專利名稱：利巴韋林與干擾素β在脫髓鞘疾病中的聯用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明為神經系統(tǒng)疾病領域，涉及通式(I)所示的化合物 與干擾素(IFN)聯用在制造治療和/或預防脫髓鞘疾病的藥物中的用途。具體地說，它涉及利巴韋林與IFN-β聯用在治療和/或預防脫髓鞘疾病如多發(fā)性硬化癥(MS)中的用途。
背景技術：
脫髓鞘疾病是涉及神經系統(tǒng)髓鞘的疾病。髓鞘覆蓋很多神經纖維，由幼年形成的脂蛋白層組成。髓磷脂由中樞神經系統(tǒng)的少突膠質細胞形成，促進神經沖動沿軸突傳遞。
許多先天性代謝疾病(例如苯丙酮尿癥、其他氨基酸尿癥；泰-薩二氏病、尼-皮二氏病和高歇氏病(Gaucher′s disease)；胡爾勒氏綜合征(Hurler′ssyndrome)；克臘比氏病(Krabbe′s disease)及其他腦白質病變)影響到髓鞘發(fā)育，主要影響到中樞神經系統(tǒng)的髓鞘發(fā)育。除非能修復或補償生化缺陷，否則會導致神經功能永久地，通常大范圍，缺損。
很多神經系統(tǒng)疾病的一個特征是晚年脫髓鞘，它可能因局部損傷、缺血、毒劑或代謝失調引起神經或髓磷脂受損所致。大量損失髓磷脂往往導致軸突退化，經常還伴隨細胞體退化，兩種退化都無法恢復。不過，有很多情況會發(fā)生髓鞘質再生現象，使得神經功能能迅速修復、再生和完全恢復。神經功能的恢復通常發(fā)生于以許多周圍神經病變?yōu)樘攸c的節(jié)段性脫髓鞘之后；此過程是多發(fā)性硬化癥(MS)惡化和緩解的原因。目前主要是中樞脫髓鞘(即脊髓、腦或視神經脫髓鞘)，在原發(fā)性脫髓鞘疾病中發(fā)現，其病因尚不清楚。最為人所知的脫髓鞘疾病是多發(fā)性硬化癥(見下文)。
其他脫髓鞘疾病包括急性播散性腦脊髓炎，其特點為血管周中樞神經系統(tǒng)脫髓鞘，可自發(fā)性發(fā)病，但通常受病毒感染或病毒接種后也會發(fā)??；急性炎癥性周圍神經病變，由病毒接種或格-巴二氏綜合征所引起，僅累及周圍結構；腦白質腎上腺萎縮癥和腎上腺脊髓神經病，都是罕見的X連鎖隱性代謝疾病，其特點為腎上腺功能不良和神經系統(tǒng)大范圍脫髓鞘；利伯氏遺傳性視神經萎縮癥及相關腺粒體病，其主要特點為喪失兩側中心視力，類似多發(fā)性硬化癥中的視神經炎；以及HTLV-相關性脊髓病，是一種緩慢漸進性脊髓疾病，與感染到人T細胞淋巴病毒有關，其特點為雙腿痙攣無力。
多發(fā)性硬化癥(MS)是一種緩慢漸進性中樞神經系統(tǒng)疾病，其特點為腦和脊髓散布脫髓鞘斑塊，導致出現各種各樣神經系統(tǒng)癥狀和征兆，通常病情時好時壞(參見The Merck Manual Home Edition，www.merck.com)。
病因仍然不明，但現有不多的線索都表明有一特定機理，人們開始懷疑是免疫系統(tǒng)異常所致。假設的病因包括慢性或潛隱性病毒感染以及酶引起的髓鞘溶解癥。一般情況下，腦脊液(CSF)的IgG水平較高，已經知道，滴度較高與包括麻疹在內的很多疾病都有關聯。目前尚未知道這些發(fā)現以及與HLA異型和T細胞數量改變之關聯性的意義，已有的證據部分互相矛盾。家族發(fā)病率上升表明有遺傳易感性；女性受感染的機會比男性稍高。環(huán)境因素似乎起一定作用。雖然發(fā)病年齡一般為20至40歲，但已經發(fā)現，多發(fā)性硬化癥與患者15歲前居位的地理區(qū)域有關聯。15歲后遷移到其他地區(qū)不會改變患病的風險。
脫髓鞘斑或島散布在整個中樞神經系統(tǒng)，主要在白質內，偏向側柱和后柱(特別是頸和背部)、視神經和室周部位，破壞少突神經膠質和造成血管周發(fā)炎。還累及中腦、腦橋和小腦的腦束，大腦和脊髓的灰質也受到影響。
一般情況下，細胞體和軸突會被保存下來，尤其是早期病變時。軸突在后期可被破壞，尤其在長束內，纖維神經膠質增生致使這些長束出現“硬化”跡象。早期和后期病變可能同時被發(fā)現。已經證實，在斑塊內及斑塊周圍，髓磷脂的脂質和蛋白質發(fā)生化學變化。
此種疾病表現為中樞神經系統(tǒng)功能障礙的癥狀和征兆，病情時好時壞。最常見的癥狀是軀體四肢中一肢或多肢，或者面部一側感覺異常；腿或手無力或笨拙；或者視覺障礙，例如部分眼盲和一只眼睛疼痛(眼球后視神經炎)，視力減弱或盲點。其他常見早期癥狀包括重視(復視)引起的眼原性麻痹、四肢中一肢或多肢短暫無力、肢體輕度僵直或容易疲勞、輕度步態(tài)障礙、膀胱控制困難、眩暈和中度情感障礙；所有這些都表明所涉及的中樞神經系統(tǒng)很分散，往往在確診前數月或數年前已出現這些癥狀。
疾病進程各有不同，無法預知，多數患者間歇性復發(fā)。除了特別嚴重的病例，壽命一般不會縮短。最初階段，疾病可能緩解數月或數年，特別當發(fā)病始于眼球后視神經炎時。疾病緩解時間可超過10年。不過，有些病人會經常發(fā)作，并很快喪失工作能力；少數人特別是發(fā)病年齡為中年的男性病人，其病程進展很快。因發(fā)燒或環(huán)境過熱有時會使癥狀惡化。
診斷只能是間接的，根據臨床及實驗表征進行推斷。MRI是最常用的診斷成像技術，可顯示斑塊。釓-對比度增強法(Gadolinium-contrast enhancement)能夠區(qū)分活動性炎癥部位與舊的腦斑。通過對比度增強的CT掃描(給予2倍碘量和延遲掃描，即雙倍延遲CT掃描)可看得見多發(fā)性硬化癥病變。
大多數患者的腦脊液呈現異常狀態(tài)。IgG可能大于13％，而淋巴細胞和蛋白質含量可能輕微上升。寡克隆帶表示血腦屏障內IgG合成，通過對90％以上多發(fā)性硬化癥患者的腦脊液進行瓊脂糖電泳，可檢測到寡克隆帶，但檢測不出這些帶并不排除有多發(fā)性硬化癥。IgG水平與病情輕重程度有關聯。在活動性脫髓鞘過程中髓磷脂基礎蛋白質上升。
由于能夠自發(fā)性緩解，而且癥狀忽輕忽重，因此難以評價治療效果。治療主要采用皮質類固醇，它們雖然不能影響最后長期喪失工作能力的結果，但可縮短發(fā)作期間的征狀期。表現為急性重度視神經炎的患者，若采用靜脈內給予高劑量皮質類固醇，可推遲MS發(fā)病時間。
