專利名稱：用于hiv感染者的口服組合物的制作方法
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及可以對人免疫缺陷病毒感染者產(chǎn)生有益健康效果的含有酵母細胞的口服組合物。本發(fā)明還涉及制造這種口服組合物的方法以及這種組合物的使用方法。
2.發(fā)明背景2.1艾滋病艾滋病(AIDS，獲得性免疫缺陷綜合癥)自1981年美國首次報道以來，已成為一種世界性的主要流行病。艾滋病是由人免疫缺陷病毒(HIV)引起的。HIV通過殺死或破壞機體免疫系統(tǒng)的細胞進行性地破壞機體抵抗感染和某些癌癥的能力。免疫系統(tǒng)減弱的結(jié)果是，許多艾滋病病人患上了威脅生命的機會病菌感染，如肺炎、視網(wǎng)膜炎和曲霉病。
截止2000底，估計全世界有3610萬人-3470萬成年人和140萬15歲以下底兒童-感染了HIV或患有艾滋病。這些人中70％以上(2530萬)生活在非洲撒哈拉周邊地區(qū)，還有16％(580萬)生活在南亞和東南亞。僅2000年，HIV/AIDS相關(guān)疾病就造成全世界大約300萬人死亡，包括大約50萬15歲以下的兒童(UNAIDS.Report on the globalHIV/AIDS epidemicDecember 2000)。
在美國，每年有約4萬新的HIV感染發(fā)生，感染者約70％為男性，30％為女性。截止2000年底，美國有大約322,685人患艾滋病。艾滋病是美國25-44歲人群中的第五大致死原因。見美國疾病預防控制中心(CDC)的報告HIV/AIDS Surveillance Report 2000；12(no.2)1-44。據(jù)中國的首屆全國艾滋病會議(2001)報道，艾滋病已在中國迅速傳播，感染人數(shù)以每年30％的速度增長。中國13億人口中估計有60萬HIV感染者。
據(jù)估計，美國艾滋病相關(guān)的年死亡人數(shù)從1995年到1999年下降了大約67％，從1995年的50,877例死亡到1999年的16,767例死亡(美國疾病預防及控制中心，HIV and AIDS-United States，1981-2001，MMWR 2001；50430-434)。美國食品藥品管理局(FDA)批準了一些治療HIV感染的藥物。第一類藥物稱為逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(包括核苷和非核苷類似物)，它們阻斷病毒復制的早期階段。該類藥物包括AZT(也稱為齊多夫定或ZDV)、ddC(扎西他濱)、ddI(二脫氧肌苷)、d4T(stavudine)、3TC(拉米夫定)、delvaridine(Rescriptor)、奈韋拉平(Viramune)和efravirenz(Sustiva)。第二類被批準用于艾滋病治療的藥物稱為蛋白酶抑制劑，它們在病毒生命周期的晚期阻斷其復制。它們包括Invirase(沙奎那韋)、Norvir(ritonavir)、Crixivan(indinavir)、Viracept(nelfinavir)和Agenerase(amprenivir)。由于HIV能對任何這些藥物產(chǎn)生抗性，醫(yī)務人員必需采用聯(lián)合治療來有效抑制病毒?，F(xiàn)有的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物不能治愈感染HIV的人或艾滋病病人。另外，它們都有可能很嚴重的副作用。一些核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑可能造成紅細胞或白細胞貧乏，特別是在疾病晚期服用時更是如此。有些還可能引起胰腺的炎癥和疼痛的神經(jīng)損傷。蛋白酶抑制劑最常見的副作用包括惡心、腹瀉和其他胃腸道癥狀。
雖然這些藥物在許多情況下對抑制疾病有效，但這些藥物的昂貴費用是中國和非洲撒哈拉周邊地區(qū)(半數(shù)以上HIV陽性人群生活在這里)對付艾滋病流行的主要障礙。
