/v)PVA儲備液(見實施例8)。簡而言之，直接稱重17.5克PVA到600ml玻璃燒杯中，加入500毫升蒸餾水。在燒杯中放置一個涂有3英寸特氟隆的攪拌條。用玻璃罩蓋上燒杯以減少蒸發(fā)。將燒杯放入盛有300ml水的2000ml玻璃燒杯中(作為水浴)。將PVA在300轉(zhuǎn)/分下于85℃攪拌(Corning熱板/攪拌器)2小時或者至完全溶解。PVA的溶解可以觀察確定，溶液應(yīng)澄清。然后用吸量管將溶液轉(zhuǎn)入一個玻璃螺旋塞的容器中，在4℃最長可貯存2個月。該溶液在使用或稀釋前應(yīng)升至室溫。
3.毫微球的生產(chǎn)方法將攪拌裝置置于通風(fēng)櫥中。將100mlPVA溶液(濃度如表III所示)放入200ml的水夾套燒杯中。Haake循環(huán)水浴與該燒杯連接，將內(nèi)容物在27℃(+/-10℃)平衡10分鐘。將架空攪拌器的初始速率調(diào)節(jié)到3000轉(zhuǎn)/分(+/-200轉(zhuǎn)/分)。把架空攪拌器的槳葉置于PVA溶液的中間，開啟攪拌器。用5ml自動吸量管經(jīng)2分鐘將10ml聚合物溶液(使用的聚合物溶液基于預(yù)制備毫微噴霧劑的類型)滴加到攪拌著的PVA中。3分鐘后，調(diào)整攪拌速率至2500轉(zhuǎn)/分(+/-200轉(zhuǎn)/分)，繼續(xù)攪拌2.5小時。然后從毫微噴霧劑制劑溶液中移去攪拌槳葉，用10ml蒸餾水漂洗。將漂洗液并入毫微噴霧劑制劑溶液中。
將毫微噴霧劑制劑液倒入500ml燒杯中。用70ml蒸餾水洗滌夾套水浴，將其也并入毫微噴霧劑制劑溶液中。然后用玻璃棒攪拌180ml的毫微噴霧劑制劑溶液，分別等量倒入四個50ml聚丙烯離心管中。然后蓋好離心管，在10000g(+/-1000g)離心10分鐘。用5ml的自動吸量管或者真空吸管將毫微噴霧劑丸中45ml的PVA溶液吸出棄去。將5毫升蒸餾水分別加入每個離心管中，然后將其渦旋以再懸浮微球。用20ml蒸餾水將四種微球懸浮液沖入一個離心管中。為了洗滌微球，于10000g(+/-1000g)將毫微噴霧劑離心10分鐘。除去微球丸的上清液。加入40ml蒸餾水，用渦旋再懸浮微球。另外重復(fù)兩次這一過程，總共洗滌3次。進行第四次洗滌，但是只用10ml(不是40ml)蒸餾水再懸浮微球。第四次洗滌后，將微球制劑轉(zhuǎn)入一個事先稱重的玻璃閃爍瓶中。
塞好瓶，于室溫(25℃)放置1小時以使直徑為2um及3um的微球在重力作用下沉降。1小時后，用一5ml自動吸量管吸去上部9ml的懸浮液。將此9ml放入無菌帶塞的50ml離心管中。在10000g(+/-1000g)將懸浮液離心10分鐘。棄去上清液，在無菌鹽水中再懸浮球丸。所用鹽水的量取決于所需懸浮液的終濃度(通常為10％w/v。在無菌鹽水中徹底漂洗氣溶膠裝置，將毫微噴霧劑懸浮液加入到氣溶膠中。
C裝有紅豆杉醇微球的制備為制備含有紅豆杉醇的毫微噴霧劑，使用紅豆杉醇(Sigma級95％純度)。為制備聚合物藥物儲備液，直接稱取適量的紅豆杉醇到20ml玻璃閃爍瓶中。直接放入20ml玻璃閃爍瓶中。適量的確定基于毫微噴霧劑中紅豆杉醇的百分比。例如，如果需要含有5％紅豆杉醇的毫微噴霧劑，則需稱取的紅豆杉醇量為25mg，因為所加入的聚合物的量為10ml5％的聚合物DCM溶液(見下一步驟)。
向含有紅豆杉醇的瓶中加入10毫升適當(dāng)?shù)?％聚合物溶液。蓋好塞并渦旋或者手振蕩以溶解紅豆杉醇(觀察確定紅豆杉醇的溶解)。標(biāo)記生產(chǎn)日期。當(dāng)天使用。
按上述步驟，除了用聚合物/藥物(如紅豆杉醇)儲備液代替聚合物溶液。
D生產(chǎn)薄膜的方法術(shù)語“薄膜”是指可形成各種幾何形狀其中一種的聚合物。薄膜可以是薄的聚合彈性層或者2mm厚的聚合物圓盤。將薄膜設(shè)計為可以放在暴露的組織上，因此任何包囊的藥物在該組織部位可以經(jīng)過很長的時間從聚合物釋放出?？梢酝ㄟ^幾種方法制備薄膜，包括例如澆鑄和噴霧。
澆鑄技術(shù)中，將聚合物熔化并倒入塑模中，或者將其溶于二氯甲烷并倒入塑模中。然后將聚合物冷卻固化或者將溶劑蒸發(fā)而固化。噴霧技術(shù)中，將聚合物溶于溶劑中，噴霧到玻璃上，當(dāng)溶劑蒸發(fā)后，聚合物就固化在玻璃上。重復(fù)噴霧能使聚合物形成可從玻璃上剝離下來的薄膜。
用于下述實驗的試劑和設(shè)備包括小燒杯，corning熱板攪拌器，澆鑄塑模(如50ml離心管塞)及塑模支持裝置，20ml帶塞玻璃閃爍瓶(塑料插入型)，TLC噴霧器，氮氣缸，聚己內(nèi)酯(“PCL”-分子量10,000到20,000，Polyscience)，紅豆杉醇(Sigma95％純度)，乙醇，“洗滌后”(見前)乙烯乙酸乙烯(“EVA”)，聚(DL)乳酸(“PLA”-分子量15,000到25,000，Polyscience)，二氯甲烷(HPLCgradeFisherscentific)。
1.生產(chǎn)薄膜的方法-熔融澆鑄直接稱取已知重量的PCL到一個小燒杯中。將該燒杯放在含有水的較大的燒杯中(作為水浴)，置于70℃的熱板上15分鐘或者直至聚合物完全熔化。將已知重量的藥物加入熔化的聚合物中，充分?jǐn)嚢杌旌衔?。為了協(xié)助藥物在熔化PCL中的分散，可以將藥物懸浮/溶解在少量(＜10％體積的熔化PVL)的100％乙醇中。然后將乙醇懸浮液混合到熔化的聚合物中。將熔化的聚合物倒入塑模中，使其冷卻。冷卻后，在一個容器中貯存薄膜。
2.生產(chǎn)薄膜的方法-溶劑澆鑄直接稱取已知重量的PCL到20ml玻璃閃爍瓶，加入足量的DCM得到10％w/v的溶液。蓋好瓶塞，混合溶液。將足量的紅豆杉醇加入溶液中以獲得所需的紅豆杉醇終濃度。用手振搖或者渦旋以溶解溶液中的紅豆杉醇。將溶液放置1小時(直至沒有氣泡)，然后緩緩倒入塑模中。所用的塑?；谒璧男螤?。在通風(fēng)櫥中將塑模放置過夜以蒸發(fā)DCM。將薄膜留在塑模中貯存或者刮下貯存在密閉的容器中。
3.生產(chǎn)薄膜的方法-噴霧直接稱取足量的聚合物到20ml玻璃閃爍瓶中，加入足量的DCM，得到2％w/v的溶液。蓋好瓶塞，混合溶液以溶解聚合物(手振搖)。在通風(fēng)櫥中于適當(dāng)?shù)乃苣ＶС盅b置中垂直方向放置塑模。將此塑模固定裝置放在距通風(fēng)櫥底6至12英寸的一個適當(dāng)?shù)闹С治锷?例如，倒扣的2000ml玻璃燒杯)以進行水平噴霧。用一自動吸量管將適量(最少5ml)2％聚合物溶液轉(zhuǎn)入另外一個20ml玻璃閃爍瓶中。將足量紅豆杉醇加入溶液中，手搖帶塞瓶以溶解之。開始噴霧時，拿下瓶蓋，將TLC噴霧器的吸管(僅此)浸入聚合物溶液中。注意在本過程中不需使用噴霧器的儲蓄器-20ml的玻璃瓶作為儲蓄器。