較嚴重的漸進性疾病可采用免疫抑制劑(甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、克拉屈濱)。使用干擾素-β的免疫調節(jié)療法減少MS的復發(fā)次數。其他正在研究的有希望的治療包括使用其他干擾素、口服髓磷脂，以及glatiramer，幫助身體抵抗自身的髓磷脂。Glatiramer是一種合成共聚物，類似髓磷脂基礎蛋白質，每日皮下注射給予。一般認為，它的主要作用是抑制針對髓磷脂的免疫反應，從而加強免疫耐受性(Clegg and Bryant，2001)。
干擾素是細胞因子，即是在細胞之間傳遞信息，并通過幫助破壞引發(fā)感染的微生物及修復任何造成的損害而在免疫系統(tǒng)中扮演重要作用的可溶性蛋白質。干擾素由感染細胞自然分泌出來，于1957年被首次鑒定。因為它們“干擾”病毒復制和生產而被命名為干擾素。
干擾素具有抗病毒和抗增殖活性?；谏再|和免疫性質，將天然存在的人干擾素分為三大類干擾素-α(白細胞)、干擾素-β(成纖維細胞)和干擾素-γ(免疫)。目前，干擾素-α在美國和其他國家已被批準用于治療毛細胞白血病、性病疣、卡波西氏肉瘤(一種通常導致病人患上獲得性免疫程序缺陷綜合癥(AIDS)的癌癥)、以及慢性非甲、非乙型肝炎。
此外，干擾素(IFN)是身體應答病毒感染而產生的糖蛋白。它們在受保護細胞內抑制病毒繁殖。IFN由低分子量蛋白質組成，它們的作用有明顯的非特異性，即由一個病毒誘導的IFN對其它許多病毒也有效。但它們具有物種特異性，即由一物種產生的IFN只能在相同或極為相關物種的細胞內刺激抗病毒活性。IFN是被用來研究抗腫瘤和抗病毒活性的第一組細胞因子。
三種主要IFN被稱為IFN-α、IFN-β和IFN-γ。這些主要IFN最初是按照它們的細胞來源(白細胞、成纖維細胞或T細胞)劃分的。不過，現在已經知道這幾類IFN都可由一種細胞產生。因此，白細胞IFN現在被稱為IFN-α，成纖維細胞IFN是IFN-β，而T細胞IFN是IFN-γ。此外，還有第四類IFN-類淋巴母細胞IFN，在“Namalwa”細胞系(自伯基特淋巴瘤產生)中產生，此細胞系似乎能產生白細胞和成纖維細胞IFN混合物。
關于干擾素的干擾素單位或國際單位(國際單位為U或IU)已有報導，它是IFN活性的量度，定義為需要保護一半細胞抗病毒破壞所需的數量?？捎脕頊y定生物活性的試驗是細胞病變效應抑制試驗，參見文獻(Rubinstein等人，1981；Familletti，P.C.，等人，1981)所述。在此干擾素抗病毒試驗中，產生一半細胞病變效應所需的數量約1單位/毫升干擾素。根據國際參考標準，確定單位為美國國家衛(wèi)生研究院制訂的Hu-IFN-β(Pestka，S.1986)。
每類IFN均含有多種不同型式。IFN-β和IFN-γ都是單個基因產物。
歸類為IFN-α的蛋白質是變化最多的一組，含有約15種型式。染色體9上帶有一組IFN-α基因，含有至少23個成員，其中15個具有活性并被轉錄。成熟IFN-α不會被糖基化。
IFN-α和IFN-β的長度相等(165或166個氨基酸)，生物活性相似。IFN-γ長146個氨基酸，與α及β類相似度不高。只有IFN-γ能夠激活巨噬細胞或者能夠誘導殺傷T細胞成熟。這些新型治療劑因為對生物體或腫瘤反應產生作用，通過免疫調節(jié)影響識別，所以有時又被稱為生物反應修正劑(BRMs)。
人成纖維細胞干擾素(IFN-β)具有抗病毒活性，也可以刺激針對贅生細胞的天然殺傷細胞。它是一種由病毒和雙鏈RNA誘導的多肽，重約20,000Da。通過重組DNA技術克隆(Derynk等人，1980)從成纖維細胞干擾素的基因核苷酸序列，推導出蛋白質的全氨基酸序列。它長166個氨基酸。
Shepard等人(1981)描述了一個使其失去抗病毒活性的堿基842突變(位置141上Cys→Tyr)，也描述了一個缺失核苷酸1119-1121的突變克隆。
Mark等人(1984)以(A)置換堿基469的(T)，插入一個人工突變，導致位置17上的氨基酸從Cys轉換為Ser。得到的IFN-β據報與“天然”IFN-β一樣具有活性，長期儲存能保持穩(wěn)定(-70℃)。
干擾素療法的最新發(fā)展是用Rebif(重組人干擾素-β)治療多發(fā)性硬化癥(MS)，這代表了治療方法上一個重大進展。Rebif是干擾素(IFN)-β1a，由哺乳動物細胞系產生。已經確定，每周皮下給予三次干擾素β-1a，對復發(fā)-緩解型多發(fā)性硬化癥(RR-MS)有治療效果。干擾素β-1a對長期MS病程具有有益效果，它減少復發(fā)次數，減輕病情，并且經MRI測定，減輕疾病負擔和疾病活動性(Study Group，1998)。
利巴韋林(1-β-D-核呋喃糖基-1H-1，2，4-三氮唑-3-甲酰胺)，是第一個合成廣譜抗病毒核苷酸，其描述見默克指標，第十一版，化合物編號8199，它是肌酸一磷酸鹽脫氫酶(IMPDH)的競爭性抑制劑?？赏ㄟ^商業(yè)途徑獲得，例如ICN Pharmaceuticals，Inc.，Costa Mesa，California。也可以參照美國專利US4,138,547或US 3,991,078描述的方法制備利巴韋林。其制造方法和配方見美國專利US 4,211,771。
使用利巴韋林的主要副作用是劑量相關的貧血癥，停止治療后可恢復(DiBisceglie AM等人，1992；Jarvis，S.等人，1998)。業(yè)已知道，利巴韋林能誘導延遲細胞增殖(Joksic G.等人，2000)?？共《竞涂鼓[瘤治療中采用的許多其他三氮唑型核苷類似物對IMPDH的選擇性都較低，不利于長期治療和/或使用較高劑量的治療。
到目前為止，利巴韋林作為單一療法已廣泛用來治療病毒性感染，包括呼吸道合胞病毒(Hall CB等人，1985)、拉沙熱病毒(McCormick JB等人，1986)、流行性感冒(Togo Y，McCracken EA.，1976)以及丙型肝炎(Reichard O等人，1991；Di Bisceglie AM等人，1992；)。已經發(fā)現，利巴韋林與干擾素-α(IFN-α)聯用治療丙型肝炎比僅用利巴韋林更有效(Brillanti s.等人，1994)。除了作為直接抗病毒劑的公知作用外，利巴韋林也具有免疫調節(jié)性質(Hultgren C.等人，1998；Tam RC等人，1999)。
專利EP 11329393和WO 01/68034描述了利巴韋林類似物(L-異構體、Levovirin)的合成及在治療感染如乙型肝炎、寄生蟲病如原生動物或蠕蟲病、腫瘤如由病毒或自身免疫疾病(如關節(jié)炎、牛皮癬或多發(fā)性硬化癥)引起的癌癥或腫瘤中的用途，它可單獨使用或與抗病毒劑(如干擾素-α、干擾素-γ、利巴韋林、acyclovir)、抗真菌劑、抗腫瘤劑、皮膚病藥物、偏頭痛制劑或類固醇聯用。
