專(zhuān)利名稱(chēng)：微囊化材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物投遞系統(tǒng)領(lǐng)域。特別是，本發(fā)明涉及用無(wú)抗原性生物可降解材料制備微囊藥物的方法，還涉及微囊化組合物，其靶向消化生物可降解包衣，并在細(xì)胞內(nèi)或積累部位釋放完整藥物或活性成分的吞噬細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞等，或患病器官(如肝、腎、肺、心臟、脾)，或患病位點(diǎn)(如腫瘤、關(guān)節(jié))。該組合物可用于治療和預(yù)防疾病。
背景技術(shù)：
我們實(shí)驗(yàn)室(和在先前同時(shí)待審申請(qǐng))已證實(shí)，包含于清蛋白微球體(MS)中的水溶性化合物的微囊化靶向產(chǎn)生大多數(shù)前炎性細(xì)胞因子的吞噬細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞。該技術(shù)已證實(shí)提高細(xì)胞因子抑制化合物的功效，如中和抗體。我們已進(jìn)一步評(píng)估了制備含其他種類(lèi)的藥物，如CNI-1493(一種抑制p38 MAP激酶的脒基腙化合物)、氯膦酸鹽(clodronate)(一種二膦酸鹽)、抗氧化劑如吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamate)、及NF-kB的反義寡聚物的清蛋白微球體的方法。這些化合物的微囊化在體內(nèi)全血模型、內(nèi)毒素休克模型及細(xì)菌敗血性休克模型中提高細(xì)胞因子如TNF和IL1-β的抑制作用。我們也評(píng)估了制劑，并完成了黑素瘤疫苗制劑的效率檢測(cè)試驗(yàn)，它在小鼠中很好地抑制腫瘤。
發(fā)明概述在本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)以前開(kāi)發(fā)的乳化方法學(xué)中的各種過(guò)程參數(shù)、材料和反應(yīng)條件進(jìn)行了擴(kuò)展(也在上述引用的待同時(shí)待審申請(qǐng)中進(jìn)行描述)。
針對(duì)特定患病位點(diǎn)的藥物遞送有助于降低對(duì)患者的副作用，從而預(yù)防毒性。通過(guò)使用微囊形式的藥物，可預(yù)防藥物暴露在非患病器官和組織中。
先前在同時(shí)待審申請(qǐng)中已公開(kāi)了一種通過(guò)乳化方法，以橄欖油為乳化介質(zhì)制備微囊化單克隆抗體的方法。此處我們公開(kāi)了以幾種不同的油為乳化介質(zhì)，并在不同的溫度下評(píng)估生物活性蛋白藥物，即NF-kB的反義寡核苷酸后的另外的數(shù)據(jù)，而且也對(duì)用不同的水溶性溶劑溶解藥物的過(guò)程進(jìn)行了評(píng)估。
在本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)一種新型的噴霧方法，以不同的藥物、不同的溶劑、不同的溫度和方法學(xué)變量為例制備微球體。
用本乳化方法評(píng)估的其他種類(lèi)的藥物如下a)生物活性蛋白藥物(如NF-kB的反義寡核苷酸)；b)疫苗制劑抗腫瘤(黑素瘤)疫苗制劑；c)化學(xué)藥物如CNI-1493(一種脒基腙化合物)及氯膦酸鹽(一種二膦酸鹽)。
在該實(shí)施方案中，我們?cè)u(píng)價(jià)了不同溶劑、不同溫度和方法學(xué)變量。用該噴霧方法評(píng)估的藥物是NF-kB的反義寡核苷酸。
在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種通過(guò)噴霧包囊生物活性物質(zhì)的方法，包括a.在水中溶解清蛋白；b.在磷酸鹽緩沖液(PBS)中溶解NF-kB的反義寡核苷酸(寡聚物)；c.將溶解的清蛋白和溶解的NF-kB的反義寡核苷酸(寡聚物)混合在一起；d.將步驟c形成的混合物冷卻；e.提供溶劑；f.冷卻步驟e的溶劑；g.將步驟f的溶劑維持在低溫下，以形成溶劑系統(tǒng)；h.攪拌步驟g的溶劑，將溶解的清蛋白和溶解的NF-kB的反義寡核苷酸(寡聚物)噴霧溶解到溶劑中；i.評(píng)估含微囊化清蛋白藥物微球體的溶劑系統(tǒng)尺寸以獲得微球體；j.在攪拌溶劑系統(tǒng)并維持在低溫下時(shí)用戊二醛交聯(lián)微球體；k.用溶劑洗滌步驟j的微球體；l.測(cè)定步驟k中的微球體大??；及m.將步驟l的微球體冷凍干燥。
上述遞送系統(tǒng)表明NF-kB的反義寡核苷酸可非常有效地抑制吞噬細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞參與的細(xì)胞因子介導(dǎo)的過(guò)程。從這些研究中，其他幾個(gè)申請(qǐng)如下相關(guān)A)細(xì)胞因子相關(guān)疾病a)纖維化綜合征TGF-β的反義化合物可用于抑制纖維化綜合征中TGF-β的參與。
b)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎TNF-α和IL-1-β的反義化合物可用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
c)移植排斥TNF-α和IL-1-β的反義化合物可用于抑制細(xì)胞因子(如TNF-α和IL-1-β)在器官移植時(shí)的釋放。
d)再灌注損傷TNF-α和IL-1-β的反義化合物可用于抑制細(xì)胞因子在再灌注損傷時(shí)的釋放。
e)敗血性休克吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(一種抗氧化劑)可用于抑制細(xì)胞因子(例如TNF-α和IL-1-β)的釋放。該藥物抑制NF-kB的激活作用。NF-kB是一種負(fù)責(zé)激活前炎性細(xì)胞因子的核轉(zhuǎn)錄因子。
B)疫苗遞送系統(tǒng)a)抗腫瘤疫苗微球體可用作與本申請(qǐng)證實(shí)的黑素瘤疫苗制劑類(lèi)似的幾種類(lèi)型疫苗制劑的有效疫苗遞送系統(tǒng)。
b)抗AIDS疫苗微球體可能用作抗AIDS病毒的有效疫苗遞送系統(tǒng)。AIDS病毒實(shí)際上在巨噬細(xì)胞中感染并擴(kuò)增，由于微球體可被巨噬細(xì)胞有效攝入，因此將抗AIDS疫苗制劑加到微球體中可將其直接靶向巨噬細(xì)胞。而且這些微球體可包含抗AIDS藥物，如AZT，從而可直接在已知AIDS病毒擴(kuò)增的位點(diǎn)，即巨噬細(xì)胞中釋放藥物。
C)抗腫瘤持續(xù)性藥物遞送系統(tǒng)a)治療癌癥的白介素-12持續(xù)性釋放微球體考慮到癌癥治療通常是長(zhǎng)期的，對(duì)于治療癌癥治療性藥物的持續(xù)性釋放是一個(gè)令人關(guān)注的問(wèn)題。這樣可能使用更低的劑量而達(dá)到與常規(guī)的非持續(xù)性劑量形式相同的治療效果。隨著生物技術(shù)的出現(xiàn)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，我們的抗腫瘤庫(kù)已很快擴(kuò)展到包括蛋白藥物、肽類(lèi)和細(xì)胞因子類(lèi)。這些新型的武器，盡管有效，但仍需要適當(dāng)?shù)倪f送系統(tǒng)。由于這些藥物本質(zhì)上是蛋白質(zhì)，因此它們可能是血液中酶的靶標(biāo)。因此注射這些藥物時(shí)需要很高的劑量，這不僅花費(fèi)昂貴，而且是潛在危險(xiǎn)的。白介素-12是最近發(fā)現(xiàn)的異二聚體細(xì)胞因子。在多種癌癥的動(dòng)物模型中已表明，白介素-12具有巨大的抗腫瘤潛力。利用遺傳工程學(xué)構(gòu)建的成纖維細(xì)胞，已證實(shí)較低濃度的白介素-12的持續(xù)存在產(chǎn)生與更大濃度但不持續(xù)存在的白介素-12相同的抗腫瘤效果。但是，產(chǎn)生遺傳工程細(xì)胞不太容易，而且由于考慮到所涉及的花費(fèi)和勞動(dòng)力，將其用于大規(guī)模治療甚至更加困難。更好的選擇是形成顆粒藥物遞送系統(tǒng)，例如微球體，這樣不僅可保護(hù)這些蛋白藥物免受血液中酶的作用，而且可維持藥物的釋放。微球體除了具有可用大量生物可降解多聚體進(jìn)行制備的優(yōu)點(diǎn)外，還具有可大規(guī)模生產(chǎn)的另外的優(yōu)點(diǎn)。
我們已評(píng)估了生物可降解清蛋白微球體在維持白介素-12釋放方面的作用。當(dāng)對(duì)具有皮下黑素瘤的C57BL/6小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)給藥時(shí)，如果以周劑量的一半的溶液制劑進(jìn)行給藥微球體，則可顯著延長(zhǎng)存活時(shí)間。微球體劑型通常也產(chǎn)生更低水平的肝腎功能酶，這表明具有更低的毒性作用。
D)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)微球體可用作將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中的有效工具。目前的一些細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法可在轉(zhuǎn)染過(guò)程，例如顯微操作中導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡。由于我們研究所用的微球體大小小于1微米，因此它們很容易被細(xì)胞攝入，從而將微球體中的藥物/物質(zhì)直接轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。
