專利名稱：來源于髓鞘堿性蛋白的耐受原性肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來源于髓鞘堿性蛋白的肽。特別的，本發(fā)明涉及包括髓鞘堿性蛋白131-158區(qū)段的一部分的肽及其在治療和/或預(yù)防疾病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中，T淋巴細(xì)胞可以識別蛋白抗原的內(nèi)在表位?？乖蔬f細(xì)胞(APC)吸收蛋白抗原并將其降解成為短的肽片段。肽可與細(xì)胞內(nèi)主要的組織相容復(fù)合物(MHC)I或II類分子結(jié)合，并被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面。當(dāng)與MHC分子結(jié)合被呈遞至細(xì)胞表面時，該肽可被T細(xì)胞識別(通過T細(xì)胞受體(TCR))，在該情況下該肽為T細(xì)胞表位。
T細(xì)胞表位在對任何抗原，無論是自身的或是外來的，的適應(yīng)性免疫應(yīng)答中扮演了重要的角色。通過使用實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，展示了T細(xì)胞表位在過敏性疾病(其包括變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性疾病和移植排斥)中扮演著重要角色。通過注射與佐劑組合的合成肽(基于T細(xì)胞表位的結(jié)構(gòu))可以誘導(dǎo)炎癥或過敏性疾病。
經(jīng)比較，顯示通過給藥可溶形式的肽表位有可能誘導(dǎo)針對特定肽表位的免疫耐受性。在實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(EAE-一種多發(fā)性硬化癥的模型(MS))(Metzler & Wraith(1993)Int.Immunol.51159-1165；Liu & Wraith(1995)Int.Immunol.71255-1263；Anderton & Wraith(1998)Eur.J.Immunol.281251-1261)；以及關(guān)節(jié)炎，糖尿病和葡萄膜視網(wǎng)膜炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?如上述AndertonWraith(1998)中的評述)中，給藥可溶性的肽抗原被證實(shí)是一種抑制疾病的有效途徑。這也被證實(shí)是一種治療EAE疾病進(jìn)展的途徑(如上述Anderton & Wraith(1998))。
耐受原性肽在治療或預(yù)防疾病中的應(yīng)用已吸引了相當(dāng)多的注意力。其一方面的原因是某些耐受原性表位可下調(diào)針對相同組織內(nèi)的不同抗原的T細(xì)胞應(yīng)答。這種現(xiàn)象，被稱為是“旁觀者抑制”，其意思是采用特定的耐受原性肽(如上述Anderton & Wraith(1998))應(yīng)當(dāng)可以誘導(dǎo)針對特定抗原內(nèi)的多于一個表位的和針對給定疾病的多于一個抗原的耐受性。這避免了需確定特定疾病中的全部病原性抗原的需要。
由于肽相對較低的成本以及可生產(chǎn)出具有改變的免疫性狀的肽類似物的事實(shí)，肽也是一種有利的治療選擇。因此，可以對肽進(jìn)行修飾從而改變其與MHC或TCR的相互作用。采用這種方法的一種可能的問題是已經(jīng)證實(shí)不是所有的作為T細(xì)胞表位發(fā)生作用的肽都能誘導(dǎo)耐受性。髓鞘堿性蛋白(MBP)肽89-101是一種致免疫后的免疫優(yōu)勢性抗原，同時也是一種在引發(fā)T細(xì)胞反應(yīng)和誘導(dǎo)EAE方面非常有效的免疫原。然而，當(dāng)以溶液給藥時，該肽顯示出在誘導(dǎo)耐受性方面無效(如上述Anderton & Wraith(1998))。
對于這種觀察到的在T細(xì)胞表位誘導(dǎo)耐受性能力方面的等級現(xiàn)象提出了多種解釋(如上述Anderton & Wraith(1998)中的評述)。特別地，有人提出在肽對MHC的親和力和耐受原性間存在相關(guān)性(如上述Liu & Wraith(1995))，但是這與某些觀察到的現(xiàn)象并不吻合。例如，非耐受原性的MBP[89-101]以相對高的親和力與I-AS結(jié)合。因此，無法直接預(yù)測哪些肽將誘導(dǎo)耐受性。
本發(fā)明人已經(jīng)顯示，如果一種肽表位具有適合于被未成熟APC呈遞的大小且不需要抗原加工，則其可誘導(dǎo)免疫耐受性(國際專利申請?zhí)朠CT/GB01/03702)。因此，可以通過一些表位在其能被MHC分子呈遞前需要進(jìn)一步的加工的事實(shí)來解釋一些T細(xì)胞表位為耐受原性而另一些無法誘導(dǎo)耐受性的觀察現(xiàn)象。雖然當(dāng)與佐劑組合注射時，其有能力誘導(dǎo)疾病，但當(dāng)以溶液形式給藥時這些需要進(jìn)一步加工的表位無法誘導(dǎo)耐受性。
