專利名稱：阿爾茨海默氏疾病分泌酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到阿爾茨海默氏疾病，APP，淀粉樣蛋白β肽及人天冬酰氨蛋白酶等領域，同時也涉及到調控這些多肽活性的生物因子的鑒別方法。
背景技術：
由于淀粉樣蛋白蝕斑的形成，神經(jīng)原纖維纏結，神經(jīng)膠質過多及二乙基溴乙酰胺降低等情況的發(fā)生，阿爾茨海默氏疾病(AD)可致進行性早老性癡呆。該疾病既可遺傳發(fā)生，也可隨機形成，其臨床特征及病理學特點都非常相似。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有三個基因的突變將致常染色體上阿爾茨海默氏疾病顯性結構的形成。其編碼淀粉樣蛋白蛋白前體(APP)及兩個相關的蛋白，早老蛋白-1(presenilin-1)(PS1)及早老蛋白-2(PS2)，其正如其名字所示那樣在結構及功能上都非常相關。三個基因任一發(fā)生突變都可通過細胞內(nèi)途徑加速APP蛋白酶水解進程，其產(chǎn)生淀粉樣蛋白β肽或者Aβ肽(有時候也寫為A beta)，即一種為AD中淀粉樣蛋白蝕斑最基本組分的40-42氨基酸長的多肽。蛋白水解酶處理的胞內(nèi)途徑的調節(jié)異常可能是AD病理生理學的主要特征。在蝕斑形成的情形下，APP PS1或者PS2的突變持續(xù)加速APP的蛋白水解進程從而加快Aβ1-42的形成，Aβ1-42是Aβ肽的一種形式，具有獨特的淀粉樣遺傳特性，因而在AD中非常重要。APP的不同形態(tài)大小不一，從695到770個氨基酸殘基，位于細胞表面上，并具有單一的C端橫跨膜區(qū)域。Aβ肽源于APP的一個區(qū)域，其臨近并含有橫跨膜區(qū)域的一部分。正常情況下，APP在α-分泌酶位點的處理過程將靠近膜的Aβ序列的中間區(qū)域分開，并釋放出來自于細胞表面的APP的可溶的細胞外區(qū)域。這些α-分泌酶的APP處理過程，產(chǎn)生了可溶性的APP-α，其為正常現(xiàn)象，并未被認為導致AD的發(fā)生。
APP在β-及γ-分泌酶位點上的病理學處理過程產(chǎn)生了與其在α-分泌酶位點上處理的不同的結果。在β-及γ-分泌酶位點上的連續(xù)處理釋放出一種可能在AD發(fā)病機理上非常重要的Aβ肽，細胞表面上的APP再內(nèi)在化(在所有的細胞中)后，β-及γ-分泌酶位點上的處理可能同時發(fā)生在內(nèi)質網(wǎng)(在神經(jīng)元中)及紅細胞漿質/溶酶體途徑中。盡管經(jīng)過艱苦的努力，10年或者更長的時間，來鑒別負責在β-及γ-分泌酶位點上的處理APP以產(chǎn)生Aβ肽的酶，直到本發(fā)明前依然未知。這里，我們首次報道了β一分泌酶的鑒別及并對其特征進行了描述。我們也揭示了一些已知的及一些新的人類天冬氨酸蛋白酶，其可以如β一分泌酶一樣產(chǎn)生作用，且首次解釋了這些蛋白酶在AD中所發(fā)揮的作用。我們也描述了這些蛋白酶中有著獨特功能的區(qū)域，并且首次對其作用底物的特征進行了描述。這是該種類型活性蛋白表達分離純化的首次描述，也是該蛋白的使用，及有用細胞系及抑制劑的鑒別及生產(chǎn)的首次描述。
發(fā)明概述本發(fā)明公開了asp2基因及多肽的大量突變體。
編碼可以在APP的β一分泌酶切割位點進行切割的蛋白酶的任一分離或純化的多核苷酸中含有兩個或多個特殊核苷酸序列，這些特殊的核苷酸為編碼100-300個氨基酸位置的核苷酸所分開。在這些位點上的氨基酸可以是任何一種氨基酸，第一組特殊的核酸含有可以編碼多肽DTG的核酸，這兒第一組特殊的核酸的第一種核酸是第一種特殊的核酸，第二組特殊的核酸編碼多肽DSG或者DTG，第二組核酸的最后一種核酸是最后一種特殊的核酸，在附件中并未包括揭示于SEQ ID NO.1及SEQ.ID NO.5的核苷酸。權利要求1所述的核酸多聚核苷酸其中兩組核酸為編碼大約125-222氨基酸位點的核酸所分開，這些氨基酸可以為任何一種氨基酸。權利要求2所述的核酸多聚核苷酸其編碼大約150-172氨基酸位點，這些氨基酸可以為任何一種氨基酸。權利要求3中所述的編碼172氨基酸位點的核酸多聚核苷酸，這些氨基酸可以為任何一種氨基酸。權利要求4所述的核酸多聚核苷酸其中的核苷如SEQ.ID.NO.3所示。權利要求5所述的核酸多聚核苷酸其中兩組核酸為編碼大約150-196氨基酸位點的核酸所分開。權利要求6所述的核酸多聚核苷酸其中兩組核苷為編碼大約196氨基酸(位點)的核酸所分開。權利要求7所述的核酸多聚核苷酸其中兩組核酸被與分開如SEQ.ID.NO.5所示的同一套特殊核酸的同一核酸序列所分開。權利要求4所述的核酸多聚核苷酸其中兩組核酸為編碼大約150-190氨基酸(位點)的核酸所分開。權利要求9所述的核酸多聚核苷酸其中兩組核酸為編碼大約190氨基酸(位點)的核酸所分開。權利要求10所述的核酸多聚核苷酸其中兩組核酸為分開如SEQ.ID.NO.1所示特殊核酸的相同的核酸所分開。權利要求1-11中第一組特殊氨基酸的第一種核酸，是第一種特殊的核酸，其被可操作性地連接到任一密碼子上，其中該密碼子的核酸編碼任一含有1-10,000氨基酸(位點)的多肽。權利要求1-12中所述的核酸多聚核苷酸其中第一組特殊的核酸可操作性地連接到核酸聚合體上，該聚合體編碼選自下述的任一多肽任一報道蛋白或利于純化的蛋白。權利要求1-13中所述的核酸多聚核苷酸其中第一種特殊的核酸可操作性地連接到核酸聚合體上其編碼任一多肽選自于含有下列組分的組免疫球蛋白的重鏈，麥芽糖結合蛋白，谷胱甘肽S轉染，綠色熒光蛋白，及泛素。權利要求1-14中第二組特殊氨基酸的最后一種核酸，即最后一個特異性核酸可操作性地連接到核酸聚合體上，其編碼任一含有從1到10,000個氨基酸的多肽。權利要求1-15其中最后一種特殊的核酸可操作性地連接到任一密碼子上，該密碼子被連到核酸聚合體上，其編碼選自下述的任一多肽報道蛋白任一報道蛋白或利于純化的蛋白。權利要求1-16中所述的核酸多聚核苷酸其中第一種特殊的核酸可操作性地連接到核酸聚合體上其編碼任一多肽選自于含有下列組分的組免疫球蛋白的重鏈，麥芽糖結合蛋白，谷胱甘肽S轉染，綠色熒光蛋白，及泛素。
任一分離或純化的核酸多聚核苷酸其編碼一種能夠裂解APPβ-分泌酶切割位點的蛋白酶，其含有兩個或更多的特殊核酸，其中所述的特殊核酸可以為編碼大約100～300個氨基酸(位點)的核酸所分開，其中這些位點上的氨基酸可以為任何一種氨基酸，這兒第一組特殊的核酸含有可以編碼多肽DTG的核酸，這兒第一組特殊的核酸的第一種核酸是第一種特殊的核酸，第二組特殊的核酸編碼多肽DSG或者DTG，第二組特殊核酸的最后一種核酸是最后一種特殊的核酸，這里第一種特殊的核酸可操作性地連接到編碼從0到81個任一數(shù)量的氨基酸的核酸上，這里每一種密碼子可以編碼任一氨基酸。在權利要求18中所述的核酸多聚核苷酸其中第一種特殊的核酸可操作性地連接到編碼從64到77個任一數(shù)量的氨基酸的核酸上，這里每一種密碼子可以編碼任一氨基酸。在權利要求19中所述的核酸多聚核苷酸其中第一種特殊的核酸可操作性地連接到編碼71個氨基酸的核酸上。在權利要求20中所述的核酸多聚核苷酸其中第一種特殊的核酸可操作性地連接到71個氨基酸上，這71個氨基酸的第一種是氨基酸T。在權利要求21中所述的核酸多聚核苷酸中，多聚核苷酸含有一種序列，其至少有95％與序列SEQ.ID.(實施例11)相似。在權利要求22中所述的核酸多聚核苷酸中，其有一種完整的含有序列SEQ.ID.(實施例11)的多聚核苷酸。在權利要求18中所述的核酸多聚核苷酸其中第一種特殊的核酸可操作性地連接到編碼從40到54個任一數(shù)量的氨基酸的核酸上，這里每一種密碼子可以編碼任一氨基酸。在權利要求24中所述的核酸多聚核苷酸其中第一種特殊的核酸可操作性地連接到編碼47個氨基酸的核酸上。在權利要求20中所述的核酸多聚核苷酸其中第一種特殊的核酸可操作性地連接到47個氨基酸上，這47個氨基酸的第一種是氨基酸E。在權利要求21中所述的核酸多聚核苷酸中，多聚核苷酸含有一種序列，其至少有95％與序列SEQ.ID.(實施例10)相似。在權利要求22中所述的核酸多聚核苷酸中，其有一種完整的含有序列SEQ.ID.(實施例10)的多聚核苷酸。
任一分離或純化的核酸多聚核苷酸其編碼一種能夠裂解APPβ-分泌酶切割位點的蛋白酶，其含有兩個或更多的特殊核酸，其中特殊核酸可以為編碼大約100～300個氨基酸(位點)的核酸所分開，其中在這些位點上的氨基酸可以為任何一種氨基酸，這兒第一組特殊的核酸含有可以編碼多肽DTG的核酸，這兒第一組特殊的核酸的第一種核酸是第一種特殊的核酸，第二組特殊的核酸編碼多肽DSG或者DTG，第二組特殊核酸的最后一種核酸，即最后一種特殊的核酸，可操作性地連接到編碼從50-170任一數(shù)量的密碼子的核酸上。在權利要求29中所述的核酸多聚核苷酸其中最后一種特殊的核酸可操作性地連接到含有從100到170個密碼子的核酸上。在權利要求30中所述的核酸多聚核苷酸其中最后一種特殊的核酸可操作性地連接到含有從142到163個密碼子的核酸上。在權利要求31中所述的核酸多聚核苷酸其中最后一種特殊的核酸可操作性地連接到含有大約142個密碼子的核酸上。在權利要求32中所述的核酸多聚核苷酸其中多聚核苷酸含有與SEQ.ID(實施例9或10)具有至少95％相似性的一段序列。在權利要求33中所述的核酸多聚核苷酸其中完整的多聚核苷酸含有序列SEQ.ID(實施例9或10)。在權利要求31中所述的核酸多聚核苷酸其中最后一種特殊的核酸可操作性地連接到含有大約163個密碼子的核酸上。在權利要求35中所述的核酸多聚核苷酸其中多聚核苷酸含有一種序列其與SEQ.ID(實施例9或10)有至少95％的相似性。在權利要求36中所述的核酸多聚核苷酸其中完整的多聚核苷酸含有序列SEQ.ID(實施例9或10)。在權利要求31中所述的核酸多聚核苷酸其中最后一種特殊的核酸可操作性地連接到含有大約170個密碼子的核酸上。權利要求1-38中編碼多肽DSG的第二組特殊的核酸，并且任選地第一組核酸多聚核苷酸可操作性地連接到一種多肽純化標記上。權利要求1-39中核酸多聚核苷酸可操作性地連接到一種六組氨酸的多肽純化標記上。權利要求1-40中第一組特殊的核酸在一種多聚核苷酸上，第二組特殊的核酸在另一種多聚核苷酸上，其中第一種及第二個多聚核苷酸都至少有50個密碼子。權利要求1-40中第一組特殊的核酸在一種多聚核苷酸上，第二組特殊的核酸在另一種多聚核苷酸上，其中第一種及第二個多聚核苷酸都至少有50個密碼子，而在這里所述的多聚核苷酸都在同一種溶液中。一種載體其含有一種如權利要求1-42所述的多聚核苷酸。一種細胞或一種細胞系其含有一種如權利要求1-42所述的多聚核苷酸。
任一分離或純化的多肽或蛋白質，其中含有一氨基酸多聚體，該多聚體是一種能夠切割APP中β-分泌酶切割位點的蛋白酶，其中含有兩組或多組特殊氨基酸，其中所述的特殊核氨基酸可以為大約100～300個氨基酸(位點)所分開，所述位點上的氨基酸可以為任何一種氨基酸，這兒第一組特殊的氨基酸含有多肽DTG，這兒第一組特殊的氨基酸的第一種氨基酸是第一種特殊的氨基酸，第二組特殊的氨基酸選自含有DSG或者DTG的多肽，第二組特殊氨基酸的最后一種氨基酸，即最后一種特殊的氨基酸，但SEQ ID NO.2及SEQ.ID NO.6所示的蛋白酶不包括在其中。權利要求45所述的氨基酸多肽其中兩組氨基酸為大約125到222個氨基酸位點所分開，這里的每一個位點可以是任何一種氨基酸。權利要求46所述的氨基酸多肽其中兩組氨基酸為大約150到172個氨基酸位點所分開。權利要求47所述的氨基酸多肽其中兩組氨基酸為大約172個氨基酸位點所分開。權利要求48所述的氨基酸多肽其中的蛋白酶如SEQ.ID.NO.4所示的那樣。權利要求46所述的氨基酸多肽其中兩組氨基酸為大約150到196個氨基酸位點所分開。權利要求50所述的氨基酸多肽其中兩組氨基酸為大約196個氨基酸位點所分開。權利要求51所述的氨基酸多肽其中兩組氨基酸為分開SEQ.ID.NO.6所示的同組特殊氨基酸的相同的氨基酸序列所分開。權利要求46所述的氨基酸多肽其中兩組氨基酸為大約150到190個氨基酸位點所分開。權利要求53所述的氨基酸多肽其中兩組氨基酸為大約190個氨基酸位點所分開。權利要求54所述的氨基酸多肽其中兩組核苷為分開SEQ.ID.NO.2所示的同組特殊氨基酸的相同的氨基酸序列所分開。權利要求45-55其中第一組特殊的氨基酸的第一種氨基酸是第一種特殊的氨基酸，其可操作性地連接到從1到10,000個氨基酸的任一多肽上。權利要求45-56所述的氨基酸多肽其中第一種特殊的氨基酸可操作性地連接到任一選自含有任一一種報道蛋白或利于純化的蛋白的組的任一多肽上。權利要求45-57所述的氨基酸多肽其中第一種特殊的氨基酸可操作性地連接到任一選自含有免疫球蛋白的重鏈，麥芽糖結合蛋白，谷胱甘肽S轉染，綠色熒光蛋白，及泛素的組的任一多肽上。在權利要求45-58中，其中第二組特殊氨基酸的最后一種氨基酸，也即最后一種特殊的氨基酸，可操作性地連接到從1到10,000個氨基酸的任一多肽上。權利要求45-59所述的氨基酸多肽其中最后一種特殊的氨基酸可操作性地連接到任一選自含有任何一種報道蛋白或利于純化的蛋白的組的任一多肽上。權利要求45-60所述的氨基酸多肽其中第一種特殊的氨基酸可操作性地連接到任一選自含有免疫球蛋白的重鏈，麥芽糖結合蛋白，谷胱甘肽S轉染，綠色熒光蛋白，及泛素的組的任一多肽上。
任一分離或純化的多肽或一種含有編碼能夠裂解APPβ-分泌酶切割位點的蛋白酶的氨基酸多肽的蛋白，其含有兩組或更多的特殊氨基酸，其中特殊氨基酸可以為大約100～300個氨基酸(位點)所分開，其中在這些位點上的氨基酸可以為任何一種氨基酸，這兒第一組特殊的氨基酸含有氨基酸DTG，這兒第一組特殊的氨基酸的第一種氨基酸是第一種特殊的氨基酸D，第二組氨基酸為DSG或者DTG，第二組特殊氨基酸的最后一種氨基酸，即最后一種特殊的氨基酸G，這里第一種特殊的氨基酸可操作性地連接到編碼從0到81個任一數(shù)量的氨基酸位點的氨基酸上，這里的每一個位點可以是任一氨基酸。權利要求62所述的氨基酸多肽，其中第一種特殊的氨基酸可操作性地連接到來自大約64到77個氨基酸位點的一種多肽上，這里的每一個位點可以是任一氨基酸。權利要求63所述的氨基酸多肽，其中第一種特殊的氨基酸可操作性地連接到來自大約77個氨基酸位點的一種多肽上。權利要求64所述的氨基酸多肽，其中第一種特殊的氨基酸可操作性地連接到71個氨基酸位點上，而且這71個氨基酸的第一種為氨基酸T。權利要求65所述的氨基酸多肽，其中的多肽含有一種序列，其與SEQ.ID.(實施例11)具有至少95％的相似性。權利要求66所述的氨基酸多肽，其中的完整多肽含有序列SEQ.ID.(實施例11)。權利要求62所述的氨基酸多肽，其中第一種特殊的氨基酸可操作性地連接到來自大約40到54個氨基酸位點的任何一種多肽上，這里的每一個位點可以是任一氨基酸。權利要求68所述的氨基酸多肽，其中第一種特殊的的氨基酸可操作性地連接到編碼47個氨基酸的多肽的氨基酸上。權利要求69所述的氨基酸多肽，其中第一種特殊的的氨基酸可操作性地連接到一種47個氨基酸的多肽上，其中這47個氨基酸的第一種是氨基酸E。權利要求70所述的氨基酸多肽，其中的多肽含有一種序列其與SEQ.ID.(實施例10)有至少95％的相似性。該氨基酸多肽其中的多肽含有實施例10)。
任一分離或純化的多肽其是一種能夠裂解APPβ-分泌酶切割位點的蛋白酶，其含有兩組或更多的特殊氨基酸，其中特殊氨基酸可以為大約100～300個氨基酸(位點)所分開，其中在這些位點上的氨基酸可以為任何一種氨基酸，這兒第一組特殊的氨基酸含有編碼DTG的氨基酸，這兒第一組特殊的氨基酸的第一種氨基酸是第一種特殊的氨基酸D，第二組氨基酸為DSG或者DTG，第二組特殊氨基酸的最后一種氨基酸，即最后一種特殊的氨基酸G，其可操作性地連接到從50到170的任一數(shù)目的氨基酸上，該氨基酸可以是任意一種氨基酸。權利要求73所述的氨基酸多肽其中最后一種特殊的氨基酸可操作性地連接到一種大約100～170個氨基酸的多肽上。權利要求74所述的氨基酸多肽其中最后一種特殊的氨基酸可操作性地連接到一種大約142～163個氨基酸的多肽上。權利要求75所述的氨基酸多肽其中最后一種特殊的氨基酸可操作性地連接到一種大約142個氨基酸的多肽上。權利要求76所述的氨基酸多肽，其中的多肽含有一種序列其與SEQ.ID.(實施例9或10)有至少95％的相似性。權利要求75所述的氨基酸多肽其中最后一種特殊的氨基酸可操作性地連接到一種大約163個氨基酸的多肽上。權利要求79所述的氨基酸多肽，其中的多肽含有一種序列其與SEQ.ID.(實施例9或10)有至少95％的相似性。權利要求79所述的氨基酸多肽，其中的完整的多肽含有一種序列SEQ.ID.(實施例9或10)。權利要求74所述的氨基酸多肽其中最后一種特殊的氨基酸可操作性地連接到一種大約170個氨基酸的多肽上。權利要求46-81其中第二組特殊的氨基酸由具有氨基酸序列DSG的多肽組成。權利要求45-82其中的氨基酸多肽可操作性地連接到一種多肽純化標記上。權利要求45-83其中的氨基酸多肽可操作性地連接到一種為六個組氨酸的多肽純化標記上。權利要求45-84其中第一組特殊的氨基酸在一種多肽上，而第二組特殊的氨基酸在另一種多肽上，而第一種及第二個多肽都至少有50個氨基酸，所述氨基酸可以是任意一種氨基酸。權利要求45-84其中第一組特殊的氨基酸在一種多肽上，而第二組特殊的氨基酸在另一種多肽上，而第一種及第二個多肽都至少有50個氨基酸，且所述多肽在同一溶液中。一種載體其含有一種如權利要求45-86所述的多聚核苷酸。一種細胞或一種細胞系其含有一種如權利要求45-87所述的多聚核苷酸。制備權利要求1-44所述的任一多聚核苷酸，載體，或細胞系的方法。制造權利要求45-88所述的任一多聚核苷酸，載體，或細胞系的方法。利用權利要求89和90中所述方法制備而成的如權利要求1-88中所述的任一種多聚核苷酸、多肽、載體、細胞或細胞系。
任一分離或純化的多肽或蛋白質，其中含有一氨基酸多肽，該氨基酸多肽編碼一種能夠裂解APPβ-分泌酶切割位點的蛋白酶，所述蛋白酶中含有兩組或更多的特殊氨基酸，其中特殊氨基酸可以為大約100～300個氨基酸(位點)所分開，其中在這些位點上的氨基酸可以為任何一種氨基酸，這兒第一組特殊的氨基酸含有氨基酸DTG，這兒第一組特殊的氨基酸的第一種氨基酸是第一種特殊的氨基酸D，第二組氨基酸為DSG或者DTG，第二組特殊氨基酸的最后一種氨基酸，即最后一種特殊的氨基酸G，這里第一種特殊的氨基酸可操作性地連接到0-81個氨基酸位置上任一數(shù)目的氨基酸上，這里的每一個位點可以是任一氨基酸。
權利要求62所述的氨基酸多肽，其中第一種特殊的氨基酸可操作地連接到一長約30～77個氨基酸位點的多肽上，這里的每一個位點可以是任一氨基酸。權利要求63所述的氨基酸多肽，其中第一種特殊的氨基酸可操作性地連接到一長為35，47，71或77個氨基酸位點的多肽上。
權利要求63所述的氨基酸多肽，其中第一種特殊的氨基酸可操作性連接到來自SEQ.ID.NO.3長度為35、47、71、或77的一組相應多肽上，從第一種特殊序列DTG的氨基酸上開始，向SEQ.ID.NO.3的N端方向計數(shù)。
權利要求65所述的氨基酸多肽，其中的多肽含有一種序列，其與相同的SEQ.ID.NO.4所示相應的氨基酸具有至少95％的相似，也就是說，與SEQ.ID.NO.4所示的部分序列相同。包括所有從第一和/或第二個特殊核苷酸開始朝向N末端，經(jīng)過并包括第一段特殊氨基酸之前的71，47，35個氨基酸(實施例10及11)的所有序列。
權利要求65所述的氨基酸多肽，其中的完整多肽含有一種71個氨基酸的多肽，其中的第一種氨基酸為T，第二個為Q。權利要求21所述的核酸多聚核苷酸，其中的多聚核苷酸含有一段與SEQ.ID.NQ.3所示氨基酸有著至少95％同源性的序列。也就是說，與SEQ.ID.NO.3所示的序列相同，其中包括從第一和/或者第二個特殊核苷酸朝向N末端，經(jīng)過并包括71個氨基酸的所有序列，參見實施例10，開始于DTG位點且包括編碼71個氨基酸的核苷。
在權利要求22中所述的核酸多聚核苷酸中，其有所述的完整的多聚核苷酸含有與序列SEQ.ID..NO.3所示氨基酸相同的序列。也就是說，與SEQ.ID.NO.3中的序列相同，其中包括從第一和/或者第二個特殊核苷酸開始朝向N末端，經(jīng)過并包括71個氨基酸的所有序列，參見實施例10，開始于DTG位點且包括編碼71個氨基酸的核苷。
