抗人vegf的重組嵌合抗體及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，特別是抗體方面，更具體地涉及一種抗VEGF的重組嵌合 抗體及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 在迄今發(fā)現(xiàn)的20多種多肽類血管生長(zhǎng)因子中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelialgrowthfactor,VEGF,也可寫作VEGF-A)是針對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞特異性最高，促 血管生長(zhǎng)作用最強(qiáng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在多種原發(fā)性惡性腫瘤組織中均呈高表達(dá)，所述腫 瘤包括肺、乳房、胃腸道、腎、胰臟和卵巢腫瘤（BerkmanRA等，1993，/CZi/?TsmsA 91:153-159)。
[0003]VEGF家族除了原型成員VEGF-A外，還包括胎盤生長(zhǎng)因子（placentagrowth factor,P1GF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D。VEGF-A是高度保守的同源二聚體糖蛋白，由兩條 分子量各為24kDa的單鏈以二硫鍵組成二聚體。人VEGF-A基因由8個(gè)外顯子、7個(gè)內(nèi)含子 組成，由于mRNA不同的剪切方式，分別產(chǎn)生出VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF2Q6等至 少5種蛋白形式，其中VEGF165是體內(nèi)表達(dá)最多且生物活性最強(qiáng)的亞型。VEGF家族通過與受 體結(jié)合發(fā)揮作用。
[0004] 貝伐單抗（Avastin)是FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)抗腫瘤血管生成的人源化單克隆抗體 (美國專利No. 08/833504 ;中國專利CN1259962A)。它是一種抗VEGF的抗體（IgGl)，93%的 人源結(jié)構(gòu)域和7%的鼠源結(jié)合區(qū)域（抗原決定簇，CDR)組成。貝伐單抗與VEGF的結(jié)合親和 力約為0. 5nM，可抑制VEGF與VEGFRl和VEGFR2的結(jié)合。貝伐單抗在人體內(nèi)的消除半衰期 為17~21天。Avastin于2004年2月被美國FDA批準(zhǔn)作為聯(lián)合化療治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌 的一線藥物上市。隨后幾年，貝伐單抗又被FDA批準(zhǔn)用于聯(lián)合化療或其他抗腫瘤藥物作為 晚期非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌以及腦膠質(zhì)瘤的一線治療藥物。另外，Avastin用于治 療HER2陰性乳癌的申請(qǐng)已獲歐洲藥監(jiān)局EMA的批準(zhǔn)。目前針對(duì)卵巢癌、轉(zhuǎn)移性胃腺癌、復(fù) 發(fā)性肝癌的貝伐單抗聯(lián)合化療的II/III期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。
[0005] 除了癌癥外，抗VEGF抗體也是治療包括老年性黃斑變性（AMD)，糖尿病引起的眼 底病在內(nèi)的多種眼科疾病的一線藥物。眼睛水狀液和玻璃狀液中VEGF的增加已與各種視 網(wǎng)膜病相關(guān)聯(lián)（AielloLP等，#份取1994，331:1480-1487)。為了治療這些 疾病，在Avastin的基礎(chǔ)上，基因泰克公司又將其全抗體分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行簡(jiǎn)化，保留能夠中 和VEGF的抗體片段，同時(shí)將給藥途徑由靜脈注射改為玻璃體直接注射，由此成就另一藥 物-Avastin的孿生姊妹蘭尼單抗（Lucentis)，即一種源自貝伐單抗的親和力成熟的 Fab片段。2006年，蘭尼單抗被美國藥監(jiān)局批準(zhǔn)用于治療AMD，很快就成為治療老年性黃斑 變性和糖尿病引起的眼底病的首選藥。
[0006] 雖然貝伐單抗已應(yīng)用于臨床多年，對(duì)多種實(shí)體腫瘤的治療都取得了良好的療效， 但貝伐單抗對(duì)VEGF親和力不高，并且由獨(dú)家生產(chǎn)，病人需要花費(fèi)高額的費(fèi)用，目前一個(gè)病 人用藥一年的費(fèi)用約在5萬至10萬美元。此外，有效性和不良反應(yīng)也是不容忽視的問題。用 Avastin輔助治療癌癥會(huì)導(dǎo)致副作用，包括高血壓、蛋白尿、血栓栓塞事件（thromboembolic event)、出血和心臟毒性（BlowerE等，/M/rs，2009,18:351-6，358)。另外，VEGF抗 體針對(duì)同一靶點(diǎn)不同亞型的特異性會(huì)影響其治療效果，已證實(shí)貝伐單抗不僅結(jié)合VEGF還 可與VEGF165b結(jié)合,并不適用于治療體內(nèi)高度表達(dá)VEGF1651^tJ患者（HarperSJ等，Caflcer, 2008， 8:880-887)。