不需要進(jìn)一步加工的表位可以誘導(dǎo)耐受性，并被發(fā)明人稱為“apitopes”(不依賴于抗原加工的表位)。
發(fā)明簡述本發(fā)明人研究了MBP的131-158區(qū)段，并發(fā)現(xiàn)許多可被固定抗原呈遞細(xì)胞呈遞至T-細(xì)胞的肽。
由于其不需要進(jìn)一步的加工就可與MHCI或II類分子結(jié)合，因此將這些肽定義為apitopes。
因此，在第一個方面，本發(fā)明提供了一種包括髓鞘堿性蛋白131-158區(qū)段的一部分的apitope。
本發(fā)明人還確定了該區(qū)段中可被特定T-細(xì)胞克隆識別的兩個最小的表位。所述肽可包括這兩個表位中的一個或兩個，它們是MBP142-152和140-148。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽選自下述髓鞘堿性蛋白肽134-148、135-149、136-150、137-151、138-152、139-153、140-154。
在第二個方面，本發(fā)明提供了一種包括一種或多種如本申請第一個方面所述的肽的藥物組合物。
在第三個方面，本發(fā)明提供了一種治療和/或預(yù)防需要治療和/或預(yù)防的個體中的疾病的方法，其包括對個體給藥如本發(fā)明第一個方面所述的肽的步驟。
本發(fā)明還提供了如本發(fā)明第一個方面所述的肽在制備用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的肽可用于預(yù)防和/或治療多發(fā)性硬化癥。
附圖簡述
圖1顯示了T細(xì)胞克隆MS60D2對由APC在131-158區(qū)段呈遞嵌合MBP肽的應(yīng)答。
圖2顯示了T細(xì)胞克隆N5對由APC呈遞MBP肽140-154的應(yīng)答。
圖3顯示了T細(xì)胞克隆N5對由APC在136-157區(qū)段呈遞嵌合MBP肽的應(yīng)答。
發(fā)明詳述在第一個方面，本發(fā)明涉及一種肽。
肽術(shù)語“肽”根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)含義是用來表示一系列殘基，典型地為典型地通過α-氨基和相鄰氨基酸的羧基基團(tuán)之間的肽鍵相互連接起來的L-氨基酸。該術(shù)語包括修飾的肽和合成的肽類似物。
本發(fā)明中的肽可以是不需進(jìn)一步加工就可與MHC I或II類分子結(jié)合的任何長度。
能與MHC I類分子結(jié)合的肽典型地為7至13，更通常為8至10個氨基酸長度。所述肽的結(jié)合通過在肽的主鏈原子與所有MHC I類分子的肽結(jié)合溝槽的非可變位點(diǎn)之間的接觸來使其兩個末端穩(wěn)定。在與肽的氨基和羧基末端結(jié)合的溝槽兩端都有非可變位點(diǎn)。肽鏈長度的變化通過肽主鏈卷曲來調(diào)節(jié)，通常在能提供所要的柔性的脯氨酸或苷氨酸殘基處發(fā)生。
與MHC II類分子結(jié)合的肽典型地為8至20個氨基酸的長度，更通常地為10至17個氨基酸的長度，且可以更長。這些肽以沿著兩端開放的MHC II肽結(jié)合溝槽(與MHC I類肽結(jié)合溝槽不同)伸展的構(gòu)象存在。主要通過主鏈原子與排列形成肽結(jié)合溝槽的保守殘基接觸，使肽處于合適的位置。
本發(fā)明的肽可以通過化學(xué)方法制備(肽化學(xué)，實(shí)用教程。MikosBodansky，Springer-Verlag，Berlin.)。例如，可通過固相技術(shù)來合成肽(Roberge JY et al(1995)Science 269202-204)，從樹脂上切下，并且通過制備性的高壓液相色譜純化(例如，Creighton(1983)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子原理，WH Freeman & Co，New York NY)。例如，根據(jù)制造商提供的說明書，采用ABI 43 1 A肽合成儀(Perkin Elmer)可實(shí)現(xiàn)自動合成。
所述肽可選擇地可以通過重組方式，或從一較長多肽上切除的方式來制備。例如，所述肽可通過從髓鞘堿性蛋白上切除來獲得。肽的組成可通過氨基酸分析或測序來確定(例如，Edman降解法)。
本發(fā)明中的肽來源于MBP的131-158區(qū)段。優(yōu)選的所述肽來源于經(jīng)APC對抗原天然加工而產(chǎn)生的抗原片段。
為了實(shí)用目的，有所述肽應(yīng)當(dāng)顯示的各種其他的特性。例如，所述肽應(yīng)當(dāng)在一允許其在體內(nèi)應(yīng)用的濃度下是可溶的。優(yōu)選的，所述肽應(yīng)當(dāng)在0.5mg/ml的濃度下是可溶的，更優(yōu)選所述肽應(yīng)當(dāng)在1mg/ml的濃度下是可溶的，最優(yōu)選所述肽應(yīng)當(dāng)在5mg/ml的濃度下是可溶的。