本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)可通過(guò)以下本發(fā)明實(shí)施方案的詳細(xì)描述及參考后附的權(quán)利要求而更加明顯。
附圖簡(jiǎn)述在附圖中舉例說(shuō)明本發(fā)明，其中相同的參考字符或參考表示整個(gè)圖片中相同或相似部分或參數(shù)(除非特別注明)

圖1所示的是利用以水為溶解藥物的水相在5攝氏度制備的不同的油，通過(guò)乳化方法和噴霧方法，NF-kB反義(AS)寡聚物的百分比藥物含量分析。
圖2所示的是利用作為溶解藥物水相的水和橄欖油在不同溫度設(shè)置下制備的批次，通過(guò)乳化方法和噴霧方法，NF-kB反義(AS)寡聚物的百分比藥物含量分析。
圖3所示的是通過(guò)乳化方法和噴霧方法，用橄欖油在10攝氏度制備的不同水相，NF-kB反義(AS)寡聚物的百分比藥物含量分析。
圖4所示的是通過(guò)乳化方法和噴霧方法，用不同的油制備N(xiāo)F-kB反義(AS)寡聚物的微球體的TNF-α水平。
圖5所示的是通過(guò)乳化方法和噴霧方法，在制備N(xiāo)F-kB反義(AS)寡聚物的過(guò)程中使用不同溫度時(shí)的TNF-α水平。
圖6所示的是通過(guò)乳化方法和噴霧方法，在制備N(xiāo)F-kB反義(AS)寡聚物的過(guò)程中測(cè)試的使用不同水相的TNF-α水平。
圖7所示的是在80微克MECA研究中所含的20微克ECA的腫瘤發(fā)病率。
圖8所示的是CNI-1493對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNF-α釋放的影響。
圖9所示的是CNI-1493對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的IL-1-β釋放的影響。
圖10所示的是不同劑量的可溶性(SOL)和微囊化(MC)CNI-1493對(duì)內(nèi)毒素血癥誘導(dǎo)的TNF-α水平的影響。
圖11所示的是不同劑量的可溶性(SOL)和微囊化(MC)CNI-1493對(duì)內(nèi)毒素血癥誘導(dǎo)的IL-1-β水平的影響。
圖12故意省略。
圖13所示的是氯膦酸鹽對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNF-α釋放的影響。
圖14所示的是氯膦酸鹽對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的IL-1-β釋放的影響。
圖15所示的是NF-kB反義(AS)寡聚物對(duì)在微球體(MS)和溶液(Soln)制劑中TNF-α抑制的影響。
圖16所示的是NF-kB反義(AS)寡聚物對(duì)微球體(MS)和溶液(Soln)制劑中IL-1-β水平的影響。
圖17所示的是在內(nèi)毒素休克大鼠模型中，反義NF-kB微球體的劑量應(yīng)答研究的影響。
圖18所示的是在內(nèi)毒素休克大鼠模型中，用NF-kB(微球體和溶液)治療對(duì)TNF-α水平的影響。
圖19所示的是在內(nèi)毒素休克大鼠模型中，用反義NF-kB微球體進(jìn)行同時(shí)治療的劑量應(yīng)答研究對(duì)存活率的影響。
圖20所示的是在內(nèi)毒素休克大鼠模型中，用NF-kB反義寡聚物的微球體和溶液形式同時(shí)(S)處理對(duì)存活率的影響。
圖21所示的是用NF-kB反義寡聚物(微球體和溶液形式)進(jìn)行同時(shí)(S)處理對(duì)TNF-α水平的影響。
圖22所示的是用NF-kB反義寡聚物(微球體和溶液形式)進(jìn)行同時(shí)(S)處理對(duì)存活率的影響。
圖23所示的是用NF-kB反義寡聚物(微球體和溶液形式)進(jìn)行延遲(D)處理對(duì)TNF-α水平的影響。
圖24所示的是用NF-kB反義寡聚物(微球體和溶液形式)進(jìn)行延遲(D)處理對(duì)IL-1-β水平的影響。
圖25所示的是用NF-kB反義寡聚物(微球體和溶液形式)進(jìn)行延遲(D)處理對(duì)存活率的影響。
圖26所示的是在全血模型中，通過(guò)用不同溶解系統(tǒng)制備的NF-kB反義(AS)寡聚物微球體，制備條件對(duì)抑制TNF-α的影響。
圖27所示的是體外PDTC對(duì)細(xì)胞因子水平的影響。
實(shí)施方案的詳細(xì)描述我們首先對(duì)原來(lái)在同時(shí)待審申請(qǐng)中公開(kāi)的乳化方法的擴(kuò)展進(jìn)行描述。
我們進(jìn)一步擴(kuò)展了對(duì)用不同藥物、不同的油在不同過(guò)程溫度及用于溶解藥物的不同水性溶劑制備的微球體的檢測(cè)，還基于最初的專(zhuān)利申請(qǐng)，其中以清蛋白為多聚體基質(zhì)、橄欖油為乳化介質(zhì)，用針對(duì)細(xì)胞因子拮抗劑的單克隆抗體通過(guò)乳化方法制備微球體，評(píng)估了制備方法中的變量。
實(shí)施例1描述了通過(guò)乳化典型的生物活性蛋白，即核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的反義寡核苷酸進(jìn)行包被。過(guò)程參數(shù)擴(kuò)展包括對(duì)低芥酸菜子油(canolaoil)、棉子油(cottonseed oil)和礦物油的檢測(cè)。結(jié)果表明所檢測(cè)的油均能夠很好地工作。其他的生物惰性植物油或其他油，根據(jù)特定的生物惰性，包括但不限于，例如，葵花油、紅花油、豆油、棕櫚油、棕櫚仁油、椰子油、蓖麻油(caster)、花生油、gingley油、魚(yú)油、芝麻油、米糠油等，其所含的亞成分包括但不限于，例如，單不飽和脂肪酸(MUFA)、多不飽和脂肪酸(PUEA)和必需脂肪酸(EFA)及上述混合物。其他礦物油包括但不限于重、輕及各種亞級(jí)分及其組合，包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
對(duì)冷卻溶劑的溫度范圍進(jìn)行檢測(cè)和擴(kuò)展。檢測(cè)了5-40攝氏度的溫度范圍，并得到可以接受的結(jié)果。當(dāng)溫度低于約5攝氏度時(shí)可能導(dǎo)致至少水溶性組分部分凍結(jié)，因此是不可取的。
進(jìn)一步，水相的選擇目前擴(kuò)展到包括但不限于，水、磷酸鹽緩沖液、水加吐溫80及鹽水。
實(shí)施例2描述了典型腫瘤疫苗藥物，即細(xì)胞外抗原的微球體形成及獲得的生物活性。
實(shí)施例3描述了水溶性藥物，即CNI-1493，一種脒基腙的微球體形成及獲得的生物活性。檢測(cè)結(jié)果表明利用本發(fā)明方法微囊化的CNI-1493在減緩內(nèi)毒素或細(xì)胞因子釋放方面比相應(yīng)劑量的可溶性非微囊形式更有效。
實(shí)施例4描述了典型化學(xué)藥物，即氯膦酸鹽，一種二膦酸鹽的微球體形成及獲得的生物活性。
實(shí)施例5描述了典型生物活性蛋白藥物，即NF-kB的反義寡核苷酸的微球體形成及獲得的生物活性。
實(shí)施例6描述了通過(guò)本發(fā)明的新型噴霧方法形成NF-kB的反義寡核苷酸的微球體制劑及獲得的生物活性。
本發(fā)明將結(jié)合以下僅用于舉例說(shuō)明的實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步描述。除非特別規(guī)定，這些實(shí)施例中出現(xiàn)的部分和百分比均以重量計(jì)算。而且應(yīng)注意，除非特別聲明，形成微球體的方法中使用的是橄欖油。
實(shí)施例；第一部分實(shí)施例1生物活性蛋白藥物NF-kB-在敗血性休克中的臨床應(yīng)用-NF-KB反義寡聚物的配制和檢測(cè)A)簡(jiǎn)介NF-kB是一類(lèi)核轉(zhuǎn)錄因子，以與IkB結(jié)合的非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。內(nèi)毒素刺激胞內(nèi)介質(zhì)，導(dǎo)致IkB磷酸化，將NF-kB轉(zhuǎn)位到核中，隨后激活DNA。從而很快產(chǎn)生合成多個(gè)前炎性介導(dǎo)物，包括TNF、IL1和IL6的mRNA。我們已發(fā)現(xiàn)針對(duì)NF-kB的p65亞單位的微囊化反義寡聚物(MSASO)在體外抑制TNF、IL1和IL6。反義化合物由于其可抑制特異蛋白合成的能力而有潛力作為非常有效的治療藥物。但反義治療的一個(gè)限制因素是這些大化合物很難獲得足夠的細(xì)胞內(nèi)滲透。我們以前的工作已表明使用NF-kB反義物通過(guò)微囊化的細(xì)胞內(nèi)遞送提高在細(xì)胞因子抑制的效率。微囊化改善了反義化合物的遞送，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的寡核苷酸很快被轉(zhuǎn)運(yùn)到核內(nèi)。我們以前的研究已通過(guò)在內(nèi)毒素休克及膿毒癥大鼠模型中證實(shí)了針對(duì)NF-kB p65部分的微囊化反義物的效率大大提高證實(shí)了該假設(shè)。
B)通過(guò)清蛋白制備N(xiāo)F-kB的反義寡核苷酸。
1)將50mg人清蛋白溶于2cc無(wú)熱源的水中。
2)將NF-kB的反義寡核苷酸(寡聚物)以25mg/cc的濃度單獨(dú)溶解在磷酸鹽緩沖液(PBS)中。