將氮氣缸連接到噴霧器的氣體入口。逐漸增加壓力直至開始噴霧。記錄這一壓力，并且在此整個過程中都使用該壓力。用5秒種振動噴霧(每次噴霧間有15秒種的干燥時間)來噴霧塑模。繼續(xù)噴霧直至適當(dāng)厚度的聚合物沉積在塑模上。厚度基于所需量。使噴霧薄膜留在塑模上，將其貯存在密閉容器中。
E毫微糊的制備過程毫微糊是一種懸浮在親水膠中的微球懸浮液。本發(fā)明的一方面，作為將裝有藥物的微球緊置于靶組織上的一種方法，可以將膠或糊涂敷在組織上。由于糊是水性的，其可以很快被體液稀釋，因此導(dǎo)致糊稠度的下降，使微球易于沉積在鄰近的組織上。因此微球包囊的藥物池就定位在靶組織周圍。
用于本實驗的試劑和燒杯包括玻璃燒杯、聚羧乙烯925(藥用級，GoodyerChemicalCo.)、蒸餾水、氫氧化鈉(1M)水溶液、氫氧化鈉(5M)水溶液、懸浮在水中的20％w/v，0.1um至3um粒度范圍的微球(見前)。
1.5％聚羧乙烯膠的制備將足量的聚羧乙烯加入1M的氫氧化鈉，得到5％w/v的溶液。為了溶解1M氫氧化鈉中的聚羧乙烯，放置混合液約1小時，在此期間，用玻璃棒攪拌混合物。1小時后，測定混合液的pH值。低pH值表示聚羧乙烯尚未完全溶解。所需達到的pH值應(yīng)為7.4。用5M的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值(將5M氫氧化鈉緩緩滴加到混合液中，不斷攪拌混合液并測定混合液的pH值)。將pH值調(diào)至7.4通常要花約1個小時的時間。一旦pH值成為7.4，蓋好凝膠并放置2至3小時。然后，檢測pH值以確保其仍為7.4。重復(fù)該過程，直至達到了所需的穩(wěn)定的pH值。在容器上標(biāo)記凝膠名稱及日期。在下一周用此凝膠制備毫微糊。
2.生產(chǎn)毫微糊的方法將足量0.1um至3um的微球加入水中，得到20％微球懸浮液。將8ml5％w/v聚羧乙烯膠放在一個玻璃燒杯中。加入2ml20％的微球懸浮液。用玻璃棒或混合鏟攪拌混合液以充分分散凝膠中的微球。這需30分鐘。一旦微球分散在凝膠中，將混合液放在一個儲存罐中。于4℃貯存。其必須在一個月內(nèi)使用。
實施例11紅豆杉醇從微球中(由乙烯乙酸乙烯酯共聚物及聚(D，L乳酸)混合組成)的控制性釋放。微球在CAM試驗中的體內(nèi)實驗本實施例描述了制備裝有紅豆杉醇的微球(由生物降解性聚(d，1-乳酸)(PLA)聚合物及非生物降解性乙烯乙酸乙烯酯(EVA)共聚物組成)。此外，表明了紅豆杉醇從CAM上的微球中的體外釋放率及抗血管生長活性。
用于本實驗的試劑包括紅豆杉醇(從SigmaChemicalCo.(St.Louis，MO)購買)；PLA(分子量15,000-25,000)及EVA(60％乙酸乙烯酯)(從Polyscience(Warrington，PA)購買)；聚乙烯醇(PVA)(分子量124,000-186,000，99％水解掉，從AkdrichChemicalCo.(Milwaukee，WI)購買)以及二氯甲烷(DCM)(HPLC級，來自FisherScientificCo.)。蒸餾水用于整個過程。
A微球的制備如實施例8用溶劑蒸發(fā)法制備微球。簡而言之，用EVA∶PLA為35∶65至90∶10之間的混合物制備5％w/v聚合物的20mlDCM溶液。向20ml玻璃瓶中5ml2.5％w/v的PVA水溶液中邊攪拌邊滴加1ml的聚合物溶液。將6個類似的瓶放在架空攪拌器、溶解測試儀(Vanderkamp)的6個位置，在200轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢?。將瓶溫?jīng)15分鐘從室溫升至40℃，并在40℃保持2小時。于500×g離心瓶，在水中洗滌微球三次。在一些EVA∶PLA聚合物的混合物中，由于除去了分散劑或乳化劑-PVA，微球試樣在洗滌過程中會聚集。可以半定量分析聚集作用，因為聚集的微球會熔融并且熔融后的聚合物團塊漂浮在洗液的表面。在洗滌過程中棄去這層表面聚合物層，將剩下的丸狀微球稱重。聚集百分?jǐn)?shù)(％)由下式得到
將紅豆杉醇溶解在5％w/v聚合物的DCM溶液中制備裝有紅豆杉醇的微球(0.6％w/w紅豆杉醇)。所用的聚合物混合物為50∶50的EVA∶PLA。通過將紅豆杉醇/聚合物溶液分別滴加到2.5％w/vPVA及5％w/vPVA中而制備微球的“大”顆粒部分及“小”顆粒部分。在200轉(zhuǎn)/分于40℃攪拌分散液2小時，離心并在水中洗滌3次(如前所述)?？諝庵懈稍镂⑶?，用帶有分級測微計的光學(xué)顯微鏡測量試樣的粒度。每個試樣計數(shù)逾300個微球。制備對照組微球(不含紅豆杉醇)，如前測定大小。
B包囊效率將已知重量的裝有紅豆杉醇的微球溶于1mlDCM中，于50℃加入20ml40％的乙腈水溶液，渦旋直至DCM蒸發(fā)掉。用HPLC(流動相為水∶甲醇∶乙腈(37∶5∶58)，流速1ml/分鐘，(Beckmanisocratic泵)，C8反相柱(Beckman)，232nmUV檢測)測定40％乙腈中紅豆杉醇的濃度。為確定提取過程的回收率，將已知重量(100-1000ug)的紅豆杉醇溶于1mlDCM中，如前再進行相同的提取過程。回收率總大于85％，適當(dāng)校正包囊率的數(shù)值。
C藥物釋放研究在15ml螺旋塞玻璃試管中放入10ml10mM磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(pH7.4)及35mg裝有紅豆杉醇的微球。在37℃轉(zhuǎn)動試管，于給定間隔在1500×g離心5分鐘，留下上清液以作分析。于37℃在新鮮的PBS(10ml)中再懸浮微球丸并保溫。將紅豆杉醇吸入1mlDCM中來確定其的濃度，隨后在氮氣流下蒸發(fā)干燥，在1ml40％乙腈水溶液中再生，用如前所述的HPLC分析。
D掃描電子顯微鏡(SEM)將微球放在試樣架上，用金噴鍍包衣，用Philips501BSEM(在15kV操作)進行顯微攝影。
ECAM研究將受精的家養(yǎng)雞胚在無殼培養(yǎng)前孵育4天。在90％相對濕度及3％CO2中孵育蛋內(nèi)容物。孵育的第6天，將1mg等分試樣的裝有0.6％紅豆杉醇或?qū)φ战M微球(不含紅豆杉醇)直接置于CAM表面。暴露2天后，用一個與攝像機接口的立體顯微鏡檢查脈管系統(tǒng)；然后將視頻信號顯示在計算機上并打印。
F結(jié)果由100％EVA制得的微球可自由懸浮在PVA溶液中，但是在隨后于水中洗滌以除去PVA的過程中則發(fā)生凝聚及結(jié)合或者徹底的熔融。與不斷增加比例的PVA混合的EVA所制得的微球，當(dāng)在水中洗滌時，則表現(xiàn)出下降的凝聚力及結(jié)合力(如圖15A所示)。由50∶50混合的EVA∶PLA形成的微球具有良好的物理穩(wěn)定性，即，微球可保持分離狀態(tài)，并且可以很好的懸浮而不發(fā)生聚集及結(jié)合(可忽略)。