為了鼻內(nèi)給藥，采用當(dāng)前操作可以被吸收的劑量的最大體積為每個鼻孔大約200μl。如果所述肽在1mg/ml時是可溶的，則每鼻孔雙倍劑量可使向每個病人給藥800μg。在任何單獨(dú)劑量中給藥多于5mg是不尋常的。
為了治療有效，所述肽在體內(nèi)足夠穩(wěn)定也是十分重要的。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)給藥30分鐘后試驗(yàn)肽的總量降至約50％，在給藥4小時后總量降至約30％，但經(jīng)5天后所述肽仍然可被檢測到(約5％)。所述肽在體內(nèi)的半衰期應(yīng)當(dāng)至少為10分鐘，優(yōu)選至少為30分鐘，更優(yōu)選至少為4小時，最優(yōu)選至少為24小時。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在經(jīng)鼻內(nèi)給藥后，引流淋巴結(jié)中肽的量在給藥約4小時后達(dá)到峰值，不過5天后肽仍然可被檢測到(在最大約5％的水<p>PEC48包括一個數(shù)據(jù)總線230和一個低速串行總線232。SDRAM控制器234和DRAM接口單元236都連接到低速串行總線232。PEC控制器228連接到數(shù)據(jù)總線230上。PEC控制器228還經(jīng)低速接口220連接到低速串行總線232。高速接口214、PEC222和行下載裝置/格式化裝置單元也連接到數(shù)據(jù)總線230。
在使用中，因?yàn)镻EC48從DRAM打印頁帶，給定的帶B在可以開始打印以前經(jīng)高速接口214加載進(jìn)DRAM。然后，在PEC48經(jīng)PEU再現(xiàn)帶B的同時，可以將帶B+1加載到DRAM上，同時帶B+1被擴(kuò)展和印刷，帶B+2可以被加載，并且可以如此繼續(xù)。
下表中簡短地說明上述的PEC48的各個部件。
表2.PEC內(nèi)的單元(高層面)
位的。
然而，在對免疫優(yōu)勢性肽發(fā)生首次免疫應(yīng)答后，表位“攤開”可發(fā)生于亞優(yōu)勢性決定區(qū)段(Lehmann et al(1992)Nature 358155-157)。亞優(yōu)勢性表位的呈遞對引發(fā)自身免疫十分重要。因此，本發(fā)明的apitope可以基于亞優(yōu)勢性表位。
對任何特定的抗原，也可能存在隱蔽表位(cryptic epitopes)。隱蔽表位是那些當(dāng)以肽形式給藥時能刺激T細(xì)胞應(yīng)答，但當(dāng)以完整抗原給藥時不能產(chǎn)生這種應(yīng)答的表位。這可能是在APC中將抗原加工成肽的過程中，隱蔽表位被破壞了。
隱蔽表位在體外可作為apitope而起作用，因?yàn)槠洳恍枰M(jìn)一步加工就可與MHC分子結(jié)合，同時誘導(dǎo)識別該隱蔽表位的T細(xì)胞發(fā)生無反應(yīng)性。然而，這種apitope不太可能具有治療效果，因?yàn)槠洳荒苣褪芸勺R別天然加工的抗原表位的T細(xì)胞。
抗原表位可通過測量被APC呈遞時針對跨越整個抗原的重疊肽(參加下文)的T細(xì)胞應(yīng)答來確定。這種研究通常產(chǎn)生“嵌套組”的肽，同時特定的T細(xì)胞系/克隆的最小表位可通過測量對截短肽的應(yīng)答來評估。
不能假設(shè)抗原的最小表位可作為apitope而發(fā)揮作用。為了與MHC最佳結(jié)合要求最小表位兩側(cè)氨基酸是十分必要的。應(yīng)當(dāng)將Apitope設(shè)計成能涵蓋不同T細(xì)胞克隆的最小表位間的細(xì)微差別的可能性。
應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)，不可能確定一適合所有表位的apitope。有清楚的證據(jù)顯示一些表位以依賴于內(nèi)體中的負(fù)載MHC的方式與MHC結(jié)合，因此其需要加工((Viner et al(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.922214-2218)。這是為什么不能假設(shè)每一最小表位將不可避免地發(fā)揮apitope的作用的另一原因。
含有T細(xì)胞表位的肽的確定本領(lǐng)域有許多已知的方法來確定給定抗原中的T細(xì)胞表位。