3)將上述兩種溶液在一起混合約30分鐘。
4)將得到的混合物冷卻到5攝氏度。
5)將20cc橄欖油倒入50cc燒杯中，冷卻到5攝氏度，并在冰浴中維持該溫度。
6)將清蛋白及寡核苷酸混合物加到油中，并用Branson超聲波儀以適中設(shè)置乳化20分鐘。
7)用激光顆粒篩選器估計(jì)含有微囊化清蛋白-藥物微球體的乳劑大小，直到微球體直徑約1微米。
8)將微球體與0.5cc 25％w/v戊二醛溶液交聯(lián)1小時(shí)，并用組織勻漿器以高設(shè)置進(jìn)行恒定攪拌，同時(shí)用冰浴維持在約5攝氏度的溫度。
9)微球體用20cc甲醇洗滌3次，最后用連續(xù)HPLC過(guò)濾器(50、20、10、5和1微米大小)篩分并懸浮在最終的甲醇洗滌物中。
10)將微球體冷凍干燥并儲(chǔ)存在冰箱中直至使用。
在所有情況下，微球體在使用前均懸浮在無(wú)熱源的水或鹽水中。
重復(fù)上述程序，以評(píng)估使用不同類(lèi)型的油為乳化介質(zhì)，除了上述的5攝氏度外，對(duì)不同溫度在制備中的影響也進(jìn)行了評(píng)估。最后，除水外，也評(píng)估了不同溶劑作為介質(zhì)溶解藥物的能力。被評(píng)估的每個(gè)參數(shù)的詳細(xì)說(shuō)明如下a)不同油的影響在研究中對(duì)不同的油，例如低芥酸菜子油、棉子油和礦物油進(jìn)行了評(píng)估，并與以前制備微球體所用的橄欖油進(jìn)行比較。應(yīng)理解可以使用任何生物惰性的植物油或礦物油。
b)不同溫度的影響在較寬的溫度變化，如5、10、30和40攝氏度下制備微球體。因此本發(fā)明的方法可在約5-40攝氏度的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。
c)溶解藥物的不同水相的影響除水和磷酸鹽緩沖液(PBS)之外，使用含吐溫TM-80(聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯，購(gòu)自ICI Americas，Inc.)的水和鹽水檢驗(yàn)是否存在顯著差異。
用體外全血模型進(jìn)行評(píng)估TNFα抑制作用的藥物含量分析和效率。對(duì)以下制備程序中的變量進(jìn)行評(píng)估。
C)實(shí)驗(yàn)方法a)藥物含量分析通過(guò)我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)展的HPLC進(jìn)行藥物含量分析。
b)用體外全血模型評(píng)估TNFα抑制作用的效率研究。
用全血模型評(píng)估制劑的藥物效率，簡(jiǎn)述如下將血液倒入含EDTA的lavender top管中。將血液分成3個(gè)5ml的等份樣品，并用以下批次的微球體的一種預(yù)處理1小時(shí)并用內(nèi)毒素(100mcg/m1)刺激。在內(nèi)毒素刺激0和4小時(shí)之后取樣并測(cè)定TNF-α水平。由于加入微囊化NF-kB寡聚物而產(chǎn)生的細(xì)胞因子抑制效率與同時(shí)待審專(zhuān)利申請(qǐng)中所述用橄欖油制備的微球體進(jìn)行比較。
D)結(jié)果不同油對(duì)藥物含量分析的影響圖1所示的是通過(guò)乳化方法和噴霧方法用不同的油，以水為水相溶解藥物，在5攝氏度制備的NF-kB反義(AS)寡聚物的百分比藥物含量分析。各批次之間在p＜0.05無(wú)顯著性差異。雖然預(yù)計(jì)可使用輕礦物油和其他植物性油，但也使用了重礦物油(因?yàn)樵撔g(shù)語(yǔ)是本領(lǐng)域熟練人員所熟知的)。溫度變化對(duì)藥物含量分析的影響圖2所示的是通過(guò)乳化方法和噴霧方法，用作為溶解藥物的水相的水和橄欖油，在不同溫度設(shè)置下制備的批次的NF-kB反義(AS)寡聚物的百分比藥物含量分析。各批次之間在p＜0.05無(wú)顯著性差異。在約5攝氏度以下，水相開(kāi)始凝結(jié)，從而降低產(chǎn)量和活性。
使用的不同水相對(duì)藥物含量分析的影響圖3所示的是通過(guò)乳化方法和噴霧方法(如下述實(shí)施例6的詳細(xì)描述)用橄欖油在10攝氏度制備的不同的水相的NF-kB反義(AS)寡聚物的百分比藥物含量分析。各批次之間在p＜0.05無(wú)顯著性差異。不同的油對(duì)TNFα抑制的影響圖4所示的是通過(guò)乳化方法和噴霧方法用不同的油制備的NF-kB反義(AS)寡聚物微球體的TNFα水平。用水溶解藥物，溫度維持在5攝氏度。用橄欖油和其他油制備的各種批次之間在p＜0.05無(wú)顯著性差異。溫度變量對(duì)TNFα抑制的影響圖5所示的是通過(guò)乳化方法和噴霧方法在NF-kB反義(AS)寡聚物的制備過(guò)程中使用不同溫度的TNFα水平。在該過(guò)程中使用的是橄欖油。在不同的溫度設(shè)置下，各批次之間在p＜0.05無(wú)顯著性差異。使用的不同水相對(duì)TNFα抑制的影響圖6所示的是通過(guò)乳化方法和噴霧方法在NF-kB反義(AS)寡聚物的制備過(guò)程中檢測(cè)的用不同水相的TNFα水平。用橄欖油在10攝氏度制備微球體。使用不同的水相制備的各批次之間在p＜0.05無(wú)顯著性差異。
實(shí)施例2-腫瘤疫苗藥物-在腫瘤疫苗中以微球體為佐劑或聯(lián)合佐劑的腫瘤保護(hù)研究A)簡(jiǎn)介免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)是一個(gè)需要用完整的免疫系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估的綜合和復(fù)雜的過(guò)程。因此用小鼠的腫瘤模型來(lái)評(píng)估微囊化細(xì)胞外抗原(MECA)疫苗制劑。疫苗中所用的抗原來(lái)源于在培養(yǎng)中生長(zhǎng)的B16鼠黑素瘤細(xì)胞。并使用與B16鼠黑素瘤細(xì)胞同源的C57BL/6小鼠。該疫苗是一種預(yù)防性腫瘤疫苗，首先對(duì)小鼠進(jìn)行接種，以誘導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答。然后刺激小鼠，從而測(cè)定抗腫瘤應(yīng)答是否被誘導(dǎo)有能力以抑制鼠黑素瘤的建立。
B)制備黑素瘤疫苗制劑。
根據(jù)實(shí)施例1描述的方法制備微囊化疫苗制劑。
C)實(shí)驗(yàn)方法。
免疫和腫瘤保護(hù)研究以戊二醛為交聯(lián)劑，通過(guò)油包水的乳化交聯(lián)技術(shù)制備MECA(總量80μg MECA中含20μgECA)和空白MP(微粒)。為了評(píng)估在第一次研究(共80μg MECA)中使用的等量的微粒中20μg胞外抗原的抗腫瘤作用，對(duì)3組8-12周齡的C57BL/6雌性小鼠(n＝5)進(jìn)行皮下接種。這3組分別用20μg包含于總量為80μg微囊化胞外抗原MECA，并用PBS重懸到總體積為100μl中的胞外抗原(ECA)、溶解在PBS中的胞外抗原溶液(ECA solu)及溶解在PBS中的空白微粒(空白MP)進(jìn)行接種。對(duì)小鼠每周接種一次，接種3周，共注射4次。最后一次接種7天后，用7×105成活的B16黑素瘤細(xì)胞對(duì)小鼠在對(duì)側(cè)位置進(jìn)行皮下刺激，如上所述。然后對(duì)小鼠的腫瘤發(fā)展觀察60天，并記錄腫瘤的大小和腫瘤的發(fā)病率。
D)結(jié)果和討論C57BL/6雌性小鼠用MECA(20μgECA包含于總量為80μg的MECA中)，空白MP或ECA溶液進(jìn)行皮下接種。第一次免疫接種后，小鼠每周接種一次，共進(jìn)行3周。最后一次接種7天后，以7×105成活的同源B16黑素瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)離的位點(diǎn)接種C57BL/6小鼠。然后監(jiān)測(cè)小鼠的腫瘤發(fā)展，并報(bào)告腫瘤的發(fā)病率(圖7)。本研究中MECA組在第60天仍有80％無(wú)腫瘤。相反在空白微粒組中有40％無(wú)腫瘤，ECA溶液組中有0％的小鼠無(wú)腫瘤。
本研究表明微囊化腫瘤抗原具有佐劑作用，可通過(guò)靶向?qū)Ｂ毧乖蔬f細(xì)胞而誘導(dǎo)腫瘤免疫。另外，在第60天空白微粒組有40％的小鼠無(wú)腫瘤的結(jié)果表明，由于BSA和B700腫瘤抗原之間具有同源性，因此BSA微?？赡苁荁16黑素瘤很好的佐劑。
圖7所示的是包含于80微克MECA研究中的20微克ECA的發(fā)病率。用總體積100微升PBS對(duì)小鼠進(jìn)行皮下接種，共注射4次。每周進(jìn)行1次接種。最后一次接種7天后，用7×105成活的腫瘤細(xì)胞(B16)進(jìn)行刺激，并監(jiān)測(cè)MECA組和對(duì)照組ECA溶液(ECA SOLN)和空白微粒(空白MP)組的發(fā)病率。
E)結(jié)論。
體內(nèi)劑量應(yīng)答研究表明，在本研究中20μg包含于80μg MECA中的ECA的接種劑量可很好的進(jìn)行工作。該MECA疫苗的接種劑量可在直到60天的研究期內(nèi)仍有80％的C57BL/6小鼠保持無(wú)腫瘤。本研究表明微囊化腫瘤抗原通過(guò)靶向?qū)Ｂ毧乖蔬f細(xì)胞在誘導(dǎo)腫瘤免疫中具有佐劑作用。另外，在第60天空白微粒組有40％的小鼠無(wú)腫瘤的結(jié)果表明，由于BSA和B700腫瘤抗原之間具有同源性，因此BSA微粒可能是B16黑素瘤極好的佐劑。