在權利要求18中所述的核酸多聚核苷酸中，其中第一組特殊的核酸可操作性地連接到編碼任一從30到54數(shù)目的氨基酸的核酸上，其中的每一種密碼子可以編碼任一氨基酸。
在權利要求20中所述的核酸多聚核苷酸中，其中的第一組特殊的核酸可操作性地連接到47個密碼子上，其中這些35或47個氨基酸的第一種為氨基酸E或G。
權利要求21所述的核酸多聚核苷酸，其中的多聚核苷酸含有一種序列其與SEQ.ID.NQ.3所示氨基酸有著至少95％的同源性。也就是說，與SEQ.ID.NO.3所示的部分序列相似，包括所有從或者第一或者第二個特殊核苷酸直到N末端，經(jīng)過及包括35或47個氨基酸，參見實施例11的47個例子，開始于DTG位點且包括在DTG位點前編碼35或47個氨基酸的核苷。權利要求22所述的核酸多聚核苷酸，其中的多聚核苷酸具有一定的與SEQ.ID.NO.3所示相同或相應的氨基酸的同源性。也就是說，與SEQ.ID.NO.3所示的序列相似，包括所有從或者第一或者第二個特殊核苷酸直到N末端，經(jīng)過及包括35或47個氨基酸，參見實施例11的47個例子，開始于DTG位點且包括在DTG位點前編碼35或47個氨基酸的核苷。
一種分離的核酸分子，其中包括一多聚核苷酸，該多聚核苷酸編碼一Hu-Asp多肽，其核苷酸序列與選自下列的序列有至少95％的同源性
(a)編碼一種Hu-Asp多肽的一段核苷酸序列，該多肽選自Hu-Asp1，Hu-Asp2(a)，及Hu-Asp2(b)，其中所述Hu-Asp1，Hu-Asp2(a)，及Hu-Asp2(b)多肽分別具有如SEQ ID No.2，SEQ ID No.4，及SEQ ID No.6所示的完全的氨基酸序列，及(b)與(a)中核苷酸序列互補的核苷酸序列。
權利要求92所述的核酸分子，其中所述Hu-Asp多肽為Hu-Asp1，所述的1(a)多聚核苷酸包括有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。權利要求92所述的核酸分子，其中所述Hu-Asp多肽為Hu-Asp2(a)，所述的1(a)多聚核苷酸包括有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。權利要求92所述的核酸分子，其中所述Hu-Asp多肽為Hu-Asp2(b)，所述的1(a)多聚核苷酸包括有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。一種分離的核酸分子包括一種多聚核苷酸，該多聚核苷酸在嚴格條件下與具有如權利要求92的(a)或(b)的核苷酸序列的多聚核苷酸進行雜交。一種含有權利要求96所示核酸分子的載體。在權利要求97所述的載體中，其中所述核酸分子可操作性地連接到表達Hu-Asp多肽的啟動子上。在權利要求98所述的載體中，其中所述Hu-Asp多肽為Hu-Asp1。在權利要求98所述的載體中，其中所述Hu-Asp多肽為Hu-Asp2(a)。在權利要求98所述的載體中，其中所述Hu-Asp多肽為Hu-Asp2(b)。一種含有權利要求98所述的載體的宿主細胞。一種獲取Hu-Asp多肽的方法，其包括培養(yǎng)權利要求102所述的宿主細胞，且分離出所述的Hu-Asp多肽。一種分離的Hu-Asp1多肽，其包括一種含有與如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列有至少95％相似性的氨基酸序列。一種分離的Hu-Asp2(a)多肽，其包括一種含有與如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列有至少95％相似性的氨基酸序列。一種分離的Hu-Asp12(b)多肽，其包括一種含有與如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列有至少95％相似性的氨基酸序列。一種分離的抗體，其可與權利要求104-107任一所述的Hu-Asp多肽特異性地結合。
本發(fā)明中公開了多種分析該種酶的方法。
一種鑒別可用于篩選β分泌酶活性抑制劑的細胞的方法，該方法包括下述步驟
(a)鑒別一種細胞，該細胞能表達一種能夠在APPβ分泌酶位點進行切割的蛋白酶包括以下步驟i)收集細胞或待鑒定細胞的上清液；ii)測量核心多肽的產(chǎn)量，其中該核心多肽選自APPC-末端肽或者可溶性的APP；iii)選擇產(chǎn)生核心多肽的細胞。
權利要求108所述的方法其中細胞被收集且核心多肽為用β分泌酶進行裂解生成的APPC末端肽。權利要求108所述的方法其中上清液被收集且核心多肽為可溶性的APP，其中所述可溶的APP具有一種因β分泌酶裂解而生成的C末端。權利要求108所述的方法，其中所述細胞含有任一種如權利要求1-86所述的核酸或多肽且這里細胞被顯示可以裂解含有下列多肽結構的任一多肽中的β分泌酶位點P2、P1、P1’、P2’其中P2為K或N，P1為M或L，P1’為D，P2’為A的β分泌酶位點。權利要求111所述的方法，其中P2為K，P1為M。權利要求112所述的方法，其中P2為N，P1為L。
任一細菌細胞，其中含有如權利要求1-86及92-107所述的任一種核酸或多肽。權利要求114所述的細菌細胞，其中所述細菌為大腸桿菌。含有如權利要求1-86及92-107所述的任一種核酸或多肽的任一真核細胞。
含有如權利要求1-86及92-107所述的任一種核酸或多肽的任一昆蟲細胞。一種如權利要求117所述的昆蟲細胞，其中所述昆蟲為sf9，或者High5。一種如權利要求100所述的昆蟲細胞，其中的昆蟲細胞為High5。任一哺乳動物細胞含有如權利要求1-86及92-107所述的任何的核酸或多肽。一種權利要求120所述的哺乳動物細胞，其中所述的哺乳動物細胞選自下列類型的細胞人，嚙齒類，兔類及靈長類。一種如權利要求121所述的哺乳動物細胞其中的哺乳動物細胞選自人類細胞。一種如權利要求122所述的哺乳動物細胞其中的人類細胞選自HEK293及IMR-32。一種如權利要求121所述的哺乳動物細胞其中的細胞為靈長類動物細胞。權利要求124所述的靈長類動物細胞其中的靈長類動物細胞為COS-7細胞。一種如權利要求121所述的哺乳動物細胞其中的細胞選自一種嚙齒類動物細胞。權利要求126所述的一種嚙齒類動物細胞選自CHO-K1，Neuro-2A，3T3細胞。一種如權利要求115所述的酵母細胞。一種如權利要求115所述的鳥類細胞。
APP的任一同工型，其中最后兩個羧基端氨基酸都為賴氨酸殘基。在說明書中，所定義的同工型為任一APP多肽，包括APP變體(包括突變體)，及存在于人體中的APP片段，如US 5,766,846，第7欄，第45-67行(其作為參考資料引入本文件)所述的APP片段，在此引入作為參考。權利要求114所述的APP同工型，包括被稱為APP695的同工型，其經(jīng)修飾從而使最后兩個具有賴氨酸殘基成為其最后兩個羧基端氨基酸。權利要求130所述的APP同工型，包括SEQ.ID.16。權利要求130所述的APP同工型變體，包括SEQ.ID.18，及20。任一真核細胞系，包括如權利要求130-132所述的核酸及多肽。任一如權利要求133所述的細胞系，其為哺乳動物細胞系(HEK293，Neuro2a，及其它)。一種用于鑒別針對能夠裂解APPβ-分泌酶切割位點的酶的抑制劑的方法，包括下列步驟a)在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，采用能夠實現(xiàn)下述目的的條件酶可以對APP進行處理，及釋放淀粉樣蛋白β肽到培養(yǎng)基中，并可使得APP的CTF99片段聚集于細胞溶胞產(chǎn)物中；b)將已培養(yǎng)的細胞暴露于一種待測組合物；并且特異性檢測該待測組合物是否抑制了酶的功能，方法是測試釋放進培養(yǎng)基中的淀粉樣蛋白β肽或者細胞溶胞產(chǎn)物中的APP的CTF99片段的數(shù)量；c)測定待測組合物減少了存在于培養(yǎng)基中的可溶性淀粉樣蛋白β肽的數(shù)量，以及細胞溶胞產(chǎn)物中的作為Asp2抑制劑的APP的CTF99片段的減少。
如權利要求135所述的方法，其中所培養(yǎng)的細胞是人類，嚙齒類或昆蟲細胞系。如權利要求136所述的方法，其中的人類或嚙齒類細胞系呈現(xiàn)出了β分泌酶活性，因而發(fā)生了APP的處理，并伴有淀粉樣蛋白β肽釋放入培養(yǎng)基以及CTF99片段在細胞溶胞產(chǎn)物中的聚集。如權利要求137所述的方法，用直接針對具有β分泌酶活性的酶的抑制劑處理人或嚙齒類細胞，減少了可溶性淀粉樣蛋白β肽釋放進培養(yǎng)基中的數(shù)量及CTF99在細胞溶胞產(chǎn)物中的聚集。鑒別一種試劑的方法，該試劑可以減少選自Hu-Asp1，Hu-Asp2(a)，及Hu-Asp2(b)的Hu-Asp多肽的活性，該方法包括a)在試劑存在及不存在的情況下測定所述Hu-Asp多肽的活性，及b)比較所述試劑存在及不存在的情況下所測定的Hu-Asp多肽的活性；試劑存在的情況下所述Hu-Asp多肽的活性比試劑不存在情況下要低，這表明該試劑減少了所述Hu-Asp多肽的活性。本發(fā)明所述的核酸、多肽、蛋白、載體、細胞及細胞系以及測試方法。
本發(fā)明所提供了分離的核酸分子，其包括一編碼一種多肽多聚核苷酸，所述多肽選自人類天冬氨酰蛋白酶。具體地為人類天冬氨酰蛋白酶1(Hu-Asp1)及人類天冬氨酰蛋白酶2(Hu-Asp2)的兩個可選擇的剪接變體(Hu-Asp2(a)及Hu-Asp2(b))。正如這兒所使用的，所有涉及的″Hu-Asp″應該被理解為指的是所有的Hu-Asp1，Hu-Asp2(a)及Hu-Asp2(b)。此外，正如這兒所使用的，所有涉及的″Hu-Asp2″應該被理解為指的是Hu-Asp2(a)及Hu-Asp2(b)。Hu-Asp1在胰臟及前列腺組織表達量最高，而Hu-Asp2(a)及Hu-Asp2(b)在胰臟及腦組織中的表達量最高。本發(fā)明同時也提供了分離的Hu-Asp1，Hu-Asp2(a)及Hu-Asp2(b)多肽及顯示出天冬氨酰蛋白酶活性的片段。
在一種優(yōu)選的實施例當中，核酸分子含有一個多聚核苷酸，其核苷酸序列選自SEQ ID NO1所示的1-1554殘基，其編碼Hu-Asp1，SEQ ID NQ3的1-1503殘基，其編碼Hu-Asp2(a)，SEQ ID NQ5的1-1428殘基，其編碼Hu-Asp2(b)。在另一方面，本發(fā)明也提供了一種分離的核酸分子其包括一種多聚核苷酸，其在嚴格條件下能夠與編碼Hu-Asp1，Hu-Asp2(a)及Hu-Asp2(b)或者其中片段的多聚核苷酸雜交。歐洲專利申請EP 0 848 062公開了一種多肽Asp1，其與Hu-Asp1基本上同源，而國際申請WO 98/22597揭示了一種多肽Asp2，其與Hu-Asp2(a)具有很大的同源性。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明所述分離的核酸分子的載體，引入該載體的宿主細胞，以及通過培養(yǎng)上述宿主細胞及分離相關多肽以獲取Hu-Asp1，Hu-Asp2(a)及Hu-Asp2(b)多肽的重組方法。
另一方面，本發(fā)明同時也提供了分離的Hu-Asp1，Hu-Asp2(a)，及Hu-Asp2(b)多肽及其片段。在優(yōu)選的實施例當中，Hu-Asp1，Hu-Asp2(a)及Hu-Asp2(b)多肽分別具有如SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6所示的氨基酸序列。本發(fā)明同時也描述了Hu-Asp2(a)的活性結構，制備該活性結構的方法，制備可溶性結構的方法，測量Hu-Asp2活性的方法，及Hu-Asp2作用的底物。本發(fā)明同時也描述了靶向Hu-Asp1，Hu-Asp2(a)，及Hu-Asp2(b)mRNA轉錄物的反義低聚體及該反義低聚體用于減少該mRNA及其相應多肽的產(chǎn)量的用途。分離的多克隆或單克隆抗體，都可特異性連接到本發(fā)明所提供的Hu-Asp1，Hu-Asp2(a)，及Hu-Asp2(b)中的等任一多肽上。
本發(fā)明同時也提供了一種方法，其可以鑒別用于調控Hu-Asp1，Hu-Asp2(a)，及Hu-Asp2(b)任一之活性的試劑。本發(fā)明描述了一種方法，其可以通過加入Hu-Asp2多肽，無細胞測試該種試劑，以及在Hu-Asp2存在的條件下在人體或其它哺乳類動物細胞中測試該試劑的方法。
所列序列的簡要描述Sequence ID No.1-人類Asp-1，核苷酸序列Sequence ID No.2-人類Asp-1，推測的氨基酸序列Sequence ID No.3-人類Asp-2(a)，核苷酸序列Sequence ID No.4-人類Asp-2(a)，推測的氨基酸序列Sequence ID No.5-人類Asp-2(b)，核苷酸序列Sequence ID No.6-人類Asp-2(b)，推測的氨基酸序列Sequence ID No.7-鼠Asp-2(a)，核苷酸序列Sequence ID No.8-鼠Asp-2(a)，推測的氨基酸序列Sequence ID No.9-人類APP695，核苷酸序列Sequence ID No.10-人類APP695，推測的氨基酸序列Sequence ID No.11-人類APP695-Sw，核苷酸序列Sequence ID No.12-人類APP695-Sw，推測的氨基酸序列
Sequence ID No.13-人類APP695-VF，核苷酸序列Sequence ID No.14-人類APP695-VF，推測的氨基酸序列Sequence ID No.15-人類APP695-KK，核苷酸序列Sequence ID No.16-人類APP695-KK，推測的氨基酸序列Sequence ID No.17-人類APP695-Sw-KK，核苷酸序列Sequence ID No.18-人類ApP695-Sw-KK，推測的氨基酸序列Sequence ID No.19-人類APP695-VF-KK，核苷酸序列Sequence ID No.20-人類APP695-VF-KK，推測的氨基酸序列Sequence ID No.21-T7-人類-pro-Asp-2(a)ΔTM，核苷酸序列Sequence ID No.22-T7-人類-pro-Asp-2(a)ΔTM，氨基酸序列Sequence ID No.23-Caspase-人類-pro-Asp-2(a)ΔTM，核苷酸序列Sequence ID No.24-T7-Caspase-人類-pro-Asp-2(a)ΔTM，氨基酸序列Sequence ID No.25-人類-pro-Asp-2(a)ΔTM(低GC含量)，核苷酸序列Sequence ID No.26-人類-pro-Asp-2(a)ΔTM，(低GC含量)，氨基酸序列Sequence ID No.27-T7-Caspase-Caspase 8 cleavage-人類-pro-Asp-2(a)ΔTM，核苷酸序列Sequence ID No.28-T7-Caspase-Caspase 8 cleavage-人類-pro-Asp-2(a)ΔTM，氨基酸序列Sequence ID No.29-人類Asp-2(a)ΔTM，核苷酸序列Sequence ID No.30-人類Asp-2(a)ΔTM，氨基酸序列Sequence ID No.31-人類Asp-2(a)ΔTM(His)6，核苷酸序列Sequence ID No.32-人類Asp-2(a)ΔTM(His)6，氨基酸序列Sequence ID No.s 33-46在下述本發(fā)明的詳細描述中說明。
附圖的簡要說明

圖1圖1顯示出人Asp1的核苷酸序列(SEQ ID NO1)及推測的氨基酸序列(SEQ ID NO2)；圖2圖2顯示出人Asp2(a)的核苷酸序列(SEQ ID NO3)及推測的氨基酸序列(SEQ ID NO4)；
圖3圖3顯示出人Asp2(b)的核苷酸序列(SEQ ID NO5)及推測的氨基酸序列(SEQ ID NO6)；推測的Hu-Asp2(b)生物橫跨膜區(qū)域附于括弧中；圖4圖4顯示出鼠Asp2(a)的核苷酸序列(SEQ ID NO7)及推測的氨基酸序列(SEQ ID NO8)；圖5圖5顯示出Hu-Asp2(a)及鼠Asp2(a)的推測的氨基酸序列的最匹配序列；圖6圖6顯示出T7-人類-pro-Asp-2(a)ΔTM的核苷酸序列(SEQ ID NO21)及推測的氨基酸序列(SEQ ID NO22)；圖7圖7顯示出T7-caspase-人類-pro-Asp-2(a)ΔTM的核苷酸序列(SEQ ID NO23)及推測的氨基酸序列(SEQ ID NO24)；圖8圖8顯示出人類-pro-Asp-2(a)ΔTM(低GC含量)的核苷酸序列(SEQ ID NO25)及推測的氨基酸序列(SEQ ID NO26)；圖9蛋白質印跡顯示通過用反義低聚體靶定Hu-Asp2 Mrna轉染HEK125.3細胞可以減少CTF99的產(chǎn)量；圖10蛋白質印跡實驗顯示在用或不用Hu-Asp2與APP-KK共轉染的鼠Neuro-2a細胞中，只有那些用HuAsp2共轉染的細胞中才出現(xiàn)CTF99產(chǎn)量的增加。用HuAsp2或不用HuAsp2與APP-Sw-KK共轉染的細胞中，只有那些共轉染了Hu-Asp2的細胞內(nèi)才出現(xiàn)CTF99產(chǎn)量的進一步增加。
圖11圖11顯示出人類-Asp2(a)ΔTM的推測的氨基酸序列(SEQ IDNO30)；圖12圖11顯示出人類-Asp2(a)ΔTM(His)6的推測的氨基酸序列(SEQID NO30)。
本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明所使用的一些定義見下文，大多數(shù)定義為本領域普通技術人員所使用的定義。
當β淀粉樣蛋白多肽，任一來自APPβ分泌酶切割位點的多肽，其包括39，40，41，42及43個氨基酸的多肽，從β分泌酶切割位點向外延伸39，40，41，42及43個氨基酸。β淀粉樣蛋白多肽還可為序列1-6，該序列參見美國專利US 5,750,349的SEQ.ID.NO.1-6，于1998年5月12日頒布(在此引入作為參考)。本發(fā)明公開的β分泌酶切割片段被稱為CTF--99，其由β分泌酶切割位點延伸至APP的羧基端。
當APP的同工型被討論當其被認為是任一APP多肽時，包括APP變體(包括突變體)，以及存在于人體中的APP片段如美國專利US 5,766,846，第7欄，45-67行所描述的APP片段，在此引入作為參考。
這兒所使用的詞組″β-淀粉樣蛋白前體蛋白″(APP)被定義為這樣一種多肽，其為同名的位于人類第21于染色體長臂上的基因所編碼，且其包括“βAP-這里指β-淀粉樣蛋白蛋白”參見上文，在其第三羧基范圍內(nèi)。APP是一種蛋白糖基化的，單膜形成的蛋白，其在許多哺乳動物組織的很廣泛的細胞內(nèi)進行表達。現(xiàn)在已知存在于人類的APP特異同工型的實例為Kang等(1987)自然325733-736一文中所描述的695-氨基酸多肽，稱為“正常”APP；Ponte等.(1988)自然331525-527(1988)及Tanzi等.(1988)自然331528-530所描述的751-氨基酸多肽，及Kitaguchi等.(1988)自然331530-532所描述的770-氨基酸多肽。APP變體的具體實例包括點突變其可以因位置和顯型而有不同的變化，(參照已知的變種突變，參見flardy(1992)Nature Genet.1233-234).所有文獻在此引入作為參考。這里所使用的詞組″APP片段″意指除了那些僅包括βAP或βAP片段之外的APP片段，也就是說，APP片段包括那些除完整βAP或βAP片段之外的APP片段的APP氨基酸序列。
當詞組“任一氨基酸”被使用時，所指氨基酸選自下述的三個字母或單個字母的簡寫，提供如下丙胺酸Ala，A；精氨酸，Arg，R；天冬酰胺酸，Asn，N；天(門)冬氨酸，Asp，D；半胱氨酸，Cys，C；谷氨酸，Gln，Q；lu；E-谷氨酸，Glu，E；氨基乙酸，Gly，G；組氨酸，His，H；異亮氨酸，Ile，I；亮氨酸，leu，L；賴氨酸，Lys，K；蛋氨酸，Met，M；苯丙氨酸，Phe，F(xiàn)；脯氨酸，Pro，P；絲氨酸，Ser，S；蘇氨酸，Thr，T；色氨酸，Trp，W；酪氨酸，Tyr，Y；纈氨酸，Val，V；天冬氨酸或者天冬酰胺酸，Asx，B；谷氨酸或谷氨酸鹽，Glx，Z；其它的氨基酸，Xaa，X..