“小”顆粒部分微球的粒度范圍確定為＞95％的微球試樣(重量)在10-30mm之間，而“大”顆粒部分的微球則為＞95％的微球試樣(重量)在30-100mm之間。裝有紅豆杉醇的50∶50EVA∶PLA微球的“小”和“大”粒度范圍的代表性掃描電子顯微攝影分別如圖15B及15C所示。微球為表面光滑的球體，并且在微球的表面沒有固體藥物。將紅豆杉醇裝入50∶50EVA∶PLA微球的效率在95-100％之間(紅豆杉醇的初始濃度為每50mg聚合物100-1000mg的紅豆杉醇)。在“小”或“大”微球的包囊效率之間沒有顯著的差異(Studentt-檢驗，p＜0.05)。
紅豆杉醇從0.6％w/v裝載的50∶50EVA∶PLA微球中釋放的時間如圖15D所示(“小”顆粒微球是圓圈，“大”顆粒微球是黑點)。在三個試管中用3項不同的實驗進行釋放速率的研究。釋放圖為雙相，即紅豆杉醇最初的快速釋放或“突發(fā)”相(發(fā)生在兩種粒度范圍微球的最初4天)。隨后是一個非常慢的釋放相。在“小”或“大”微球的釋放速率之間沒有顯著的差異。在含有10-13％紅豆杉醇的微球中，紅豆杉醇在50天釋放完。
用CAM試驗測試裝有紅豆杉醇的微球(0.6％w/v的裝載量)，結(jié)果示于圖15E中。紅豆杉醇微球?qū)⒆懔康乃幬镝尫懦?，從而在周圍組織中產(chǎn)生一個無血管區(qū)(圖15F)。注意緊接微球(圖15E及15F中的“MS”)的是一個完全沒有血管的區(qū)域(區(qū)1)；離微球再遠一些的地方是一個萎縮的無功能毛細管區(qū)(區(qū)2)；只有在離微球約6mm遠的地方毛細管才恢復(fù)正常。在用對照組微球(不含紅豆杉醇)處理的CAM中，血管網(wǎng)為正常。
討論動脈化學(xué)性栓塞是一種侵襲性外科技術(shù)。因此，理想地，抗血管生長藥物及抗癌藥物(如紅豆杉醇)化學(xué)性栓塞的形成可以在腫瘤部位以長時間(幾個月)發(fā)揮活性的足夠濃度釋放藥物。EVA是一種組織相容性非降解聚合物，其已用于長期(＞100天)控制釋放大分子。
最初選擇EVA作為制備微球的聚合物生物材料，其中紅豆杉醇分散在聚合物基質(zhì)中。但是，用100％EVA制備的微球在洗滌過程中幾乎會全部聚集及結(jié)合。
以乳酸和羥基乙酸為基礎(chǔ)的聚合物及共聚物是生理惰性和生物相容性的，并且可以通過水解而降解為毒理學(xué)上可接受的產(chǎn)物。乳酸及羥基乙酸的共聚物比PLA具有更快的降解率，用這些共聚物制備的藥物裝載微球不適于幾個月的長期控制性釋放。Dollinger和Sawan將PLA與EVA混合發(fā)現(xiàn)PLA的降解周期隨EVA在混合物中比例的增加而增加。他們設(shè)想EVA與PLA的混合可以提供給聚合物基質(zhì)比PLA更好的機械穩(wěn)定性及更好的藥物釋放速率的控制。
圖15A表EVA∶PLA基質(zhì)中混合50％或更少的EVA可生產(chǎn)出在水或PBS中物理穩(wěn)定的微球懸浮液。選擇50∶50EVA∶PLA的混合用于隨后所有的研究。
不同粒度范圍的微球可以通過改變?nèi)榛瘎?PVA在水相中的濃度而制備?！靶　蔽⑶蛟?％w/v的高PLA濃度制備，而“大”微球在2.5％w/v的PVA中制備。所有其它生產(chǎn)變量對于兩種粒度微球都相同。高濃度的乳化劑得到稍粘稠的水性分散介質(zhì)，并且制得乳化在水相中的聚合物/紅豆杉醇/DCM小滴，這樣即為小微球。將含有95-100％初始紅豆杉醇的微球加入有機相中在固態(tài)微球中包囊。紅豆杉醇低的水溶性有利于其分散到含有聚合物的有機相中。
紅豆杉醇從50∶50EVA∶PLA微球中的釋放速率非常慢，在50天中釋放出少于15％的裝載紅豆杉醇。藥物釋放的最初突發(fā)相是由于微球表層(靠近微球的表面)藥物的分散。
藥物從非降解性聚合物基質(zhì)(如EVA)的釋放機制認為是水通過聚合物中分散的藥物相而擴散，藥物的溶解及溶質(zhì)通過一系列中間連接(充滿液體的孔)而擴散。EVA和PLA的混合物在PLA中30-70％EVA的范圍內(nèi)是不混溶的或者是雙連續(xù)的。37℃在PBS緩沖液中進行的降解研究中(在誘導(dǎo)或滯后期后)，PLA進行水解性降解并且從EVA∶PLA聚合物混合基質(zhì)中浸蝕下來，殘留下一個惰性海綿狀空架。盡管誘導(dǎo)期及PLA降解的速率以及從混合基質(zhì)的浸蝕取決于PLA在基質(zhì)中的比例及所經(jīng)歷的過程，但是直至40-50天后幾乎沒有或沒有PLA的損失。
盡管在50天的體外釋放速率研究中可能發(fā)生PLA從50∶50EVA∶PLA微球的某些浸蝕(圖15C)，但是很可能藥物從聚合物混合體釋放的原始機制是溶質(zhì)通過聚合物基質(zhì)中多孔網(wǎng)的擴散。
在總結(jié)釋放速率的研究時，分析微球中殘留的藥物量。保留在50天孵育微球試樣中的紅豆杉醇的百分?jǐn)?shù)值分別為94％+/-9％(“大”微球)和89％+/-12％(“小”微球)。
裝載6mg每mg聚合物(0.6％)的微球當(dāng)其置于雞胚CAM上時顯示出強烈的血管生長抑制作用(圖15E和15F)。
實施例12紅豆杉醇在聚(E-己內(nèi)酯)微球中的包囊。裝載紅豆杉醇微球在CAM試驗中的血管生長抑制作用本實施例闡述了聚(e-己內(nèi)酯)的生物可降解微球中紅豆杉醇的體外釋放速率，并且表明了在CAM上從這些微球中釋放出的紅豆杉醇的抗血管生長活性。用于本實驗的試劑包括聚(e-己內(nèi)酯)(“PCL”)(分子量35,000-45,000；從Polysciences(Warrington，PA)購買)；二氯甲烷(“DCM”)(購自FisherScientificCo.，加拿大；聚乙烯醇(PVA)(分子量12,000-18,000，99％水解掉，從AkdrichChemicalCo.(Milwaukee，Wis.)購買)以及來自SigmaChemicalCo.(St.Louis，MO)的紅豆杉醇。除非另有說明，所用的化學(xué)試劑都使用所提供的。蒸餾水用于整個過程。
A微球的制備如實施例8用溶劑蒸發(fā)法制備微球。簡而言之，通過將10mg紅豆杉醇及190mgPCL溶于2mlDCM中、加入100ml1％PVP水溶液并在1000轉(zhuǎn)/分于25℃攪拌2小時而制備裝載5％w/w紅豆杉醇的微球。將微球懸浮液在1000×g離心10分鐘(BeckmanGPR)，除去上清液，用水洗滌微球3次。洗滌后的微球空氣干燥過夜，在室溫下儲存。對照組微球(不含紅豆杉醇)如上制備。用一個帶有分級測微計的光學(xué)顯微鏡測定微球的粒度。