B16鼠源黑素瘤是一種非常嚴(yán)格的腫瘤模型。因此更可能代表人的癌癥情況。這些結(jié)果表明微粒誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的抗腫瘤作用。
實(shí)施例3-化學(xué)藥物，CNI-1493一種脒基腙化合物-在敗血性休克中的應(yīng)用-微囊化CNI-1493的配制和檢測(cè)-通過(guò)微囊化CNI-1493在實(shí)驗(yàn)性敗血性休克中預(yù)防致死率和抑制前炎性細(xì)胞因子A)簡(jiǎn)介動(dòng)物的內(nèi)毒素血癥與由激活的巨噬細(xì)胞和多形核細(xì)胞釋放的多效性細(xì)胞因子，例如TNFα和IL-1-β有關(guān)。抑制這些細(xì)胞因子作用的實(shí)驗(yàn)性藥物，例如單克隆中和抗體(TNFα單克隆抗體)、受體拮抗劑(IL-1受體拮抗劑)和受體融合蛋白已在動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)中對(duì)其在敗血性休克中的效率進(jìn)行了評(píng)價(jià)。最近，新開(kāi)發(fā)的水溶性四價(jià)脒基腙化合物，命名為“CNI-1493”(N，N’-雙[3，5-二乙酰苯基]癸二酰胺脒腙四氯化氫)顯示在降低動(dòng)物中脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的TNFα、IL-1-β和IL-6的釋放中是有效的。
我們先前已報(bào)道，在各種體外和體內(nèi)疾病模型中，微囊化細(xì)胞因子中和抗體與可溶形式相比增加它們的作用效果。同樣，由于微囊化藥物被巨噬細(xì)胞靶向吸收，其他細(xì)胞因子拮抗劑的微球體形式也比相應(yīng)的可溶形式更有效。在本實(shí)施例中，我們通過(guò)結(jié)合的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)對(duì)微球體形式的新開(kāi)發(fā)的化合物CNI-1493的功效進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用體外內(nèi)毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放全血模型和內(nèi)毒素血癥和大腸桿菌誘導(dǎo)的腹膜炎的體內(nèi)模型對(duì)可溶形式和微囊形式的CNI-1493的功效進(jìn)行比較評(píng)估。
B)CNI-1493微球體的制備。
根據(jù)實(shí)施例1制備微囊化CNI-1493制劑。
C)實(shí)驗(yàn)方法a)全血模型中體外內(nèi)毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放在EDTA中收集5只大鼠中每個(gè)樣品(n)的血液(每ml血含1.5mg EDTA)，并匯集在一起。在基線血漿樣品之后將血液等分為5組。每組有6個(gè)重復(fù)。每組進(jìn)行以下一種處理0.25、0.5或1.0微克/毫升鹽水或可溶形式的CNI-1493或空白微球體(MC)，或0.25、0.5或1.0微克/毫升MC形式的CNI-1493。所有組在含5％CO2的氣氛中，37℃下溫育。溫育2小時(shí)后，向所有組中加入獲自大腸桿菌的內(nèi)毒素0113(100ng/ml)(Associates of Cape Cod，Wood Hole，Massachusetts)，另外溫育24小時(shí)。在加入內(nèi)毒素2、4、6和24小時(shí)后定時(shí)收集血漿樣品，并通過(guò)改進(jìn)的堿性磷酸酶ELISA技術(shù)測(cè)定TNFα和IL-1-β。
b)內(nèi)毒素血癥體內(nèi)模型每組共有4只大鼠。每組大鼠進(jìn)行以下一種靜脈注射處理1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg或10mg/kg鹽水或可溶形式的CNI-1493或空白MC，或1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg或10mg/kg MC形式的CNI-1493。所有的大鼠也用15mg/kg從大腸桿菌獲得的內(nèi)毒素0113(Associates of Cape Cod，Wood Hole，Massachusetts)進(jìn)行靜脈注射，并監(jiān)測(cè)7天的存活率。在加入內(nèi)毒素0、2、4、8、24和48小時(shí)后，從大鼠的尾靜脈處收集血液，并用ELISA技術(shù)測(cè)定TNFα和IL-1-β。
c)大腸桿菌誘導(dǎo)的腹膜炎的體內(nèi)模型每組共6只大鼠。每組大鼠進(jìn)行以下一種處理靜脈注射鹽水，或靜脈注射空白MC，或靜脈注射2mg/kg或5mg/kg可溶形式的CNI-1493，或靜脈注射2mg/kg或5mg/kg MC形式的CNI-1493，或靜脈注射2mg/kg或5mg/kg可溶形式的CNI-1493及腹膜注射15mg/kg慶大霉素，或靜脈注射2mg/kg或5mg/kg MC形式的CNI-1493及腹膜注射15mg/kg慶大霉素。所有的大鼠均腹膜注射1×1010CFU大腸桿菌活菌，并監(jiān)測(cè)5天的存活率。在注射大腸桿菌0、2、4、8、24和48小時(shí)后，從大鼠的尾靜脈處收集血液，并用ELISA技術(shù)測(cè)定TNFα和IL-1-β。
D)結(jié)果和討論全血模型中內(nèi)毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放CNI-1493對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNFα和IL-1-β釋放的影響分別如圖8和9所示?？瞻譓C的存在并不顯著影響內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNFα和IL-1-β的釋放。劑量為0.25微克/毫升可溶形式的CNI-1493不改變內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNFα和IL-1-β的釋放，但0.5和1.0微克/毫升CNI-1493可顯著降低內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNFα和IL-1-β的釋放。另外，含0.25、0.5和1.0微克/毫升CNI-1493的所有劑量的MC形式的CNI-1493顯著(p＜0.05)降低內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNFα和IL-1-β的釋放。另外，所有劑量的MC形式的CNI-1493對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放的降低程度明顯大于相應(yīng)的可溶形式的CNI-1493。
內(nèi)毒素血癥體內(nèi)模型存活率數(shù)據(jù)如表1所示。
表1致死性?xún)?nèi)毒素血癥中使用可溶形式(Sol.)和微囊化(MC)CNI-1493的存活率的比較。
*-使用Mann-Whitney檢測(cè)，當(dāng)與相等劑量的Sol.CNI-1493或單獨(dú)內(nèi)毒素進(jìn)行比較時(shí)，在p＜0.05的顯著性。
所有用1、2、5mg/kg可溶形式的CNI-1493處理的動(dòng)物在注射內(nèi)毒素24小時(shí)之內(nèi)均全部死亡，而50％用10mg/kg可溶形式的CNI-1493處理的動(dòng)物和25％用1mg/kg劑量的MC形式的CNI-1493處理的動(dòng)物在注射內(nèi)毒素后仍然存活7天。另外，所有(100％)經(jīng)過(guò)2、5和10mg/kgMC形式的CNI-1493處理的動(dòng)物在注射內(nèi)毒素后都存活7天。本研究的細(xì)胞因子水平如圖10和11所示(圖12特意省略)?？扇苄问胶蚆C形式的CNI-1493對(duì)TNFα水平的降低程度較大，而對(duì)IL-1-β水平的降低程度較小。但MC形式的CNI-1493在降低TNFα和IL-1-β二者的水平上顯著好于可溶形式的CNI-1493。
敗血性休克的大腸桿菌誘導(dǎo)的腹膜炎模型存活數(shù)據(jù)如表2所示。
表2大腸桿菌誘導(dǎo)的腹膜炎中使用可溶形式(Sol.)和微囊化(MC)CNI-1493的存活率的比較。
*-使用Mann-Whitney檢測(cè)，當(dāng)與大腸桿菌+鹽水組或大腸桿菌+空白微球體組進(jìn)行比較時(shí)，在p＜0.05的顯著性。
在注射大腸桿菌4到8小時(shí)內(nèi)，所有用鹽水或空白MC或2mg/kg可溶形式的CNI-1493或5mg/kg可溶形式的CNI-1493或2mg/kg MC形式的CNI-1493預(yù)處理的動(dòng)物均全部死亡。用5mg/kg MC形式的CNI-1493或2mg/kg可溶形式的CNI-1493及慶大霉素處理后，存在存活率為17％的針對(duì)致死率的最小保護(hù)。在經(jīng)過(guò)5mg/kg可溶形式的CNI-1493預(yù)處理的組中，給藥慶大霉素可使存活率增加到50％，在經(jīng)過(guò)2mg/kg MC形式的CNI-1493預(yù)處理的組中可達(dá)到67％，在經(jīng)過(guò)5mg/kg MC形式的CNI-1493預(yù)處理的組中可達(dá)到83％?？扇苄问胶蚆C形式的CNI-1493均降低大腸桿菌誘導(dǎo)的TNFα和IL-1-β水平，但MC形式的CNI-1493在降低大腸桿菌誘導(dǎo)的TNFα和IL-1-β的水平上顯著優(yōu)于可溶形式的CNI-1493。