雖然化療藥物對治療HIV感染和艾滋病是有效的，一直以來需要找出能更有效和經(jīng)濟地控制這種疾病而副作用更小的治療形式和途徑。本發(fā)明提供了一種用含酵母的口服組合物進行艾滋病治療和HIV感染控制的替代途徑。
2.2基于酵母的組合物已有酵母和其成分被開發(fā)用于食物補充劑或者藥物。但沒有現(xiàn)有技術(shù)方法使用在電磁場中培養(yǎng)的酵母來生產(chǎn)對HIV感染者具有有益效果的產(chǎn)品。以下是酵母和其成分現(xiàn)有應用的一些例子美國專利6,197,295公開了一種可以用作食物補充劑的富含硒的干酵母產(chǎn)品。酵母株Saccharomyces boulardii sequela PY 31(ACTT 74366)在硒鹽存在下培養(yǎng)，其含有300到約6000ppm的細胞內(nèi)硒。還公開了該含硒酵母產(chǎn)品與化療藥物聯(lián)合給藥減少腫瘤細胞生長的方法。
美國專利6,143,731公開了一種含有來自酵母的全β-葡聚糖的食物添加劑，給予動物或人時，能提供食物纖維來源、糞便膨脹劑、短鏈脂肪酸來源，降低膽固醇和LDL水平并提高HDL水平。
美國專利5,504,079公開了一種利用具有高免疫生物活性的改性酵母葡聚糖刺激免疫應答的方法。這種改性葡聚糖由酵母屬酵母的細胞壁制成，可以通過各種途徑給藥，包括例如口服、靜脈、皮下、表皮和鼻內(nèi)途徑。
美國專利4,348,483公開了一種制備具有高細胞內(nèi)鉻含量的鉻酵母產(chǎn)品的方法。該方法包括讓酵母細胞在控制的酸性pH值下吸收鉻，然后加入營養(yǎng)物誘導該酵母細胞生長。該酵母細胞經(jīng)干燥用作飲食補充劑。
這里引述這些文獻并不是承認任何這些所引述的文獻為相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)，或承認所引述的文獻對本申請權(quán)利要求的專利性有實質(zhì)性影響。所有關(guān)于這些文獻的日期或內(nèi)容的陳述都是以申請人現(xiàn)有信息為基礎的，并不等于承認這些文獻的日期或內(nèi)容的正確性。
3.發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及用于HIV感染者和/或艾滋病患者的生物組合物或口服組合物。在一種實施方案中，本發(fā)明提供含有能對HIV感染者和/或艾滋病患者產(chǎn)生有益健康效果的活酵母的生物組合物。在另一實施方案中，本發(fā)明提供制備這種生物組合物的方法，以及使用該生物組合物的方法。
具體講，本發(fā)明的方法包括在一系列電磁場存在下培養(yǎng)酵母細胞，使酵母細胞呈代謝活性。所用的電磁場各自以五個頻率范圍之一和一個寬范圍的場強確定。起始酵母細胞是市場上有售的和/或公眾可以獲得的，例如(但不限于)卡爾斯伯根糖酵母(Saccharomyces carsbergensis)。本發(fā)明制備生物組合物的方法還包括在電磁場存在下在植物提取物和動物胃液中調(diào)理或馴化所述活化酵母細胞。
所述制備方法可包括在電磁場存在下在大規(guī)模培養(yǎng)中擴大活化并調(diào)理酵母細胞的數(shù)量，采取質(zhì)量控制措施和包裝。本發(fā)明的藥物組合物包括活化并調(diào)理的酵母細胞和一種或多種藥物可接受的賦形劑或載體?？梢韵蛩錾锝M合物中加入其他成分如維生素和/或香味劑，以形成本發(fā)明的口服組合物。這種額外的載體和成分可以提高口服組合物的有益健康效果、藥理特性和感官特性。在制造過程中，被活化或被活化并調(diào)理的酵母細胞可以被干燥或保持低溫，并保存一段時間。
本發(fā)明的生物或口服組合物由相關(guān)主體攝食或者用作待摻入相關(guān)主體食物中的添加劑。本發(fā)明包括含有被活化并調(diào)理酵母細胞的飲食補充劑和營養(yǎng)組合物。優(yōu)選所述主體是人。