B包囊效率將已知重量的裝載藥物微球(約5mg)溶于8ml乙腈中，加入2ml蒸餾水沉淀聚合物?；旌衔镌?000g離心10分鐘，包囊的紅豆杉醇量從上清液中的吸收計算(用UV分光光度計(Hewlett-Packard8452ADiodeArraySpectrophotometer)在232nm測定)。
C藥物釋放研究將約10ml裝載紅豆杉醇的微球懸浮在一個螺旋塞玻璃試管中10ml10mM磷酸鹽緩沖鹽水中(PBS)(pH7.4)。在37℃轉(zhuǎn)動(開口及管底方向)試管，于給定間隔除去19.5ml上清液(微球沉積在管底后)，通過0.45mm的膜濾器過濾后留作紅豆杉醇分析。在每個試管中放入等體積的PBS以在整個研究中保持下降的狀態(tài)。用3×1mlDCM萃取濾液，將DCM萃取物于氮氣流下蒸發(fā)干燥，再溶于1ml乙腈中，用HPLC(流動相為水∶甲醇∶乙腈(37∶5∶58)，流速1ml/分鐘，(Beckmanisocratic泵)，C8反相柱(Beckman)，232nmUV檢測(ShimadzuSPDA))分析。
DCAM研究將受精的家養(yǎng)雞胚在無殼培養(yǎng)前孵育4天。孵育的第6天，將1mg等分試樣的裝載5％紅豆杉醇或?qū)φ战M微球(不含紅豆杉醇)直接置于CAM表面。暴露2天后，用一個與攝像機接口的立體顯微鏡檢查脈管系統(tǒng)；然后將視頻信號顯示在計算機上并打印。
E掃描電子顯微鏡(SEM)將微球放在試樣架上，用金噴鍍包衣，用Philips50|B掃描電子顯微鏡(在15kV操作)進行顯微攝影。
F結(jié)果微球試樣的粒度范圍在30-100mm之間，盡管在所有裝載紅豆杉醇或者對照組微球中發(fā)現(xiàn)一些微球落在此范圍外。PCL微球裝載紅豆杉醇的效率在所有裝載藥物的微球中通常大于95％。掃描電子顯微鏡檢查表明所有的微球都是球體，形態(tài)上許多為粗糙或紋孔表面。在微球表面沒有發(fā)現(xiàn)固體藥物。
紅豆杉醇從裝載1％、2％及5％紅豆杉醇PCL微球中的釋放時間如圖16A所示。釋放圖為雙相。在所有裝載的藥物中有一個紅豆杉醇最初的快速釋放或“突發(fā)”相。突發(fā)相在1％和2％紅豆杉醇的裝載中發(fā)生1-2天，在5％裝載的微球中發(fā)生3-4天。繼最初的快速釋放相后是一個非常慢的藥物釋放相。含有1％或2％紅豆杉醇的微球在21天后就沒有更多的藥物釋放了。在裝載5％紅豆杉醇的微球中，21天后微球已釋放出全部藥量的20％。
圖16B表明用對照組PCL微球處理的CAM，圖16C表明用裝載5％紅豆杉醇微球處理的CAM。用對照組微球處理的CAM具有正常的毛細管網(wǎng)。用紅豆杉醇-PCL微球處理的CAM顯示出明顯的血管退化及缺乏血管網(wǎng)的區(qū)域。
G討論制備裝載紅豆杉醇微球的溶劑蒸發(fā)法具有很高的紅豆杉醇包囊效率-95-100％。這是由于紅豆杉醇難溶于水，其的憎水特性有利于其在含有聚合物的有機溶劑相中分配。
紅豆杉醇的雙相釋放圖是許多藥物從生物可降解聚合物基質(zhì)中釋放的典型方式。聚(e-己內(nèi)酯)是一個酯族聚酯，其在生理條件下通過水解而降解，無毒，同時其是組織相容性的。PCL的降解比已做過詳細研究的乳酸和羥基乙酸的聚合物及共聚物的降解要慢的多，因此其適用于長期藥物釋放體系。紅豆杉醇釋放的最初快速或突發(fā)相認為是由于微球表層(靠近微球的表面)藥物的分散。紅豆杉醇在第二相(慢)的釋放方式不可能歸因于PCL的降解或浸蝕，因為研究表明在體外的條件下，經(jīng)過7.5星期的時間，PCL在水中沒有明顯的重量損失或表面浸蝕。紅豆杉醇釋放的慢相可能是由于藥物溶解在聚合物基質(zhì)充滿液體的孔隙中以及在孔隙中的擴散。在裝載紅豆杉醇較多的微球中較高的釋放速率可能是聚合物基質(zhì)中更多孔隙網(wǎng)的結(jié)果。
已表明含有5％紅豆杉醇的微球當(dāng)置于CAM上時能釋放出足量的可產(chǎn)生血管生長強烈抑制作用的藥物。對血管生長的抑制導(dǎo)致了圖16C中所示的無血管區(qū)。
實施例13由乙烯乙酸乙烯酯及表面活性劑組成的裝載紅豆杉醇的聚合物薄膜如實施例10制備兩種類型的薄膜裝載紅豆杉醇的純EVA薄膜及裝載紅豆杉醇的EVA/表面活性劑混合薄膜(即，PluronicF127，Span80和PluronicL101)。
檢測的表面活性劑是兩種憎水表面活性劑(Span80和PluronicL101)和一種親水表面活性劑(PluronicF127)。Pluronic表面活性劑本身是聚合物，這一點很吸引人，因為其可與EVA混合而使各種因為釋放性質(zhì)最佳化。Span80的分子稍小，其可以某種方式分散在聚合物基質(zhì)中，但是不形成混合物。
表面活性劑可以用于調(diào)節(jié)紅豆杉醇從薄膜的釋放速率，并且可以優(yōu)化薄膜的某些物理參數(shù)。表面活性劑混合的薄膜(其表明藥物釋放速率可以控制)具有改變速率及化合物在水中膨脹程度的能力。水在聚合物-藥物基質(zhì)中的擴散對藥物從載體中的釋放很重要。圖17C和17D表明了當(dāng)表面活性劑水平在混合物中改變時薄膜膨脹的程度。純EVA薄膜在2個月內(nèi)沒有顯著程度的膨脹。但是，當(dāng)增加加入EVA中表面活性劑的水平時，可以增加混合物的膨脹程度，增加親水性也可以增加膨脹。
這些薄膜的實驗結(jié)果如圖17A-E所示。簡而言之，圖17A表明紅豆杉醇從純EVA薄膜中的釋放量(mg)與時間。圖17B表明留在同一薄膜中的藥物百分?jǐn)?shù)。從這兩個圖中可看出，當(dāng)裝載紅豆杉醇的量增加時(即紅豆杉醇的重量百分?jǐn)?shù)增加)，藥物的釋放速率也增加，其表明了預(yù)計的濃度依賴性。當(dāng)裝載紅豆杉醇的量增加時，保留在薄膜中的紅豆杉醇百分?jǐn)?shù)也增加，這表明高裝載量更適用于長期釋放的制劑。
薄膜物理強度和彈性的評價如圖17E所示。簡而言之，圖17E表示純EVA和EVA-表面活性劑混合膜的應(yīng)力/張力曲線。這一應(yīng)力的粗測量表明，表明的彈性隨PluronicF127的加入而增加，抗拉強度(斷裂時的應(yīng)力)隨PluronicF127的加入而增加(濃度依賴性)。在設(shè)計薄膜時彈性和強度是重要的考慮因素，薄膜可設(shè)計為特殊的臨床應(yīng)用形式而不引起化合物的形變。
上述數(shù)據(jù)表明了一些表面活性劑添加劑控制藥物釋放速率的能力，以及改變賦形劑物理性質(zhì)的能力。
實施例14結(jié)合甲氧基聚乙二醇350(MEPEG)到聚(E-己內(nèi)酯)中以制備紅豆杉醇糊劑的控制釋放制劑用于本實驗的試劑和設(shè)備包括甲氧基聚乙二醇350(“MePEG”-UnionCarbide，Danbury，CT)。MePEG在室溫下呈液態(tài)，凝固點為10到-5℃。