可通過對從抗原-負(fù)載的APC上洗脫下的肽進(jìn)行質(zhì)譜分光光度分析來確定天然加工的表位。這些是被刺激吸收抗原的，或通過采用適當(dāng)基因轉(zhuǎn)化而被迫產(chǎn)生胞內(nèi)蛋白的APC。典型的APC與可溶形式的或適于靶向APC細(xì)胞表面的蛋白一起培養(yǎng)。經(jīng)在37℃下培養(yǎng)后，細(xì)胞在去垢劑中裂解，同時通過，例如親和層析來純化II類蛋白。采用合適的化學(xué)介質(zhì)(例如酸條件)處理純化的MHC，從而將肽從MHC上洗脫下來。分離該肽庫，并將其分布型與來源于采用相同方式處理的對照APC的肽相比較。分析特異于蛋白表達(dá)/滋養(yǎng)細(xì)胞的峰值(例如通過質(zhì)譜法)，并確定肽片段。該操作通常產(chǎn)生有關(guān)通過抗原加工從特定抗原得到的產(chǎn)生的肽范圍(通常以“嵌套組”的形式發(fā)現(xiàn))的信息。
另一種確定表位的方法是在體外試驗(yàn)中篩選重疊且跨越抗原全長的合成肽文庫。例如可采用15個氨基酸長度的并且有5或10個氨基酸重疊的肽。采用包括抗原呈遞細(xì)胞和T細(xì)胞的抗原呈遞系統(tǒng)來測試肽。例如，抗原呈遞系統(tǒng)可以是鼠脾細(xì)胞制備物，和來源于扁桃體或PBMC的人細(xì)胞制備物。可選的，抗原呈遞系統(tǒng)可包括特定的T細(xì)胞系/克隆和/或特定的呈遞抗原的細(xì)胞類型。
T細(xì)胞活化可通過T細(xì)胞增殖(例如采用摻入3H-胸腺嘧啶核苷)或細(xì)胞因子生成來測量。TH1-型CD4+T細(xì)胞的活化，例如可通過可采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如ELISPOT試驗(yàn)檢測的IFNγ生成來檢測。
重疊肽研究通常顯示表位所處的抗原區(qū)域。一種特定T細(xì)胞的最小表位可通過測量對截短肽的應(yīng)答來評估。例如，如獲得一針對重疊文庫中的包括1-15個殘基的肽的應(yīng)答，兩端均被截短的組(例如，1-14，1-13，1-12等和2-15，3-15，4-15等)可被用于確定最小表位。
不依賴于抗原加工的呈遞系統(tǒng)(APIPS)一旦確定了一個表位，下一步將調(diào)查其是否也起apitope的作用。
一種apitope必須是無需抗原加工即可呈遞至T細(xì)胞。在確定了含有T細(xì)胞表位的肽后，apitopes可通過無加工的系統(tǒng)來確定?？刹捎锚?dú)立于抗原加工的呈遞系統(tǒng)(APIPS)來測試截短的肽和肽類似物。
APIPS的例子包括a)固定的APC(含有或不含CD28抗體)；b)含有MHC I或II類分子的脂質(zhì)膜(含有或不含CD28抗體)；和c)純化的天然或重組的與平板結(jié)合(plate-bound)形式的MHC(含有或不含CD28抗體)。
已知可采用固定的APC來調(diào)查T細(xì)胞應(yīng)答，例如在研究中，通過測量對截短肽的應(yīng)答來調(diào)查多肽內(nèi)的最小表位(Fairchild et al(1996)Int.Immunol.81035-1043)。可采用，例如甲醛(通常為多聚甲醛)或戊二醛來固定APC。
脂質(zhì)膜(其可為平面膜或脂質(zhì)體)可通過采用人工脂質(zhì)制備或其可以是來源于APC的原生質(zhì)膜/微粒體碎片。
在使用中，可將APIPS施用于組織培養(yǎng)皿的孔中。隨后加入肽抗原，并通過添加挑選的T細(xì)胞系或克隆來檢測肽與APIPS的MHC部分的結(jié)合。通過本領(lǐng)域已知的任何方法，例如通過摻入3H-胸腺嘧啶核苷或細(xì)胞因子分泌都可測量T細(xì)胞系或克隆的活化。
耐受性本發(fā)明的肽應(yīng)當(dāng)能誘導(dǎo)針對MBP的耐受性，因?yàn)槠涫窃摽乖腶pitopes。
如本文所使用的，術(shù)語“耐受原性”是指能誘導(dǎo)耐受性。
耐受性是指對抗原不應(yīng)答。對自身抗原的耐受性是免疫系統(tǒng)的一個重要特征，當(dāng)其失去時將產(chǎn)生自身免疫性疾病。適應(yīng)性免疫系統(tǒng)必須保持對大量的各種感染抗原的應(yīng)答能力同時避免其自身組織中含有的自身抗原的免疫攻擊。這在很大程度上受不成熟T淋巴細(xì)胞對胸腺中細(xì)胞程序性死亡的靈敏度的調(diào)控(中樞耐受)。但是，不是所有的自身抗原都能在胸腺中檢測到，因此自身反應(yīng)性的胸腺細(xì)胞死亡并不完全。因此，外周組織中也存在通過成熟的自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞而獲得耐受性的機(jī)制(外周耐受)。Anderton等人在(1999)(Immunological Reviews 169123-137)中給出了對中樞和外周耐受性機(jī)制的綜述。可通過誘導(dǎo)在至少一部分CD4+T細(xì)胞中發(fā)生無反應(yīng)性來產(chǎn)生或特征描述耐受性。為了活化T細(xì)胞，肽必須與一種能向T細(xì)胞傳遞兩個信號的“專業(yè)”APC聯(lián)合。第一信號(信號1)被APC細(xì)胞表面上的MHC-肽復(fù)合體傳遞，并通過TCR被T細(xì)胞接收。第二信號(信號2)被APC表面上的共同刺激分子，例如CD80和CD86傳遞，并被T細(xì)胞表面上的CD28接收。認(rèn)為當(dāng)T細(xì)胞在缺乏信號2的情況下接收信號1時，其并未被活化，事實(shí)上，變得無反應(yīng)性。無反應(yīng)性的T細(xì)胞對隨后的抗原刺激也無反應(yīng)，并且能抑制其他的免疫應(yīng)答。無反應(yīng)性的T細(xì)胞被認(rèn)為與介導(dǎo)T細(xì)胞的耐受性有關(guān)。