本發(fā)明提供了一種可從基因數(shù)據(jù)庫中篩選出具有天冬氨酰蛋白酶活性的單活性位點基元的方法。真核天冬氨酰蛋白酶例如胃蛋白酶及血管緊張肽原酶其具有一種兩功能域的結構其折疊可形成兩個天冬氨酰殘基在活性位點之間更為靠近。它們包埋在短的三肽基序DTG中，或更不常見的包埋于DSG。
許多天冬氨酰蛋白酶作為酶原出現(xiàn)，其N端被切割活化。DTG或DSG活性位點基序在酶原中出現(xiàn)在大約第65-70個殘基上(凝乳酶原，胃蛋白酶原)，但在N端功能域切割后出現(xiàn)在活性酶的大約第25-30個殘基上?；钚晕稽c基序的有限長度使得搜索收集短的表達序列標記(EST)以發(fā)現(xiàn)新的天冬氨酰蛋白酶的工作變得困難。EST序列一般平均為250個核苷或者更短，并由此編碼80-90個氨基酸殘基或者更短。這樣的序列太短而無法跨越所述的兩個活性位點基序。優(yōu)選的方法就是篩選假設的或裝配的蛋白編碼序列的數(shù)據(jù)庫。本發(fā)明描述了一種計算機方法在該蛋白序列數(shù)據(jù)庫中鑒別候選的天冬氨酰蛋白酶。該方法被用于在Caenorhabditis elegans基因組中鑒別7個候選的天冬氨酰蛋白酶序列。這些序列經(jīng)過同源性檢索找到了Hu-Asp1及Hu-Asp2的兩個可選擇的剪接變體，這里將其命名為Hu-Asp2(a)及Hu-Asp2(b)。
本發(fā)明的一種重要的方面我們這里所披露的是有關APP處理的新的信息。淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)經(jīng)過Aβ途經(jīng)的病理學處理需要有β-分泌酶及γ-分泌酶兩種蛋白酶的連續(xù)作用。經(jīng)過用β-分泌酶及γ-分泌酶兩種蛋白酶切割APP分別產(chǎn)生Aβ肽的N端及C端。因為Aβ肽的過量生產(chǎn)，具體為Aβ1-42，可以引發(fā)阿爾茨海默氏疾病，因而β-分泌酶和/或γ-分泌酶的抑制劑對治療阿爾茨海默氏疾病有潛在的作用。盡管β-分泌酶和γ-分泌酶在APP的病理學過程中的重要性，但是這些酶的分子定義至今尚未完成。那就是說，尚未知在β-分泌酶或γ-分泌酶切割位點需要那種酶。這些位點其本身已知是因為APP及Aβ1-42已知，參見US 5,766,846及US5,837,672，(作為參考引入，除了″可溶性″多肽外)。但是那種酶涉及生產(chǎn)Aβ1-42至今尚未知。
本發(fā)明涉及到幾種新的人類天冬氨酰蛋白酶的分子學定義，其中之一指的是Hu-Asp-2(a)及Hu-Asp2(b)，其特征已作了詳細描述。已經(jīng)公開的asp1及asp2的現(xiàn)有形式，參見EP0848062A2及EP 0855444 A2，發(fā)明者為Dayid Powel等，申請人為Smith Kline Beecham公司(已作為參考資料引入)。本發(fā)明公開了Hu-Asp2的新型及舊型。其第一次以一活性形式表達，它們的底物及其特異性都是首次公開。在該發(fā)明前，細胞或細胞提取物需要在β-分泌酶位點進行裂解，現(xiàn)在純化蛋白可以被用于如此分析。基于下述實驗結果(1)反義敲除實驗，(2)瞬時轉染敲入實驗，及(3)使用純化重組的Hu-Asp-2進行的生化實驗，我們發(fā)現(xiàn)Hu-Asp-2是參與APP處理過程的β-分泌酶。盡管已經(jīng)報道了Hu-Asp-2(a)的核酸及推測的氨基酸序列，如上看到的那樣，參見EP 0848062 A2及EP 085544 A2，但并未披露這些酶的功能性特征， 這里作者描述了Hu-Asp-2酶的特點，并能夠解釋為什么其在Aβ1-42多肽的形成過程中為一種重要且必要的酶及在AD的形成過程中為一種重要且必要的步驟。
在另外一種實施例中，本發(fā)明同樣描述了一種Hu-Asp2的新型剪切變體，其為Hu-Asp2(b)，其在本發(fā)明前從未被揭示過。
在另外一種實施例中，本發(fā)明提供了一種分離的核酸分子，其包括這樣一種多聚核苷酸其編碼一種多肽，該多肽選自人天冬氨酰蛋白酶1(Hu-Asp1)及人天冬氨酰蛋白酶2(Hu-Asp2)的兩個可選擇性變體，即本發(fā)明中的Hu-Asp-2(a)及Hu-Asp2(b)。正如這兒所使用的，所有涉及的″Hu-Asp2″應該被理解為指的是Hu-Asp2(a)及Hu-Asp2(b)。Hu-Asp1在胰臟及前列腺組織中有著豐富的表達量，而Hu-Asp2(a)及Hu-Asp2(b)在胰臟及腦組織中有著豐富的表達量。本發(fā)明同時也提供了分離的Hu-Asp1，Hu-Asp2(a)及Hu-Asp2(b)多肽及其顯示天冬氨酰蛋白酶活性的片段。
Hu-Asp1，Hu-Asp2(a)及Hu-Asp2(b)的推測的氨基酸序列與先前所鑒別的哺乳動物天冬氨酰蛋白酶如胃蛋白酶原A，胃蛋白酶原B，組織蛋白酶B，組織蛋白酶E，及血管緊張肽原酶具有顯著的同源性。P.B.Szecs，Scand.J.Clin.Lab.Invest.52(Suppl.2105-22(1992)).這些酶的共同特征是具有一種重復的DTG/DSG序列基元。本發(fā)明公開的Hu-Asp1及HuAsp2多肽與來自蛋白質序列資料庫的編碼天冬氨酰蛋白酶的ProSite共有基序有著極高的同源性。
給出的如SEQ ID NO1所示的1-1554殘基的核苷酸序列對應于編碼Hu-Asp1的核苷酸序列，給出的如SEQ ID N03所示的1-1503殘基的核苷酸序列對應于編碼Hu-Asp2(a)的核苷酸序列，而且給出的如SEQ ID NO5所示的1-1428殘基的核苷酸序列對應于編碼Hu-Asp2(b)的核苷酸序列。在實施例1及2中將描述編碼Hu-Asp1及HuAsp2(a)及Hu-Asp2(b)的DNA的分離及測序。
正如實施例1及2所描述的，自動的測序方法將被用于獲得Hu-Asp1，Hu-Asp2(a)及Hu-Asp-2(b)的核苷酸序列。本發(fā)明所獲得的Hu-Asp核苷酸序列為DNA雙鏈，并且相信為100％的準確。然而，正如本領域公知的那樣，用自動測序法所獲得的核苷酸序列可能發(fā)生一些錯誤。自動測序法所測定的核苷酸序列與給定的核酸分子的實際核苷酸序列一般有至少90％，更一般的為至少95％至大約99.9％的同一性。實際上核苷酸序列通過用本領域公知的手工測序的方法進行測定將更為準確。序列中的一點錯誤如加入或刪除一個或多個核苷將導致翻譯時發(fā)生移碼其結果是從點突變位點開始，推測的氨基酸序列將完全不同于核酸分子的實際核苷酸序列所能夠推測的氨基酸序列。本發(fā)明的Hu-Asp DNA包括cDNA、化學合成的DNA、通過PCR分離的DNA、基因組DNA、及其結合體?；蚪MHu-Asp DNA可以通過用這里所述的Hu-Asp2 cDNA使用本領域公知的技術常識或者使用寡聚核苷酸(其選自Hu-Asp2序列，其將引導聚合酶鏈式反應(PCR))篩選基因組文庫獲得。本發(fā)明也同樣包括由Hu-Asp DNA轉錄獲得的RNA。
因為遺傳密碼的簡并性，兩個DNA序列雖不同，但也可能編碼相同的氨基酸序列。本發(fā)明因此提供了分離的核酸分子，其多聚核苷酸序列編碼本發(fā)明所述的任一Hu-Asp多肽，這里所述的多聚核苷酸序列可編碼具有如SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6或其片段所示的完整的氨基酸序列或其片段的Hu-Asp多肽。
本發(fā)明還提供了純化的Hu-Asp多肽，包括重組和非重組形式，更為重要的是，提供了一種生產(chǎn)活性Hu-Asp2多肽的方法。其包括在細菌細胞，昆蟲細胞及哺乳動物細胞中生產(chǎn)Hu-Asp2多肽及其衍生物，其中其允許Hu-Asp2多肽從細菌，昆蟲及哺乳動物細胞中分泌進入培養(yǎng)基中，以及用于制備摻入了氨基酸標記以利于后續(xù)純化的Hu-Asp2多肽變體的方法。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方案中，Hu-Asp2多肽在轉化細胞中或者經(jīng)過純化及在無細胞系統(tǒng)中用另一種蛋白酶進行裂解被轉化為一種蛋白水解活性形態(tài)，Hu-Asp2多肽這樣的活性形式其N端以序列TQHGIR或ETDEEP起始。Hu-Asp蛋白的變體及衍生體，包括片段，只要它們具有如SEQ ID Nos2，4，和6所示的天然氨基酸序列且保留了Hu-Asp的任一種生物活性，那么就也都在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。當然本技術領域的任一普通技術如用標準的天冬氨酰蛋白酶分析化驗Hu-Asp蛋白的一種變種，衍生體或者片段也很容易測定其是否可以展示Hu-Asp的活性。本發(fā)明范圍內(nèi)的Hu-Asp片段包括那些含有具有氨基酸序列DTG的活性位點區(qū)域的片段，及那些含有具有氨基酸序列DSG的活性位點區(qū)域的片段，及那些含有同時具有氨基酸序列DSG的活性位點區(qū)域的片段，DTG及DSG活性位點序列間隔已被加長的片段，及其間隔被縮短的片段。同樣也包括在本發(fā)明保護范圍內(nèi)的Hu-Asp片段其跨膜區(qū)域被刪除以允許Hu-Asp2以一可溶性形式生產(chǎn)。在本發(fā)明的另一個實施例中，Hu-Asp2的兩個組件，可以重組多肽的形式單獨進行生產(chǎn)，然后合并在溶液中，并在溶液中重新組配成活性蛋白酶，上述的每個組件中各含一單個的活性位點DTG或DSG序列。
自然編碼Hu-Asp的核苷酸序列可以通過突變獲取Hu-Asp變種，例如，一種Hu-Asp變種，這里所指的是與自然的Hu-Asp多肽基本同源的一種多肽，但其中的一段氨基酸序列因為發(fā)生一處或多處缺失，插入，或替代而與自然的Hu-Asp的氨基酸序列不同。變體的氨基酸序列或核苷酸序列與自然的Hu-Asp序列同源性為至少80％，優(yōu)選至少為90％，最優(yōu)選至少95％。這樣，一種變體的核苷酸序列其與自然的Hu-Asp基因序列相比不同，例如，每100個核苷發(fā)生5點突變，其將與自然的蛋白有95％的同源性。自然及變種的Hu-Asp序列的相似性，或同源性的百分比可以通過下列方法測定，例如，通過使用一般用于此目的計算機程序，例如，Gap程序(威斯康星序列分析軟件包，Unix第8版，Genetics Computer Group，UniversityResearch Park，Madison Wisconsin)其使用Smith及Waterman的運算法則(Adv.AppL Math.2.’482489(1981))可以進行測定。
自然的Hu-Asp的氨基酸序列的改變，可以通過大量現(xiàn)有技術中的任一種來實現(xiàn)。例如，用本領域已知方法在特定座位引入突變，如寡聚核苷酸介導的誘變，正如下述幾位描述的那樣Walder等(基因42133(1986))；Bauer等(基因3773(1985))；Craik(生物技術，1985，1月，12-19頁)；Smith等.(基因工程原理和方法，Plenum Press(1981))；及美國專利文獻Nos.4,518,584及4,737,462。
本發(fā)明保護范圍內(nèi)的Hu-Asp變種可以包括保守的替代序列，意指Hu-Asp多肽的一種或幾個氨基酸殘基為其它不同的殘基所取代但其并不會改變Hu-Asp多肽的二級或三級結構。這種替代可以包括氨基酸殘基的取代為另一種理化性質相似的多肽的殘基所取代，例如替代一種脂肪簇的殘基(Ile，Val，leu or Ala)為其它，或者替代發(fā)生在兩個基本的殘基之間，如Lys及Arg，酸性殘基Glu及Asp，氨基組合物殘基Gln及Asn，羥基氫氧基殘基Ser及Tyr，或者芳香殘基Phe及Tyr。有關表型陰性的氨基酸殘基的交換的進一步的信息可以在Bowie等，科學2471306-1310(1990)發(fā)現(xiàn)。另一種其能充分地表現(xiàn)出的物學活性的Hu-Asp變種為那些氨基酸殘基的替代發(fā)生在蛋白結構域以外Hu-Asp變種。
另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的核酸分子，其包括一種多聚核苷酸其能在嚴格條件下與上述核酸分子的一部分發(fā)生雜交，例如，先前所描述的核酸分子的至少大約15個核苷，更好為大約20個核苷，再好為至少大約30個核苷，最好為至少大約30個至100個核苷。這些核酸分子的一部分具有參考資料所述的長度，如，至少有大約15個臨近核苷為參考資料所述。在嚴格的雜交條件下過夜培養(yǎng)，溫度大約為42℃，時間為大約2.5個小時，在6×SSC/0.1％SDS中，接著在65℃下，在1.0×SSC，0.1％SDS中過濾洗滌。
這里所描述的編碼Hu-Asp的核酸分子的片段，以及能與該核酸分子雜交的多聚核苷酸，都可以被用做探針，或可在聚合酶鏈式反應(PCR)的過程中作為引物。該探針可以被使用，例如，用于體外測試方法去檢測Hu-Asp核酸的存在，以及用于Southern和Northern印跡實驗。表達Hu-Asp的細胞類型可以通過使用該探針進行鑒別。這種處理過程是公知的，本領域技術人員可以根據(jù)不同的應用選擇不同長度的探針。對于PCR來說，相應于所期望的Hu-Asp核酸分子5’及3’引物可以通過使用傳統(tǒng)的技術來分離及擴增該序列。
另外的有用的Hu-Asp核酸分子為反義或有義的寡聚核苷酸包括一單鏈核酸序列，其能夠與一目標的Hu-Asp mRNA(使用一條有義鏈)，或者Hu-Asp DNA(使用一條反義鏈)序列進行結合。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方案中，這些Hu-Asp反義寡聚核苷酸減少了Hu-Asp mRNA，并隨之減少了Hu-Asp多肽的生產(chǎn)量。
在另一方面，本發(fā)明包括有或者沒有自然模式糖基化的Hu-Asp多肽。Hu-Asp1及Hu-Asp2具有良好的天冬酰氨聯(lián)結糖基受體位點，其中Hu-Asp1具有兩個這樣的位點，Hu-Asp2具有四個這樣的位點。酵母或者哺乳類動物細胞表達系統(tǒng)中(下面接著討論)表達的Hu-Asp與自然狀態(tài)下的Hu-Asp多肽在分子量或糖基化模式上或者相似或者有顯著的不同。Hu-Asp在細菌系統(tǒng)中的表達將提供一種非糖基化的Hu-Asp。
本發(fā)明的多肽更適宜以一分離且充分純化的形式提供，Hu-Asp多肽可以通過眾所周知的方法包括硫化銨或乙醇沉淀，陰陽離子交換色譜，磷酸纖維素色譜， 疏水作用色譜，親合色譜，羥磷灰石色譜，植物血凝素色譜，及高壓液相色譜(HPLC)等從組織，培養(yǎng)細胞，或重組的細胞培養(yǎng)物中恢復和純化。在一種優(yōu)選的實施例中，使用基因工程技術將一種氨基酸標記加入到一種Hu-Asp多肽中為本領域技術人員所共知，其包括六個組氨酸氨基酸殘基的加入以允許結合在一適宜支持物上的鎳而純化，單克隆或多克隆的表位包括但并不限于T7表位，myc抗原決定基及V5a表位，Hu-Asp2與一適宜的蛋白伴侶融合，其包括但并不限于谷胱甘肽-S-轉移酶或者麥芽糖結合蛋白。在一具體的實施例中，這些另外的氨基酸序列加入到Hu-Asp的C端，但其也可以加入到Hu-Asp多肽的N端或其中間的插入位置。
本發(fā)明同樣涉及到一種載體，其含有本發(fā)明的多聚核苷酸分子，以及用該載體轉化后的宿主細胞。本發(fā)明的任一的多聚核苷酸分子都可被加入到一種載體中，其一般包括一種選擇性標記及一種復制的起始位點以在宿主細胞中進行繁殖。因為本發(fā)明同樣也提供了一種由上述多聚核苷酸分子所表達的Hu-Asp多肽，也選擇了一些表達Hu-Asp的載體。這些載體包括編碼上述或下述任一Hu-Asp多肽的DNA，其被可操作地連接到一種適宜的轉錄或翻譯調控序列上，例如那些獲自哺乳動物細胞，細菌，病毒或昆蟲基因的調控序列。調控序列包括轉錄啟動子，操縱子，或增強子，信使RNA核糖體結合位點，及可以調控轉錄或翻譯的適宜序列。當調控序列與編碼Hu-Asp的DNA相關時將這些序列可操作地連接在一起。這樣，如果一種啟動子核苷酸序列可介導Hu-Asp序列的轉錄的話，那么就將其可操作地連接一段Hu-Asp DNA序列上。
為了克隆編碼Hu-Asp的多聚核苷酸分子，或者為了表達Hu-Asp多肽，選擇適宜載體的，這當然取決于載體所轉化宿主細胞。而且如果可以的話，宿主細胞應選自Hu-Asp多肽可以被表達的細胞。表達Hu-Asp多肽的適宜的宿主細胞包括原核生物細胞，酵母細胞及高等的真核生物細胞，每一種下面都要進行論述。
在這些宿主細胞中表達的Hu-Asp多肽也可以為融合性蛋白，其包括來自異種蛋白的區(qū)域。其可以帶來這樣的優(yōu)點，允許分泌，穩(wěn)定性的提高，或利于蛋白質的純化。例如，一段編碼一定信號肽的序列，可以被引入表達載體中。一種編碼該信號肽的DNA序列(導向分泌)可以被融入Hu-Asp序列的閱讀框內(nèi)，這樣Hu-Asp被作為一含有該信號肽的融合性蛋白被翻譯。在目標宿主細胞中該信號肽具有一定的功能，其可以促進Hu-Asp多肽的胞外分泌。優(yōu)選地，一旦Hu-Asp多肽從細胞中分泌完畢，信號肽將與Hu-Asp多肽分離。信號序列無任何限制，在實踐該發(fā)明時其可以包括酵母細胞的I因子，及在sf9昆蟲細胞中的蜜蜂褪黑激素導向因子。
在一種優(yōu)選的實施方案中，Hu-Asp多肽作為一融合蛋白其包括一種異源結構域其可被用于促進該多肽的純化。許多可用于此功能的蛋白允許該分泌蛋白選擇性結合在一結合伴侶的融合性蛋白上。例如，Hu-Asp多肽可被修飾以包括一種多肽以形成一種融合蛋白，其特異性結合在一結合伴侶上，或一多肽標記上。該多肽標記的非限制性實例包括6-His標記，硫氧還蛋白標記，血球凝集素標記，OST標記，及OmpA信號序列標記。正如本技術領域人員所能理解的那樣，其能夠被認識及結合在一多肽上的結合伴侶可以是任一分子或組合物包括金屬離子(例如金屬親合柱)，抗體，或其片段。任一結合該多肽的蛋白或多肽，例如FLAG標記。