A含有紅豆杉醇的MePEG/PCL糊劑的制備
MePEG/PCL糊劑的制備首先將定量的紅豆杉醇溶于MePEG，然后將其結(jié)合到熔化的PCL中。這一方法的優(yōu)點在于不需要DCM。
B熔點分析PCL/MePEG聚合物混合物的熔點通過差示掃描量熱法從30℃到70℃以每分鐘2.5℃的加熱速率來確定。實驗結(jié)果如圖18A和18B所示。簡而言之，圖18A中所示的聚合物混合物熔點(熱分析確定)以一種MePEG濃度依賴的方式而降低。MePEG濃度對聚合物混合物的熔點的作用如圖18A所示。這種低熔點也可平移到聚合物混合物由熔化到固化的增加時間中(如圖18B所示)。30∶70混合的MePEG∶PCL從液態(tài)熔化物到固化所需的時間比單獨的PCL從液態(tài)熔化物到固化所需的時間長兩倍多。
C脆性測定將MePEG結(jié)合到PCL中與單獨的PCL相比似乎可產(chǎn)生脆性低的固體。作為一種“粗”定量方法，將已稱重的針從相同的高度落入含有0％至30％MePEG的PCL聚合物混合物中，然后測量針穿入固體的距離。實驗結(jié)果圖如圖18C所示。實驗點是4次測量的平均值+/-1標(biāo)準(zhǔn)偏差(S.D.)。
D.紅豆杉醇釋放的測試將聚合物丸(含有0％，5％，10％或20％MePEG的PCL)在磷酸鹽緩沖鹽水中(PBS，pH7.4)保溫，隨時間測量聚合物重量的百分?jǐn)?shù)(％)變化。從圖18D中可看出，當(dāng)MePEG開始出現(xiàn)在混合物中時，重量損失的量即增加。這種重量的損失可能是由于MePEG從聚合物基質(zhì)釋放入保溫液。這表明紅豆杉醇易于從MePEG/PCL混合物中釋放，因為紅豆杉醇在結(jié)合到PCL前首先溶于MePEG中。
E不同量MePEG對紅豆杉醇釋放的影響制備在PCL中含有0.8％-20％MePEG的熱糊。其用1％的紅豆杉醇裝載。用HPLC監(jiān)測37℃在PBS緩沖液中紅豆杉醇從10mg丸的釋放。如圖18E所示，制劑中MePEG的量不影響釋放出的紅豆杉醇量。
F不同量紅豆杉醇對紅豆杉醇從20％MePEG/PCL混合物中釋放總量的影響制備在PCL中含有0.8％-20％MePEG的熱糊。紅豆杉醇的釋放量如上測量。如圖18F所示，紅豆杉醇的釋放量隨裝載紅豆杉醇量的增加而增加。但是當(dāng)繪制為總紅豆杉醇釋放量的百分?jǐn)?shù)時，順序則反過來(圖18G)。這表明在糊劑中仍殘留有紅豆杉醇(如果假設(shè)外推這些數(shù)據(jù)是有效的)，其也可延長一段時間，期間紅豆杉醇將從20％MePEG熱糊中釋放出。
G不同MePEG/PCL混合物的強度分析用CT-40機械強度檢測儀測量直徑為0.88cm、平均厚度為0.560cm的固態(tài)聚合物“片”的強度。聚合物片是濃度為0％，5％，10％或20％的MePEG在PCL中的混合物。
試驗結(jié)果如圖18H所示，其中抗拉強度和斷裂時間繪制為％MePEG在混合物中的功能。單一變量ANOVA表明每組中的片厚是相同的。從圖18H可看出，PCL中MePEG的加入降低了所得固體的硬度。
實施例15裝載紅豆杉醇的熱糊對體內(nèi)血管生長的作用將受精的家養(yǎng)雞胚在無殼培養(yǎng)前孵育4天(如實施例2所述)。將蛋內(nèi)容物從殼中倒入圓底無菌玻璃碗中，用陪替氏培養(yǎng)皿蓋好。
將如上所述(見實施例10)的5％、10％及20％(w/v)濃度的紅豆杉醇結(jié)合到熱糊中用于下述實驗。然后將干燥后切下的熱糊加熱至60℃，并且在兩層parafilm中擠壓成扁平狀，冷卻。6個胚胎接受20％的裝載紅豆杉醇熱糊，6個胚胎接受用此方法制備的無裝載熱糊。每組中都有一個胚胎死去，因此在每個對照組及處理組中留下5個胚胎。
將無裝載熱糊及含有20％紅豆杉醇的熱糊加熱至60℃，直接放在孵育6天的CAM生長邊緣；以此方式每次處理兩個胚胎。
采用不同方法所得到的結(jié)果中沒有明顯的不同，這表明糊劑在施用時的溫度對所得結(jié)果不是一個原因。
將含有10％紅豆杉醇的熱糊置于11個CAM上，無裝載熱糊置于另外11個CAM上，同時將裝載5％紅豆杉醇的熱糊置于10個CAM上，無裝載熱糊置于另外10個CAM上。暴露2天后(孵育的第8天)，在立體顯微鏡的協(xié)助下檢查脈管系統(tǒng)。將LiposynII(一種白色不透明溶液)注入CAM中以增加血管細節(jié)的可見度。
裝載20％紅豆杉醇的熱糊在所有接受此處理的5個CAM中顯示出廣泛的無血管區(qū)(見圖19B)。抑制作用的最高程度定義為6mm×6mm的無血管區(qū)域。用裝載20％紅豆杉醇熱糊處理的所有CAM都顯示出這一程度的血管生長抑制作用。
相比而言，對照組(無裝載)熱糊不抑制CAM的血管生長(見圖19A)；這一高倍影像(注意在影像的頂部可看到熱糊的邊緣)說明鄰接糊劑的血管不受熱糊的影響。其表明所觀察到的作用歸因于紅豆杉醇的持續(xù)釋放，而不是由于聚合物本身或者是糊劑對生長中的脈管系統(tǒng)的輔助壓力。
本項研究證實了熱糊能釋放出可以抑制CAM脈管系統(tǒng)正常生長的足量血管生長抑制劑(本實驗中為紅豆杉醇)。
實施例16裝載紅豆杉醇的熱糊對體內(nèi)腫瘤生長及腫瘤血管生長的作用將受精的家養(yǎng)雞胚在除去期蛋殼前孵育3天。通過除去位于空氣中的蛋殼而倒空蛋的內(nèi)容物，分離里面的蛋殼膜，將蛋殼的另一末端穿孔以使蛋內(nèi)容物緩慢滑出鈍端。將蛋內(nèi)容物倒入圓底無菌玻璃碗中，用陪替氏培養(yǎng)皿蓋上。于90％的相對濕度及3％CO2的條件下孵育(見實施例2)。
將MDAY-D2細胞(一種鼠淋巴瘤)注入鼠中使其長成重量為0.5-1.0g的腫瘤。處死鼠，用酒精擦拭腫瘤部位，切開，置于無菌組織培養(yǎng)基中，在層流通風(fēng)櫥中切成1mm見方的小塊。在將切好的腫瘤放到9天大的雞胚之前，用30規(guī)的針輕刮CAM表面以保證腫瘤的移植。然后將腫瘤置于孵育8天(脫殼后4天)的CAM上，使其在CAM上生長4天用以建立血管供給。用此方法制備4個胚胎，每個胚胎接種3個腫瘤。在這些胚胎中，一個腫瘤接受裝載20％紅豆杉醇的熱糊，一個接受無裝載的熱糊，另一個沒有任何處理。處理持續(xù)2天后，記錄結(jié)果。
移植的MDAY-D2腫瘤分泌血管生長因子，其誘導(dǎo)毛細管(來自CAM)向腫瘤塊內(nèi)的生長，并且使其的大小繼續(xù)長大。由于腫瘤所有的血管都來自CAM，同時所有的腫瘤細胞都來自移植物，因此可以獨立評價兩個過程中的治療效果。本試驗已用于確定裝載紅豆杉醇的熱糊在(a)抑制腫瘤血管化及(b)抑制腫瘤本身生長的效果。