不希望受到理論的束縛，本發(fā)明人預(yù)測，由于其需要通過呈遞成熟抗原的細(xì)胞進(jìn)行加工，因此在與MHC分子聯(lián)合被呈遞前，需要加工的肽不能誘導(dǎo)耐受性。呈遞成熟抗原的細(xì)胞能加工抗原，但是也能傳遞信號1和信號2二者至T細(xì)胞，導(dǎo)致T細(xì)胞活化。另一方面，apitopes能與不成熟APC表面上的MHC II類分子結(jié)合。因此，其無需共同刺激就可被呈遞至T細(xì)胞，從而導(dǎo)致T細(xì)胞的無反應(yīng)性和耐受性。
毫無疑問，apitopes也能與成熟APC細(xì)胞表面上的MHC分子結(jié)合。不過，免疫系統(tǒng)含有比成熟APC更豐富的不成熟APC(有人提出少于10％的樹突狀細(xì)胞被活化Summers et al.(2001)Am.J.Pathol.159285-295)。因此，apitope的默認(rèn)狀態(tài)為無反應(yīng)性/耐受性，而非活化。
已經(jīng)顯示，當(dāng)通過吸入肽誘導(dǎo)耐受性時，抗原特異性的CD4+T細(xì)胞的增殖能力下降。同時由這些細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2，IFN-γ和IL-4的生成量被下調(diào)，但I(xiàn)L-10的生成量增加。對處于肽誘導(dǎo)耐受性狀態(tài)的小鼠中的IL-10進(jìn)行中和顯示完全恢復(fù)了對疾病的敏感性。有人提出調(diào)控細(xì)胞的總數(shù)持續(xù)保持在產(chǎn)生IL-10同時介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)的耐受狀態(tài)(Burkhart et al(1999)Int.Immunol.111625-1634)。
因此可通過各種技術(shù)來監(jiān)測耐受性的誘導(dǎo)，其包括(a)降低對感染其中所述肽為該疾病的體內(nèi)目標(biāo)表位的疾病的敏感性；(b)在CD4+T細(xì)胞中誘導(dǎo)無反應(yīng)性(可通過隨后的體外抗原刺激來檢測)；(c)改變CD4+T細(xì)胞數(shù)量，包括(i)降低增殖；(ii)下調(diào)IL-2、IFN-γ和IL-4的生成量；(iii)增加IL-10的生成量。
目標(biāo)疾病本發(fā)明的肽可用于治療和/或預(yù)防疾病。
本發(fā)明的肽在治療和/或預(yù)防多發(fā)性硬化癥(MS)中十分有效。多發(fā)性硬化癥是一種以多種髓鞘脫失損害為特征的，在整個CNS白質(zhì)中傳播并在各種位點(diǎn)和各個時期發(fā)生的慢性炎癥疾病(McFarlin &McFarland，1982 New England J.Medicine 3071183-1188 &1246-1251)。MS被認(rèn)為通過自身反應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)。
在動物中，MBP具有致免疫性同時MBP-特異性T淋巴細(xì)胞具有致腦炎活性(Segal et al.，1994 J.Neuroimmunol.517-19；Voskuhletal.，1993 J.Neuroimmunol 42187-192；Zamvil et al.，1985 Nature317355-8)。
藥物組合物在第二個方面，本發(fā)明涉及一種包含一種或多種本發(fā)明第一個方面所述肽的藥物組合物。所述組合物還可包括來源于MBP另一區(qū)段或來源于不同抗原的一個或多個apitopes。
本發(fā)明人預(yù)測，盡管存在“旁觀者抑制”，但靶向許多不同的T細(xì)胞克隆從而有效誘導(dǎo)耐受性是十分必要的。從而為了預(yù)防和治療疾病可將較多的肽給藥至個體。
所述藥物組合物可以，例如包括介于1至50個apitopes，優(yōu)選地1至15個apitopes。如果存在多于一個的apitope，優(yōu)選地，該apitopes為不需進(jìn)一步加工就全部可與MHC I類分子結(jié)合，或全部可與MHC II類分子結(jié)合。
當(dāng)存在兩個或更多的apitopes時，所述藥物組合物可以為試劑盒的形式，其中一些或每一種apitopes均分開提供，用于同時的，分開的或按順序的給藥。
可選的(或另外)，如果所述藥物組合物(或其任何部分)以多劑量給藥，則每一劑量可獨(dú)立包裝。