表達Hu-Asp多肽的適宜的宿主細胞包括原核生物細胞，酵母細胞，及高等的真核生物細胞。用于表達Hu-Asp的適宜的原核生物宿主細胞包括埃希氏桿菌屬細菌，桿菌屬細菌，及沙門氏菌屬細菌，以及假單胞菌屬，鏈酶菌屬，及葡萄球菌屬細菌。對于在大腸桿菌中進行的表達，一種Hu-Asp多肽可能包括一種N末端甲硫氨酸殘基，以利于在一原核宿主細胞中表達該重組多肽。N末端甲硫氨酸殘基可以隨意地從表達的Hu-Asp多肽中進行分離。另一種可以被加入到Hu-Asp多肽中以利于在大腸桿菌中進行表達的N末端氨基酸殘基包括但并不限于T7前導序列，T7caspase 8前導序列，及其它的前導序列包括用于純化的標記如6-His標記(見實施例9)。在大腸桿菌中表達的Hu-Asp多肽可以通過移去細胞質尾端，橫跨膜區(qū)域，或膜最接近區(qū)域而被縮短。在大腸桿菌中表達的Hu-Asp多肽可以溶解形式或者以包含體在或非包含體的不溶形式而獲得。非溶解多肽可以通過加入HCl胍，尿素或其它蛋白質變性劑然后通過稀釋或透析進入合適的含水緩沖液之前或之后純化前或后重新折疊形可溶形式。如果使用重組方法生產(chǎn)失活的Hu-Asp前體，可以用另一種適宜的蛋白酶如人類免疫性缺陷病毒蛋白酶切除一前體節(jié)段(prosegment)使其具有活性。
用于原核宿主細胞中的表達載體一般包括一種或多個可選擇性標記的表型基因，該基因一般編碼，例如，具有抗生素抗性或滿足一營養(yǎng)缺陷型要求的蛋白。該載體具有一種較寬的選擇范圍其很容易從商業(yè)渠道獲得。例如有pSPORT載體，pGEM載體(Promega)，pPRQEX載體(LTIBethesda，MD)，Bluescript載體(Stratagene)，pET載體(Novagen)及pQE載體(Qiagen)。
Hu-Asp同樣也可在酵母宿主細胞中表達，其可選自下列的種屬，包括酵母屬，畢赤酵母屬，及克魯維酵母屬。最適宜的酵母宿主細胞為釀酒酵母及巴斯德畢赤酵母。酵母載體通常包括一種來自2T酵母質粒的復制序列的起始位點，一段自動復制序列(ARS)，一個啟動子區(qū)，一段聚腺甘化的序列，一段轉錄終止的序列，及一種選擇性標記基因。同時用到在酵母及大腸桿菌中都可進行復制的載體(命名為穿梭質粒)，除了上述的酵母載體的特征外，穿梭質粒同樣也包括一種在大腸桿菌中進行選擇和復制的序列。在酵母宿主細胞中表達的Hu-Asp多肽的直接分泌可以通過在編碼Hu-Asp的核苷酸序列的5’末端融入編碼酵母I因子前導序列的核苷酸序列來完成。
昆蟲宿主細胞培養(yǎng)系統(tǒng)可同樣被用于表達Hu-Asp多肽，在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的Hu-Asp多肽使用一昆蟲細胞表達系統(tǒng)進行表達(參見實施例10)。此外，一桿狀病毒表達系統(tǒng)也可用于在昆蟲表達系統(tǒng)中表達Hu-Asp多肽，如luckow及Summers，生化技術647(1988)所述那樣。
在另一種優(yōu)選實施方案中，Hu-Asp多肽在哺乳動物宿主細胞中進行表達。適宜的哺乳動物細胞系的非限制性實施例包括猴腎細胞COS-7細胞系(Gluzman等，細胞23175(1981))，人胚胎腎細胞系293，及中國鼠卵巢(CHO)細胞。最好是，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞被用于表達Hu-Asp蛋白(見實施例11)。
本發(fā)明的Hu-Asp多肽的適宜性表達載體的選擇將當然依賴于所使用的哺乳動物宿主細胞，這是本領域技術人員所共知的常識。適宜性表達載體例如包括pcDNA3(Invitrogen)及pSVL(Pharmacia Biotech)。用于表達Hu-Asp多肽的載體為pcDNA3.1-Hygro(Invitrogen)。在哺乳動物宿主細胞中進行表達的載體可以包括獲自病毒基因組的轉錄及轉譯控制序列。本發(fā)明一般所使用的啟動序列及增強序列包括但并不限于，那些獲自人類細胞巨化病毒(CMV)，腺病毒2，多形瘤病毒，及猿病毒40(SV40)。這里也描述了構建哺乳動物細胞表達載體的方法，例如，在Okayama及Berg(MoL CelL BioL 3280(1983))；Cosman等(MoL，免疫學23935(1986))；Cosman等(自然312768(1984))；EP-A-0367566；及WO91/18982。
本發(fā)明的多肽同樣可被用于制備單克隆或多克隆抗體，這些抗體可以用于檢測Hu-Asp多肽表達的診斷實驗中。這些抗體可以通過傳統(tǒng)的技術手段來進行制備。參見，例如，抗體實驗室指南，Harlow及Land(eds.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1988)；單克隆抗體，雜交瘤生物分析的一種新的方法，Kennet等(eds.)，Plenum Press，New York(1980)。包括Hu-Asp第5至20位氨基酸殘基的合成多肽也可用于生產(chǎn)單克隆或多克隆抗體，但在這之前須先連接一適宜的載體蛋白，該蛋白包括但并不限于匙孔血藍蛋白(KLH)，雞卵白蛋白，或者牛血清白蛋白，使用不同的交聯(lián)試劑包括碳二亞胺，戊二醛，或者如果該多肽含有一種半胱氨酸，N-甲基順丁烯二酰亞胺。用于免疫目的的一適宜性多肽當與KLH結合時含有分別含有QRRPRDPEVVNDESSLVRHRWK或者LRQQHDDFADDISLLK的Hu-Asp1或者Hu-Asp2的C末端。
本發(fā)明的Hu-Asp核酸分子對于染色體鑒別來說同樣是有用的，因為其能夠與人染色體的特定位點進行雜交。Hu-Asp1已被定位于第21號染色體上，而Hu-Asp2被定位于染色體11q23.3-24.1上。在染色體上進行特定位點的鑒別是一現(xiàn)實需要，因為基于實際序列數(shù)據(jù)庫(重復多態(tài)性)的少數(shù)染色體標記試劑對于在染色體位點上標記是現(xiàn)實可用的。一旦一種序列被繪制至一種精確的染色體位點，該序列在染色體上的自然位點可與基因圖譜庫進行關聯(lián)?；蚺c疾病(其已被繪制在同一染色體區(qū)域)的關系可以通過連接分析進行測定，這里自然上接近的基因的共遺傳可以被測定?？雌饋砼c一特定疾病相關的一種基因事實上是否該疾病的導致原因可以通過比較受疾病影響及未受其影響的個體的核酸序列來進行測定。
在另一種實施例中，本發(fā)明也涉及到一種分析Hu-Asp特別是Hu-Asp2的功能的方法，其中所述，在溶液中與一適宜底物溫育Hu-Asp多肽，該底物包括但并不限于含有APPβ分泌酶切割位點的合成多肽，最好是一種含有在瑞典人家族中的遺傳性AD發(fā)現(xiàn)的突變?nèi)鏚M變?yōu)镹L的多肽，這樣的多肽包括有序列SEVNLDAEFR，在酸性緩沖液中，最好是pH為5.5(見實施例12)的酸性緩沖液中使用高壓液相色譜來監(jiān)控該多肽的分解以來作為對Hu-Asp活性的測量。蛋白酶水解活性的最佳測試方法使用內(nèi)部熄滅多肽化驗底物的方法。該適宜性底物包括附有一對熒光團及一種含有但并不限于香豆素及二硝基酚的淬火劑的多肽。這樣一來Hu-Asp切割多肽的結果將因為熒光團與淬火劑的的分離而導致熒光的增加。Hu-Asp蛋白酶水解活性的比色分析將使用另一合適的底物，其包括P2及具有通過一氨基組合物連接至o-硝基酚的識別位點的P1氨基酸，這樣一來通過Hu-Asp切割改變分析緩沖液至一堿性pH后將導致光學密度的增加。
在另一實施例中，本發(fā)明涉及到一種方法，其可以鑒別這樣一種試劑，其增強了Hu-Asp多肽的活性，該多肽選自含有Hu-Asp1，Hu-Asp2(a)，及Hu-Asp2(b)的組，該方法包括(a)在待測試劑的存在下或不存在下測定所述Hu-Asp多肽的活性，且，(b)比較在待測試劑的存在下與不存在下所測定的所述Hu-Asp多肽的活性；在試劑存在的情況下所述Hu-Asp多肽的活性比較在試劑不存在的情況下所述Hu-Asp多肽的活性要高顯示出該試劑增加了所述Hu-Asp多肽的活性。該種與Hu-Asp多肽一起進行的測試可以在無細胞系統(tǒng)中也可以在表達Hu-Asp的培養(yǎng)細胞中及其衍生體或變體進行。
在另一實施例中，本發(fā)明涉及到一種方法，其可以鑒別這樣一種試劑，其減弱了Hu-Asp多肽的活性，該多肽選自含有Hu-Asp1，Hu-Asp2(a)，及Hu-Asp2(b)的組，該方法包括(a)在待測試劑的存在下或不存在下測定所述Hu-Asp多肽的活性，且，(b)比較在待測試劑的存在下與不存在下所測定的所述Hu-Asp多肽的活性；在試劑存在的情況下所述Hu-Asp多肽的活性比較在試劑不存在的情況下所述Hu-Asp多肽的活性要低顯示出該試劑減弱了所述Hu-Asp多肽的活性。該種與Hu-Asp多肽一起進行的測試可以在無細胞系統(tǒng)中也可以在表達Hu-Asp的培養(yǎng)細胞中及其衍生體或變體進行。
在另一實施例中，本發(fā)明涉及到一種新的細胞系(HEK125.3細胞)以測量淀粉樣蛋白β肽(Aβ)從淀粉樣蛋白蛋白前體(APP)發(fā)生的進程。這些細胞都是來自人類胚胎腎293細胞(HEK293)的穩(wěn)定的轉化子，其具有一種雙順反子載體其獲自含有一種修飾的人類APP cDNA，一種內(nèi)部核糖體進入位點及在另一種順反子上的一種增強的綠色熒光蛋白(EGFP)cDNA的pIRES-EGFP(Clontech)，APP cDNA通過在一APP編碼序列的羧基末端上加入兩個賴氨酸密碼子來進行修飾，這樣一來其提高了來自人類APP的Aβ肽2-4倍。Aβ肽的處理水平相比較未轉化的HEK293細胞提高了60倍。HEK125.3細胞將對分析抑制Aβ肽的處理過程的組合物來講是有用的。本發(fā)明同樣也包括了在APP的另一同工型包括751及770氨基酸同工型的C末端增加兩個賴氨酸殘基，或在具有人類AD發(fā)現(xiàn)的突變(包括瑞典KM→NL及V717→F的突變)的APP的同工型的C末端增加兩個賴氨酸殘基，在APP片段的C末端增加兩個賴氨酸殘基，例如那些以β分泌酶切割位點開始APP片段的C末端，及在含有β分泌酶切割位點(其可以被連接到一種N端信號肽上以進行膜插入或分泌)的APP片段的C末端增加兩個賴氨酸殘基，及一種APP片段的C末端(其可以被連接到一種N端信號肽上以進行膜插入或分泌及一種信號序列(包括但并不限于綠色熒光蛋白或者堿性磷酸脂酶這樣β分泌酶切割就會從表達該多肽的細胞表面釋放該信號蛋白)上)增加兩個賴氨酸殘基。
上文已對本發(fā)明作了概括性描述，通過下文的實施例將對本發(fā)明有更進一步的理解，提供這些實施例是為了說明本發(fā)明而非進行任何限制。
實施例實施例1可用于在Wormpep12中進行C.elegans天冬氨酰蛋白酶基因及天冬氨酰蛋白酶的鑒別的搜尋規(guī)則系統(tǒng)的發(fā)展材料和方法一般的天冬氨酰蛋白酶例如胃蛋白酶及血管緊張肽原酶具有兩個結構域結構，該結構的折疊可使活性位點中的兩個天冬氨酰殘基成為鄰近殘基。它們包埋在短的三肽基序DTG中，或更為罕見地包埋于DSG。DTG或者DSG活性位點基序出現(xiàn)在酶的大約25-30個氨基酸殘基之間，而酶原中(凝乳酶原，胃蛋白酶原)為約65-70個氨基酸殘基之間。該基序再一次出現(xiàn)在酶的下游大約150-200個氨基酸殘基之間。通過切除N端前結構域激活該酶原。下面的橫式例示了通過基因復制及趨異明顯引發(fā)的天冬氨酰蛋白酶的雙重結構域結構NH2-----X-----D25TG-----------Y---DY+25TG--------------------CX表示酶的開始，位于N末端前結構域之后，Y表示分子中心在這里基因再一次重復開始。
就逆轉錄病毒酶，例如HIV蛋白酶而言，它們僅具備眾所周知的蛋白酶如胃蛋白酶，組織蛋白酶D，血管緊張肽原酶等的二結構域結構的一半。它們無前體節(jié)段(prosegment)，而是從含有病毒gag及pol蛋白的多蛋白前體中切割出來，其可以被表示為NH2---------D25TG------------------C100這種″單體″僅具有約100個氨基酸，因此與其它的前結構域不計在內(nèi)的N端氨基酸具有330個左右氨基酸的天冬氨酰蛋白酶二聚物相比是極為節(jié)省的。
真核天冬氨酰蛋白酶活性位點基序的有限長度對于為搜尋收集新序列的EST來說是很困難的。典型地EST序列平均長為250個核苷，因此在這種情況下不可能橫跨兩個天冬氨酰蛋白酶活性位點的基序。作為替代，如果我們轉向C.elegans基因組。C.elegans基因組估計含有大約13,000個基因。當然，大約有12,000個被測序，而其相應的假定閱讀框(ORF)被放置于數(shù)據(jù)庫Wormpep12中。我們使用這個數(shù)據(jù)庫作為對高等真核生物新型天冬氨酰蛋白酶的整個基因組瀏覽的基礎。所使用的方法為我們開發(fā)專門用于此目的的運算法則。下面的這個AWK程序(其專門用于定位含有兩個DTG或DSG基序的蛋白)被用來作為搜尋，其可以被重復四次以恢復天冬氨?；虻某呻p聯(lián)合。BEGIN{RS＝″>″} /*defines″＞″as record separator for FASTA format*/{pos＝index($0，″DTG″) /*finds″DTG″in record*/if(pos>0){rest＝substr($0，pos+3)/*get rest of record after first DTG*/pos2＝index(rest，″DTG″) /*find second DTG*/if(pos2>0)printf(″％s％s\n″，″>″，$0)} /*report hits*/}}上述的AWK程序被用于搜尋Wormpepl2，其可以從下列網(wǎng)址進行下載fttp.sanger.ac.uk/pub/databases/wormpep，該序列至少含有兩個DTG或DSG基序。使用AWK限制每一記錄為3000個特征或更少。這樣，35個左右大的記錄從Wormpep12中手工進行刪除因為不管在什么情況下其都不可能編碼天冬氨酰蛋白酶。
結果及討論Wormpep12數(shù)據(jù)庫具有12,178個記錄，盡管其中有些(＜10％)代表來自相同基因的可選擇性剪接轉錄子。估計在C.elegans基因組中的編碼基因數(shù)量為13,000個，因此，Wormpepl2可被估計為覆蓋了C.elegans基因組的大于90％的基因組。
真核天冬氨酰蛋白酶含有一種雙結構域結構，其大概源自祖先基因的復制。每一種結構域都含有活性位點基序D(S/T)G其位于每一結構域的20-25個氨基酸殘基之間。逆轉錄病毒(例如.，HIV蛋白酶)或者反轉座子蛋白酶都為亞基的同聚二聚體，其與單一的真核天冬氨酰蛋白酶結構域有一定的同源性。一種AWK程序被用于搜尋Wormpep12數(shù)據(jù)庫以找出這樣的蛋白其中D(S/T)G基序至少出現(xiàn)兩次。這樣鑒別出超過60個蛋白質具有兩個DTG或者DSG基序。病毒檢測被用于選擇蛋白其中天冬氨酰結構域的位置被提示為一種雙結構域的結構滿足上述的機理。
此外，PROSITE真核及病毒天冬氨酰蛋白酶活性位點模式PS00141被用于搜尋Wormpep12數(shù)據(jù)庫以找出候選的天冬氨酰蛋白酶(Bairoch A.，Bucher P.，Hofmann K.，PROSITE數(shù)據(jù)庫其1997年狀況，核酸研究.24217-221(1997)).其產(chǎn)生了一種與Wormpep12一樣的序列，當然，這7個序列含有兩個DTG或者DSG基序及PROSITE天冬氨酰蛋白酶活性位點模式。其中三個發(fā)現(xiàn)在同一裝配性質?？寺≈?F21F8.3，F(xiàn)21F8.4，及F21F8.7)啟示其代表了一種因祖先基因復制而激活的蛋白質家族。其它兩個具有與F21F8.3，F(xiàn)21F8.4及F21F8.7有很強同源性的ORFs位于相同的基因簇(F21F8.2及F21F8.6)中，然而，其僅僅含有一種DTG基序。在Wormpep12數(shù)據(jù)庫中進行更為詳盡的BLAST搜索這7個序列并未發(fā)現(xiàn)在C.elegans基因組(含有兩個重復序列DTG或DSG基序)中其它的候選天冬氨酰蛋白酶。
用BLASTX在SWISS-PROT，GenPep及TREMBL中搜尋每一種C.elegans序列揭示出R12H7.2為與哺乳動物天冬氨酰蛋白酶同源的最為接近的蠕蟲，T18H9.2為有稍微遠一點的相關性，而CEASP1，F(xiàn)21F8.3，F(xiàn)21F8.4，及F21F8.7形成了一種亞簇其序列與哺乳動物序列同源性最低。
討論APP，早老蛋白(presenilins)，及p35，cdk5的活化劑，所有都要經(jīng)歷胞內(nèi)蛋白酶水解，在該位點上遵循HIV蛋白酶底物特異性的特點。因此，具有相同的底物特異性的胞內(nèi)天冬氨酰蛋白酶的調控紊亂，可能為提供了一種AD中的和混亂病理的統(tǒng)一機制。因此，我們著力去辨別新的人類天冬氨酰蛋白酶。在C.elegans中進行的全基因組搜尋辨別出7個開放閱讀框，其附于我們已經(jīng)鑒別出的天冬氨酰蛋白酶譜上。這7個天冬氨酰蛋白酶可能包含有在一種簡單的，多細胞真核生物中的該蛋白酶完整的互補序列。其包括4個唯一于C.elegans(其可能因祖先基因的復制而激活)的4個最為接近相關的天冬氨酰蛋白酶。其它三個候選的天冬氨酰蛋白酶(T18H9.2，R12H7.2及Cl1D2.2)被發(fā)現(xiàn)具有與哺乳動物基因序列的同源性。
實施例2通過基因組橋連用數(shù)據(jù)庫Mining來鑒別新型的人類天冬氨酰蛋白酶材料和方法EST數(shù)據(jù)庫，cDNA，及推測的多肽序列的計算機輔助分析用CEASP1，F(xiàn)21F8.3，F(xiàn)21F8.4，及F21F8.7序列對EST數(shù)據(jù)庫進行詳盡的同源性檢索并未發(fā)現(xiàn)任何新的哺乳動物的同源物。TBLASTN用R12H7.2搜索顯示其與組織蛋白酶D，組織蛋白酶E，胃蛋白酶原A，胃蛋白酶原C及血管緊張肽原酶有很強的同源性，尤其是在活性位點的DTG基序左右，但并未識別出其它額外的新的哺乳動物細胞的天冬氨酰蛋白酶。這顯示了C.elegans基因組可能僅含有一種單鏈的溶酶體天冬氨酰蛋白酶其在哺乳動物細胞中為一種基因族所表現(xiàn)并通過一種祖先基因的復制及隨之產(chǎn)生的修飾而激活。