本實驗中直接進行的體內(nèi)立體顯微鏡檢查及組織固定后的組織學(xué)檢查如下闡述。在用裝載20％紅豆杉醇的熱糊處理的腫瘤中，與對照組腫瘤相比，供給腫瘤的血管數(shù)量有所下降(見圖20C和20D)，腫瘤內(nèi)血管的數(shù)量也有所下降，同時腫瘤周圍的血管(該區(qū)域在實心瘤中具有最多的血管)數(shù)量有所下降。進行研究兩天中腫瘤開始減小其的大小及質(zhì)量。另外，觀察到許多內(nèi)皮細胞在細胞分裂中受到抑制，其表明內(nèi)皮細胞的增殖受到影響。也不斷發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞在有絲分裂中的抑制。所有4個胚胎都表明裝載紅豆杉醇的熱糊可以抑制腫瘤血管生長，而無裝載的熱糊沒有作用。
相比而言，在用無裝載熱糊處理的CAM中，腫瘤高度血管化，即與正常的周圍組織相比，在數(shù)量及密度上增加，同時與用裝載紅豆杉醇的糊劑處理的腫瘤相比，可觀察到明顯增多的血管。新形成的血管從各種角度進入腫瘤，就象輻條連接到輪子的中心(見圖20A和20B)。在研究過程中，對照組腫瘤繼續(xù)在大小和質(zhì)量上增加。從組織學(xué)而言，在質(zhì)量周圍觀察到許多膨脹的薄壁毛細管，并且在細胞分裂中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞。腫瘤組織在整個過程中高度血管化并且是活動的。
作為一個例子，在置于相同CAM上的兩個近似大小(最初移植時)的腫瘤中，得到下述數(shù)據(jù)。對于用裝載20％紅豆杉醇的熱糊處理的腫瘤而言，測得腫瘤為330mm×597mm；腫瘤最鄰近的四周有14條血管，腫瘤塊中只有3-4條小毛細管。對于用無裝載熱糊處理的腫瘤而言，腫瘤大小為623mm×678mm；腫瘤最鄰近的四周有54條血管，而腫瘤塊中有12-14條小毛細管。此外，與紅豆杉醇處理的腫瘤四周區(qū)域相比，CAM的四周含有更多的血管。
本項研究證實了熱糊能釋放出可以抑制伴有腫瘤生長及進展的病理性血管生長的足量血管生長抑制劑(本實驗中為紅豆杉醇)。在這種情況下，血管生長通過腫瘤細胞被最大程度地激化，該腫瘤細胞可以產(chǎn)生誘導(dǎo)毛細管從四周組織向腫瘤塊內(nèi)生長的血管生長因子。裝載紅豆杉醇的熱糊可以阻滯這一過程，并且限制了腫瘤組織維持足量血液供給的能力。其導(dǎo)致了通過藥物對腫瘤細胞的細胞毒作用以及通過剝奪組織生長和擴大的營養(yǎng)物質(zhì)而使腫瘤塊減小。
實施例17血管生長抑制物對鼠腫瘤模型體內(nèi)腫瘤生長的作用用鼠MDAY-D2腫瘤模型檢查化療用以及抗血管生長化合物(如紅豆杉醇)對腫瘤生長、腫瘤遷徙及動物存活率的局部慢釋放作用。MDAY-D2細胞系在含有5％小牛血清的αmem培養(yǎng)基的細胞懸浮液中生長。細胞在37℃于含有5％二氧化碳的潮濕氣中孵育，每隔3天用因子15稀釋直至得到足夠數(shù)目的細胞，孵育期后，用光學(xué)顯微鏡檢查細胞的生活性，然后在1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。將PBS加入到細胞中，得到每毫升1,000,000個細胞的稀釋液。
使新到的10周大的DBA/2j雌性鼠適應(yīng)環(huán)境3-4天。然后在每只鼠的后側(cè)肋腹皮下注射100,000MDAY-D2細胞的100mlPBS溶液。先前的研究已表明這一過程可在3-4天內(nèi)于注射部位產(chǎn)生可見的腫瘤，14天后腫瘤大小達1.0-1.7g；并且在注射后19到25天可在肝臟產(chǎn)生可見的遷移瘤?；诒狙芯康哪康?，可以在疾病進展中的任何時候進行治療性干預(yù)。
使用上述動物模型，將140,000相同的MDAY-D2細胞注射到20只鼠中，使腫瘤生長。在第5天將鼠分成5組。麻醉下手術(shù)切開腫瘤，用裝載藥物的熱糊或者對照組熱糊處理局部區(qū)域而不干擾現(xiàn)存的腫瘤組織，縫合傷口。5個組或者不接受任何處理(只是縫合了傷口)，或者只接受聚合物(PCL)，或者是裝載10％的熱糊，亦或是植入到腫瘤附近的裝載20％紅豆杉醇的熱糊(只注射4只)。在第16天處死鼠，切開腫瘤并檢查(總體及組織學(xué))腫瘤的生長、遷徙、由于該處理所導(dǎo)致的局部及全身毒性、傷口的愈合作用、腫瘤血管化作用以及殘留在切開處的糊劑的狀況。
每只動物中腫瘤的重量如下表所示
表IV腫瘤重量(gm)
裝載20％紅豆杉醇的熱糊與對照組動物(平均重量為0.618)相比降低了腫瘤生長的85％(平均重量為0.105)。單獨用熱糊或者含有10％紅豆杉醇的熱糊處理的動物對腫瘤生長只有中度的作用；腫瘤的重量分別僅減少了10％和35％(圖21A)。因此，含有20％紅豆杉醇的熱糊比含有10％紅豆杉醇的熱糊在減少腫瘤生長中更有效(見圖21C及圖21B)。
在一些動物的用藥部位檢測到了熱糊。15至鼠中有8只檢測到了重量在0.026g至0.078g不等的聚合物。實驗組中每只含有裝載20％紅豆杉醇熱糊的動物都含有殘留的聚合物，表明其不易于溶解。在組織學(xué)上，用裝載紅豆杉醇熱糊處理的腫瘤比對照組腫瘤含有更少的細胞構(gòu)成及更多的組織壞死。脈管系統(tǒng)減少并且不斷觀察到細胞分裂中內(nèi)皮細胞的抑制。裝載紅豆杉醇的熱糊沒有表現(xiàn)出影響腫瘤四周皮膚或組織的完整性或細胞構(gòu)成。總體上看，傷口的愈合未受到影響。
實施例18裝載血管生長抑制物的手術(shù)用薄膜在癌切除手術(shù)中用于防止腫瘤細胞的醫(yī)源性遷移作為一種無菌、柔韌、可伸展的藥物-聚合物化合物，其可用于癌切除過程。在切除手術(shù)中通常希望將正常的周圍組織與惡性組織隔離以防止疾病向鄰近器官的醫(yī)源性擴展(通過癌細胞的不經(jīng)意污染)。裝載藥物的parafilm可以在腫瘤控制前伸展到正常組織。如果在腸癌切除術(shù)中將其置于肝臟及其它腹部內(nèi)臟周圍會特別有用，因為其可防止疾病經(jīng)腹膜擴散到肝臟。將生物可降解性薄膜置于該部位可以提供持續(xù)的防護。
切口處也是一種常見的術(shù)后惡性腫瘤復(fù)發(fā)部位。認為其是由于手術(shù)過程中腫瘤細胞對傷口的污染。為闡明這些問題，進行實驗來確定裝載血管生長抑制物薄膜阻止這一現(xiàn)象發(fā)生的能力。
A材料和方法手術(shù)用薄膜的制備。如實施例10制備手術(shù)用薄膜。制備測得約1cm×1cm的薄膜，其含有單獨的聚合物(PCL)或用5％紅豆杉醇裝載的PCL。