專利WO 00/30656描述了一種神經系統(tǒng)疾病，如阿爾茨海默氏病、帕金森氏癥、多發(fā)性硬化癥和亨廷頓氏病，的治療方法，該方法結合使用了利巴韋林與諸如NGF(神經生長因子)或FGF(成纖維細胞生長因子)等神經營養(yǎng)因子。
但本技術領域還未有人考慮過以利巴韋林與IFN-β聯用治療脫髓鞘疾病。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及通式(I)所示的化合物， 式中，R1、R2、R3和A將在下文詳細描述，與干擾素(IFN)，其同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或鹽聯合在制造治療和/或預防脫髓鞘疾病的藥物中的用途，可同時、先后或分開使用。
具體實施例方式
本發(fā)明涉及通式(I)所示的化合物， 與干擾素(IFN)，其同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或鹽聯合在制造治療和/或預防脫髓鞘疾病的藥物中的用途，可同時、先后或分開使用。
通式(I)的取代基定義如下R1選自包括或者由以下基團組成的組氫、?；?、未取代或取代的C1-C6-烷基、未取代或取代的C2-C6-烯基、未取代或取代的C2-C6-炔基、未取代或取代的C1-C6-烷基氨基羰基、未取代或取代的C1-C6-烷基氨基、未取代或取代的C1-C6-烷基烷氧基、未取代或取代的C1-C6-烷基硫烷基、未取代或取代的C1-C6-烷基亞磺?；⑽慈〈蛉〈腃1-C6-烷基磺?；?、芳基、雜芳基、未取代或取代的C3-C8-環(huán)烷基或未取代或取代的C3-C8元雜環(huán)烷基、未取代或取代的C1-C6-烷基芳基、未取代或取代的C1-C6-烷基雜芳基、任選地含有1至3個雜原子的未取代或取代的C1-C6烷基環(huán)烷基、未取代或取代的C2-C6-烯基-芳基或-雜芳基、未取代或取代的C2-C6-炔基芳基或-雜芳基、磺酰基或者磷酰基；R2選自包括或者由以下基團組成的組氫、未取代或取代的C1-C6-烷基、未取代或取代的C2-C6-烯基、未取代或取代的C2-C6-炔基、未取代或取代的C1-C6-烷氧基、羥基、鹵素；R3選自包括或者由以下基團組成的組氫、未取代或取代的C1-C6-烷基、未取代或取代的C2-C6-烯基、未取代或取代的C2-C6-炔基；A是N或CR4，其中R4是H或NR5R5′，其中R5和R5′各自獨立地選自包括或者由以下基團組成的組氫、?；⑽慈〈蛉〈腃1-C6-烷基、未取代或取代的C2-C6-烯基、未取代或取代的C2-C6-炔基、未取代或取代的C1-C6-烷基氨基羰基、未取代或取代的C1-C6-烷基氨基、未取代或取代的C1-C6-烷基烷氧基、未取代或取代的C1-C6-烷基硫烷基、未取代或取代的C1-C6-烷基亞磺?；?、未取代或取代的C1-C6-烷基磺?；?、芳基、雜芳基、未取代或取代的C3-C8-環(huán)烷基或未取代或取代的C3-C8元雜環(huán)烷基、未取代或取代的C1-C6-烷基芳基、未取代或取代的C1-C6-烷基雜芳基、任選地含有1至3個雜原子的未取代或取代的C1-C6烷基環(huán)烷基、未取代或取代的C2-C6-烯基-芳基或-雜芳基、未取代或取代的C2-C6-炔基芳基或-雜芳基、磺?；蛄柞；?；R3與R5可一起形成一個雜環(huán)。
以下各段提供構成本發(fā)明化合物的各化學基團的定義，除非另行表述提供更為廣泛的定義，以上定義要統(tǒng)一地應用于本說明書和權利要求書中。
“?；敝富鶊F-C(O)R，其中R包括“C1-C6-烷基”、“芳基”、“雜芳基”、“C1-C6-烷基芳基”或“C1-C6-烷基雜芳基”。
“C1-C6-烷基”指具有1-6個碳原子的單價烷基。例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正己基等。
“C2-C6-烯基”指優(yōu)選具有2-6個碳原子并且有至少1個或2個烯基不飽和位的烯基基團。優(yōu)選的烯基包括乙烯基(-CH＝CH2)、n-2-丙烯基(烯丙基，-CH2CH＝CH2)等。
“C2-C6-炔基”指優(yōu)選具有2-6個碳原子并有至少1-2個炔基不飽和位的炔基基團，優(yōu)選的炔基包括乙炔基(-C≡CH)、炔丙基(-CH2C≡CH)等。
“氨基羰基”指基團-C(O)NRR’，其中R、R’各自獨立地包括氫或“C1-C6-烷基”或“芳基”或“雜芳基”或“C1-C6烷基芳基”或“C1-C6-烷基雜芳基”。
“C1-C6-烷基氨基羰基”指有氨基羰基取代基的C1-C6-烷基，包括2-(二甲基氨基羰基)乙基等。
“氨基”指基團-NRR’，其中R，R’各獨立地是氫或“C1-C6-烷基”或“芳基”或“雜芳基”或“C1-C6-烷基芳基”或“C1-C6-烷基雜芳基”或“環(huán)烷基”或“雜環(huán)烷基”，其中R和R’與和它們連接的氮原子一起可任選地形成3-8元雜環(huán)烷基環(huán)。
“C1-C6-烷基氨基”指有氨基取代基的C1-C6-烷基，包括2-(1-吡咯烷基)乙基等。
“C1-C6-烷基烷氧基”指有烷氧基取代基的C1-C6-烷基，包括2-乙氧基乙基等。
“C1-C6-烷基硫烷基”指有硫烷基取代基的C1-C6-烷基，包括2-(乙基硫烷基)乙基等。
“C1-C6-烷基亞磺酰基”指有亞磺?；〈腃1-C6-烷基，包括2-(甲基亞磺?；?乙基等。
“C1-C6-烷基磺?；敝赣谢酋；〈腃1-C6-烷基，包括2-(甲基磺?；?乙基等。
“芳基”指具有單環(huán)(如苯基)或稠合多環(huán)(如萘基)的含有6-14個碳原子的不飽和芳族碳環(huán)基團。優(yōu)選的芳基包括苯基、萘基、菲基等。