TBLASTN用T18H9.2進行搜索，剩余的C.elegans序列，辨別出幾個ESTs其被裝配進入一種編碼一新型人類天冬氨酰蛋白酶(Hu-Asp1)的鄰近序列群。正如上述實施例1所述，用Hu-Asp1的鄰近序列群進行的BLASTX搜索SWISS-PROT發(fā)現(xiàn)序列的活性位點基序與其它的天冬氨酰蛋白酶的活性位點排列成一行。詳盡的，反復地進行BLASTN搜索LifeSeq，LifeSeqFL，及公開的EST收集物，從已被裝配進入一單鏈鄰近序列群的多倍CDNA文庫中鑒別出102EST。發(fā)現(xiàn)于公開EST收集物中的該鄰近序列群的51序列同樣亦被基因組研究學院(TIGR)裝配進入一單鏈鄰近序列群(THC213329)。該TIGR的注解顯示其并未發(fā)現(xiàn)在鄰近序列群的數(shù)據(jù)庫中有所要尋找的序列。注意TIGR鄰近序列群是我們所裝配的LifeSeq鄰近序列群的反義互補。用Hu-Asp1在ZooSeq中進行BLASTN搜索鼠類EST序列發(fā)現(xiàn)在每一數(shù)據(jù)庫中有一種同源性的EST(分別是Incyte clone 700311523及IMAGE clone313341，GenBank序列號W 10530，)。
用裝配的編碼Hu-Asp1的DNA序列進行TBLASTN搜索LifeSeqFL及公開的EST數(shù)據(jù)庫顯示出另一種相關的人類序列(Hu-Asp2)其用一單鏈EST(2696295)來體現(xiàn)。該部分CDNA序列的翻譯揭示出一種單鏈DTG基序其與一牛天冬氨酰蛋白酶(NM 1)的活性位點基序具有同源性。
BLAST搜索鄰近序列群集合及多倍序列集合可以通過使用來自Incyte的LifeSeq，LifeSeqFL及LifeSeq的裝配數(shù)據(jù)庫所提供的生物信息學工具來完成。推測蛋白基序可以通過使用ProSite文(Motifs in GCG 9)庫或者Pfam數(shù)據(jù)庫來鑒別。
Hu-Asp1的全長cDNA克隆C.elegans的基因T18H9.2CE的開放閱讀框被用于搜索IncyteLifeSeq及LifeSeq-FL數(shù)據(jù)庫，檢測到一單電子集合1863920CE1。5’端更多的cDNA克隆位于這個鄰近序列群1863920，其獲自Incyte且兩條鏈已被完全測序。含有克隆1863920的開放閱讀框的翻譯揭示出復制的天冬氨酰蛋白酶的活性位點基序(DTG/DSG)的存在但5’末端卻是不完整的。Hu-Asp1編碼序列的殘余物可通過使用一種人類胎盤制備的cDNA模板(Clonetech)由5’Marathon RACE分析進行測定。一種為5’末端克隆1863920特異性的3’-反義寡聚核苷酸引物與在PCR中為Marathon制備cDNA調節(jié)子特異性的5’-有義引物進行配對。特異的PCR產(chǎn)品通過循環(huán)測序被直接序列化且結果產(chǎn)生裝配有克隆1863920序列以產(chǎn)生完整的Hu-Asp-1(SEQ ID No.1)的編碼序列的序列。
幾個相關特征都已體現(xiàn)在Hu-Asp1的原始的氨基酸序列中(圖1，SEQ IDNo.2)。該序列包括一種信號肽(SEQ ID No.2中的殘基1-20)，一前體節(jié)段，及一種含有天冬氨酰蛋白酶的活性位點基序(DTG/DSG)的兩個拷貝的酶促結構域。第一種及第二個活性位點基序之間的間隔大約為200個殘基其符合所期望的單個真核天冬氨酰蛋白酶結構域的大小。更為相關的是，該序列包含一種靠近C端的所期望的橫跨膜的結構域(SEQ ID No.2中的殘基469-492)其提示該蛋白酶是鑲嵌在膜上的。該特征在其它的天冬氨酰蛋白酶上并未發(fā)現(xiàn)。
Hu-Asp2的全長cDNAs克隆正如實施例1所述的那樣，Caenorhabditis elegans的為推定的天冬氨酰蛋白酶數(shù)據(jù)庫WormPep12基因組大范圍掃描并降低了人類EST數(shù)據(jù)庫揭示了一種人類與C.elegans基因T18H9.2的定向進化同源基因其這里所指為Hu-Asp1。裝配的Hu-Asp1的鄰近序列群通過使用BLAST搜索工具在人類EST數(shù)據(jù)庫中被用于調查人類平行進化同源基因結果與Lifeseq FL數(shù)據(jù)庫相比較有大約60％的同源性其具有一定的匹配性(2696295CE1)。相同的調查對或者gb105PubEST或者可能來自TIGR人類數(shù)據(jù)庫家族并未發(fā)現(xiàn)相似的EST克隆。CDNA克隆2696295，辨別于一來自人類子宮cDNA文庫的單鏈繼代序列分析，其獲自Incyte雙鏈的完整序列。該克隆包括一種不完整的1266個bp的開放閱讀框其編碼一種422個氨基酸多肽但在5’末端缺乏一種起始密碼子ATG。檢查推測序列顯示復制的天冬氨酰蛋白酶的活性位點基序(DTG/DSG)的存在，其被194個氨基酸殘基分開。隨后檢索LifeSeq EST數(shù)據(jù)庫的后期版本發(fā)現(xiàn)一種額外的ESTs序列，其來自人類天冬氨酰cDNA文庫(4386993)，其表現(xiàn)出含有額外的與克隆2696295相關的5’末端序列。克隆4386993獲自Incyte及雙鏈具有完整序列。對克隆4386993及克隆2696295進行比較分析證實克隆4386993用31個氨基酸殘基(包括兩個基本點框內(nèi)翻譯起始密碼子)擴展了開放閱讀框。盡管兩個框內(nèi)密碼子ATGs的存在，在ATG的下游并未發(fā)現(xiàn)框內(nèi)終止密碼子，這說明4386993并非全長。此外，克隆2696295及4386993的序列比較揭示了于發(fā)現(xiàn)相對于克隆4386993克隆2696295的插入75個堿基對中因而25個額外氨基酸殘基插入進克隆2696295中。Hu-Asp2編碼序列的余值可以通過使用一人類海馬Marathon制備cDNA模板用5’Marathon RACE分析進行測定。一種特異于所共享的克隆2696295及4386993的3’-反義寡聚核苷酸引物與一種特異于在PCR中Marathon制備cDNA合成的調節(jié)子的5’-有義引物進行配對。具體的PCR產(chǎn)品可通過循環(huán)序列化進行直接測序，結果用克隆2696295及4386993的序列裝配的最終序列分別產(chǎn)生了一種完整的編碼Hu-Asp2(a)(SEQ ID No.3)及Hu-Asp2(b)(SEQ ID No.5)的序列。
幾個相關特征列于Hu-Asp2(a)(圖2及SEQ ID No.4)及Hu-Asp-2(b)(圖3，SEQ ID No.6)的原始氨基酸序列中。這兩個序列都含有一種信號多肽(在SEQ ID No.4及SEQ ID No.6中的殘基1-21)，一種前體節(jié)段，及一種含有兩個天冬氨酰蛋白酶活性位點基序(DTG/DSG)的兩個拷貝的酶促結構域。第一種及第二個活性位點基序之間的間隔因為在Hu-Asp-2(b)中25個氨基酸殘基的刪除而有所變化，Hu-Asp2(b)及Hu-Asp-2(a)中分別含有168及194個氨基酸殘基。更為相關的是，兩個序列都含有一接近C末端的推測的橫跨膜功能域(在SEQ ID No.4中的殘基455-477及在SEQ ID No.6中的殘基430-452)其啟示該蛋白酶鑲嵌于膜上。該特征在除了Hu-Asp1外的其它種的天冬氨酰蛋白酶中并未發(fā)現(xiàn)。
實施例3鼠Asp2 cDNA及基因組DNA的分子克隆，鼠類Asp2 cDNA的克隆及特征分析鼠類動物的Hu-Asp2的定向進化同源基因使用重組cDNA文庫篩選，PCR，及基因組克隆進行克隆。來自鼠大腦cDNA文庫的大約500,000個獨立的克隆通過使用32P標記的編碼序列探針(用Hu-Asp2制備)進行篩選。按照DNA序列分析進行正鏈復制，最長的cDNA含有3’端未翻譯的全部區(qū)域及編碼區(qū)的47個氨基酸。先經(jīng)過DNA序列分析，用特異于上面測定的5’端最多的cDNA序列的反義寡聚核苷酸引物及特異于人類5’端Asp2序列的有義引物對相同的鼠腦cDNA文庫進行PCR擴增以提供一種980個bp的編碼序列。鼠類Asp-2的5’端序列的殘余起源于基因組序列(參見下文)。
鼠類Asp-2基因的分離及序列分析---------編碼鼠類Asp2 cDNA一部分的鼠類EST序列通過使用BLAST搜索工具及Hu-Asp2編碼序列作為調查以在GenBank EST數(shù)據(jù)庫中進行鑒別。克隆g3160898與超過352個bp的人類序列顯示出88％的同源性。與鼠類Asp2的該區(qū)域特異性配對的寡聚核苷酸引物被合成且用于擴增鼠類基因的所述區(qū)域。鼠類基因組DNA，來自種屬129/SvJ，其用PCR進行擴增(25個循環(huán))，其使用特異于鼠類Asp2的不同引物對及并用瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)品進行分析。引物對Zoo-1及Zoo4擴增了一種750個bp的片段其基于與已知的cDNA序列進行的比較含有大約600個bp的內(nèi)含子序列。該引物對然后被用于通過PCR篩選一種鼠類BAC文庫，單個基因組克隆被分離及該克隆通過DNA序列分析被證實含有鼠科動物Asp2基因。該Asp2基因組克隆的ShotgunDNA序列測定及與Hu_Asp2的cDNA序列及被全長鼠類Asp2序列(SEQ ID No.7)所測定的部分鼠類cDNA序列進行比較。該推測的鼠類Asp2的氨基酸序列(SEQ ID No.8)顯示出相比較人類序列(圖4)與18/501氨基酸殘基取代有96.4％的同源性(GCG最佳配對運算法則)。
實施例4Hu-Asp2轉錄表達的組織分布材料和方法Hu-Asp2表達的組織分配可以通過使用獲自Clonetech(Palo Alto，CA)的多倍體組織RNA印跡法來進行測定。在載體pINCY中的Incyte克隆2696295用EcoRI/NotI進行消化，插入1.8kb cDNA，用制備型瓊脂糖凝膠電泳進行純化。該片段被熒光標記至一特定的活性其大于1×109dpm/μg，在[a-32P-dATP](＞3000Ci/mmol，Amersham，Arlington Heights，IL)及DNA多聚酶I的Klenow片段的存在下經(jīng)過任意引導，從不同人類組織分離的尼龍膜過濾的含有變性的，大小分級分離的多聚A+RNAs與2×106dpm/ml的探針在ExpressHyb緩沖液(Clonetech，Palo Alto，CA)中，在68℃下進行雜交1個小時，然后通過推薦的手工方法進行洗滌。通過自動射線照射術(使用BioMax XR膠卷(Kodak，Rochester，NY))顯示雜交信號，并在-80℃下篩選鑒別。
結果和討論因為相對較少量的ESTs通過使用上述方法進行檢測，來自于數(shù)據(jù)庫分析的關于Hu-Asp2轉錄表達的組織分配的信息是很有限的(＜5)。在獲得Hu-Asp2基因表達的更多的信息的努力中，應用Northern分析進行測定Hu-Asp2轉錄子的大小和數(shù)量。經(jīng)過在變性環(huán)境下分離，分離自一系列外周組織及腦組織的PolyA+RNAs被顯示于一固體支持物上，Hu-Asp2轉錄子通過高度嚴格雜交條件下雜交一來自于克隆2696295的熒光標記插入物而被顯現(xiàn)。該2696295 cDNA探針顯現(xiàn)出一轉錄子群其中表面尺寸為3.0kb，4.4kb及8.0kb的轉錄子共移動，其中后兩者為最豐富的。
經(jīng)過組織學調查，Hu-Asp2轉錄子在胰腺及腦組織中是最為豐富的，在其它所檢測的組織中除了胸腺及PBLs其含量雖低但是還可以達到可測量的水平。假定在腦組織中的Hu-Asp2轉錄子的相對含量，腦組織的區(qū)域表達也是可以建立的。一相似尺寸的轉錄子群在所檢測的腦區(qū)的所有區(qū)域都是可以檢測到的。[小腦，大腦皮層，枕骨柱，腦前葉，顳葉，及大腦皮層]，在骨髓及脊柱中有最高的含量。
實施例5在人類細胞系中對Hu-Asp-1及Hu-Asp-2轉錄子進行RNA印跡檢測對多種人類細胞系進行測試以測定其產(chǎn)生Hu-Asp1及Hu-Asp2 mRNA的能力。人類胚胎腎(HEK-293)細胞，非洲綠猴(Cos-7)細胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，HELA細胞，及成神經(jīng)瘤細胞系IMR-32都獲自ATCC。除了CHO細胞保持在α-MEM/10％FCS外，其它細胞被培養(yǎng)在含有10％FCS的DME中，在37℃下，5％的CO2下直到幾近鋪滿。洗過的細胞單層，(3×107)被溶解在盤中，使用Qiagen Oligotex介導的信使RNA試劑盒抽提poly A+RNA。來自每一細胞系的含有2μg polyA+RNA的樣品在變性條件下分餾(乙二醛處理)，通過毛細管作用轉移到一種固體尼龍膜支持物上，通過與任意引導標記(32P)(獲自Hu-Asp1或Hu-Asp2的編碼序列探針)雜交使轉錄子發(fā)生顯色反應。通過暴露于X射線膠卷檢測到放射性信號，然后使用磷光計進行圖象分析。
Hu-Asp1 cDNA探針顯示出一種相似的轉錄子群(2.6kb及3.5kb)其先前在人類組織器官中被檢測到過。放射性信號定量分析測定其相對含量為Cos-7＞HEK292＝HELA＞IMR32。
Hu-Asp2 cDNA探針與組織相比較同樣也顯示出一種相似的轉錄子群(3.0kb，4.4kb，及8.0kb)，其具有下列相對含量HEK293＞Cos7＞IMR32＞HELA。
實施例6修飾APP以增加Aβ處理用于體外篩選從APP中加工Aβ肽的人類細胞系提供了一種方法其可以以胞內(nèi)實驗篩選β-分泌酶及γ-分泌酶的抑制物。Aβ肽的生產(chǎn)及釋放進入培養(yǎng)物上清液中可以通過酶聯(lián)免疫試驗(EIA)進行調控。盡管APP的表達有很寬的范圍，不管是神經(jīng)細胞系或非神經(jīng)細胞系都處理及釋放Aβ肽，內(nèi)生APP的處理水平卻是很低的且不容易為EIA所檢測到。Aβ肽的處理過程可以通過在APP突變的轉化細胞系中表達以進行提高，我們突然也發(fā)現(xiàn)到在APP695的羧基末端增加兩個賴氨酸殘基可以提高Aβ肽的處理過程，這就允許我們制造了一種轉化細胞系其釋放Aβ肽進入培養(yǎng)物上清液中達到一種顯著的水平，20,000pg/ml。
材料和方法材料人類胚胎腎細胞系293(HEK293細胞)由內(nèi)部獲得，載體pIRES-EGFP購自Clontech。使用聚合酶鏈反應(PCR)的進行突變的寡聚核苷酸0購自Genosys。含有人類APP695的質粒(SEQ ID No.9[核苷]及SEQ ID No.10[氨基酸])獲自西北大學醫(yī)學院。其在Not1位點被亞克隆進p5K(Stratagene)以產(chǎn)生一種質粒APP695。
誘變方法通過使用Stratagene快速誘變試劑盒將瑞典突變(K670N，M671L)引入pAPP695制備出所述質粒pAPP695NL(SEQ ID No.11[核苷]及SEQ IDNo.12[氨基酸])。為了在APP695的C末端引入一種雙賴氨酸基序。向前的引物#276 5’GACTGACCACTCGACCAGGTTC(SEQ ID No.47)被用于使用一種″補丁″引物#2745’CGAATTAAATTCCAGCACACTGGCTACTTCTTGTTCTGCATCTCAAAGAAC(SEQ ID No.48)及一種側面引物#275 CGAATTAAATTCCAGCACACTGGCTA(SEQ ID No.49)以修飾APP695 cDNA的3’末端(SEQ ID No.15[核苷]及SEQ ID No.16[氨基酸])。其同樣加入一種BstXl限制酶切位點其與在pIRES-EGFP的多克隆位點的BstXl位點是相匹配的。用一種Clontech HF Advantage cDNA PCR試劑盒進行PCR擴增，使用廠商提供的多聚酶混合物及緩沖液。對于″補丁″PCR，所使用的修補引物的濃度為側面引物的摩爾濃度的1/20。PCR擴增產(chǎn)品通過使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)來進行純化。經(jīng)過用限制性酶進行消化，該產(chǎn)品在0.8％的瓊脂糖凝膠中進行分離。然后用QIAquick凝膠抽提試劑盒(Qiagen)進行純化。
為了重新形成一種修飾的APP695-Sw cDNA，APP695-Sw cDNA的5’端Not1-Bg12片段及獲自PCR的APP695 cDNA的3’端Bg12-BstXl片段被共同接入在Not1及BstXl位點打開的pIRES-EGFP質粒DNA中。使用快速DNA結合試劑盒(Boehringer Mannheim)在室溫下結合5分鐘，然后轉化進入一種LibraryEfficiency DHSa Competent細胞中去(GibcoBRL Life Technologies)。使用引物#276及#275通過PCR擴增對細菌菌落進行篩選插入。使用一種QIAprep Spin Miniprep試劑盒(Qiagen)進行哺乳動物細胞轉染使得質粒DNA純化。所獲得的構建體被命名為pMG125.3(APPSW-KK，SEQ IDNo.17[核苷]及SEQ ID No.18[氨基酸])。
哺乳動物細胞轉染用于轉染的HEK293細胞在Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)中經(jīng)過使用10％牛胎血清被培養(yǎng)至80％匯合點處，使用LipofectAmine(Gibco-BRL)進行共轉染。用3μg的pMG125.3 DNA及9μg的pcDNA3.1 DNA每10×106個細胞。轉染后三天，細胞在400μg/ml的濃度下經(jīng)過一含有G418的培養(yǎng)基。在選擇性培養(yǎng)基中經(jīng)過三天生長，細胞因其熒光被分類篩選。