所述藥物組合物可包括治療或預(yù)防有效量的特定或每一apitope，同時可選的包括藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
同樣地，在本發(fā)明的藥物組合物中，特定的或每一apitope可與任何合適的粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、包被劑、或助溶劑混合。
給藥所述肽可在無佐劑的情況下以溶解形式給藥。
優(yōu)選的所述肽通過粘膜途徑給藥。
研究顯示，當(dāng)以溶解形式經(jīng)腹膜內(nèi)(i.p.)、靜脈內(nèi)(i.v.)或鼻內(nèi)(i.n.)或口服給藥時，該肽可誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受性(如上述Anderton& Wraith(1998)；Liu & Wraith(1995)如上述；Metzler & Wraith(1999)Immunology 97257-263)。
優(yōu)選的肽經(jīng)鼻內(nèi)給藥。
小鼠研究顯示，誘導(dǎo)耐受性所必需的肽的給藥持續(xù)時間視受體中的T細(xì)胞前體頻度而定(如上述Burkhart et al(1999))。在許多實(shí)驗(yàn)性研究中顯示，重復(fù)劑量的肽是誘導(dǎo)耐受性所必須的(如上述Burkhart et al(1999))。因此，肽的確切劑量和劑數(shù)將視個體而定，不過在一優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行了多劑量給藥。
如果同時給藥多種肽，其可以為適合單劑或多劑給藥的“雞尾酒”形式。可選的，優(yōu)選給予多劑但調(diào)整劑與劑之間肽的相對濃度。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，可沿用“劑量梯度增加”方案，其中多個劑量以遞增濃度的方式對病人給藥。這種方法已被采用，例如，被用于針對蜜蜂毒變態(tài)反應(yīng)的免疫治療應(yīng)用中的磷脂酶A2(Müller et al(1998)J.Allergy Clin Immunol.101747-754 & Akdis et al(1998)J.Clin.Invest.10298-106)。
實(shí)施例如下實(shí)施例用于舉例說明本發(fā)明，但不能解釋為對本發(fā)明的限定。本發(fā)明特別的涉及描述于這些實(shí)施例中的特定的
具體實(shí)施方式
。
實(shí)施例1-確定MBP區(qū)段134-154中的apitopes材料和方法抗原如Deibler等人所述，從腦白質(zhì)中制備得到人MBP(Deibler etal.，1972 Preparative Biochemistry 2139)，并通過SDS-PAGE來檢測其純度。MBP和肺結(jié)核分支桿菌純化的蛋白衍生物(PPD)(UK中心獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，Surrey)在預(yù)先設(shè)定的最適濃度下用于增殖實(shí)驗(yàn)；每一抗原的最適濃度為20ug/ml。在Abimed AMS 422多肽合成儀上(Abimed，Langenfeld，Germany)通過F-moc化學(xué)方法合成了跨越MBP區(qū)段131-158的一組15-鏈節(jié)的重疊肽。每一肽有1個氨基酸被替換，并有14個氨基酸重疊。
組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基添加有20mM HEPES(Sigma，Poole，UK)、青霉素(100U/ml)、鏈霉素硫酸鹽(100mg/ml)和4mM L-谷酰胺(均來源于LifeTechnologies，Paisley，Scotland)的RPMI-1640培養(yǎng)基被作為組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基使用。無血清培養(yǎng)基被用于漂洗淋巴細(xì)胞和TCL。對于所有的培養(yǎng)條件和實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)基均添加有10％的熱滅活的自體血漿。