微囊化CNI-1493在體外和體內(nèi)模型中顯著提高效率。結(jié)果表明MC形式的CNI-1493在降低內(nèi)毒素或大腸桿菌誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放和致死率上比相應(yīng)劑量的可溶形式的CNI-1493更有效。在以前用微囊化細(xì)胞因子中和抗體的研究中，我們發(fā)現(xiàn)與相應(yīng)的可溶形式的中和抗體相比較，在抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放和預(yù)防由于內(nèi)毒素或大腸桿菌誘導(dǎo)的腹膜炎的致死率方面功效的改善。微囊化合物的效率(持續(xù)釋放方式除外)通過(guò)吞噬細(xì)胞的胞內(nèi)釋放而進(jìn)行放大。在吞噬細(xì)胞吞噬后從微球體中釋放的CNI-1493提供更高的胞內(nèi)濃度，從而通過(guò)胞內(nèi)作用機(jī)制有效抑制前炎性細(xì)胞因子。以前的研究已表明可溶性CNI-1493可抑制來(lái)自外周血單核細(xì)胞的LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子，如TNFα、IL-1-β和IL-6，如本研究所見(jiàn)。推測(cè)CNI-1493抑制TNFα合成的機(jī)制在翻譯或翻譯后水平。在本研究中，MC形式的CNI-1493在體外和體內(nèi)模型中可強(qiáng)烈抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNFα和IL-1-β水平，而可溶形式的CNI-1493抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNFα和IL-1-β水平的程度較小。在體外全血模型中，被最低劑量的MC形式的CNI-1493(0.25microM)抑制的內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNFα水平的程度與最高劑量(1.0mM)的可溶形式的CNI-1493相似。這表明理論上MC形式的CNI-1493在抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNFα合成方面與至少4倍可溶形式的CNI-1493的效力相同。
MC形式的CNI-1493(2mg/kg)可對(duì)致死性?xún)?nèi)毒素血癥提供完全的保護(hù)作用，而相同劑量的可溶形式的CNI-1493(2mg/kg)處理，沒(méi)有存活，而用5倍劑量可溶形式的CNI-1493(10mg/kg)處理，僅有50％的存活率。MC形式的CNI-1493對(duì)內(nèi)毒素血癥致死率的完全保護(hù)作用表明，微囊化遞送系統(tǒng)具有更高的效率。與慶大霉素與可溶形式的CNI-1493聯(lián)合使用(50％)相比較，在劑量為5mg/kg CNI-1493時(shí)，慶大霉素和MC形式的CNI-1493聯(lián)合使用的大腸桿菌誘導(dǎo)的腹膜炎模型中的存活率更高(83％)。在本致死性感染模型中，可溶形式和MC形式均不能抑制致死率，除非慶大霉素與CNI-1493聯(lián)合使用。這表明在幾種嚴(yán)重的感染情況下，抗生素的治療是非常必要的。腹膜炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵驯砻?，?duì)單獨(dú)用抗生素或單獨(dú)可溶形式的TNFα中和抗體進(jìn)行治療的抗性。實(shí)際上，以前沒(méi)有研究報(bào)道除了聯(lián)合使用抗生素和微囊化細(xì)胞因子拮抗劑治療外，在該模型中用可溶形式的細(xì)胞因子拮抗劑處理的改善存活率。
總之，我們?cè)隗w外全血模型中已證明微囊化CNI-1493高效抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNFα和IL-1-β的釋放。改善的功效已在敗血性休克的內(nèi)毒素血癥和大腸桿菌腹膜炎模型中產(chǎn)生顯著更佳的存活率。
實(shí)施例4
-化學(xué)藥物-氯膦酸鹽-應(yīng)用-腎小球性腎炎-清蛋白微囊化的氯膦酸鹽引起的巨噬細(xì)胞耗損巨噬細(xì)胞依賴(lài)的腎小球性腎炎中細(xì)胞因子釋放的衰減A)簡(jiǎn)介巨噬細(xì)胞通過(guò)釋放細(xì)胞因子、化學(xué)因子和其他物質(zhì)而在炎癥過(guò)程中具有重要作用。可通過(guò)一種水溶性化合物——氯膦酸鹽引起的巨噬細(xì)胞耗損來(lái)評(píng)估巨噬細(xì)胞在各種炎癥介導(dǎo)的疾病中的作用。氯膦酸鹽是一種二膦酸鹽，是破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨質(zhì)再吸收過(guò)程的有效抑制劑，在臨床上用作治療代謝性骨病。游離(溶液)形式的氯膦酸鹽在全身給藥時(shí)對(duì)巨噬細(xì)胞功能的作用很小。但含有氯膦酸鹽的脂質(zhì)體很容易被巨噬細(xì)胞吞噬，從而造成肝、脾、淋巴結(jié)和腹膜腔的巨噬細(xì)胞及全身循環(huán)的單核細(xì)胞的耗損。我們已開(kāi)發(fā)一種用清蛋白微囊化氯膦酸鹽的方法，該法比使用脂質(zhì)體具有幾種優(yōu)勢(shì)。清蛋白可作為生物可兼容的多聚體基質(zhì)，從而形成各種大小的微球體(MS)，該微球體比脂質(zhì)體穩(wěn)定性更大，更容易進(jìn)行制備。清蛋白是一種生物可降解的無(wú)毒物質(zhì)，具有高效的微囊化效率。本研究的目的是測(cè)定含氯膦酸鹽的清蛋白MS是否1)將產(chǎn)生全身性巨噬細(xì)胞耗損，2)在體外對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNFα和IL-1-β釋放有作用，及3)在大鼠的實(shí)驗(yàn)性腎小球性腎炎(GN)中對(duì)巨噬細(xì)胞滲透有作用。結(jié)果表明，氯膦酸鹽MS有效耗損巨噬細(xì)胞，降低內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNFα和IL-1-β的釋放，抑制實(shí)驗(yàn)性GN誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞滲透到腎小球中。
B)微球體的制備。
微囊化氯膦酸鹽根據(jù)實(shí)施例1進(jìn)行制備。
C)實(shí)驗(yàn)方法a)在大鼠全血模型中比較游離形式和微球體形式的氯膦酸鹽的體外效率將6到7只重200-500克Fisher大鼠(F-344)(從Harlan Sprague-Dawley獲得)經(jīng)心臟穿刺采血，并對(duì)每個(gè)“n”合并。向每毫升血中加入10微升15％EDTA溶液，抑制血液凝聚。將血液等分，對(duì)每毫升血液分別加入25、50和100μg溶解在鹽水中的游離氯膦酸鹽或50、100和200μg氯膦酸鹽MS(由于微囊化氯膦酸鹽制劑中清蛋白∶氯膦酸鹽的比率為1∶1，因此分別相當(dāng)于25、50和100μg游離氯膦酸鹽)。來(lái)自每只大鼠的一份血液也用50μl鹽水或400μg空白MS進(jìn)行處理。2小時(shí)后加入100ng/ml內(nèi)毒素，然后將血液樣品在5％CO2的氣氛中，37℃溫育24小時(shí)。1000xg離心10分鐘，收集基線、2、4、6和24小時(shí)的血漿樣品，并用我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)展的改進(jìn)堿性磷酸酶ELISA技術(shù)測(cè)定TNFα和IL-1-β。
b)健康大鼠和具有抗GBM GN的大鼠中氯膦酸鹽引起的巨噬細(xì)胞耗損通過(guò)用溶解在弗氏完全佐劑(FCA，Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri USA)中的大鼠腎的膜級(jí)分重復(fù)免疫綿羊而獲得抗GBM球蛋白。將綿羊血清針對(duì)大鼠紅細(xì)胞加熱去互補(bǔ)并吸收兩次(體積比為10％)。用終濃度50％的硫酸銨沉淀制備球蛋白級(jí)分并針對(duì)磷酸鹽緩沖液充分透析。通過(guò)向從動(dòng)物服務(wù)中心(Monash University，Clayton，Victoria，Australia)獲得的重100-150克的Sprague-Dawley雄性大鼠靜脈注射劑量為100μg/gm體重的綿羊抗大鼠GBM球蛋白而引起GN。在引起抗GBM GN 48小時(shí)之前，對(duì)一組大鼠用5mg氯膦酸鹽MS(假設(shè)含有重量不超過(guò)50％的氯膦酸鹽)處理，而另一組不用氯膦酸鹽處理。以一組不進(jìn)行任何抗GBM GN處理的健康正常大鼠作為對(duì)照。在注射抗GBM 72小時(shí)后，將所有的大鼠(包括健康對(duì)照大鼠)處死，從而獲得脾、肝和腎的組織樣品。然后將組織樣品在高碘酸鹽-賴(lài)氨酸-低聚甲醛中固定4小時(shí)，用7％蔗糖溶液洗滌，然后凍存在液氮冷凍的異戊烷中。