通過FACS克隆選擇125.3細胞在一種為空調氬激光所提供的裝備有488nm激發(fā)線的EPICS EliteESP流體細胞記數(shù)器(Coulter，Hialeah，F(xiàn)L)中對細胞樣品進行分析，EGFP的釋放可以通過一種525nm的袋狀過濾膜進行測量，經(jīng)過向前或向右角度的光散射來調控該成活細胞后，熒光強度被展示于一種4的十進制的對數(shù)的范圍內(nèi)。單一的綠色細胞被分離至一種96孔平板(其含有生長培養(yǎng)基并沒有G418)的每一孔中。經(jīng)過一種4天的恢復期，G418被加入到該培養(yǎng)基中至一最終濃度為400μg/ml。經(jīng)過選擇，32％的孔含有擴展的菌落。具有菌落的孔從96孔平板上轉移到一種24孔平板上，然后至一具有快速生長菌落(其被選于在每一通道處進行擴展)的6孔平板上。最終所選擇的細胞系為以最快速度生長的最后6個生長的細胞)。該菌落，其被命名為125.3，已被保存在G418以400μg/ml的濃度，每4天換入一新鮮的培養(yǎng)基。經(jīng)過23次傳代后，并未發(fā)現(xiàn)EGFP熒光的Aβ產(chǎn)品有任何損失。
AβEIA分析(雙重抗體夾心ELISA分析hAβ1-40/42)經(jīng)過轉染后48小時，收集細胞培養(yǎng)物上清液，并以下述標準的AβEIA方法進行分析。在一種雙抗體夾心ELISA中，人類A1-40或者1-42使用單克隆抗體(mAb)6E10(Senetek，St.Louis，MO)及生物素化的兔抗血清162或者164(紐約州立基礎研究所，Staten Island，NY)進行測量。捕獲抗體6E10特異性針對呈現(xiàn)其在hAβN端氨基酸殘基1-16上的抗原表位。綴合的檢測抗體162及164，其分別特異于hAβ140及142。簡而言之，一種NuncMaxisorp 96孔免疫平板上涂覆100μg/孔的mAb 6E10(5μg/ml)，稀釋于0.1M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液，pH9.6及在40℃下過夜培養(yǎng)。通過用含有0.05％of Tween-20(DPBST)的3倍的0.01M DPBS(來自Pierce，Rockford，IIModified Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水(0.008M磷酸鈉，0.002M磷酸鉀，0.14M氯化鈉，0.01M氯化鉀，pH7.4))洗滌平板，該平板用200μl的10％的在0.01MDPBS中的正常綿羊血清(Sigma)封閉60分鐘，以避免非特異性結合。洗滌平板后加入人類Aβ1-40或者1-42的標準品100μl/孔(Bachem，Torrance，CA)(由在DMSO中的1mg/ml的儲備溶液用培養(yǎng)基稀釋)及100μl/孔的樣品，例如，轉染細胞的條件培養(yǎng)基。該平板在室溫下培養(yǎng)2小時及4℃下過夜保存。第二天，在洗滌平板后，加入100μg/孔的生物素化的兔抗血清162 1∶400或者1641∶50稀釋于DPBST+0.5％BSA，在室溫下培養(yǎng)1小時15分鐘。洗滌后，加100μg/孔的中性抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶(Pierce，Rockford，II)(在DPBST中稀釋10,000倍)，在室溫下培養(yǎng)1小時。經(jīng)過最后一次洗滌100μg/孔的鄰苯二胺二鹽酸化物(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)，在50mM的檸檬酸/100mM磷酸鈉緩沖液(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)，pH5.0中，作為底物加入，在一種運動的微量平板閱讀儀上使用Soft max Pro軟件，監(jiān)控顏色變化20分鐘。所有的標準品和樣品都以一式三份操作。吸收值落入標準曲線內(nèi)的樣品通過使用Soft max Pro軟件由標準曲線進行外推且以pg/ml培養(yǎng)基來表示。
結果在APP695的C末端增加兩個賴氨酸殘基可以極大地提高在HEK293細胞中的Aβ處理過程，正如瞬時表達(表1)所顯示的那樣。在APP695中增加二賴氨酸基序可使Aβ加工提高到在含有瑞典突變的APP695中所看到的那樣。將二賴氨酸基序與瑞典突變結合可以將處理過程再提高2.8倍。
HEK293細胞與pMG125.3及pcDNA3.1的共轉染可以允許對于G4 18抗性的轉化細胞的雙重選擇及EGFP的高水平表達。通過用FACS進行克隆選擇，經(jīng)過在24孔平板上培養(yǎng)36小時所獲得的細胞系產(chǎn)生了一種極高的在每毫升的培養(yǎng)基中的20,000pg的Aβ肽。在不同生長條件下Aβ肽的產(chǎn)量總結于表2中。
表1.HEK293細胞經(jīng)過與含有野生型或者修飾的APP的指定載體進行瞬時轉染后48小時Aβ肽向培養(yǎng)基中的釋放量。表列值為使用學生t-測試來估計不等方差的逐對比較的平均值+SD及P-值。
APP結構 Aβ1-40多肽提高的倍數(shù) P-值(pg/ml)pIRES-EGFP載體147+28 1.0wtAPP695(142.3) 194+15 1.3 0.051wtAPP695-KK(124.1)424+34 2.8 3×10-5APP695-Sw(143.3) 457+65 3.1 2×10-3APP695-SwKK(125.3)1308+98 8.9 3×10-4表2.在不同生長條件下Aβ肽從HEK293細胞中的釋放量培養(yǎng)平板類型 培養(yǎng)基體積 培養(yǎng)時間 Ab1-40 Ab1-42(pg/ml) (pg/ml)24孔平板 400μl 36小時 28,036 1,439實施例7在HEK125.3細胞中加工Aβ肽的反義低聚物抑制為了選擇目標序列及使用專利技術(Sequitur Ver.D Pat pending#3002)設計第二代嵌合反義低聚體，向Sequitur，Inc(Natick，MA)提供Hu-Asp1及Hu-Asp2序列。批號為S644，S645，S646及S647的反義低聚體被作為Asp1的目標靶，批號為S648，S649，S650及S651的反義低聚體被作為Asp2的目標靶。批號為S652，S653，S655，及S674的對照反義低聚體被作為不相關基因的目標靶，批號為S656，S657，S658，及S65的反義低聚體被作為另一種不相關基因的目標靶。
為了用反義低聚體進行轉染，HEK125.3細胞被培養(yǎng)至以補充有10％牛胎血清的最少必需量的培養(yǎng)基(MEM)的6孔平板的50％覆蓋度。2mg/mloligofectin G(Sequitur Inc.，Natick，MA)的儲備液在無血清MEM中被稀釋至50μg/ml單獨地，在Opti-MEM(GIBCO-BRL，GrandIsland，NY)中，100μM的反義低聚體儲備液被稀釋至800nM。oligofectin G及反義低聚體被稀釋的儲備液以1∶1的比例進行混合，然后在室溫下進行溫育。經(jīng)過15分鐘后，該試劑被稀釋10倍進入含有10％牛胎血清的MEM中，經(jīng)過第一次轉移掉舊的培養(yǎng)基后，在六孔平板上每一孔加入上述2ml稀釋的試劑。轉染后，細胞依然在oligofectin Glantisense低聚體的存在下進行繼續(xù)培養(yǎng)。為了調控Ab多肽的釋放，從轉染結束后24小時開始，400μl條件培養(yǎng)基定期從培養(yǎng)孔中移去，取而代之以新鮮的培養(yǎng)基。所報道的數(shù)據(jù)來自培養(yǎng)結束后48小時收獲的培養(yǎng)物上清液。
結果獲自Sequitur Inc的16個不同的反義低聚體分別被轉染進入HEK125.3細胞以測定其對Aβ肽處理過程所產(chǎn)生的效果。只有標定Asp1及Asp2的反義低聚體減少了Aβ肽的處理過程，其中含有標定Asp2的反義低聚體的HEK125.3細胞具有更強的抑制效果。Aβ(1-40)及Aβ(1-42)都以相同的程度被抑制。在表3中，百分比抑制度可以通過與未轉染細胞相比較來計算。提供大于50％制度的反義低聚體試劑用一種星號來進行標記。在所測試的試劑中，標定Asp1的反義低聚體的4個中的3個給出了一種對于Aβ(1-40)處理的平均52％的抑制度，及對于Aβ(1-42)處理的平均47％的抑制度。對于ASP2，4個反義低聚體中的4個給出大于50％的抑制度，而對于Aβ(1-40)處理的平均62％的抑制度，及對于Aβ(1-42)處理的平均60％的抑制度。
表3.用反義低聚體處理的HEK125.3細胞中釋放的Aβ肽的抑制靶向的基因 反義低聚體 Aβ(1-40) Aβ(1-42)Asp1-1 S644 62％* 56％*Asp1-2 S645 41％* 38％*Asp1-3 S646 52％* 46％*Asp1-4 S647 6％ 25％Asp2-1 S648 71％* 67％*Asp2-2 S649 83％* 76％*Asp2-3 S650 46％* 50％*Asp2-4 S651 47％* 46％*Con1-1 S652 13％ 18％Con1-2 S653 35％ 30％Con1-3 S655 9％ 18％Con1-4 S674 29％ 18％Con2-1 S656 12％ 18％Con2-2 S657 16％ 19％Con2-3 S658 8％ 35％Con2-4 S659 3％ 18％實施例8在所培養(yǎng)細胞中Hu-Asp2β分泌酶活性的證明與早期發(fā)作阿爾茨海默氏疾病相關的APP的幾個突變已經(jīng)表現(xiàn)出可改變了Aβ肽的處理過程。其使得N-端及C-端切割位點側平以從APP釋放出Aβ肽。這些切割位點分別標為β-分泌酶及γ-分泌酶切割位點。APP在β-分泌酶切割位點的切割釋放出一種具有11,145道爾頓分子量的99個氨基酸的APPC末端片段。緊接β-分泌酶切割位點上游的瑞典突變KM→NL導致了Aβ肽的1-40及1-42的氨基酸結構的產(chǎn)量的提高。倫敦VF突變(在APP770同工型中V717→F)對于總的Aβ肽的產(chǎn)量卻鮮有影響，但是在APP處理過程中通過影響所使用的γ-分泌酶切割位點的選擇優(yōu)先提高了Aβ肽較長的1-42氨基酸結構的百分比含量，這樣，我們應該測定是否這些突變改變了由一與介導Hu-Asp2表達的結構共轉染的培養(yǎng)細胞所產(chǎn)生的Aβ肽的數(shù)量和類型。
做了兩個實驗其證明了在培養(yǎng)細胞中Hu-Asp2β-分泌酶的活性。在第-種實驗中，用介導如實施例7所述的Hu-Asp2轉錄子的反義低聚體處理HEK125.3細胞，結果發(fā)現(xiàn)其減少了由β-分泌酶(CTF99)(圖9)切割所形成的APPC端片段的數(shù)量。這也顯示了Hu-Asp2直接或間接地有利于β-分泌酶的切割。在另一實驗中，在已轉染的鼠Neuro2A細胞中Hu-Asp2的擴增表達表現(xiàn)出增加了CTF99β-分泌酶切割片段(圖10)的積累。當一含有一種C端兩個賴氨酸基序的突變的APP-KK菌落被用于轉染時該種增加可以很容易被發(fā)現(xiàn)。當Hu-Asp2與含有瑞典突變KM→NL的APP-Sw-KK共轉染可以看到其進一步的提高。瑞典突變已知可以提高β-分泌酶對APP的切割。
另一種實驗證明了Hu-Asp2有利于γ-分泌酶與人類胚胎腎HEK293細胞共轉染的實驗中的活性。Hu-Asp2與一種APP-KK菌落的共轉染極大地提高了來自HEK293細胞中的可溶性Aβ1-40及Aβ1-42多肽的產(chǎn)量及釋放量。Aβ1-42多肽更以成倍增加的量釋放。Aβ1-42多肽產(chǎn)量的進一步提高可以通過Hu-Asp2與APP-VF(SEQ D No.13[核苷]及SEQ D No.14[氨基酸])或者含有倫頓突變V717→F的APP-VF-KK SEQ D No.19[核苷]及SEQ D No.20[氨基酸])菌落的共轉染看到。V717→F突變已知可以改變APPγ-分泌酶切割的特異性以至于在Aβ42位點切割的可能性增加。這樣，Asp2直接或間接地有利于γ-分泌酶在β42位點對APP的切割。
材料抗體6E10及4G8購自Senetek(St.Louis，MO)?？贵w369獲自Rockefeller大學的Paul Greengard實驗室?？贵wC8獲自哈佛醫(yī)學院及伯明翰婦女醫(yī)院的Dennis Selkoe實驗室。
所使用的APP構建體用于轉染實驗的APP構建體包括下列APP野生型APP695(SEQ D No.9及No.10)APP-Sw 含有瑞典KM→NL突變的APP695(SEQ D No.11及No.12)，APP-VF 含有倫頓突變V→F的APP695(SEQ ID No.13及No.14)APP-KK 含有C末端KK基序的APP695(SEQ D No.15及No.16)，APP-Sw-KK 含有C末端KK基序的APP695-Sw(SEQ D No.17及No.18)，APP-VF-KK 含有C末端KK基序的APP695-VF(SEQ ID No.19及No.20).
通過PCR用合適的連接序列將上述結構在Not1及BstX1位點處插入到載體pIRES-EGFP(Clontech，Palo Alto CA)中。
在HEK293細胞，HEK125.3細胞及Neuro-2A細胞中的反義低聚體或質粒DNA結構的轉染人類胚胎腎細胞HEK293細胞及鼠Neuro-2a細胞使用來自Gibco/βRL的Lipofectamine Plus試劑用表達構建體進行轉染，細胞被培養(yǎng)在24孔組織培養(yǎng)平板上至70-80％匯合處的密度。其中每一平板上有4孔用2μg DNA(3∶1，APP∶共轉染子)進行轉染，8μl Plus試劑，及4μl在OptiMEM下的ipofectamine加入到一種總體積為1ml，平均每孔分配有200μl的體積，然后溫育3小時。小心保持兩種用于共轉染的質粒的比例及在轉染過程中的總的DNA的數(shù)量。轉染培養(yǎng)基用DMEM，10％FBS，NaPyruvate，及抗生素/抗真菌劑等來替代。細胞在正常條件下進行培養(yǎng)(37℃，5％CO2)48小時。該條件培養(yǎng)基被移至一聚丙烯試管中，在-80℃下儲存直到如前實施例所述的EIA分析Aβ1-40及Aβ1-42的內(nèi)容物。如實施例7所述那樣反義低聚體轉染進入HEK125.3細胞。
細胞提取物的制備，蛋白質印跡方法經(jīng)過與質粒DNA轉染60小時后收獲細胞。首先，細胞被轉移進入一種平板上的15-ml的圓錐試管，在1,500rpm下離心5分鐘以除去培養(yǎng)基。細胞沉淀用PBS洗滌一次。我們?nèi)缓笥眉毎芙饩彌_液(10mM HEPES，pH7.9，150mM NaCl，10％甘油，1mM EGTA，1mM EDTA，0.1mM釩酸鈉及1％NP-40)對細胞進行溶解。然后將裂解后的細胞混合物在5000rpm下離心，上清液作為提取物被儲存在-20℃溫度下。來自用Asp2反義低聚體轉染的HEK125.3細胞的同等量的提取物，對照實驗與抗體369(其可以識別APP的C端)一起離心。然后與抗體6E10一起進行免疫沉淀反應檢測出CTF99。使用C8(同樣可以識別APP的C末端的另一沉淀抗體)進行重復實驗。對于用Hu-Asp2及APP-KK，APP-Sw-KK，APP-VF-KK或者APP-VF進行共轉染的鼠類Neuro-2a細胞提取物的蛋白質印跡實驗，同等量的細胞提取物經(jīng)過4-10％或10-20％Tricine梯度凝膠(NOVEX，San Diego，CA)下進行電泳。全長APP及CTF99β分泌酶產(chǎn)品使用抗體6E10可以檢測到。
結果與用具有反向序列(Asp2-1反向及Asp2-2反向)的對照寡聚體類似轉移的細胞相比，用Asp2-1或者Asp2-2反義低聚體轉染HEK125.3細胞可減少CTFβ分泌酶產(chǎn)物的產(chǎn)量。在共轉染的實驗中，Hu-Asp2與APP-KK構建體共轉染進入鼠Neuro-2a細胞增加了CTF99的形成量。如果Hu-Asp2與APP-Sw-KK(含有可以提高β分泌酶處理的瑞典突變KM→NL的APP的一種變異體)進行共表達，CTF99的形成量可以進一步增加。
Hu-Asp2與APP的共轉染對于Aβ40產(chǎn)量鮮有影響但在上述條件下卻增加了Aβ42產(chǎn)量(表4)。在APP的C末端增加兩個賴氨酸基序將Aβ肽的處理過程提高了2倍，盡管Aβ40及Aβ42的產(chǎn)量保持在較低的水平(分別為352pg/ml及21pg/ml，)。Asp2與APP-KK的共轉染進一步提高了Aβ40及Aβ42的產(chǎn)量。Hu-Asp2刺激Aβ40使其產(chǎn)量提高了至少3倍，而使得Aβ42使其產(chǎn)量提高了至少10倍。這樣，Hu-Asp2與APP-KK構建體的共轉染優(yōu)先提高了Aβ42的產(chǎn)量。
APP的V717→F突變已被顯示增加了γ-分泌酶在Aβ42切割位點的處理進程。Hu-Asp2與APP-VF或APP-VF-KK結構的共轉染增加了Aβ42的產(chǎn)量(用APP-VF提高了2倍，用APP-VF-KK提高了4倍，表4)，但是對于Aβ40的產(chǎn)量有混合效果(使用APP-VF有輕微的減少，使用APP-VF-KK將其產(chǎn)量提高了2倍，相比較pcDNA共轉染對照組)。這樣，Asp2對于Aβ42產(chǎn)量的效果按比例增加結果導致Aβ42/總的Aβ的比例的增加。事實上，Aβ42/總的Aβ的比例在HEK293細胞(該細胞用Hu-Asp2及APP-VF-KK進行共轉染)中達到了一種非常高的值(42％)。
蛋白質印跡顯示HEK125.3細胞(用靶定Hu-Asp2 mRNA的反義低聚體進行轉染的細胞).所產(chǎn)生的CTF99產(chǎn)量的減少。(右)蛋白質印跡顯示出鼠Neuro-2a細胞(其與Hu-Asp2及APP-KK進行共轉染)所產(chǎn)生的CTF99產(chǎn)量的增加。CTF99產(chǎn)量的進一步提高在Hu-Asp2與APP-Sw-KK共轉染的細胞中也可以發(fā)現(xiàn))。
表-4.Hu-Asp2或者pcDNA質粒DNA與具有V717→F突變(其修飾了γ-分泌酶的處理過程)的不同的APP結構的共轉染的結果，與Asp2的共轉染持續(xù)增加了Aβ42/總的Aβ的比例，表列值為Aβ肽pg/ml.