“雜芳基”指單環(huán)雜芳族，或雙環(huán)或三環(huán)稠環(huán)雜芳族基團。雜芳族基團的具體例子包括任選地取代的吡啶基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、惡唑基、異惡唑基、噻唑基、異噻唑基、吡唑基、1，2，3-三唑基、l，2，4-三唑基、1，2，3-惡二唑基、1，2，4-惡二唑基、1，2，5-惡二唑基、1，3，4-惡二唑基、1，3，4-三嗪基、1，2，3-三嗪基、苯并呋喃基、[2，3-二氫]苯并呋喃基、異苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并三唑基、異苯并噻吩基、吲哚基、異吲哚基、3H-吲哚基、苯并咪唑基、咪唑并[1，2-a]吡啶基、苯并噻唑基、苯并惡唑基、喹嗪基、喹唑啉基、2，3-二氮雜萘基、喹喔啉基、噌啉基、1，5-二氮雜萘基、吡啶并[3，4-b]吡啶基、吡啶并[3，2-b]吡啶基、吡啶并[4，3-b]吡啶基、喹啉基、異喹啉基、四唑基、5，6，7，8-四氫喹啉基、5，6，7，8-四氫異喹啉基、嘌呤基、蝶啶基、咔唑基、呫噸基或苯并喹啉基。
“C3-C8-環(huán)烷基”指具有單環(huán)(如環(huán)己基)或多稠環(huán)(如降冰片基)的3-8個碳原子的飽和碳環(huán)基團。優(yōu)選的環(huán)烷基包括環(huán)戊基、環(huán)己基、降冰片基等。
“雜環(huán)烷基”指如上定義的C3-C8-環(huán)烷基，其中最多3個碳原子由選自O、S、NR(R定義為氫或甲基)的雜原子取代。優(yōu)選的雜環(huán)烷基包括吡咯烷、哌啶、哌嗪、1-甲基哌嗪、嗎啉等。
“C1-C6-烷基芳基”指帶有芳基取代基的C1-C6-烷基，包括芐基、苯乙基等。
“C1-C6-烷基雜芳基”指帶有雜芳基取代基的C1-C6-烷基，包括2-呋喃基甲基、2-噻吩基甲基、2-(1H-引哚-3-基)乙基等。
“C1-C6-烷基環(huán)烷基”指有環(huán)烷基取代基的C1-C6-烷基，包括環(huán)己基甲基、環(huán)戊基丙基等。
“C2-C6-烯基芳基”指具有芳基取代基的C2-C6-烯基，包括2-苯基乙烯基等。
“C2-C6-烯基雜芳基”指具有雜芳基取代基的C2-C6-烯基，包括2-(3-吡啶基)乙烯基等。
“C2-C6-炔基芳基”指具有芳基取代基的C2-C6-炔基，包括苯基乙炔基等。
“C2-C6-炔基雜芳基”指具有雜芳基取代基的C2-C6-炔基，包括2-噻吩基乙炔基等。
“硫烷基”指基團-S-R，其中R包括H、“C1-C6-烷基”、鹵素取代的“C1-C6-烷基”如-SO-CF3基團、“C2-C6-烯基”、“C2-C6-炔基”、“C3-C8-環(huán)烷基”“雜環(huán)烷基”、“芳基”、“雜芳基”、“C1-C6-烷基芳基”或“C1-C6-烷基雜芳基”、“C2-C6-烯基芳基”、“C2-C6-烯基雜芳基”、“C2-C6-炔基芳基”、“C2-C6-炔基雜芳基”、“C1-C6-烷基環(huán)烷基”、“C1-C6-烷基雜環(huán)烷基”。優(yōu)選的硫烷基包括甲基硫烷基、乙基硫烷基等。
“磺酰基”指基團-SO2-R，其中R選自H、“芳基”、“雜芳基”、“C1-C6-烷基”、鹵素取代的“C1-C6-烷基”如-SO2-CF3基團、“C2-C6-烯基”、“C2-C6-炔基”、“C3-C8-環(huán)烷基”、“雜環(huán)烷基”、“芳基”、“雜芳基”、“C1-C6-烷基芳基”或“C1-C6-烷基雜芳基”、“C2-C6-烯基芳基”、“C2-C6-烯基雜芳基”、“C2-C6-炔基芳基”、“C2-C6-炔基雜芳基”、“C1-C6-烷基環(huán)烷基”、“C1-C6-烷基雜環(huán)烷基”。
“亞磺酰基”指基團-S(O)-R，其中R選自H、“C1-C6-烷基”、鹵素取代的“C1-C6-烷基”如-SO-CF3基團，“C2-C6-烯基”、“C2-C6-炔基”、“C3-C8-環(huán)烷基”、“雜環(huán)烷基”、“芳基”、“雜芳基”、“C1-C6-烷基芳基”或“C1-C6-烷基雜芳基”、“C2-C6-烯基芳基”、“C2-C6-烯基雜芳基”、“C2-C6-炔基芳基”、“C2-C6-炔基雜芳基”、“C1-C6-烷基環(huán)烷基”、“C1-C6-烷基雜環(huán)烷基”。
“磷?；敝富鶊F-PORR’，其中R、R’各自獨立地是氫、OH、烷氧基、烷基。
“烷氧基”指基團-O-R，其中R包括“C1-C6-烷基”、或“芳基”或“雜芳基”或“C1-C6-烷基芳基”或“C1-C6-烷基雜芳基”。優(yōu)選的烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、苯氧基等。
“鹵素”指氟、氯、溴、碘原子。
“取代或未取代的”除非由個別的取代基的定義所限定，否則上述的基團，如“烷基”、“烯基”、“炔基”、“芳基”和“雜芳基”等等可任選地被1-5個取代基取代，所述取代基選自“C1-C6-烷基”、“C2-C6-烯基”、“C2-C6-炔基”、“環(huán)烷基”、“雜環(huán)烷基”、“C1-C6-烷基芳基”、“C1-C6-烷基雜芳基”、“C1-C6-烷基環(huán)烷基”、“C1-C6烷基雜環(huán)烷基”、“氨基”、“銨”、“酰基”、“酰氧基”、“?；被?、“氨基羰基”、“烷氧基羰基”、“脲基”、“氨基甲酸酯”、“芳基”、“雜芳基”、“亞磺酰基”、“磺酰基”、“烷氧基”、“硫烷基”、“鹵素”、“羧基”、三鹵甲基、氰基、羥基、巰基、硝基等?；蛘咚龅娜〈€可以包括這樣的情況相鄰的取代基發(fā)生閉環(huán)，尤其當涉及鄰位官能取代基時，因此形成如內酰胺、內酯、環(huán)狀酸酐，還包括為了得到保護基團而閉環(huán)形成的縮醛、硫縮醛、縮醛胺。
下文將通式(I)所示的化合物也稱為“本發(fā)明的化合物”。
本發(fā)明上下文中的術語“預防”，不僅指完全預防疾病或疾病的一或多種癥狀，也指在疾病發(fā)作前或發(fā)作早期任何部分或實質的預防、減弱、降低、減退或消除這種影響。
本發(fā)明上下文中的術語“治療”，指任何對疾病的進展有益的效果，包括在疾病發(fā)作后減弱、降低、減退或消除病理發(fā)展。
本發(fā)明上下文中的術語“脫髓鞘疾病”指涉及神經系統(tǒng)髓鞘異常特別是髓磷脂受到破壞的疾病，詳細描述見上文“發(fā)明背景”部分。
本文所用的“干擾素”或“IFN”包括文獻限定的任何分子，例如包括上文“發(fā)明背景”部分描述的任何類型的IFN。具體地說，IFN-α、IFN-β和IFN-γ都包括在上述定義內。本發(fā)明優(yōu)選的IFN是IFN-β。本發(fā)明適用的IFN-β可通過商業(yè)途徑獲得，例如Rebif(Serono)、Avonex(Biogen)或Betaferon(Schering)。較佳地，本發(fā)明使用人干擾素。此處的術語干擾素還包括其鹽、功能性衍生物、突變體、類似物和活性部分。