[0007] 因而，研發(fā)新的抗VEGF單克隆抗體，從而減少病人負(fù)擔(dān)，降低治療費(fèi)用是一個(gè)亟 待解決的問題?？筕EGF抗體藥物升級(jí)需要獲得和研究針對(duì)VEGF不同抗原表位或識(shí)別相同 表位而親和力不同的抗體CDR區(qū)。不同CDR免疫源性是不同的，這會(huì)造成抗體被耐受的速度 和毒性的差異，直接影響藥效。針對(duì)不同抗原表位或識(shí)別相同表位而親和力不同的抗體CDR 與抗原結(jié)合的親和力也會(huì)有差異，高親和力⑶R的抗體藥物每針劑用量預(yù)期可以下調(diào)。鑒 于VEGF和其受體的多樣性，針對(duì)VEGF不同抗原表位或識(shí)別相同表位而親和力不同的VEGF 抗體對(duì)腫瘤生長(zhǎng)或其他與VEGF高表達(dá)相關(guān)疾病的抑制效果可能是不同的。此外，抗體的療 效還受抗體血漿半衰期和血管通透性等因素的影響。因此研究識(shí)別VEGF不同抗原表位或 相同表位而親和力更高的抗體，并進(jìn)行人源化改造將有助于獲得療效更好的治療性抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 因此，本發(fā)明的目的是提供一種比現(xiàn)有技術(shù)中的小鼠抗體更加安全可靠的、功能 更顯著的抗VEGF的嵌合抗體。所述嵌合抗體與人VEGF的結(jié)合Kd值約0.OlnM，能夠高特異 性地拮抗VEGF與VEGFR的結(jié)合，其結(jié)合VEGF能力是人源化抗體Avastin的10倍以上。因 此，本發(fā)明所提供的人VEGF嵌合抗體具有更高的特異性，在臨床應(yīng)用中，有望提高安全性， 且臨床使用劑量?jī)H需Avastin的1/10即可達(dá)到等同藥效，大大降低患者的治療成本。
[0009] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，公開了一種與人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子結(jié)合的抗體，其特征在 于，該抗體的重鏈可變區(qū)的⑶R-Hl為SEQIDNO:3所示的氨基酸序列，⑶R-H2為SEQID NO:4所示氨基酸序列，和CDR-H3具有SEQIDNO:5所示氨基酸序列；以及該抗體的輕鏈可 變區(qū)的CDR-Ll為SEQIDNO:8所示氨基酸序列，CDR-L2為SEQIDNO:9所示氨基酸序列， 和CDR-L3為SEQIDNO:10所示氨基酸序列。
[0010] 在該方面的一個(gè)優(yōu)選例中，該抗體的重鏈可變區(qū)為SEQIDNO:2所示的氨基酸序 列，相應(yīng)地，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
[0011] 在該方面的另一個(gè)優(yōu)選例中，該抗體的輕鏈可變區(qū)為SEQIDNO:7所示的氨基酸 序列，相應(yīng)地，其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。
[0012] 在該方面的還有一個(gè)優(yōu)選例中，其重鏈恒定區(qū)序列是人IgGl的重鏈恒定區(qū)序列。
[0013] 在該方面的還有一個(gè)優(yōu)選例中，該抗體的輕鏈恒定區(qū)序列是人K抗體輕鏈恒定 區(qū)序列。
[0014] 在該發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，該抗體與1^￡6?165結(jié)合的1(1)值為彡0.11^，優(yōu)選為 0.OlnM。
[0015] 在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼上述嵌合抗體的分離核酸。
[0016] 在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了含有上述核酸的表達(dá)載體。
[0017] 在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，所述宿主 細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0018] 在本發(fā)明的第五個(gè)方面，提供了一種藥物組合物，含有上述抗體和藥物學(xué)上可接 受的載體。
[0019] 在本發(fā)明的第六個(gè)方面提供了所述藥物組合物的用途，優(yōu)選該藥物組合物用于治 療任何與血管生成異常相關(guān)的疾病，特別是與VEGF信號(hào)通路相關(guān)聯(lián)的血管生長(zhǎng)增加，而導(dǎo) 致、加劇、或以其他形式相關(guān)聯(lián)的狀態(tài)。這些疾病，通常與VEGF表達(dá)水平升高相關(guān)，包括 與血管生成增加相關(guān)的眼部疾病，如濕性AMD或增殖性視網(wǎng)膜病變?nèi)缣悄虿⌒砸暰W(wǎng)膜病 變，糖尿病腎病和其他糖尿病血管增生疾病，囊性纖維化病、多種依賴于新生血管生成的 腫瘤（AmorosoA等，Eur Rev Med Pharmacol Sci,1997, 1:17-25;McColleySA等， Am J Respir Crit Care Med,2000, 161:1877-1880;KhamaisiM等， 2003,18:1427-1430)以及炎癥。所述癌癥包括但不限于結(jié)腸轉(zhuǎn)移癌、直腸轉(zhuǎn) 移癌、非鱗狀非小細(xì)胞肺癌、J1ER2陰性乳癌、腎細(xì)胞癌、卵巢癌、胃腸道癌、骨腫瘤、前列腺癌 或肝癌等。所述炎癥包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、硬皮病、慢性阻塞性肺部疾病 或哮喘。
【附圖說明】
[0020] 圖1競(jìng)爭(zhēng)法ELISA篩選各孔內(nèi)抗人VEGF鼠單克隆抗體對(duì)經(jīng)HRP標(biāo)記的抗VEGF人 源化抗體Avastin與hVEGF的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合能力。
[0021] 圖2間接法ELISA測(cè)定抗人VEGF鼠單克隆抗體結(jié)合VEGF的效價(jià)。其中，鼠單克 隆抗體TM12-15-1的效價(jià)最高。
[0022] 圖3抗人VEGF鼠單克隆抗體對(duì)經(jīng)HRP標(biāo)記的抗VEGF人源化抗體Avastin與VEGF 的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定。其中，抗hVEGF鼠單克隆抗體TM12-15-1競(jìng)爭(zhēng)Avastin結(jié)合抗原的能力 最強(qiáng)。
[0023] 圖4BLI分析鼠單克隆抗體TM12-15-1親和力的動(dòng)力學(xué)擬合曲線。
[0024] 圖5鼠單克隆抗體TM12-15-1與人VEGF結(jié)合平衡解離常數(shù)Kd值測(cè)定圖。
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