大鼠肝腫瘤模型。在初始研究中，將體重約為300g的Wistar大鼠進行全身麻醉，沿腹中線切開一個3-5cm的切口。在最大的肝葉的肝實質(zhì)中切開一個1cm的切口，切下肝臟邊緣部分。將懸浮在100ml磷酸鹽緩沖鹽水中的一百萬活的9L神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤(在使用前立即從組織培養(yǎng)物中洗脫)用一個30規(guī)針沉積在切下的肝臟邊緣。然后在含有腫瘤細胞的切下的肝臟邊緣施行手術(shù)，用明膠海綿固定。兩只動物接受含有5％紅豆杉醇PCL薄膜，另外兩只動物接受僅含有PVL的薄膜。用3.0Dexon及皮膚鉗閉合腹壁。用全身麻醉終止，使動物恢復(fù)。10天后，處死動物，組織學(xué)檢查肝臟。
B結(jié)果在用單獨聚合物處理的2個肝臟中觀察到了局部腫瘤的生長。用聚合物加紅豆杉醇處理的2個肝臟當(dāng)進行組織學(xué)檢查時完全沒有腫瘤。同樣重要的是，肝囊已退化并且完全生長在聚合物薄膜及肝臟的切口表面上，這表明其對傷口的愈合沒有明顯的作用。在任何手術(shù)薄膜(裝載藥物的及不含藥物的)周圍都沒有發(fā)現(xiàn)局部肝毒性。
C討論本項研究表明，手術(shù)中置于正常組織及切口部位的手術(shù)用薄膜可以降低惡性腫瘤切除術(shù)中腫瘤細胞意外移植入正常周圍組織的發(fā)生率。這有助于降低術(shù)后疾病局部復(fù)發(fā)的重要問題。
實施例19在治療關(guān)節(jié)炎時向關(guān)節(jié)內(nèi)注射裝載血管生長抑制物的生物可降解性的微球關(guān)節(jié)在關(guān)節(jié)炎中的損傷是由于炎癥(包括白細胞及白細胞產(chǎn)物)和關(guān)節(jié)翳組織的進展(一種由新生血管組織、結(jié)締組織和炎性細胞組成的組織)。已選擇紅豆杉醇用于初始研究，因為其是一種新生血管形成的強烈抑制劑。就此而言，紅豆杉醇的局部高濃度將是一種關(guān)節(jié)炎中的病癥減緩劑。
為了確定是否微球?qū)﹃P(guān)節(jié)具有有害作用，進行下述實驗。簡而言之，如前述實施例8制備普通的PCL和裝載紅豆杉醇的微球。
將3只兔子關(guān)節(jié)內(nèi)注射總量為0.2ml的0.5-5.0um，10-30um或30-80um的微球(含有0.5mg微球)。每日觀察(臨床)評價關(guān)節(jié)。兩周后，處死動物，組織學(xué)檢查關(guān)節(jié)的發(fā)炎跡象及蛋白多糖的虧空。
使用兔子炎性關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎模型來評價微球在減輕滑膜炎及軟骨降解中的作用。退化性關(guān)節(jié)炎是由于十字性韌帶及膝關(guān)節(jié)半月板的部分裂縫引起的。4到6周后，兔子發(fā)生了與在人骨關(guān)節(jié)中觀察到的類似的軟骨浸蝕。炎性關(guān)節(jié)炎是通過弗氏完全佐劑中用小牛血清白蛋白(BSA)進行免疫而引起的。3周后，將含有高滴度抗-BSA抗體的兔子進行關(guān)節(jié)內(nèi)注射BSA(5mg)。7天后，發(fā)生明顯的關(guān)節(jié)腫脹及滑膜炎，7-14天可觀察到蛋白多糖的虧空，4-6周可觀察到軟骨浸蝕。
如上所述誘導(dǎo)炎性關(guān)節(jié)炎。4天后，用含有5％紅豆杉醇或賦形劑的微球注射關(guān)節(jié)。在14天時處死一組動物，第28天時處死另一組。進行組織學(xué)檢查關(guān)節(jié)的炎癥及軟骨降解。該實驗被設(shè)計為確定紅豆杉醇微球是否能影響關(guān)節(jié)的發(fā)炎及軟骨基質(zhì)的降解。
在骨關(guān)節(jié)炎模型中進一步檢查含血管生長抑制劑的微球。簡而言之，如上所述誘導(dǎo)兔子的降解性關(guān)節(jié)炎，第4天時，關(guān)節(jié)內(nèi)注射微球(含有5％紅豆杉醇或只有賦形劑)。在21天及42天時處死動物，進行組織學(xué)檢查軟骨降解的跡象。
進行研究以評價作為軟骨保護劑的經(jīng)關(guān)節(jié)內(nèi)微球釋放的血管生長抑制劑。
結(jié)果將不同粒度的無裝載PCL微球(0.5-5.0um，10-30um或30-80um)關(guān)節(jié)內(nèi)注射到兔子的膝關(guān)節(jié)中。實驗結(jié)果如圖22A至D所示。簡而言之，圖22A是注射PBS的關(guān)節(jié)滑膜圖。圖22B是注射微球的關(guān)節(jié)圖。圖22C是注射PBS的關(guān)節(jié)軟骨圖。圖22D是注射微球的關(guān)節(jié)軟骨圖。
從這些圖中可看出，在組織學(xué)上，注射微球的關(guān)節(jié)與沒有注射其的關(guān)節(jié)無差異。在臨床上，在進行實驗的14天中，沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)發(fā)炎的跡象?？傮w上，與未處理的正常關(guān)節(jié)相比，在注射微球的關(guān)節(jié)中沒有關(guān)節(jié)發(fā)炎或軟骨損傷的跡象。
結(jié)論微球可以關(guān)節(jié)內(nèi)注射而不在關(guān)節(jié)表面引起任何可見的改變。這表明該方法是一種將靶向的、持續(xù)釋放的病癥減緩劑轉(zhuǎn)運到患病關(guān)節(jié)的有效的有效方式，同時使與這種生物活性化合物全身給藥有關(guān)的毒性降為最低。
如上所述，可以將微球制成具有給定藥物釋放動力學(xué)的特殊粒度。同時也證實了紅豆杉醇是一種強烈的血管生長抑制劑，其以足以阻滯CAM試驗中新生血管形成的量從微球中釋放出。因此，關(guān)節(jié)內(nèi)給予裝載血管生長抑制劑(如裝載紅豆杉醇)的微球可以阻滯出現(xiàn)在諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病中的新生血管形成及其導(dǎo)致的關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨的毀壞。就此而言，裝載藥物的微球可以作為一種“軟骨保護”劑而防止軟骨的不可逆損壞(由于侵入的新生血管關(guān)節(jié)翳組織)。
由上可得，盡管本文為了闡明已描述了特殊的實例，在不偏離本發(fā)明的宗旨及范圍下可以進行各種修飾。因此，本發(fā)明除了權(quán)利要求書以外并無限定。
序列表(1)總的信息(i)申請人Hunter，William L.
Machan，Lindsay S.
Arsenault，A.LarryBurt，Helen M.