本文所用的術語“干擾素-β(IFN-β)”包括從生物流體分離獲得的或通過DNA重組技術從原核生物或真核生物宿主細胞獲得的成纖維細胞干擾素，尤其是人成纖維細胞干擾素，以及其鹽、功能性衍生物、突變體、類似物和活性部分。
本文所用的術語“突變蛋白”指IFN的同類物，其中天然IFN的一個或多個氨基酸殘基被不同氨基酸殘基所取代，或缺失，或者IFN的天然序列中加入了一個或多個氨基酸殘基，但所產生的產物的活性與野生型IFN相比無顯著降低。這些突變型蛋白可用已知的合成和/或定點誘變技術，或任何適合的其它已知技術制備。優(yōu)選的突變蛋白包括例如Shepard等人(1981)或Mark等人(1984)描述的那些。
任何這樣一種突變蛋白最好具有IFN充分復制的氨基酸序列，從而具有與IFN基本上相似或者甚至更好的活性。干擾素的生物功能已為本領域技術人員公知，生物標準已經確立，例如可從國家生物學標準與控制研究院獲得(http//immunology.org/links/NIB SC)。
測定IFN活性的生物試驗已有報導。例如，可按照Rubinstein等人(1981)描述的方法進行IFN試驗。因此，借助常規(guī)實驗方法可確定任何一個給定突變蛋白是否具有與IFN基本相同或者甚至更好的活性。
可用于本發(fā)明的IFN突變蛋白或其編碼核酸，包括一組有限的基本上與取代肽或多核苷酸相應的序列，本領域普通技術人員可根據本文所述和提供的指南用常規(guī)方法獲得，而無須進行過多實驗。
本發(fā)明突變蛋白中的優(yōu)選變化稱為“保守性”取代。本發(fā)明多肽或蛋白質的保守性氨基酸取代可包括一組內的同義氨基酸，其具有足夠相似的生理化學特性，該組成員之間的取代將保留該分子的生物功能。顯然，在上述序列中也可進行氨基酸的插入和缺失而不改變其功能，特別是如果這種插入或缺失只涉及少數氨基酸時，如30個以下，最好為10個以下，而且不除去或取代對功能性構型起關鍵作用的氨基酸，如半胱氨酸殘基。這類缺失和/或插入所產生的蛋白質和突變蛋白屬于本發(fā)明范圍。
優(yōu)選同義氨基酸組是表1列出的那些組；更好的同義氨基酸組是表2列出的那些組；最好的同義氨基酸組是表3列出的那些組。
表1 優(yōu)選同義氨基酸組

表2 更好的同義氨基酸組


表3 最好的同義氨基酸組


在蛋白質中產生氨基酸取代的實施例可用來獲得本發(fā)明中所用的IFN突變蛋白，包括任何已知的方法步驟，如Mark等人的美國專利4,959,314、4,588,585和4,737,462；Koths等人的5,116,943；Namen等人的4,965,195Chong等人的4,879,111和Lee等人的5,017,691專利中提出的方法，以及美國專利4,904,584(Shaw等人)中提出的賴氨酸取代蛋白質。具體的IFN-β突變蛋白已由Mark等人在1984年作出報導。
術語“融合蛋白”指一多肽，其包含IFN或其突變蛋白與另一蛋白質(如在體液中停留時間延長的蛋白質)的融合。故IFN可與另一蛋白質、多肽等，如免疫球蛋白或其片段，融合。
本文使用的“功能性衍生物”，包括IFN衍生物及其突變蛋白和融合蛋白，它們可用本領域已知方法從殘基或N端或C端基團上以側鏈存在的功能性基團制備。只要它們仍然在藥學上可接受，即它們沒有破壞與IFN活性基本上相似的蛋白質活性，并且不會使含它的組合物具有毒性，均包括在本發(fā)明中。這些衍生物例如可以包括聚乙二醇側鏈，其可遮蔽抗原位并延長IFN在體液中的停留時間。其它衍生物包括羧基脂肪酯，羧基與氨或伯胺或仲胺反應產生的酰胺、氨基酸殘基的游離氨基與?；糠址肿?如烷酰基或碳環(huán)芳?；?形成的N-酰基衍生物、或游離羥基(如絲氨酰或蘇氨酰殘基的游離羥基)與?；糠址肿有纬傻腛-?；苌铩?br> 本發(fā)明的IFN的“活性部分”、或突變蛋白和融合蛋白包括單獨蛋白分子多肽鏈的任何片段或前體，或蛋白分子與相關分子或與其相連的殘基，如糖或磷酸根殘基一起，或蛋白分子或糖殘基自身的聚集物，只要所述部分具有與相應IFN基本上相似的活性。
本文所用的術語“鹽”指羧基鹽和上述蛋白質或其類似物中氨基的酸加成鹽。羧基鹽可通過本技術領域公知的方法形成，包括無機鹽，例如鈉鹽、鈣鹽、銨鹽、鐵鹽或鋅鹽等，以及有機堿鹽，例如三乙醇胺等胺、精氨酸、賴氨酸、哌啶、普魯卡因(procaine)等形成的鹽。酸加成鹽包括例如無機酸鹽，如鹽酸鹽或硫酸鹽，有機酸鹽，如乙酸鹽或草酸鹽。當然，任何這樣的一種鹽必須保留與本發(fā)明有關的蛋白質(IFN)的生物活性，即具有結合相應受體和啟動受體信號傳導的能力。
本發(fā)明的脫髓鞘疾病例如可以是“發(fā)明背景”部分描述的多發(fā)性硬化癥、急性播散性腦脊髓炎、急性炎癥性周圍神經病變、腦白質腎上腺萎縮癥和腎上腺脊髓神經病、利伯氏遺傳性視神經萎縮癥或HTLV-相關性脊髓病。它們較佳地是伴隨有異常髓鞘形成的神經病變。它們可涉及周圍或中樞神經系統(tǒng)。
最常見的脫髓鞘疾病是多發(fā)性硬化癥。所以，本發(fā)明一優(yōu)選實施例中采取本發(fā)明的化合物與干擾素聯用，用來治療和/或預防多發(fā)性硬化癥(MS)。根據本發(fā)明，MS是慢性進展性疾病。它也可以是復發(fā)-緩解型多發(fā)性硬化癥或者疾病的任何中間表現。
根據本發(fā)明一個實施例，通式(I)中R1是H。在另一實施例中，R2是OH。另一優(yōu)選實施例的A是N。在本發(fā)明又一實施例中，R3和R5形成一個6元雜環(huán)。在本發(fā)明一優(yōu)選實施例中，該雜環(huán)是嘧啶或嘧啶酮。
根據本發(fā)明，本發(fā)明的化合物特別優(yōu)選使用利巴韋林(I-β-D-核呋喃糖基-1H-1，2，4-三氮唑-3-甲酰胺)。
根據本發(fā)明，特別優(yōu)選使用重組人IFN-β和本發(fā)明的化合物。
最近，有人描述了一種特殊干擾素突變體。所謂的“共有干擾素(consensusinterferons)”是非天然存在的IFN突變體(US 6,013,253)。已證明，共有干擾素對治療多發(fā)性硬化癥有效。
所以，本發(fā)明一優(yōu)選實施例采用本發(fā)明的化合物與共有干擾素聯用。