將凍存組織在低溫保持器中切成4mm的切片。用三層免疫過(guò)氧化物酶技術(shù)對(duì)組織切片進(jìn)行染色。針對(duì)大鼠ED1的小鼠單克隆抗體，其是與細(xì)胞質(zhì)抗原反應(yīng)的pan-巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，作為添加的一抗。然后以濃度為1∶100加入第二層兔抗鼠IgG球蛋白(Dako，Glostrup，Denmark)。然后以濃度1∶100加入過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的鼠免疫球蛋白(Dako，Glostrup，Denmark)。然后將切片與二氨基聯(lián)苯胺(Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri)溫育，并用蘇木素(Harris haemotoxylin)進(jìn)行負(fù)染色。脾中巨噬細(xì)胞的數(shù)目通過(guò)計(jì)算10×1mm2紅髓區(qū)中ED1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并平均為細(xì)胞/mm2而獲得。肝中Kupffer細(xì)胞的數(shù)目通過(guò)計(jì)算10×1mm2肝索區(qū)中ED1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并平均為細(xì)胞/mm2而獲得。循環(huán)系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞以循環(huán)白細(xì)胞的比例進(jìn)行計(jì)算。
D)結(jié)果和討論我們的研究結(jié)果表明包被在清蛋白中的小劑量氯膦酸鹽可有效耗損大鼠肝、脾、腎和外周血中ED1陽(yáng)性巨噬細(xì)胞。氯膦酸鹽MS還迅速降低內(nèi)毒素刺激的TNFα和IL-1-β釋放，比游離(溶液)形式的氯膦酸鹽更顯著，并抑制巨噬細(xì)胞向大鼠實(shí)驗(yàn)性抗GBM GN過(guò)程中積累的腎小球中進(jìn)行滲透。
已證明巨噬細(xì)胞耗損在評(píng)價(jià)巨噬細(xì)胞對(duì)病理狀態(tài)發(fā)展的作用上是一個(gè)非常有用的工具。
氯膦酸鹽是一種二膦酸鹽，在游離形式下對(duì)巨噬細(xì)胞的存活力有很小的作用，但包被在脂質(zhì)體或MS(如本研究)中，則可在24-48小時(shí)內(nèi)造成巨噬細(xì)胞群的暫時(shí)耗損。由氯膦酸鹽脂質(zhì)體造成的巨噬細(xì)胞耗損是由于細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡而造成的。我們推測(cè)氯膦酸鹽MS具有相同的作用機(jī)制。
如本研究所見(jiàn)，用氯膦酸鹽MS預(yù)處理后對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNFα和IL-1-β釋放的降低已由別人通過(guò)氯膦酸鹽脂質(zhì)體而發(fā)現(xiàn)。也已表明氯膦酸鹽脂質(zhì)體可在鼠中降低細(xì)胞因子的基因表達(dá)。我們也發(fā)現(xiàn)，在全血模型中，與游離形式的氯膦酸鹽相比較，氯膦酸鹽MS更大程度降低內(nèi)毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的釋放。含有不超過(guò)100μg游離氯膦酸鹽的最高劑量的氯膦酸鹽MS幾乎可完全抑制TNFα和IL-1-β釋放。氯膦酸鹽MS的作用機(jī)制可能是由于以與脂質(zhì)體相似的方式對(duì)含氯膦酸鹽的清蛋白MS進(jìn)行吞噬，然后在胞內(nèi)釋放氯膦酸鹽，從而造成由于巨噬細(xì)胞的死亡導(dǎo)致的細(xì)胞因子釋放的抑制。氯膦酸鹽對(duì)細(xì)胞因子釋放的抑制對(duì)治療以前炎性細(xì)胞因子釋放為特征的疾病可能是非常有利的。
以前的研究已表明，巨噬細(xì)胞在GN中腎損傷的誘導(dǎo)和發(fā)展中具有重要作用。GN的一個(gè)特點(diǎn)是蛋白尿和巨噬細(xì)胞滲透。我們的研究組以前已發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)性GN中氯膦酸鹽MS降低巨噬細(xì)胞滲透。我們已表明抗GBM誘導(dǎo)的GN造成巨噬細(xì)胞滲透(8.2個(gè)細(xì)胞/腎小球橫截面)，用氯膦酸鹽MS進(jìn)行處理后抑制巨噬細(xì)胞滲透(2.2個(gè)細(xì)胞/腎小球橫截面)，類(lèi)似本研究所見(jiàn)。另外，我們也已表明氯膦酸鹽MS(8.4mg/24小時(shí))也可將抗GBMGN誘導(dǎo)的蛋白尿(43mg/24小時(shí))顯著降低到正常健康大鼠中發(fā)明的相同的水平(5.3mg/24小時(shí))。氯膦酸鹽MS可耗損GN中的巨噬細(xì)胞，因此在治療上是有用的。
氯膦酸鹽對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNFα和IL-1-β釋放的作用分別如圖13和14所示?？瞻譓S的存在并不顯著影響內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNFα和IL-1-β的釋放。低(25μg/ml)和中(50μg/ml)劑量的游離氯膦酸鹽并不改變內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNFα和IL-1-β的釋放，但更高劑量(100μg/ml)游離氯膦酸鹽顯示降低內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNFα和IL-1-β的釋放的趨勢(shì)。另外，含25、50和100μg/ml相當(dāng)?shù)挠坞x氯膦酸鹽的所有劑量的氯膦酸鹽MS顯著降低內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNFα和IL-1-β的釋放(p＜0.05)。
對(duì)ED1陽(yáng)性巨噬細(xì)胞染色的組織切片表明，與健康對(duì)照大鼠相比較，接受氯膦酸鹽處理的大鼠的肝和腎中的ED1陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞顯著降低(p＜0.001)(參見(jiàn)表3)。
表3抗GBM GN的大鼠中氯膦酸鹽MS對(duì)巨噬細(xì)胞耗損的影響
a白細(xì)胞總數(shù)的百分比；*-在p＜0.001統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
外周血中的循環(huán)單核細(xì)胞也顯著降低(表3，p＜0.001)。同樣，ED1陽(yáng)性巨噬細(xì)胞染色的腎切片表明，沒(méi)有巨噬細(xì)胞滲透到正常健康腎的腎小球中，也沒(méi)有誘導(dǎo)由ED1陽(yáng)性巨噬細(xì)胞滲透造成的抗GBM GN。用氯膦酸鹽MS預(yù)處理在抗GBM GN中顯著降低巨噬細(xì)胞的滲透。
總之，這些研究表明含有氯膦酸鹽的清蛋白MS在大鼠中是一個(gè)全身性巨噬細(xì)胞耗損的有效工具。氯膦酸鹽MS引起的巨噬細(xì)胞耗損降低前炎性細(xì)胞因子，并改善已證實(shí)是巨噬細(xì)胞依賴(lài)的實(shí)驗(yàn)性抗腎小球基膜GN。巨噬細(xì)胞的暫時(shí)性耗損可作為巨噬細(xì)胞依賴(lài)的疾病治療的一個(gè)特征。
圖13所示的是在大鼠全血模型中游離形式的氯膦酸鹽(CLON)和微球體(MS)形式的CLON對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNF-α水平的影響。
向每毫升血中加入25、50和100μg溶解在鹽水中的游離氯膦酸鹽，或50、100和200μg溶解在鹽水中的氯膦酸鹽MS(分別相當(dāng)于25、50和100μg游離氯膦酸鹽)。在所有組中，鹽水組每毫升血加入50μl鹽水，而空白MS組每毫升血加入400μg空白MS。2小時(shí)后加入100ng/ml內(nèi)毒素，然后將血液在5％CO2的氣氛中，37℃溫育24小時(shí)。內(nèi)毒素刺激后的血漿水平如本圖所示。在p＜0.05的水平上，MS形式的CLON降低內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNFα的水平顯著好于游離形式的CLON。
圖14所示的是在大鼠全血模型中游離形式的氯膦酸鹽(CLON)和微球體(MS)形式的CLON對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的IL-1-β水平的影響。每毫升血加入25、50和100μg溶解在鹽水中的游離氯膦酸鹽，或50、100和200μg溶解在鹽水中的氯膦酸鹽MS(分別相當(dāng)于25、50和100μg游離氯膦酸鹽)。在所有組中，鹽水組每毫升血加入50μl鹽水，而空白MS組每毫升血加入400μg空白MS。2小時(shí)后加入100ng/ml內(nèi)毒素，然后將血液在5％CO2氣氛中，37℃溫育24小時(shí)。內(nèi)毒素刺激后的血漿水平如本圖所示。在p＜0.05的水平上，MS形式的CLON降低內(nèi)毒素誘導(dǎo)的IL-1-β的水平顯著好于游離形式的CLON。
實(shí)施例5-生物活性蛋白藥物-NF-KB-應(yīng)用-敗血性休克-制備方法-乳化方法-含細(xì)胞因子拮抗劑，即NF-KB反義寡聚物(生物活性蛋白藥物)微球體的制備-在全血模型、內(nèi)毒素休克模型和腹膜炎模型中的評(píng)估-微囊化的NF-KB反義寡聚物一種抑制前炎性細(xì)胞因子的新方式
A)簡(jiǎn)介反義寡核苷酸與其特異的mRNA結(jié)合后可能產(chǎn)生單個(gè)蛋白合成的抑制作用。但反義化合物不足量的細(xì)胞內(nèi)滲透限制了其作用效果。包含在微囊化清蛋白中的反義化合物則有利于巨噬細(xì)胞的正常吞噬作用，以將反義寡核苷酸遞送到胞內(nèi)，從而提高寡聚物對(duì)核和胞質(zhì)mRNA的暴露水平。將熒光標(biāo)記的寡核苷酸顯微注射到巨噬細(xì)胞中，在幾分鐘內(nèi)即出現(xiàn)在核內(nèi)，從而立即與合成的mRNA相互作用。