T細(xì)胞克隆的產(chǎn)生從8位MS病人和2位健康對照捐贈者中產(chǎn)生MBP-特異性T細(xì)胞系(TCL)。按上述方法分離來源于每一個體的PBMC，并以1×106細(xì)胞/ml的密度平鋪至含有MBP(50μg/ml)的6孔板中；來源于每一個體的一部分PBMC經(jīng)常規(guī)冷凍并保存用于隨后的再刺激。七天后，采用含有2％IL-2(Lymphocult-HT；Biotest LTD.，Birmingham，UK)的新鮮培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞，并在培養(yǎng)第12天，所有的細(xì)胞均采用抗原、IL-2以及作為抗原呈遞細(xì)胞(APC)來源的經(jīng)輻射的(2500 Rad)自體PBMC以1T細(xì)胞5 APC的細(xì)胞比例進(jìn)行再刺激。每3-4天在IL-2中擴(kuò)增細(xì)胞，并在第14天采用抗原、IL-2和PBMC按上述方法進(jìn)行再刺激。在首次再刺激的那一天，檢測細(xì)胞對MBP的特異性增殖。簡單來說，將三份2×104個T細(xì)胞和1×105個經(jīng)輻射的自體PBMC培養(yǎng)于含有MBP的96孔圓底平板中。培養(yǎng)細(xì)胞兩天，并在培養(yǎng)的最后18小時采用(3H)-胸腺嘧啶核苷0.4μCi/孔的濃度進(jìn)行脈沖。然后如上文所述收獲細(xì)胞，δcpm＞1000和SI＞3的TCL被認(rèn)為是MBP-特異性的。
經(jīng)3輪再刺激/擴(kuò)增循環(huán)后，在作為APC的自體經(jīng)輻射的PBMC的存在下利用PHA(Sigma，Poole，Dorset，UK)對TCL進(jìn)行克隆。T細(xì)胞在0.1細(xì)胞/孔，0.3細(xì)胞/孔和1細(xì)胞/孔的限制稀釋條件下平鋪，并在含有1×104個經(jīng)輻射的PBMC、5μg/ml PHA和2％IL-2的Terasaki平板(Nunc International，Costar)中培養(yǎng)。經(jīng)10-12天后，采用1×105個經(jīng)輻射的PBMC、5μg/ml PHA和IL-2在96孔圓底長陽性孔進(jìn)行擴(kuò)增。三天后采用含有IL-2的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)這些孔，同時在第7天，采用1×105個經(jīng)輻射的PBMC、5μg/ml PHA和IL-2在48-孔板中擴(kuò)增克??；在該時間點(diǎn)，在增殖實(shí)驗(yàn)中測量克隆對MBP的特異性應(yīng)答。一周后，采用1×106經(jīng)輻射的PBMC和PHA或Dynabeads(Dynal，UK)和IL-2，在24-孔板中擴(kuò)增MBP-特異性克隆。采用7-10天的再刺激/擴(kuò)增循環(huán)使克隆保持于24-孔板中。
增殖實(shí)驗(yàn)將活的或p-甲醛固定的Mgar(HLA-DR2+ve)細(xì)胞與肽一起在含有T細(xì)胞的血清中或在單獨(dú)的血清中培養(yǎng)。通過如下的3H-胸腺嘧啶核苷吸收來測量T細(xì)胞增殖應(yīng)答。三等份每份100μl的每一培養(yǎng)物在96-孔圓底微量滴定板中生長48小時，隨后采用0.4μCi的[3H]-胸腺嘧啶核苷(Amersham International，Amersham，UK)進(jìn)行脈沖。經(jīng)20小時后，采用Mach 111收獲器96(Tomtec，Orange，New Jersey，USA)將細(xì)胞收獲至玻璃纖維墊上(LKB-Wallac，Turku，F(xiàn)inland)。采用Microbeta液體閃爍計數(shù)器(LKB-Wallac)來確定[3H]-胸腺嘧啶核苷的摻入。當(dāng)δcpm＞1000且刺激指數(shù)SI＞3時，含有抗原的測試孔被認(rèn)為呈陽性，其中SI＝含有CPM抗原的培養(yǎng)物/不含抗原的CPM培養(yǎng)物。
結(jié)果T細(xì)胞克隆MS60D2對在131-158區(qū)段的嵌套MBP肽的遞呈的應(yīng)答如圖1所示。由于其不需要進(jìn)一步加工就可被固定的APC呈遞至T細(xì)胞，因此肽134-148，135-149，136-150，137-151，138-152，139-153和140-154被定義為apitopes。
T細(xì)胞克隆N5對肽140-154的呈遞的應(yīng)答如圖2所示。這進(jìn)一步證實(shí)了肽140-154無需進(jìn)一步加工即可被固定的APC呈遞。
實(shí)施例2-被T細(xì)胞克隆N5和MS60D2識別的最小表位的確定將活的Mgar細(xì)胞與來源于MBP區(qū)段136-157的重疊肽一起在含有N5T細(xì)胞的血清中或在單獨(dú)血清中培養(yǎng)。通過3H-胸腺嘧啶核苷吸收來測量T細(xì)胞增殖。
結(jié)果示于圖3中。被T細(xì)胞克隆N5識別的最小表位為MBP142-152。
對T細(xì)胞克隆MS60D2進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)(圖1，未固定的Mgar)。被T細(xì)胞克隆識別的最小表位是MBP140-148。