本文所稱人干擾素共有序列(IFN-con)為非天然存在的多肽，它主要包括那些與代表大部分天然存在的人白細胞干擾素亞型序列的IFN-α子集共有的氨基酸酸殘基，并且包括在與全部亞型無共有氨基酸的那些位置中一或多個位置上的氨基酸殘基，該氨基酸殘基主要存在于那個位置上，但不得包括以至少一個天然存在的亞型存在于那個位置上的任何氨基酸殘基。IFN-con包括但不限于氨基酸序列指定的IFN-con1、IFN-con2和IFN-con3，它們在美國專利US 4,695,623、US 4,897,471和US 5,541,293中有描述。按照上述專利描述的方法或其他標準方法可生產編碼IFN-con的DNA序列。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實施例中，融合蛋白包含Ig融合。這種融合可以是直接的，或通過一個短接頭肽，長度短至1-3個氨基酸殘基或較長，如13個氨基酸殘基的長度相融合。例如，所述接頭可以是E-F-M(Glu-Phe-Met)序列的三肽或含有13個氨基酸的接頭序列，其包含導入在IFN序列和免疫球蛋白序列之間的Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met。所產生的融合蛋白具有改進的性能，如在體液的停留期(半衰期)延長，比活性提高，表達水平增加或有利于該融合蛋白的純化。
在一優(yōu)選實施例中，將IFN融合于Ig分子的恒定區(qū)。優(yōu)選融合于重鏈區(qū)，例如，人IgG1的CH2和CH3區(qū)。Ig分子的其它同種型也適合用來產生本發(fā)明的融合蛋白，例如，同種型IgG2、IgG3或IgG4，或其它Ig類，如IgM或IgA。融合蛋白可以是單體或多聚體，異質或同質多聚體。
在一優(yōu)選實施例中，功能性衍生物包括至少一部分連接于一個或多個官能團，所述官能團以氨基酸殘基上一個或多個側鏈的形式出現。較佳地，該部分是聚乙二醇(PEG)。例如，可按WO 99/55377所述的已知方法進行聚乙二醇化。
現時，治療復發(fā)-緩解型MS采用的人IFN-β標準日劑量在80,000IU/kg至200,000IU/kg范圍內，或者每人每日6MIU(百萬國際單位)至12MIU或者每人22至44μg(微克)。根據本發(fā)明，可每人每日給予約1至50μg IFN，更好約10至30μg IFN或約10至20μg IFN。優(yōu)選的給藥途徑是皮下給藥，例如，每周給予三次。另一優(yōu)選給藥途徑是肌內給藥，可每周施加一次。
較佳地，通過皮下注射一周給予三次22至44μg或者6MIU至12MIUIFN-β。
可每隔一日通過皮下給予250至300μg或者8MIU至9.6MIU IFN-β。
通過肌內注射一周給予一次IFN-β，劑量為30μg或6MIU。
IFN-β可每日或每隔一日給予，給予的頻率可進一步減少。較佳地，每周給予一次、兩次或三次IFN-β。
本發(fā)明的活性成分可以通過靜脈內、肌內或皮下途徑給予。IFN-β的優(yōu)選給藥途徑是皮下途徑。
在一優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的化合物，優(yōu)選利巴韋林的給予量為每人每日約100至2000mg，較好為每人每日約400至1200mg，更好為每人每日約800至1000mg，或約1000至1200mg。對于體重少于65kg的病人，常用劑量為每日800mg，對于體重在65kg至85kg的病人，常用劑量為每日1000mg，對于體重超過85kg的病人，常用劑量為每日1200mg。實際采用的劑量取決于病人的要求及病情嚴重程度而變化。本領域技術人員懂得為具體情況決定適合的劑量方案。為方便起見，全部日劑量可按需要在一日內分多次給予。
在一優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的化合物優(yōu)選利巴韋林通過口服給予。
利巴韋林可通過注射，或者最好通過口服給予。根據給藥途徑，化合物可與合適的稀釋劑和載體配制成藥膏、霜劑、泡沫劑以及溶液，含有約0.01％至約15％(重量)的化合物，較佳地含有約1％至約10％(重量)的化合物。用于注射途徑時，利巴韋林為溶解在或懸于生理相容性溶液中的溶液或懸浮液，濃度約10mg/ml至約1500mg/ml。注射途徑可以是靜脈內、肌內、腦內、皮下、或腹腔內。
用于口服給藥時，利巴韋林可以是膠囊、片劑、口服懸劑或糖漿劑形式。片劑或膠囊可含有約10至500mg利巴韋林。較佳地，它們含有約300mg利巴韋林。膠囊可以是一般明膠膠囊，除了含有上述所示數量的利巴韋林外，還可以含有例如少于5％(重量)的硬脂酸鎂或其他賦形劑。片劑可以含有上述數量的化合物和粘合劑，該粘合劑可以是明膠溶液、淀粉水糊、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇水溶液等等，帶有典型的糖包衣。
皮質類固醇對脫髓鞘疾病有治療效果。因此，本發(fā)明的藥物還包含皮質類固醇，可同時、先后或分開使用。作為皮質類固醇治療，例如連續(xù)2至3個星期每日口服60至100mg強的松，劑量逐漸減少，或者每日靜脈內給予甲潑尼龍500至1000mg，持續(xù)3至5日。
Glatiramer是一種合成共聚物，與髓磷脂基礎蛋白質相似，可每日皮下注射給予。已經證實，它對多發(fā)性硬化癥有治療效果。本發(fā)明一優(yōu)選實施例的藥物還包括glatiramer，可同時、先后或分開使用。
本發(fā)明的化合物和IFN可配制成藥物組合物。
術語“藥學上可接受的”指包含不會干擾活性成分的生物活性效果，并對給予的宿主無毒性的任何載體。例如，為了在腸胃外給藥，可將這些活性蛋白以注射用單位劑量形式配制在載體中，如鹽水，葡萄糖液，血清白蛋白和林格(Ringer)溶液。
本發(fā)明藥物組合物的活性成分可以以各種途徑給予個體。給藥途徑包括皮內、透皮(如緩釋制劑)、肌內、腹腔內、靜脈內、皮下、口服、硬膜外、局部和鼻內等途徑。也可采用其它有效治療途徑給藥，例如通過上皮或內皮組織吸收或通過基因療法將編碼活性藥物的DNA分子給予病人(如通過載體)，導致該活性藥物在體內表達和分泌。此外，可將本發(fā)明的蛋白質與生物活性藥物的其它組分，如藥學上可接受的表面活性劑、賦形劑、載體、稀釋劑和介質等，一起給予。
本發(fā)明優(yōu)選的給藥途徑為皮下途徑。