pcDNA Asp2共轉染 共轉染Aβ40Aβ42 Aβ42/總量 Aβ40 Aβ42 Aβ42/總量App 192+18＜4 ＜2％ 188+40 8+103.9％APP-VF118+1515+19 11.5％ 85+7 24+12 22A％
APP-KK 352+2421+65.5％1062+101 226+49 17.5％APP-VF-KK 230+31 88+2427.7％ 491+35 355+36 42％實施例9人類Asp2L的細菌表達重組Hu_Asp2L在大腸桿菌中的表達加入N末端序列后Hu-Asp2L可以在大腸桿菌中進行表達，例如加入一種T7標記(SEQ ID No.21及No.22)或者后接一aspase8前導序列(SEQ IDNo.23及No.24)的T7標記?？梢赃x擇地，通過定點誘變使得5’端序列GC含量的減少可以用于增加Hu-Asp2(SEQ ID No.25及No.26)的產(chǎn)量。此外，可以用一蛋白酶水解位點構建Asp2(SEQ ID No.27及No.28)。為了在表達及重折疊后產(chǎn)生一可溶性蛋白，跨膜區(qū)域及細胞質尾的缺失，或者臨近膜區(qū)域，跨膜區(qū)域及細胞質尾的缺失是優(yōu)選的。
方法使用含有合適連接序列的引物進行PCR，將Asp2編碼序列與包括T7標記(SEQ ID Nos.21及22)或者一種T7-caspase8前導序列(SEQ ID Nos.23及24)的N端序列修飾物組裝融合。這些構建體被克隆進一種表達載體pet23a(+)[Novagen]中其中一種T7啟動子介導一種在一種多倍克隆位點之前的T7標記的表達。為了在pet23a+的T7前導序列之后克隆一種Hu-Asp2序列，下述寡聚核苷酸被用于對所選擇的Hu-Asp2序列進行擴增#553＝GTGGATCCACCCAGCACGGCATCCGGCTG(SEQ ID No.35)，#554＝GAAAGCTTTCATGACTCATCTGTCTGTG(3AATGTTG(SEQ ID No.36)，這些引物分別將BamHI及HindIII位點置于插入片段的5’及3’端。Asp2序列從全長的Asp2(b)cDNA(其按照廠商提供的方案使用在68℃下退火及延伸的兩步PCR循環(huán)進行25個循環(huán)的Advantage-GC cDNA PCR[Clontech]被克隆進入pcDNA3.1)中進行擴增。插入子及載體都用BamHI及HindIII進行切割，通過瓊脂糖凝膠電泳進行純化，然后用快速的DNA連接試劑盒進行連接[Boerhinger Mannheim]。連接反應被用于轉化大腸桿菌菌株JM109(Promega)，挑選菌落用于質粒純化(Qiagen，Qiaprep minispin)及DNA序列分析。對于使用異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進行誘導的可誘導性表達，表達載體被轉化進入大腸桿菌菌株BL21(Statagene)中。細菌培養(yǎng)物在有100μg/ml氨芐青霉素存在的條件下在LB肉湯中進行培養(yǎng)。然后在對數(shù)生長期進行誘導，其使用OD600為0.6-1.0的1mM的IPTG在37℃下誘導4個小時。細胞沉淀物通過離心進行收獲。
為了在T7標記及caspase前導序列(SEQ ID Nos.23及24)后克隆Hu-Asp2序列，將上面所述含有T7-Hu-Asp2序列(SEQ ID Nos.21及22)的在BamHI位點打開。然后將磷酸化后的caspase8前導寡聚核苷酸。#559＝GATCGATGACTATCTCTGACTCTCCGCGTGAACAGGACG(SEQ ID No.37)，#560＝GATCCGTCCTGTTCACGCGGAGAGTCAGAGATAGTCATC(SEQ ID No.38)退并連接至載體DNA。設計每一列寡聚核苷酸的5’端的突出端使得其允許連接進入BamHI位點但使得BamHI不能再對其進行消化。如上分析連接反應轉化進入大腸桿菌菌株系BL21后的蛋白質表達，連接反應也可轉化進入JM109細胞。
為了減少Asp2 5’端的GC含量，設計了一對反平行低聚體以改變退化密碼子堿基，在從G/C至A/T(SEQ ID Nos.25及26).的大約15個氨基酸的位置。在Asp2 5’末端的新的核苷酸序列并未改變所編碼的氨基酸，選用其來優(yōu)化為大腸桿菌的表達。有義連接子序列為5’CGGCATCCGGCTGCCCCTGCGTAGCGGTCTGGGTGGTGCTCCACTGGGTCTGCG TCTGCCCCGGGAGACCGACGAA G3’(SEQ ID No.39).反義連接子序列為5’CTTCGTCGGTCTCCCGGGGCAGACGCAGACCCAGTGGAGCACCACCCAGACCGCTACGCAGGGGCAGCCGGATGCCG 3’(SEQ IDNo.40)。在0.1M NaC1-10mM Tris，pH7.4下經(jīng)過退火磷酸化的連接子其被連接進入一種位于在載體pTAC上的Hu-Asp2的唯一的Cla I及Sma I位點。對于使用異丙基-β-D-硫代吡喃乳糖苷(IPTG)進行誘導的可誘導性表達。細菌培養(yǎng)物在有100μg/ml氨芐青霉素存在的條件下在LB肉湯中進行培養(yǎng)。然后在對數(shù)生長期進行誘導，其使用OD600為0.6-1.0的1mM的IPTG在37℃下誘導4個小時。通過離心收獲細胞沉淀。
為了產(chǎn)生一種載體，其中前導序列可以通過使用caspase8進行限制性蛋白水解而移去，這樣就構建成以N末端序列GSFV(SEQ ID Nos.27及28)開始Hu-Asp2多肽文庫，隨后進行下面的程序，兩個含有caspase8切割位點IETG的磷酸化寡聚核苷，#571＝5’GATCGATGACTATCTCTGACTCTCCGCTGGACTCTGGTATCGAAACCGACG(SEQ ID No.41)和#572＝GATCCGTCGGT’TTCGATACCAGAGTCCAGCGGAGAGTCAGAGATAGTCATC(SEQ ID No.42)被退火且連接進入pET23a+(其已經(jīng)被BamHI切開)。經(jīng)過轉化進入JM109，純化載體DNA被恢復，通過DNA序列分析證實插入子的方向。+，下面的寡聚核苷被用于擴增所選擇的Hu-Asp2序列#573＝5’AAGGATCCTI～GTGGAGATGGTGGACAACCTG，(SEQ ID No.43)#554＝GAAAGCTTI’CATGACTCATCTGTCTGTGGAATGTTG(SEQ ID No.44)，其分別將BamHI及HindIII位點側面接入插入子的5’及3’端。Asp2序列從全長的Asp2cDNA(其按照廠商提供的方案使用在68℃下退火及擴展的兩步PCR循環(huán)進行25個循環(huán)的Advantage-GC cDNA PCR[Clontech]被克隆進入pcDNA3.1)中進行擴增。插入子及載體都用BamHI及HindIII進行切割，通過瓊脂糖凝膠電泳進行純化，然后用快速的DNA連接試劑盒進行連接[Boerhinger Mannheim]。連接反應被用于轉化大腸桿菌菌株JM109(Promega)，精選菌落以純化質粒(Qiagen，Qiaprep minispin)及進行DNA序列分析。對于使用異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進行誘導的可誘導性表達，表達載體被轉化進入大腸桿菌菌株BL21(Statagene)中。細菌培養(yǎng)物在有100μg/ml氨卞青霉素存在的條件下在LB肉湯中進行培養(yǎng)。然后在對數(shù)生長期進行誘導，其使用OD600為0.6-1.0的1mM的IPTG在37℃下誘導4個小時。細胞沉淀物通過離心進行收獲。
為了幫助純化，一種6-His標記通過在BamHI位點對構建體進行切割而被引入任一上述構建體的在T7前導序列之后的位點，然后在退火，及對含有六個組氨酸序列#565＝GATCGCATCATCACCATCACCATG(SEQ ID No.45)，#566＝GATCCATGGTGATGGTGATGATGC(sEQ ID No.46)的寡聚核苷酸進行磷酸化等條件下進行連接。設計每一列寡聚核苷酸的5’端的突出端使得其允許連接進入BamHI位點但結果并不使得BamHI對其進行消化。
制備細菌小球10.8L的36.34g細菌小球被擴散進入一種總體積為200ml，使用一種20mm組織均化器探子在3000至5000rpm下在2M KCl，0.1M Tris，0.05MEDTA，1mM DTT進行均化。用水調節(jié)其電導率為193mMhos。
細胞小球被擴散后，加入額外的KCl溶液，使其總體積變?yōu)?00ml。懸浮液然后在5000rpm下使用相同的探針進一步均化3小時，混合液然后通過一種在10,000psi下的Rannie高壓均化器。
在所有情況下，小球材料被收集，而溶解的片段被丟棄。結果的溶液在一種GSA轉軸下在12,500rpm下進行離心1小時。小球在同樣的溶液中使用相同的組織均化器探子在2000rpm下進行重懸浮(沒有DTT)。然后在3000rpm下均化5分鐘后，在相同的溶液條件下其體積被調整至500ml。然后在12,500rpm下離心1小時。如前一樣重懸浮小球，但這時候最終體積被調整至1.5L，然后均化5分鐘。經(jīng)過在相同的速度下離心30分鐘后，重復該程序。小球然后在大約150ml的冷水中重懸浮，集中來自六個離心試管(其使用GSA轉軸)的小球。然后在3,000rpm下均化5分鐘，用冷水調整其體積為250ml，然后離心30分鐘，生成的小球重量為17.75g。
概述細菌小球在KCl溶液中進行溶解，在此之前以一種GSA轉軸進行離心以開始制備小球。然后使用相同的溶液3次進行重懸浮/均化。最后使用水洗/均化以除去多余的KCl及EDTA。
rHuAsp2L的可溶解性一種比率為9-10ml/克的細胞小球被用于溶解來自先前所述小球的rfluAsp2L。解凍17.75g小球，然后加入150ml 8M胍HCl，5mM βME，0.1％DEA。3M Tris被用于調整pH至8.6。使用一20mm的組織均化器探子在1000rpm下開始重懸浮進入胍溶液中，混合液然后在4℃下攪動1小時，在12,500rpm下以GSA轉子離心1小時。得到的上清液再在40,000×g以一種SS-34轉子離心30分鐘。除了50ml外，最終的上清液儲存于-20℃下。
溶解的rHuAsp2L的固定化鎳親合色譜使用下列溶液A)6M胍HCI，0.1M NaP，pH8.0，0.01M Tris，5mM βME，0.5mM咪唑A’)6M尿素，20mM NaP，pH6.80，50mM NaClB’)6M尿素，20mM NaP，pH6.20，50mM NaCl，12mM咪唑C’)6M尿素，20mM NaP，pH6.80，50mM NaCl，300mM咪唑注意緩沖液A’及C’以適當?shù)谋壤旌弦蕴峁┮环N咪唑的中間濃度。
50ml的溶解材料與50ml的緩沖液A進行混合，然后加入一種100-125ml的Qiagen Ni-NTA Superflow(用緩沖液A進行預平衡)至一種5×10cm的Bio-Rad的econo柱。然后在4℃的冷室中過夜平穩(wěn)振蕩。
色譜步驟1)排去生成的流通液，2)用50ml緩沖液A進行洗滌(收集到流通液級分中)3)用250ml緩沖液A進行洗滌(洗滌1)4)用250ml緩沖液A進行洗滌(洗滌2)5)用250ml緩沖液A’進行洗滌6)用250ml緩沖液B’進行洗滌7)用250ml緩沖液A’進行洗滌8)用250ml 75mM咪唑進行洗脫9)用250ml 150mM咪唑進行洗脫(150-1)10)用250ml 150mM咪唑進行洗脫(150-2)11)用250ml 300mM咪唑進行洗脫(300-1)12)用250ml 300mM咪唑進行洗脫(300-2)
13)用250ml 300mM咪唑進行洗脫(300-3)色譜結果以75mM至300mM咪唑進行洗脫rHuAsp，75mM級分以及第一種150mM咪唑(150-1)級分含有污染蛋白如考馬斯藍染色凝膠上所顯示的那樣。因此，級分150-2及300-1將被用于進行重折疊實驗，因為其含有最大量的蛋白(參見考馬斯藍染色凝膠)。
rHuAsp2L的重折疊實驗實驗140ml的150-2用1M DTT，3M Tris，pH7.4及DEA使其值升高至一最終濃度分別表示為6mM，50mM，及0.1％。其一面攪動一面用200ml的(4℃)冷的20mM NaP，pH6.8，150mM NaCl進行突然稀釋。該稀釋使得尿素的最終濃度為1M。該溶液保持清澈，即使在RT或4℃下開口于空氣。
經(jīng)過在4℃下開口于空氣4-5小時，然后用20mM NaP，pH7.4，150mMNaCl，20％甘油透析該溶液一夜。該方法有效地取除了溶液中的尿素而并不使蛋白沉降。
實驗2一些150-2洗脫液在一種Amicon Centriprep 10,000 MWCO，中濃縮2倍。然后以實驗1那樣進行處理。該實驗材料依然是溶液，且無明顯的沉降。
實驗3
89ml的150-2洗出液用1M DTT，3M Tris，pH7.4及DEA使其值升高至一最終濃度分別為6mM，50mM，及0.1％。其一面攪動一面用445ml的(4℃)冷的20mM NaP，pH6.8，150mM NaCl進行突然稀釋。該溶液保持清澈，且無明顯沉淀。該溶液被移至RT且攪拌10分鐘，然后加入MEA使其最終濃度變?yōu)?.1mM。在RT下緩慢攪拌一小時。加入胱胺及CuSO4使最終濃度分別為1mM及10μM。該溶液在RT下緩慢攪拌10分鐘。然后被移至4℃的冷室中過夜緩慢振蕩且開口于空氣。
第二天，溶液(依然清澈，且無明顯沉淀)在100,000×g下離心1小時。收集多次離心的上清液，用20mM NaP，pH7.4，150mM NaCl，20％甘油對穩(wěn)定的蛋白進行透析。透析后，該物質被保存在-20℃下。
保存一些(大約10ml)的蛋白溶液(依然在1M的尿素中)以用于生化分析，在-20℃下冷凍儲存。
實施例10Hu-Asp2的表達及其在昆蟲細胞中的衍生細胞桿狀病毒感染表達----Hu-Asp2的編碼序列及幾個衍生物通過在昆蟲細胞中使用PCR工程化。對于全長序列，修飾翻譯起始位點以適合Kozak共有序列的5’-有義寡聚核苷引物與含有在Hu-Asp2序列中的自然翻譯終止密碼子的3’-反義寡聚核苷引物進行配對。PCR擴增pcDNA3.1(hygro)/Hu-Asp2模板(參見實施例12)。刪去了C端跨膜區(qū)域(SEQ D No.29及No.30)或者刪去了跨膜區(qū)域而在C端(SEQ D No.31及No.32)引入了一種六個組氨酸的標記的Hu-Asp2的兩個衍生物同樣可以使用PCR進行工程化。與上述相同的5’-有義寡聚核苷引物與下列任一進行配對或者一種3’-反義引物其(1)在密碼子453(SEQ ID No.3)之后引入了一種翻譯終止密碼子或者一種3’-反義引物其(2)在使用pcDNA3.1(hygro)/Hu-Asp-2L作為模板進行PCR中翻譯終止密碼子之后有一種六個組氨酸的標記。在所有的情況下，按照廠商指導，使用PwoI DNA聚合酶(Boehringer-Mannheim)進行PCR反應擴增15個循環(huán)。反應產(chǎn)物用BamHI及NotI進行消化，然后連接至BamHI及NotI消化的桿狀病毒轉移載體pVL1393(Invitrogen)。連接產(chǎn)品的一部分轉化進入合適的E.coliDH5α細胞，然后在LB-Amp上使用抗生素進行選擇。質粒DNA通過使用標準的堿性溶液進行溶解及在CsCl下連接以產(chǎn)生桿狀病毒轉移載體pVL1393/Asp2ΔTM及pVL I 393/ASp2ΔTM(His)6。重組桿狀病毒的產(chǎn)生及sf9昆蟲細胞的感染使用標準方法進行操作。
感染表達----在High 5昆蟲細胞中使用昆蟲表達載體pIZ/V5-His進行Hu-Asp2ΔTM及Hu-Asp2ΔTM(His)6的瞬時及穩(wěn)定表達。來自于表達質粒載體pVL1393IAsp2，pVL1393/Asp2AΔTM及pVL1393/ASp2ΔTM(His)6的DNA插入子同時使用BamHI及NotI進行消化切割，然后使用標準方法將其亞克隆進入BamHI及NotI消化的pIZ/V5-His。結果的表達質粒，指的是pIZ/Hu-Asp2ΔTM及pIZ/Hu-Asp2ΔTM(His)6，其以上述方法進行制備。
對于轉染，High5昆蟲細胞在27℃下在一種封閉的瓶中被培養(yǎng)在用10μg/ml慶大霉素補充的高五無血清培養(yǎng)基中，使用高五細胞進行轉染，使用標準方法在高五無血清培養(yǎng)基中補充10μg/ml慶大霉素及InsectinPlus脂質體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
對于大規(guī)模瞬時轉染，1.2×107高五細胞被放置于一種150mm的組織培養(yǎng)盤中且允許在室溫下固著15-30分鐘。在固著期內(nèi)，DNA/脂質體混合物可以通過混合6ml無血清培養(yǎng)基，60μg Asp2ΔTM/pIZ(+/-His)DNA及120μl insectin Plus進行制備，且在室溫下溫育15分鐘。平板接種培養(yǎng)基從細胞碟上移去，且與DNA/脂質體混合物在室溫下以2rpm均勻振蕩混合4小時。另外加入6ml培養(yǎng)基至細胞碟上，然后在27℃下在一潮濕的孵卵器中培養(yǎng)四天。轉染后4天收獲培養(yǎng)基，在500×g下離心純化，用蛋白質印跡法去測試Asp2的表達。對于穩(wěn)定的表達，細胞用50μg/mlZeocin進行處理，通過限制性稀釋，活細胞被用于制備克隆細胞，然后如上分析其表達程度。
Hu-Asp2ΔTM及Hu-Asp2ΔTM(His)6的純化-----從Hu-Asp2中除去跨膜片段結果使得多肽分泌進入培養(yǎng)基中。隨著通過桿狀病毒感染或轉染生產(chǎn)蛋白，收獲條件培養(yǎng)基，通過離心進行純化，以Tris-HCl(pH8.0)進行透析。該物質然后通過離子交換(Tris-HCl，pH8.0)連續(xù)色譜進行純化，然后使用NaCl梯度進行陽離子交換色譜(pH4.5下的醋酸緩沖液)。洗脫曲線可以通過下列進行繪制(1)蛋白質印跡及(2)使用如實施例12所述的多肽作用物進行活性分析。對于Hu-Asp2ΔTM(His)6，條件培養(yǎng)基在Tris緩沖液下進行培養(yǎng)(pH8.0)，然后通過在IMAC樹脂下連續(xù)色譜進行純化，然后進行陰離子交換色譜。
序列分析純化的Hu-Asp2ΔTM(His)6蛋白揭示信號肽已經(jīng)被切除。
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實施例11在CHO細胞中Hu-Asp2的表達Hu-Asp-2L在CHO-K1細胞中的異源表達-----Hu-Asp2的全部編碼序列被克隆進入哺乳動物細胞表達載體PcDNA3.1(+)Hygro(Invitrogen，Carlsbad，CA)(其含有一種緊在以驅動表達的啟動子及bGH多腺苷酸化信號的前面的CMV)中。表達質粒，pcDNA3.1(+)Hygro/Hu-Asp2，通過堿性溶解及在CsCl中進行連接來制備，兩條鏈的完全序列化證實了編碼序列的完整性。
野生型的中國倉鼠卵巢細胞(CHO-K1)可以從ATCC獲得。細胞被保存在α-MEM(其含有在37℃下，5％CO2的10％ FCS)單層細胞培養(yǎng)物上。兩個100mm的CHO-K1細胞平皿(60％融合)僅用pcDNA3.1(+)/Hygro(仿制品)或pcDNA3.1(+)Hygro/Hu-Asp2使用陽離子性的脂質體DOTAP按照廠商所推薦那樣進行轉染。細胞用質粒DNA/脂質體混合物處理15小時，然后培養(yǎng)基使用含有500單位/ml潮霉素B的生長培養(yǎng)基進行替換。在pcDNA3.1(+)Hygro/Hu-Asp2轉染CHO-K1細胞的情況下，每個潮霉素B抗性細胞通過限制性稀釋進行克隆。隨著每個細胞系的克隆表達，Hu-Asp2蛋白的表達通過使用一種多克隆兔抗血清提高重組的在大腸桿菌中進行表達的Hu-Asp2的蛋白質印跡分析獲得。每一種細胞系接近融合的皿通過在PBS中經(jīng)過離心恢復細胞獲得。細胞沉淀物在冷的含有蛋白酶抑制劑的溶解緩沖液中(25mM Tris-HCl(8.0)/5mM EDTA)重懸浮。細胞通過超聲波進行溶解。溶解的及膜級分通過離心(105,000×g，60分鐘)進行分離。來自每一部分一定量的蛋白質通過SDS-PAGE進行分離。隨著所分離多肽電轉移至PVDF膜上，Hu-Asp-2L蛋白使用兔抗Hu-Asp2血清(1/1000稀釋)進行檢測，抗原抗體復合體使用堿性磷酸酶綴合羊抗兔抗體(1/2500)顯現(xiàn)。一種具有表觀平均分子量為65 kDa的特異性免疫反應蛋白在pcDNA3.1(+)Hygro/Hu-Asp2轉染細胞中進行檢測(其無仿制細胞)。同樣，Hu-Asp2多肽僅在膜片段中檢測到，其與在推測序列中信號肽及信號跨膜區(qū)域的存在是一致的?；谏鲜龇治?，#5克隆具有Hu-Asp2蛋白最高的表達水平。這樣產(chǎn)生的細胞系經(jīng)過放大試驗以提供所要純化的物質。
來自CHO-K1/Hu-Asp2#5克隆的重組Hu-Asp-2L的純化-------在一種典型的純化實驗中，來自20個150mm融合細胞平皿的#5克隆細胞沉淀物，被用作起始物。細胞沉淀物在如上所述那樣在50ml冷的溶解緩沖液中重懸浮。細胞通過使用polytron均化器(2×20sec)進行溶解，溶胞產(chǎn)物再在338,000×g下離心20分鐘。膜沉淀物然后在20ml的含有50mMβ-辛基葡糖苷的冷的溶解緩沖液中重懸浮。然后在4℃下振蕩1小時。去污劑提取物然后通過在338,000×g下離心20分鐘而澄清，取上清液做進一步的分析。
β-辛基葡糖苷的提取物被應用一種Mono Q陰離子交換柱其先前已用25mM Tris-HCl(pH8.0)/50mMβ-辛基葡糖苷進行平衡。上樣后，柱子用一種遞增的NaCl濃度(30分鐘內(nèi)0-1.0M)的線性梯度進行洗脫并由蛋白質印跡分析測定各個級分的β分泌酶活性。(參見下文)。含有Hu_Asp-2L免疫活性及β分泌酶活性的級分被收集且在25mM NaOAc(pH4.5)/50mM的β-辛基葡糖苷下進行透析。透析后，沉淀物通過離心除去，可溶物在一種單S陽離子交換柱上進行色譜分析，其預先使用25mM NaOAc(pH4.5)/50mMβ-辛基葡糖苷進行平衡。柱子用一種遞增的NaCl濃度(30分鐘內(nèi)0-1.0M)的線性梯度進行洗脫并由蛋白質印跡分析測定各個級分的β分泌酶活性。含有Hu-Asp-2免疫活性及β分泌酶活性的級分被合并且使用SDS-PAGE/考馬斯藍染色測得其有大于90％的純度。
實施例12使用多肽底物來分析Hu-Asp2β分泌酶活性
β分泌酶的分析-----β分泌酶活性可以通過量化含有APP瑞典突變(使用RP-HPLC及UV檢測)的合成肽的水解來測量。每一種反應含有50mMNa-MES(pH5.5)，1％β-辛基葡糖苷，多肽作用底物(SEVNLDAEFR，70μM)及酶(1-5μg蛋白)。反應在37℃下溫育幾次，反應產(chǎn)物通過RP-HPLC使用一種線性梯度從0-70B經(jīng)過30分鐘(A＝0.1％TFA在水中，B＝0.1％TFA/10％水/90％AcCN)進行溶解。洗脫曲線通過在214nm處的吸收來測繪。在預備實驗中，有兩個峰值其在多肽作用底物未反應前進行洗脫，同時使用Edman測序及MADLI-TOF質譜分析法證實其具有序列DAEFR及SEVNL。多肽作用底物的水解百分比可以通過比較兩個產(chǎn)品肽完整的峰面積及在214nm處吸收所取得的起始物質的峰面積而計算出來。蛋白酶裂解反應的特異性可以通過在蛋白酶抑制劑混合物(8μM抑肽素A，10μM亮肽素，10μM E64，及5mM EDTA)的存在下進行β分泌酶試驗而測定。
一種可供選擇的β分泌酶試驗使用內(nèi)部淬火熒光底物在一單一樣品或多孔形式下使用熒光色譜來檢測酶的活性，每一反應含有50mM Na-MES(pH5.5)，多肽作用底物MCA-EVKMDAEF[K-DNP](BioSource International)(50μM)及純化的Hu-Asp-2酶。該組分被平衡至37℃幾次，反應通過加入作用底物而激活。在330nm處激活，反應動力學通過測量在390nm處的熒光釋放而計算。為了檢測調節(jié)Hu-Asp-2活性的組合物，該待測組合物在反應的預培養(yǎng)階段加入，反應動力學如上進行計算。催化劑活性以提高表觀熒光的速率的組合物來計算而抑制劑則以減少表觀熒光的速率的組合物來計算。
已經(jīng)非常清楚本發(fā)明如前面說明書及實施例所述是具有實用性的。本發(fā)明的大量的修飾和變化都可能是以本發(fā)明前文所述為基礎或提示的，因此，都在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
這兒所引用的全部的出版物的全文都作為參考資料而納入本說明書。
序列表<110>Gurney，Mark E.