對本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)的各種改進(jìn)和改變，對于本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來說是顯而易見的，其并未背離本發(fā)明的范圍和主旨。雖然結(jié)合特定實(shí)施方案來描述了本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)理解，權(quán)利要求書所要求保護(hù)的發(fā)明不應(yīng)當(dāng)過分局限于該特定的實(shí)施方案。事實(shí)上，本發(fā)明意圖包括那些為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明而對記載的模型的各種改進(jìn)，這些對于化學(xué)或生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員而言，是顯而易見的。上述說明書中提到的所有出版物在此通過參考文獻(xiàn)并入。
序列表<110>Apitope Technology(Bristol)Limited<120>來源于髓鞘堿性蛋白的耐受原性肽<130>P013368WO LCH<140>PCT/GB2003/000399<141>2003-01-30<150>GB 0202399.2<151>2002-02-01<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>15<212>PRT<213>人<400>1Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly1 5 10 15<210>2<211>15<212>PRT<213>人<400>2Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr1 5 10 15<210>3<211>15
<212>PRT<213>人<400>3Ser A1a His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu1 5 10 15<210>4<211>15<212>PRT<213>人<400>4Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser1 5 10 15<210>5<211>15<212>PRT<213>人<400>5His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys1 5 10 15<210>6<211>15<212>PRT<213>人<400>6Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile1 5 10 15
<210>7<211>15<212>PRT<213>人<400>7Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe1 5 10 1
權(quán)利要求
1.一種無需進(jìn)一步加工就可與MHC I或II類分子結(jié)合的肽，其包括髓鞘堿性蛋白區(qū)段131-158的一部分。
2.一種如權(quán)利要求1所述的肽，其包括最小表位142-152和/或最小表位140-148。
3.一種如權(quán)利要求1或2所述的肽，其選自如下的髓鞘堿性蛋白肽134-148、135-149、136-150、137-151、138-152、139-153、140-154。
4.如前述任意一項權(quán)利要求所述的肽，其用于治療和/或預(yù)防疾病。
5.如權(quán)利要求4所述的肽，所述的疾病為多發(fā)性硬化癥。
6.一種包含一種或多種如權(quán)利要求1至5中任意一項所述的肽的藥物組合物。
7.一種用于治療和/或預(yù)防在需要治療和/或預(yù)防的個體中的疾病的方法，其包括給個體服用如權(quán)利要求1至5中任意一項所述的肽的步驟。
8.如權(quán)利要求1至5中任意一項所述的肽在制備用于預(yù)防和/或治療疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種不需要進(jìn)一步加工就能與MHC I或II類分子結(jié)合的肽(也就是一種apitope)，其包括髓鞘堿性蛋白區(qū)段(131－158)的一部分，特別是本發(fā)明提供了一種選自如下髓鞘堿性蛋白肽(134－148，135－149，136－150，137－151，138－152，139－153，140－154)的apitope。本發(fā)明還提供了該肽在制備藥物組合物中的應(yīng)用和一種采用該肽來治療和/或預(yù)防疾病的方法。
文檔編號A61P25/00GK1625564SQ03803077
公開日2005年6月8日 申請日期2003年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月1日
發(fā)明者D·C·弗賴思, H·B·斯特雷特, F·M·龐斯福德, G·馬扎 申請人:阿皮托普技術(shù)(布里斯托爾)有限公司