另一種實施本發(fā)明的方法是內源性激活IFN的基因。這種方法使用在正常不表達IFN或表達IFN的量不充分的細胞中能誘導和/或增強內源性產生IFN的載體治療脫髓鞘疾病。該載體可包括在所需表達IFN的細胞中起作用的調控序列。例如，這類調控序列可以是啟動子或增強子。然后，可通過同源重組將該調控序列導入基因組的正確基因座中，使調控序列與基因作可操作性相連，所需要的表達即被誘導或被增強。該技術通常稱為“內源性基因激活”(EGA)，在WO 91/09955中有所敘述。
本發(fā)明還涉及經過基因改造產生IFN的細胞在制備治療和/或預防中樞神經系統(tǒng)疾病的藥物中的用途。
對于腸胃外(如靜脈內、皮下、肌內)給藥，可將IFN配制成溶液、懸浮液、乳液或與藥學上可接受的腸胃外介質(如水、鹽水、葡萄糖液)以及能維持等滲性(如甘露糖醇)或化學穩(wěn)定性(如防腐劑和緩沖液)的添加劑一起制成凍干粉末。以常規(guī)技術給制劑滅菌。
本發(fā)明的IFN也可用共軛方法增加分子在人體內的半衰期而改善其生物利用性。例如，如PCT專利申請WO 92/13095所述那樣，使分子與聚乙二醇結合。
給予個體單劑或多劑的劑量取決于各種因素，包括藥物動力學性能、給藥途徑、病人的病情和特征(性別、年齡、體重、健康狀況和身型大小)、癥狀輕重程度、并行治療、治療頻度和所要求的效果。
日劑量通常分成幾劑或以緩釋形式給予，能有效地獲得所希望的效果。第二次或隨后給藥可以與首次或原先給予該個體的相同劑量、少于或多于此劑量進行?？稍诎l(fā)病時或發(fā)病前進行第二次或隨后給藥。
按照本發(fā)明，本發(fā)明的化合物和IFN可以以治療有效量先于、同時或依次與其它治療方案或藥物(如多種藥物方案)預防性或治療性地給予個體。與其它治療藥物同時給予的活性藥物可在相同或不同的組合物中。
本文所引用的全部文獻，包括期刊文章或摘要、公開或未公開的美國或外國專利申請、已授權的美國或外國專利或其它文獻，均整體納入本文參考文獻中，包括引用文獻中提供的全部數據、表格、圖形及文字。此外，本文引用文獻內所引用的內容也整體納入作為參考。
參考已知的方法步驟、常規(guī)的方法步驟、已知方法或常規(guī)方法并不是承認本發(fā)明的任何方面、敘述或實施例均已在相關技術領域中公開得到、啟發(fā)或者暗示。
上述對具體實施例的敘述將完整地揭示本發(fā)明的總體特征，其他人運用本領域的一般技術常識(包括本文引用的參考文獻的內容)可在無需過多的實驗和不脫離本發(fā)明總體概念的條件下，不難對這些具體實施例的各種應用作出改變和/或調整。所以，根據本文所述和指引，意味著這樣一些改變和/或調整在本發(fā)明所公開的實施例相等的范圍內。需要知道的是，本文的用語或術語是為了說明而不具有限制性，因此這些術語或用語可由本領域技術人員根據本文所述和提供的指引，并結合本領域普通技術人員所知道的常識作出解釋。
上文對本發(fā)明進行了敘述，結合下面實施例將會更容易理解本發(fā)明，但這些實施例只用于舉例說明，而對本發(fā)明沒有任何限制作用。
實施例利巴韋林單獨或與IFN-β聯用在多發(fā)性硬化癥體內模型中的作用利用已建立的多發(fā)性硬化癥(MS)動物模型分析利巴韋林單獨或者與IFN-β聯用對疾病發(fā)展的影響。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型是小鼠慢性脫髓鞘模型。誘導小鼠EAE所用的方法根據Sahrbacher等人(1998)發(fā)表的方案作了適應性修改。
EAE誘導方案小鼠品種、品系、次代品系和性別C57 BL/6JICO雌性小鼠，來自IFFA CREDO(Saint Germain sur l’Arbresle，France)殖民地，由Charles River Italia(Calco，Lecco，Italy)提供。
年齡和體重(隨機)約8周齡；18-22g安置動物按如下條件關在籠內-每籠10只動物，置于空調房間內-溫度22℃±2-相對濕度55％±10-換氣每小時約15-20次，經HEPA 99.99％過濾-光照12小時(上午7:00至下午7:00)-籠Makrolon籠，尺寸為42.5×26.6×15，設不銹鋼帶蓋喂飼架。籠底放置格柵。定期處理通過格柵落在籠底的廢棄物。
食物食物丸，具有GLP 4RF25高級證書，由Charles River Italia的持牌供應廠商Mucedola S.r.l.，Settimo Milanese生產。為了增加體弱動物的營養(yǎng)，從第7天起每日在籠底放濕食物丸。生產商提供了營養(yǎng)及污染物分析表，它們的水平都在EPA-TSCA主張的范圍內(44FR44053-44093，July 26，1979)。動物的食物喂飼是“隨意的”。
水來自市政主要供水系統(tǒng)。水經過濾后通過自動閥系統(tǒng)隨意分配給動物。除了自動化供水系統(tǒng)外，也使用塑料瓶裝水。定期分析飲用水的微生物數量、重金屬、其他污染物(例如溶劑、殺蟲劑)以及其他物化性質。飲用水質量的容許極限符合EEC Directive 80/778的規(guī)定。
免疫程序按以下方法誘導各組小鼠產生實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)在左側皮下注射0.2mL乳液，所述乳液由200μg MOG35-55肽(Neosystem，Strasbourg，France)和含有0.5mg結核分支桿菌的全弗氏佐劑(Difco，Detroit，U.S.A.)組成，使6組動物(各含10只雌性小鼠)免疫。
然后，立即給它們腹腔內注射溶解在400μL緩沖液(0.5M NaCl、0.017％Triton X-100、0.015M Tris，pH＝7.5)的500ng百日咳毒素(List Biological Lab.，Campbell，CA，U.S.A.)。
第2天，動物接受第二次腹腔內注射500ng百日咳毒素。
第7天，在動物右側皮下注射第二劑在全弗氏佐劑中的200μg MOG35-55肽(Neosystem，Strasbourg，France)。大約從第8至10天起，該程序會導致動物逐漸麻痹，從尾部開始一直至上肢。
開始治療時每只動物的表象臨床評分1，連續(xù)治療60天。動物每天接受的治療如下

使用PBS為介質稀釋利巴韋林和r-mIFN-β至適當濃度。
每日通過腹腔內或皮下途徑給予mIFN-β，日劑量為20,000U/小鼠，體積為200μL/小鼠。每日通過腹腔內或皮下途徑單獨給予兩種劑量(50mg/kg或100mg/kg)的利巴韋林，或者通過腹腔內或皮下途徑與mIFN-β聯合給予，劑量為20,000U/小鼠，體積為200μL/小鼠。