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<150>60/101,594<151>1998-09-24<160>49<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1804<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1atgggcgcac tggcccgggc gctgctgctg cctctgctgg cccagtggct cctgcgcgcc 60gccccggagc tggcccccgc gcccttcacg ctgcccctcc gggtggccgc ggccacgaac 120cgcgtagttg cgcccacccc gggacccggg acccctgccg agcgccacgc cgacggcttg 180gcgctcgccc tggagcctgc cctggcgtcc cccgcgggcg ccgccaactt cttggccatg 240gtagacaacc tgcaggggga ctctggccgc ggctactacc tggagatgct gatcgggacc 300cccccgcaga agctacagat tctcgttgac actggaagca gtaactttgc cgtggcagga 360accccgcact cctacataga cacgtacttt gacacagaga ggtctagcac ataccgctcc 420aagggctttg acgtcacagt gaagtacaca caaggaagct ggacgggctt cgttggggaa 480gacctcgtca ccatccccaa aggcttcaat acttcttttc ttgtcaacat tgccactatt 540tttgaatcag agaatttctt tttgcctggg attaaatgga atggaatact tggcctagct 600tatgccacac ttgccaagcc atcaagttct ctggagacct tcttcgactc cctggtgaca 660caagcaaaca tccccaacgt tttctccatg cagatgtgtg gagccggctt gcccgttgct 720ggatctggga ccaacggagg tagtcttgtc ttgggtggaa ttgaaccaag tttgtataaa 780ggagacatct ggtatacccc tattaaggaa gagtggtact accagataga aattctgaaa 840ttggaaattg gaggccaaag ccttaatctg gactgcagag agtataacgc agacaaggcc 900atcgtggaca gtggcaccac gctgctgcgc ctgccccaga aggtgtttga tgcggtggtg 960gaagctgtgg cccgcgcatc tctgattcca gaattctctg atggtttctg gactgggtcc 1020cagctggcgt gctggacgaa ttcggaaaca ccttggtctt acttccctaa aatctccatc 1080tacctgagag atgagaactc cagcaggtca ttccgtatca caatcctgcc tcagctttac 1140
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<210>29<211>1362<212>DNA<213>Homo sapiens<400>29atggcccaag ccctgccctg gctcctgctg tggatgggcg cgggagtgct gcctgcccac 60ggcacccagc acggcatccg gctgcccctg cgcagcggcc tggggggcgc ccccctgggg 120ctgcggctgc cccgggagac cgacgaagag cccgaggagc ccggccggag gggcagcttt 180gtggagatgg tggacaacct gaggggcaag tcggggcagg gctactacgt ggagatgacc 240gtgggcagcc ccccgcagac gctcaacatc ctggtggata caggcagcag taactttgca 300gtgggtgctg ccccccaccc cttcctgcat cgctactacc agaggcagct gtccagcaca 360taccgggacc tccggaaggg tgtgtatgtg ccctacaccc agggcaagtg ggaaggggag 420ctgggcaccg acctggtaag catcccccat ggccccaacg tcactgtgcg tgccaacatt 480gctgccatca ctgaatcaga caagttcttc atcaacggct ccaactggga aggcatcctg 540gggctggcct atgctgagat tgccaggcct gacgactccc tggagccttt ctttgactct 600ctggtaaagc agacccacgt tcccaacctc ttctccctgc acctttgtgg tgctggcttc 660cccctcaacc agtctgaagt gctggcctct gtcggaggga gcatgatcat tggaggtatc 720gaccactcgc tgtacacagg cagtctctgg tatacaccca tccggcggga gtggtattat 780gaggtcatca ttgtgcgggt ggagatcaat ggacaggatc tgaaaatgga ctgcaaggag 840tacaactatg acaagagcat tgtggacagt ggcaccacca accttcgttt gcccaagaaa 900gtgtttgaag ctgcagtcaa atccatcaag gcagcctcct ccacggagaa gttccctgat 960ggtttctggc taggagagca gctggtgtgc tggcaagcag gcaccacccc ttggaacatt 1020ttcccagtca tctcactcta cctaatgggt gaggttacca accagtcctt ccgcatcacc 1080atccttccgc agcaatacct gcggccagtg gaagatgtgg ccacgtccca agacgactgt 1140tacaagtttg ccatctcaca gtcatccacg ggcactgtta tgggagctgt tatcatggag 1200ggcttctacg ttgtctttga tcgggcccga aaacgaattg gctttgctgt cagcgcttgc 1260catgtgcacg atgagttcag gacggcagcg gtggaaggcc cttttgtcac cttggacatg 1320gaagactgtg gctacaacat tccacagaca gatgagtcat ga 1362<210>30<211>453<212>PRT<213>Homo sapiens<400>30Met Ala Gln Ala Leu Pro Trp Leu Leu Leu Trp Met Gly Ala Gly Val1 5 10 15Leu Pro Ala His Gly Thr Gln His Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser20 25 30Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp35 40 45Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val
50 55 60Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr65 70 75 80Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser85 90 95Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr100 105 110Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val115 120 125Tyr Val Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp130 135 140Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala Asn Ile145 150 155 160Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly Ser Asn Trp165 170 175Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg Pro Asp Asp180 185 190Ser Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu Val Lys Gln Thr His Val Pro195 200 205Asn Leu Phe Ser Leu Gln Leu Cys Gly Ala Gly Phe Pro Leu Asn Gln210 215 220Ser Glu Val Leu Ala Ser Val Gly Gly Ser Met Ile Ile Gly Gly Ile225 230 235 240Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro Ile Arg Arg245 250 255Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile Asn Gly Gln260 265 270Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys Ser Ile Val275 280 285Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys Val Phe Glu Ala290 295 300Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser Ser Thr Glu Lys Phe Pro Asp
305 310 315 320Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln Ala Gly Thr Thr325 330 335Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met Gly Glu Val340 345 350Thr Asn Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Gln Tyr Leu Arg355 360 365Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys Tyr Lys Phe Ala370 375 380Ile Ser Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val Ile Met Glu385 390 395 400Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile Gly Phe Ala405 410 415Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala Ala Val Glu420 425 430Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr Asn Ile Pro435 440 445Gln Thr Asp Glu Ser450<210>31<211>1380<212>DNA<213>Homo sapiens<400>31atggcccaag ccctgccctg gctcctgctg tggatgggcg cgggagtgct gcctgcccac 60ggcacccagc acggcatccg gctgcccctg cgcagcggcc tggggggcgc ccccctgggg 120ctgcggctgc cccgggagac cgacgaagag cccgaggagc ccggccggag gggcagcttt 180gtggagatgg tggacaacct gaggggcaag tcggggcagg gctactacgt ggagatgacc 240gtgggcagcc ccccgcagac gctcaacatc ctggtggata caggcagcag taactttgca 300gtgggtgctg ccccccaccc cttcctgcat cgctactacc agaggcagct gtccagcaca 360taccgggacc tccggaaggg tgtgtatgtg ccctacaccc agggcaagtg ggaaggggag 420ctgggcaccg acctggtaag catcccccat ggccccaacg tcactgtgcg tgccaacatt 480gctgccatca ctgaatcaga caagttcttc atcaacggct ccaactggga aggcatcctg 540gggctggcct atgctgagat tgccaggcct gacgactccc tggagccttt ctttgactct 600ctggtaaagc agacccacgt tcccaacctc ttctccctgc acctttgtgg tgctggcttc 660cccctcaacc agtctgaagt gctggcctct gtcggaggga gcatgatcat tggaggtatc 720
gaccactcgc tgtacacagg cagtctctgg tatacaccca tccggcggga gtggtattat 780gaggtcatca ttgtgcgggt ggagatcaat ggacaggatc tgaaaatgga ctgcaaggag 840tacaactatg acaagagcat tgtggacagt ggcaccacca accttcgttt gcccaagaaa 900gtgtttgaag ctgcagtcaa atccatcaag gcagcctcct ccacggagaa gttccctgat 960ggtttctggc taggagagca gctggtgtgc tggcaagcag gcaccacccc ttggaacatt 1020ttcccagtca tctcactcta cctaatgggt gaggttacca accagtcctt ccgcatcacc 1080atccttccgc agcaatacct gcggccagtg gaagatgtgg ccacgtccca agacgactgt 1140tacaagtttg ccatctcaca gtcatccacg ggcactgtta tgggagctgt tatcatggag 1200ggcttctacg ttgtctttga tcgggcccga aaacgaattg gctttgctgt cagcgcttgc 1260catgtgcacg atgagttcag gacggcagcg gtggaaggcc cttttgtcac cttggacatg 1320gaagactgtg gctacaacat tccacagaca gatgagtcac agcagcagca gcagcagtga 1380<210>32<211>459<212>PRT<213>Homo sapiens<400>32Met Ala Gln Ala Leu Pro Trp Leu Leu Leu Trp Met Gly Ala Gly Val1 5 10 15Leu Pro Ala His Gly Thr Gln His Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser20 25 30Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp35 40 45Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val50 55 60Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr65 70 75 80Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser85 90 95Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr100 105 110Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val115 120 125Tyr Val Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp130 135 140Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala Asn Ile145 150 155 160
Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn G1y Ser Asn Trp165 170 175Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg Pro Asp Asp180185 190Ser Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu Val Lys Gln Thr His Val Pro195 200 205Asn Leu Phe Ser Leu Gln Leu Cys Gly Ala Gly Phe Pro Leu Asn Gln210 215 220Ser Glu Val Leu Ala Ser Val Gly Gly Ser Met Ile Ile Gly Gly Ile225 230 235 240Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro Ile Arg Arg245 250 255Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile Asn Gly Gln260 265 270Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys Ser Ile Val275 280 285Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys Val Phe Glu Ala290 295 300Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser Ser Thr Glu Lys Phe Pro Asp305 310 315 320Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln Ala Gly Thr Thr325 330 335Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met Gly Glu Val340 345 350Thr Asn Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Gln Tyr Leu Arg355 360 365Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys Tyr Lys Phe Ala370 375 380Ile Ser Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val Ile Met Glu385 390 395 400Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile Gly Phe Ala405 410 415
Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala Ala Val Glu420 425 430Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr Asn Ile Pro435 440 445Gln Thr Asp Glu Ser His His His His His His450 455<210>33<211>25<212>PRT<213>Homo sapiens<400>33Ser Glu Gln Gln Arg Arg Pro Arg Asp Pro Glu Val Val Asn Asp Glu1 5 10 15Ser Ser Leu Val Arg His Arg Trp Lys20 25<210>34<211>19<212>PRT<213>Homo sapiens<400>34Ser Glu Gln Leu Arg Gln Gln His Asp Asp Phe Ala Asp Asp Ile Ser1 5 l0 15Leu Leu Lys<210>35<211>29<212>DNA<213>Homo sapiens<400>35gtggatccac ccagcacggc atccggctg29<210>36<211>36<212>DNA<213>Homo sapiens
<400>36gaaagctttc atgactcatc tgtctgtgga atgttg36<210>37<211>39<212>DNA<213>Homo sapiens<400>37gatcgatgac tatctctgac tctccgcgtg aacaggacg 39<210>38<211>39<212>DNA<213>Homo sapiens<400>38gatccgtcct gttcacgcgg agagtcagag atagtcatc 39<210>39<211>77<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Hu-Asp2<400>39cggcatccgg ctgcccctgc gtagcggtct gggtggtgct ccactgggtc tgcgtctgcc 60ccgggagacc gacgaag 77<210>40<211>77<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Hu-Asp2<400>40cttcgtcggt ctcccggggc agacgcagac ccagtggagc accacccaga ccgctacgca 60ggggcagccg gatgccg 77<210>41<211>51<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述Caspase 8切割位點<400>41gatcgatgac tatctctgac tctccgctgg actctggtat cgaaaccgac g 51<210>42<211>51<212>DNA<213>人工序列1 Sequence<220>
<223>人工序列的描述Caspase 8切割位點<400>42gatccgtcgg tttcgatacc agagtccagc ggagagtcag agatagtcat c 51<210>43<211>32<212>DNA<213>Homo sapiens<400>43aaggatcctt tgtggagatg gtggacaacc tg32<210>44<211>36<212>DNA<213>Homo sapiens<400>44gaaagctttc atgactcatc tgtctgtgga atgttg36<210>45<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述6-His標記<400>45gatcgcatca tcaccatcac catg 24<210>46
<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述6-His標記<400>46gatccatggt gatggtgatg atgc 24<210>47<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引入KK基序<400>47gactgaccac tcgaccaggt tc 22<210>48<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引入KK基序<400>48cgaattaaat tccagcacac tggctacttc ttgttctgca tctcaaagaa c 51<210>49<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引入KK基序<400>49cgaattaaat tccagcacac tggcta 2權利要求
1.一種包含長為15-100個核苷酸的核苷酸序列的分離的核酸；其中的核酸與SEQ ID NO3或SEQ ID NO5的至少15個鄰接的核苷酸，或其互補序列，在下列雜交條件下雜交在含有6×SSC和0.1％SDS的雜交溶液中溫育2.5小時和在含有1.0×SSC和0.1％SDS的洗滌溶液中于65℃洗滌；并且其中的核酸使淀粉樣蛋白β(Aβ)在用該核酸轉染的HEK293-Swkk細胞中的加工比Aβ在未轉染的HEK293-Swkk細胞中的加工減少。
2.根據(jù)權利要求1的分離的核酸，其中的核酸是長為15-30個的核苷酸。
3.根據(jù)權利要求1的分離的核酸，其中的核酸是長為20-30個的核苷酸。
4.根據(jù)權利要求1-3任一項的分離的核酸，其中核酸分子包含與SEQ ID NO3互補的序列。
5.根據(jù)權利要求1-4任一項的分離的核酸，其包含DNA。
6.根據(jù)權利要求1-4任一項的分離的核酸，其包含RNA。
7.根據(jù)權利要求1-6任一項的分離的核酸，其使Aβ(1-40)在所述轉染細胞中的加工比在所述未轉染細胞中的加工減少至少50％。
8.根據(jù)權利要求1-7任一項的分離的核酸，其使Aβ(1-42)在所述轉染細胞中的加工比在所述未轉染細胞中的加工減少至少50％。
9.包含權利要求1-8任一項所述的核酸的載體。
10.一種減少細胞由淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)產(chǎn)生淀粉樣蛋白β(Aβ)的方法，包括用一種組合物在體外轉化或轉染細胞的步驟，所述組合物包括能夠通過減少Asp2在細胞中轉錄或翻譯來減少Asp2多肽產(chǎn)生的反義試劑，其中Asp2多肽在細胞中產(chǎn)量的降低與細胞將APP加工成Aβ的減少相關。
11.一種減少細胞由淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)產(chǎn)生淀粉樣蛋白β(Aβ)的方法，包括用一種組合物在體外轉化或轉染細胞的步驟，所述組合物包括可有效地通過減少Asp2在細胞中轉錄或翻譯來減少Asp2多肽產(chǎn)生量的權利要求1-9任一項的核酸或載體，其中Asp2多肽在細胞中產(chǎn)量的降低與細胞將APP加工成Aβ的減少相關。
12.根據(jù)權利要求10或11的方法，進一步包括在轉化或轉染步驟之前，鑒定產(chǎn)生Aβ的哺乳動物細胞的步驟。
13.根據(jù)權利要求10-12任一項的方法，其中的細胞是神經(jīng)細胞。
14.根據(jù)權利要求10的方法，其中反義試劑包含一種寡核苷酸，后者包括能夠結合到Hu-Asp mRNA上的單鏈核酸序列。
15.根據(jù)權利要求10的方法，其中反義試劑包含一種寡核苷酸，后者包括能夠結合到Hu-Asp DNA上的單鏈核酸序列。
16.權利要求1-9任一項的分離的核酸或載體在制造用于治療阿爾茨海默氏疾病的藥物中的應用。
17.能夠減少細胞由淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)產(chǎn)生淀粉樣蛋白β(Aβ)的反義試劑在制造用于治療阿爾茨海默氏疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了阿爾茨海默氏疾病分泌酶以及切割APP蛋白的β分泌酶切割位點的酶促過程，及相關的核酸，肽，載體，細胞，細胞分離物及測定方法。
文檔編號A61P25/28GK1502696SQ20031011966
公開日2004年6月9日 申請日期1999年9月23日 優(yōu)先權日1998年9月24日
發(fā)明者M·E·格尼, M·J·比安科沃斯基, R·L·希里克森, L·A·帕羅迪, R·嚴, M E 格尼, 希里克森, 帕羅迪, 比安科沃斯基 申請人:法瑪西雅厄普約翰美國公司