我們實(shí)驗(yàn)室的研究已表明清蛋白微囊1)在體外和體內(nèi)可很快的被巨噬細(xì)胞吞噬，2)在肝、脾、腎和血液中分布在大于90％的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中，和3)遷移到感染區(qū)。以前的研究我們已表明，使用體內(nèi)致死性?xún)?nèi)毒素休克模型和感染性腹膜炎模型中，微囊化TNF和IL1中和抗體在體外細(xì)胞因子抑制和動(dòng)物存活率方面均有所提高。因此，微囊化藥物遞送直接靶向分泌大部分前炎性細(xì)胞因子的巨噬細(xì)胞中，可提高這些化合物的療效。
最近已對(duì)NF-kB進(jìn)行研究，認(rèn)為它是一種負(fù)責(zé)前炎性細(xì)胞因子，如TNF和IL1合成的核轉(zhuǎn)錄因子。其他參與前炎性過(guò)程的物質(zhì)也由NF-kB調(diào)控。在膿血癥和其他前炎性疾病，例如腎小球性腎炎、急性呼吸道衰竭綜合征和腸炎中，NF-kB的活性增加。因此，NF-kB的反義寡核苷酸可能通過(guò)抑制前炎性細(xì)胞因子的合成而改變炎癥癥狀。這些化合物的微囊化可通過(guò)直接靶向巨噬細(xì)胞而進(jìn)一步提高其效率。
本研究的目標(biāo)如下a)測(cè)定NF-KB反義寡聚物的清蛋白微囊體是否可在體外全血模型中提高對(duì)內(nèi)毒素刺激的TNF、IL1、IL6和IL8的抑制作用，和b)測(cè)定微囊化NF-KB的寡聚物是否可在體內(nèi)內(nèi)毒素休克和腹膜炎模型中抑制前炎性細(xì)胞因子和改善存活率。
B)微球體的制備。
根據(jù)實(shí)施例1制備微囊化NF-kB反義寡核苷酸。
C)實(shí)驗(yàn)方法
a)體外全血模型從正常人志愿者中采集血樣品，并分成多個(gè)1ml的等份樣品。向每個(gè)樣品中加入100μg大腸桿菌內(nèi)毒素。
在以下溫育時(shí)間TNF---4小時(shí)，IL1---24小時(shí)之后，對(duì)每組通過(guò)ELISA測(cè)定細(xì)胞因子的水平，重復(fù)測(cè)定兩次。
對(duì)以下組進(jìn)行研究1.對(duì)照內(nèi)毒素+鹽水2.溶解在溶液中的NF-kB反義物，在加入內(nèi)毒素前1小時(shí)給藥200和300μg/ml3.NF-kB無(wú)義(混雜的(scrambled))200和300μg/ml4.微囊化NF-KB反義寡聚物200和300μg/ml5.微囊化無(wú)義(混雜的)寡聚物200和300μg/mlb)體內(nèi)內(nèi)毒素休克模型通過(guò)靜脈注射15mg/kg大腸桿菌內(nèi)毒素而在重約150克的Fischer大鼠中產(chǎn)生內(nèi)毒素休克。通過(guò)ELISA在0、4、8、24和48小時(shí)測(cè)定TNF。并觀察5天內(nèi)的存活率(120小時(shí))。
在一個(gè)劑量應(yīng)答研究完成后，對(duì)10只大鼠注射300μg微囊化NF-KB反義寡聚物，對(duì)10只大鼠靜脈注射300μg寡聚物溶液。
c)體內(nèi)腹膜炎模型通過(guò)腹膜內(nèi)注射1010大腸桿菌生物體而在大鼠中誘導(dǎo)產(chǎn)生腹膜炎。連續(xù)3天腹膜內(nèi)注射15mg/kg慶大霉素。在0、4、8、24和48小時(shí)測(cè)定TNF。5天(120小時(shí))內(nèi)觀察存活率。
1.同時(shí)處理大腸桿菌腹膜內(nèi)注射，以下處理同時(shí)進(jìn)行，然后每日進(jìn)行，持續(xù)2天。
a.對(duì)照b.微囊化NF-kB I.V.400μg/大鼠n＝10c.微囊化NF-kB I.V.200μg/大鼠n＝10d.NF-kB溶液I.V.400μg/大鼠n＝10
e.NF-kB溶液I.V.200μg/大鼠n＝102.延遲處理在最初腹膜內(nèi)注射大腸桿菌(在TNF峰值水平)4小時(shí)后用上述劑量的寡聚物進(jìn)行處理，然后再連續(xù)處理2天。
D)結(jié)果和討論NF-kB反義寡聚物微囊通過(guò)增加對(duì)巨噬細(xì)胞的胞內(nèi)滲透而提高對(duì)前炎性細(xì)胞因子的抑制作用。使用體外全血模型，微囊化NF-kB反義寡聚物抑制為T(mén)NF＞IL1＞1L6＞IL8，均比相應(yīng)量的寡聚物溶液的抑制作用大(p＜0.05)。在大鼠的內(nèi)毒素休克模型中，微囊化NF-kB寡聚物在TNF抑制方面產(chǎn)生劑量依賴(lài)型的提高。在內(nèi)毒素休克模型中，300μg/大鼠劑量的存活率為80％，而相應(yīng)劑量的溶液的存活率為20％(p＜0.05)。在腹膜炎模型中微囊化寡聚物的存活率為80％，在延遲處理的組中存活率為70％，而在溶液組中分別為30％和20％。在微囊組中TNF和IL1的抑制程度更大。甚至在TNF峰值發(fā)生后給藥微囊化寡聚物的延遲處理組也有存活率。
總之，在另外的內(nèi)毒素休克和腹膜炎的致死性模型中，微囊化NF-kB寡聚物在體外和體外提高對(duì)前炎性細(xì)胞因子的抑制作用，改善死亡率。微囊化NF-kB寡聚物可用于治療以前炎性細(xì)胞因子活性為特征的病理疾病。
E)結(jié)果圖15所示的是NF-kB反義(AS)寡聚物微球體(MS)和溶液(Soln)制劑對(duì)TNF-α抑制的影響。
圖16所示的是在人全血研究中，NF-kB反義(AS)寡聚物微球體(MS)和溶液(Soln)制劑對(duì)IL-1-β水平的影響。
圖17所示的是反義NF-kB微球體在內(nèi)毒素休克大鼠模型中的劑量反應(yīng)研究。
圖18所示的是在內(nèi)毒素休克大鼠模型中，NF-kB(微球體和溶液)處理對(duì)TNF-α水平的影響。
圖19所示的是在內(nèi)毒素休克大鼠模型中用反義NF-kB微球體進(jìn)行同時(shí)處理的劑量應(yīng)答研究對(duì)存活率的影響。
圖20所示的是在內(nèi)毒素休克大鼠模型中用NF-kB反義寡聚物以微球體和溶液形式進(jìn)行同時(shí)(S)處理對(duì)存活率的影響。
圖21所示的是在大鼠腹膜炎模型中，用NF-kB反義寡聚物(微球體和溶液形式)進(jìn)行同時(shí)(S)處理對(duì)TNF-α水平的影響。
圖22所示的是在大鼠腹膜炎模型中，用NF-kB反義寡聚物(微球體和溶液形式)進(jìn)行同時(shí)(S)處理對(duì)存活率的影響。
圖23所示的是在大鼠腹膜炎模型中，用NF-kB反義寡聚物(微球體和溶液形式)進(jìn)行延遲(D)處理對(duì)TNF-α水平的影響。
圖24所示的是在大鼠腹膜炎模型中，用NF-kB反義寡聚物(微球體和溶液形式)進(jìn)行延遲(D)處理對(duì)IL-1-β水平的影響。
圖25所示的是在大鼠腹膜炎模型中，用NF-kB反義寡聚物(微球體和溶液形式)進(jìn)行延遲(D)處理對(duì)存活率的影響。
實(shí)施例第二部分用不同的實(shí)例的藥物、不同的溶劑、不同的溫度和方法學(xué)變量通過(guò)噴霧方法制備微球體的評(píng)價(jià)A)簡(jiǎn)介我們的目的在于評(píng)價(jià)通過(guò)噴霧方法制備的不同類(lèi)型藥物(生物活性蛋白，寡核苷酸，化學(xué)品，疫苗)微球體，并研究油、溫度和方法的改變對(duì)制備微球體的影響。我們用生物可降解的無(wú)抗原性的清蛋白基質(zhì)包裹細(xì)胞因子拮抗劑[例如NF-kB反義寡聚物]。
B)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)微球體制劑噴霧方法一般方法學(xué)本發(fā)明的一般基礎(chǔ)包括以下步驟與包囊多聚體(例如，但不限定于，清蛋白、脫乙酰殼多糖、球蛋白或一些其他可生物降解的天然或合成多聚體)一起制備被包囊的藥物(可以是生物活性蛋白，藥物或合成藥物)的水溶液。然后將多聚體-藥物溶液煙霧化(可使用一些形成噴霧的裝置，例如，但不限定于，超聲噴霧器)，從而形成細(xì)小的霧狀噴霧。然后將這種含多聚體-藥物(或其他物質(zhì))溶液的薄霧或噴霧加入溶劑系統(tǒng)中，例如丁醇或其他低級(jí)烷醇，例如，但不限定于，甲醇、乙醇、丙醇等(參見(jiàn)圖26)或一些惰性油(例如，但不限定于，橄欖油、低芥酸菜子油、棉子油、重或輕礦物油、前述物質(zhì)的混合物或前述物質(zhì)的亞組分，或類(lèi)似物質(zhì))。溶劑系統(tǒng)保持在攪拌狀態(tài)下。細(xì)小的多聚體-藥物微球體混合到溶劑中，由于水溶性液滴不與溶劑系統(tǒng)混合，因此它們?nèi)匀槐３指髯苑蛛x。根據(jù)霧化的多聚體-藥物溶液的濃度，噴頭的構(gòu)型，和/或可能其他參數(shù)(例如施加到溶液的壓力、通過(guò)溶液的空氣或氣體的速度或其他類(lèi)似參數(shù))，微球體的直徑范圍在約0.05-50微米之間，更優(yōu)選地，直徑在約0.5-5微米。在溶劑系統(tǒng)中可含有或不含有乳化劑，例如Span 85。根據(jù)被包被藥物的性質(zhì)，溶劑系統(tǒng)的溫度可在5-60攝氏度的范圍內(nèi)變動(dòng)。在所有溶液霧化完畢后，仍持續(xù)攪拌1/2-2小時(shí)。通過(guò)a)在于燥器中使用戊二醛蒸汽或b)將干燥的微球體浸在溶劑系統(tǒng)中，所述溶劑系統(tǒng)含有0.5-20％w/v戊二醛的丁醇溶液的改變性質(zhì)的戊二醛，或浸在類(lèi)似的溶劑系統(tǒng)中，通過(guò)表面交聯(lián)硬化微球體。然后根據(jù)被包囊藥物的性質(zhì)，用溶劑，例如，但不限定于乙醇、甲醇或丁醇或正己烷將微球體洗滌幾次。將水從微球體上除去，并通過(guò)a)冷凍干燥微球體或b)通過(guò)在干燥器中用脫水劑，例如碳酸鈣除去水，或通過(guò)c)根據(jù)藥物的性質(zhì)，在真空爐中在溫度約25-100攝氏度下進(jìn)行干燥，從而使微球體形成一個(gè)堅(jiān)硬的表面。所用的噴霧器(煙霧器)是超聲類(lèi)型的(Omron MicroAir，NE-U03V)或任何可產(chǎn)生細(xì)小煙霧狀噴霧的裝置，例如a)甚至簡(jiǎn)單的裝置，例如可以使用香水噴霧器，或可以使用氣壓式噴嘴類(lèi)型的裝置。其他噴霧產(chǎn)生裝置和機(jī)械是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的，在此處不進(jìn)行詳細(xì)討論。