每天監(jiān)測各組接受治療的動物的臨床癥狀和體重。從第7天開始，分別檢查各只動物是否出現麻痹，采用以下臨床評分0＝沒有疾病癥狀0.5＝尾部局部麻痹1＝尾部麻痹1.5＝尾部麻痹+單側后肢局部麻痹2＝尾部麻痹+后肢無力或后肢局部麻痹2.5＝尾部麻痹+后肢局部麻痹(低至骨盆)3＝尾部麻痹+后肢完全麻痹3.5＝尾部麻痹+后肢完全麻痹+失禁4＝尾部麻痹+后肢麻痹+前肢無力或局部麻痹5＝瀕臨死亡或死亡組織學分析治療結束時，動物用戊巴比妥麻醉，再用4％甲醛通過左室灌注固定。然后，小心將它們的脊髓切片，固定于福爾馬林中。把脊髓切片植入石蠟塊。進行如下操件切片，以蘇木精和曙紅為炎癥部位染色，以Kluver-PAS(Luxolfast blue加上過碘酸-Schiff染色)為檢測脫髓鞘染色。
各組的臨床檢查結果以平均值(±SEM)評分表示。把測試物質的效果分別與經介質處理的陽性對照組作比較。每次測量，各組間臨床評分之差異采用單向方差分析(One-way ANOVA)檢驗法分析，若存在差異顯著，再以Fisher檢驗法分析。體重數據以單向方差分析法分析，若存在差異顯著，再以Tukey檢驗法分析。使用S-Plus軟件。
一如所料，可觀察到IFN-β與利巴韋林聯用具有明顯的治療效果。
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權利要求
1.通式(I)所示的化合物與干擾素-β(IFN-β)，或其同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或鹽聯用在制造治療和/或預防脫髓鞘疾病的藥物中的用途，可同時、先后或分開使用， 通式(I)中，R1選自包括或者由以下基團組成的組氫、?；?、C1-C6-烷基、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基、C1-C6-烷基氨基羰基、C1-C6-烷基氨基、C1-C6-烷基烷氧基、C1-C6-烷基硫烷基、C1-C6-烷基亞磺?；?、C1-C6-烷基磺?；?、芳基、雜芳基、C3-C8-環(huán)烷基或C3-C8元雜環(huán)烷基、C1-C6-烷基芳基、C1-C6-烷基雜芳基、任選地含有1至3個雜原子的C1-C6烷基環(huán)烷基、C2-C6-烯基-芳基或-雜芳基、C2-C6-炔基芳基或-雜芳基、磺?；蛘吡柞；?；R2選自包括或者由以下基團組成的組氫、C1-C6-烷基、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基、C1-C6-烷氧基、羥基、鹵素；R3選自包括或者由以下基團組成的組氫、C1-C6-烷基、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基；A是N或CR4，其中R4是H或NR5R5′，其中R5和R5′各自獨立地選自包括或者由以下基團組成的組氫、酰基、C1-C6-烷基、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基、C1-C6-烷基氨基羰基、C1-C6-烷基氨基、C1-C6-烷基烷氧基、C1-C6-烷基硫烷基、C1-C6-烷基亞磺酰基、C1-C6-烷基磺?；?、C1-C6-烷基磺?；被蓟?、芳基、雜芳基、C3-C8-環(huán)烷基或雜環(huán)烷基、C1-C6-烷基芳基、C1-C6-烷基雜芳基、任選地含有1至3個雜原子的C1-C6烷基環(huán)烷基、C2-C6-烯基-芳基或-雜芳基、C2-C6-炔基芳基或-雜芳基、磺?；蛄柞；籖3與R5可一起形成一個雜環(huán)。
2.根據權利要求1所述的用途，其特征在于，R1是H。
3.根據上述權利要求任一項所述的用途，其特征在于，R2是OH。
4.根據上述權利要求任一項所述的用途，其特征在于，R3是H。
5.根據上述權利要求任一項所述的用途，其特征在于，A是N。
6.根據上述權利要求任一項所述的用途，其特征在于，R3和R5形成一個6元雜環(huán)。
7.根據上述權利要求任一項所述的用途，其特征在于，所述雜環(huán)是嘧啶或嘧啶酮。
8.根據權利要求1所述的用途，其特征在于，所述化合物是1-β-D-核呋喃糖基-1H-1，2，4-三氮唑-3-甲酰胺(利巴韋林)。
9.根據上述權利要求任一項所述的用途，其特征在于，所述脫髓鞘疾病是多發(fā)性硬化癥。
10.根據上述權利要求任一項所述的用途，其特征在于，所述的融合蛋白包括一個免疫球蛋白(Ig)融合。
11.根據上述權利要求任一項所述的用途，其特征在于，所述功能性衍生物包括至少一部分連接于一個或多個官能團，所述官能團以氨基酸殘基上一個或多個側鏈的形式出現。
12.根據權利要求11所述的用途，其特征在于，所述的部分是聚乙二醇部分。
13.根據上述權利要求任一項所述的用途，其特征在于，所述IFN-β的劑量為每人每日約1至50μg，或每人每日約10至30μg，或每人每約10至20μg。
14.根據上述權利要求任一項所述的用途，其特征在于，所述IFN-β每日或每隔一日給予。
15.根據上述權利要求任一項所述的用途，其特征在于，所述IFN-β每周給予二次或三次。
16.根據上述權利要求任一項所述的用途，其特征在于，所述IFN-β通過皮下途徑給予。
17.根據上述權利要求任一項所述的用途，其特征在于，所述IFN-β通過肌內途徑給予。
18.根據上述權利要求任一項所述的用途，其特征在于，所述化合物的劑量為每人每日約100至2000mg，或每人每日約400至1200mg，或每人每約800至1000mg，或每人每約1000至1000mg。
19.根據上述權利要求任一項所述的用途，其特征在于，所述化合物口服給予。
全文摘要
本發(fā)明為神經系統(tǒng)疾病領域，涉及通式(I)所示的化合物與干擾素(IFN)聯用在制造治療和/或預防脫髓鞘疾病的藥物中的用途。具體地說，它涉及利巴韋林與IFN－β聯用在治療和/或預防脫髓鞘疾病如多發(fā)性硬化癥中的用途。
文檔編號A61K38/21GK1761471SQ200480007399
公開日2006年4月19日 申請日期2004年2月24日 優(yōu)先權日2003年2月25日
發(fā)明者G·德魯卡 申請人:應用研究系統(tǒng)Ars股份公司