(ii)發(fā)明題目抗血管生長組合物及使用方法(iii)序列數(shù)1(iv)有關(guān)地址(A)收信人SEED and BERRY(B)街道701 Fifth Avenue，6300 Columbia Center(C)城市Seattle(D)州Washington(E)國家USA(F)ZIP98104(v)計算機類型(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機
(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release#1.0，Version#1.25(vi)目前的申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請目(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名McMasters，David D(B)登記號33，963(C)對照/存檔號110129，401(ix)通訊信息(A)電話(206)622-4900(B)傳真(206)682-6031(C)電傳3723836(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)股單股(D)拓撲線性(ii)分子類型肽(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO1Cys Asp Pro Gly Tyr Ile Gly Ser Arg1 權(quán)利要求
1.組合物，其包含(a)破壞微管功能的化合物；以及(b)聚合物，條件是所述的聚合物不是膠囊或聚酐。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的組合物形成具有平均粒徑為0.5-200μm的微球。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的組合物形成厚度為100μm-2mm的薄膜。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的聚合物為乳酸和羥基乙酸的共聚物。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的聚合物為聚己內(nèi)酯。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的聚合物為聚乳酸。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的聚合物為聚乳酸和聚己內(nèi)酯的共聚物。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的破壞微管功能的化合物為紅豆杉醇或其同類物或衍生物。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的破壞微管功能的化合物選自雌莫司汀、秋水仙堿、curacin-A、epothilone、長春堿和t-BCEU。
10.權(quán)利要求8的組合物，其中所述的紅豆杉醇或其同類物或衍生物為紅豆杉醇。
11.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的聚合物為聚(烷基碳酸酯)、聚(原酸酯)或聚乙交酯。
12.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的聚合物為粘膜粘著聚合物。
13.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的聚合物為水凝膠。
14.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的聚合物為甲基纖維素。
15.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的聚合物為聚對苯二甲酸乙二酯。
16.權(quán)利要求1-15任一項的組合物，其中所述的組合物是無菌的。
17.權(quán)利要求8-10任一項的組合物，其中所述的聚合物是生物可降解的。
18.權(quán)利要求8-10任一項的組合物，其中所述的聚合物是白蛋白。
19.權(quán)利要求8-10任一項的組合物，其中所述的聚合物是非生物可降解的。
20.組合物，包含紅豆杉醇或其同類物或衍生物以及一種聚合物，其中所述的組合物是無菌的，條件是所述聚合物不為聚酐。
21.權(quán)利要求20的組合物，其中所述的組合物形成平均粒徑為0.5-200μm的微球。
22.權(quán)利要求20的組合物，其中所述的組合物形成厚度為100μm-2mm的薄膜。
23.權(quán)利要求20的組合物，其中所述的聚合物為乳酸和羥基乙酸的共聚物。
24.權(quán)利要求20的組合物，其中所述的聚合物為聚己內(nèi)酯。
25.權(quán)利要求20的組合物，其中所述的聚合物為聚乳酸。
26.權(quán)利要求20的組合物，其中所述的聚合物為聚乳酸和聚己內(nèi)酯的共聚物。
27.權(quán)利要求20的組合物，其中所述的聚合物是生物可降解的。
28.權(quán)利要求20的組合物，其中所述的聚合物是白蛋白。
29.權(quán)利要求20的組合物，其中所述的聚合物為聚(烷基碳酸酯)、聚(原酸酯)或聚乙交酯。
30.權(quán)利要求20的組合物，其中所述的聚合物為粘膜粘著聚合物。
31.權(quán)利要求20的組合物，其中所述的聚合物為水凝膠。
32.權(quán)利要求20的組合物，其中所述的聚合物為甲基纖維素。
33.權(quán)利要求20的組合物，其中所述的聚合物為聚對苯二甲酸乙二酯。
34.權(quán)利要求20的組合物，其中所述的紅豆杉醇或其同類物或衍生物為紅豆杉醇。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有抗血管生長因子及聚合物載體的組合物?？寡苌L因子的代表性例子包括抗侵襲性因子、視黃酸及其衍生物以及紅豆杉醇。同時也提供了用于栓塞血管、消除膽管、尿道、食管及氣管/支氣管阻塞的方法。
文檔編號A61F2/06GK1502331SQ20031011988
公開日2004年6月9日 申請日期1994年7月19日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月19日
發(fā)明者W·L·亨特, W L 亨特, L·S·馬單, 馬單, A·L·阿森奧特, 阿森奧特, J·K·約翰, 約翰 申請人:血管技術(shù)藥物公司, 不列顛哥倫比亞大學(xué)