本方法的優(yōu)點(diǎn)如下a)產(chǎn)生的顆粒大小約0.05-50微米。
b)每批的顆粒大小分布在很窄的范圍。
c)本方法重復(fù)性好d)可在較短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大批量尺寸，使得該程序利于大批量生產(chǎn)。過(guò)程更類(lèi)似于一個(gè)連續(xù)的流程。
實(shí)施例6-生物活性蛋白藥物NF-kB-應(yīng)用-敗血性休克-制備方法-噴霧-通過(guò)噴霧方法制備含有細(xì)胞因子拮抗劑，即NF-kB反義寡聚物(生物活性蛋白藥物)微球體A)簡(jiǎn)介在本研究中對(duì)含有細(xì)胞因子拮抗劑(NF-kB反義寡聚物(生物活性蛋白藥物))的微球體進(jìn)行評(píng)價(jià)。
B)通過(guò)噴霧方法用清蛋白制備N(xiāo)F-kB反義寡核苷酸。
含有細(xì)胞因子拮抗劑[(NF-kB反義寡聚物(生物活性蛋白藥物)]的微球體與清蛋白微球體基質(zhì)的交聯(lián)。
1)將50mg人清蛋白溶解在2cc無(wú)熱源的水中。
2)將NF-kB反義寡核苷酸(寡聚物)以25mg/cc的濃度單獨(dú)溶解在磷酸鹽緩沖液(PBS)中。
3)將上述兩種溶液在一起混合約30分鐘。
4)將得到的混合物冷卻到5攝氏度。
5)將以下概括為“不同油和溶劑的影響”中的20cc溶劑放在50cc燒杯中，冷卻到5攝氏度，并在冰浴中維持該溫度。
6)將清蛋白和寡核苷酸混合物噴霧到溶劑中，對(duì)溶劑系統(tǒng)持續(xù)攪拌30分鐘。
7)用激光顆粒篩選器對(duì)含有微囊化清蛋白-藥物微球體的溶劑系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估尺寸，直到微球體直徑約1微米。
8)將微球體與0.5cc 25％w/v戊二醛溶液交聯(lián)1小時(shí)，并用組織勻漿機(jī)以高速進(jìn)行持續(xù)攪拌，同時(shí)在冰浴中維持溫度在約5攝氏度。
9)將微球體用20cc丁醇或乙醇或甲醇或正己烷洗滌3次，并用連續(xù)HPLC過(guò)濾器(50、20、10、5和1微米尺寸)最好篩選尺寸，同時(shí)懸浮在最后的溶劑中。
10)將微球體冷凍干燥，貯存在冰箱中備用。
在所有情況下，使用前均將微球體懸浮在無(wú)熱源的水或鹽水中。在噴霧步驟中，在噴頭得到的顆粒通過(guò)管導(dǎo)入到含上述步驟5)溶劑的容器中，管尖維持在溶劑表面以下，從而使噴霧的顆粒在低于空氣界面的表面導(dǎo)入到溶劑溶液中，從而最小化在空氣中的損失。
為了對(duì)不同類(lèi)型的油和溶劑系統(tǒng)作為乳化介質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，重復(fù)上述步驟，除了上述5攝氏度以外，對(duì)制備中不同的溫度也進(jìn)行了評(píng)價(jià)。最后，除水外，對(duì)不同溶劑作為溶解藥物的介質(zhì)也進(jìn)行了評(píng)價(jià)。對(duì)以下變量進(jìn)行評(píng)價(jià)a)不同油和溶劑的影響在研究中使用了不同的油/溶劑，例如橄欖油、棉子油、低芥酸菜子油、礦物油和丁醇。
b)不同溫度的影響在寬變量的溫度條件下制備微球體。
c)溶解藥物的不同水相的影響除了PBS外，使用鹽水、蒸餾/去離子水和含吐溫-80的水溶解清蛋白和藥物。
d)不同交聯(lián)變量的影響當(dāng)所有微球體噴霧到溶劑中后添加交聯(lián)劑，評(píng)估交聯(lián)的影響。
C)實(shí)驗(yàn)方法a)藥物含量分析通過(guò)我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)展的HPLC方法確定藥物含量分析。
b)效率研究-體外全血模型研究在全血模型中對(duì)制劑的藥效進(jìn)行評(píng)價(jià)，如下概述將血液合并到含EDTA的lavender top管中。將血液分成3個(gè)5ml的等份，用以下批次的微球體的一種預(yù)處理1小時(shí)，并用內(nèi)毒素(100mcg/ml)進(jìn)行刺激。在內(nèi)毒素刺激0和4小時(shí)后取樣測(cè)定TNF-α水平。
D)結(jié)果圖1-6表示由噴霧方法和乳化方法制備的微球體的藥物含量和TNF-α抑制效率的數(shù)據(jù)比較。
實(shí)施例7-化學(xué)藥物吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽-應(yīng)用-敗血性休克-制備方法乳化-微囊化吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽的制備和評(píng)價(jià)A)簡(jiǎn)介吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PTDC)是一種水溶性低分子量抗氧化劑物質(zhì)，抑制NF-kB活化。NF-kB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，負(fù)責(zé)激活前炎性細(xì)胞因子。幾項(xiàng)研究已證實(shí)PTDC在大鼠內(nèi)毒素休克模型中體外抑制細(xì)胞因子，并改善死亡率的功效。我們已證實(shí)在體外和體內(nèi)，化合物，例如中和抗體和NF-kB反義寡聚物在細(xì)胞因子抑制方面的效率改善。化合物的微囊化靶向巨噬細(xì)胞，從而提高細(xì)胞因子抑制的效率。
B)實(shí)驗(yàn)方法用全血模型評(píng)價(jià)微囊化PDTC的效率。對(duì)3個(gè)劑量[15微摩爾(μM)、30μM和60μM]進(jìn)行研究。以包囊化形式和溶液形式將這些劑量加到1ml等份樣品中。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法測(cè)定TNF-α水平。
PDTC.
C)結(jié)果圖27所示的是PDTC在體外對(duì)細(xì)胞因子水平的影響。在所評(píng)價(jià)的3個(gè)劑量上，PDTC微球體與相應(yīng)溶液劑量顯著不同。
雖然在以上僅對(duì)本發(fā)明的一些示例性實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但本領(lǐng)域中熟練人員容易理解，示例性實(shí)施方案的許多修改是可能的，只要沒(méi)有本質(zhì)上脫離本發(fā)明的新的教導(dǎo)和優(yōu)點(diǎn)。因此，所有這些修改均包括在以下權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍中。進(jìn)一步應(yīng)注意到任何此處提及的專(zhuān)利、申請(qǐng)和出版物全文結(jié)合于此作為參考。
權(quán)利要求
1.一種將生物活性物質(zhì)包囊的方法，包括a.在水中溶解清蛋白；b.在磷酸鹽緩沖液(PBS)中溶解NF-kB的反義寡核苷酸(寡聚物)；c.將所述溶解的清蛋白和所述溶解的NF-kB的反義寡核苷酸(寡聚物)混合在一起；d.將步驟c中形成的混合物冷卻；e.提供溶劑；f.冷卻步驟e的所述溶劑；g.在冷卻的溫度下維持步驟f的所述溶劑，以形成溶劑系統(tǒng)；h.將所述溶解的清蛋白和所述溶解的NF-kB的反義寡核苷酸(寡聚物)噴霧到所述溶劑中，同時(shí)攪拌步驟g的所述溶劑；i.評(píng)估步驟h的含有微囊化清蛋白-藥物微球體的溶劑系統(tǒng)的尺寸以獲得微球體；j.攪拌并在冷卻的溫度下維持所述溶劑系統(tǒng)，用戊二醛交聯(lián)所述微球體；k.用溶劑洗滌步驟j的微球體；l.測(cè)定步驟k中的微球體尺寸；及m.將步驟1的微球體冷凍干燥。
全文摘要
一種形成生物活性物質(zhì)，例如蛋白聚合物或藥物微球體的方法，其通過(guò)在攪拌的冷的溶劑系統(tǒng)霧化溶解形式的待包囊物質(zhì)，和包囊物質(zhì)，例如清蛋白，使得形成的微球體證實(shí)當(dāng)被巨噬細(xì)胞攝入時(shí)胞內(nèi)生物活性，所述溶劑系統(tǒng)含有植物油、礦物油和/或低級(jí)醇。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1756535SQ03824752
公開(kāi)日2006年4月5日 申請(qǐng)日期2003年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月29日
發(fā)明者馬丁·J·德蘇扎 申請(qǐng)人:默瑟大學(xué)公司