在各種實施方案中，本發(fā)明的生物或口服組合物用于在HIV感染主體中產(chǎn)生有益健康效果。具體講，本發(fā)明的生物組合物可以減緩口服接受該組合物的哺乳動物中HIV病毒的生長。本組合物還可用于延長HIV感染和/或AIDS患者的存活時間。
4.附圖簡述

圖1酵母細胞的活化和調(diào)理。1.酵母細胞培養(yǎng)物；2.容器；3.電磁場源；4.電極。
圖2酵母細胞的大規(guī)模繁殖。5.第一容器；6.第二容器；7.第三容器；8.酵母細胞培養(yǎng)物；9.電磁場源。
5.發(fā)明詳細描述本發(fā)明涉及可對HIV感染者和/或愛滋病患者產(chǎn)生有益健康效果的生物組合物。本發(fā)明提供該生物組合物的制備方法以及使用該生物組合物的方法。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供含有酵母的生物組合物。與傳統(tǒng)的酵母用作食物成分的應用不同，本發(fā)明的酵母細胞不是主體的主要營養(yǎng)來源，酵母細胞也不是用作物質(zhì)的載體，如金屬鹽的載體。本發(fā)明的酵母在口服或與食物一起由主體攝取時是活的。雖不拘于任何理論或機制，發(fā)明人相信本發(fā)明的培養(yǎng)條件激活和/或擴增了酵母細胞中的某種基因或一組基因的表達，使得酵母細胞可以高效地刺激動物的免疫系統(tǒng)，包括特異的和非特異的免疫反應，其結(jié)果表現(xiàn)為在被治療主體中觀察到整體的健康效益。使用本發(fā)明的生物組合物所提供的有益健康效果已在人類患者中征實，有些表現(xiàn)為CD4+細胞計數(shù)和胃腸功能的改善。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供制備本發(fā)明生物組合物中的酵母細胞的方法。起始材料是易于從市場上獲得或從公共微生物保藏機構(gòu)獲得的普通酵母細胞。本發(fā)明的方法包括可重復應用來激活酵母細胞的一套培養(yǎng)條件。本發(fā)明方法中所用培養(yǎng)條件的關(guān)鍵特征是施用于生長中的活酵母細胞培養(yǎng)物的具有確定頻率范圍和場強的一系列交替的電磁場。該方法還包括調(diào)理或馴化被活化的活酵母細胞以適應主體胃的酸性環(huán)境的步驟。這些方法中使用的電磁場可以在各種規(guī)模下重復設置，從而使得甚至可以大規(guī)模制造本發(fā)明的生物組合物。通過小心控制培養(yǎng)條件，可以將普通的酵母細胞可重復地、成常規(guī)地轉(zhuǎn)變成本發(fā)明的酵母細胞。
在又一實施方案中，本發(fā)明提供口服組合物的制造方法，所述口服組合物含有本發(fā)明的被活化并被調(diào)理的酵母和其他成分，包括但不限于，藥物可接受的載體或賦形劑、維生素、草藥提取物、礦物質(zhì)、氨基酸、調(diào)味劑、著色劑或防腐劑。
在又一實施方案中，本發(fā)明的生物組合物可以添加到主體食用的食物中。如相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員所知，可以使用許多方法將本發(fā)明的生物或口服組合物與食物混合，而保持酵母細胞存活。在一個具體的實施方案中，就在食用前將含有本發(fā)明活酵母細胞的培養(yǎng)液直接加入到食物中。也可以在食用前將干酵母粉配制然后直接加入到食物中。
在各種實施方案中，本發(fā)明的口服組合物可以由主體直接攝取或直接喂給主體。例如，主體可以直接飲用含有活化并調(diào)理酵母細胞的培養(yǎng)液或其提取部分。含有干酵母細胞的口服組合物也可以以固體劑型給予主體。
雖然不是必需的，本發(fā)明的生物或口服組合物可以與其他治療形式如(但不限于)化療藥物和疫苗聯(lián)合或交替使用。因為本發(fā)明的生物組合物是口服給藥的，專業(yè)醫(yī)護人員的幫助在該組合物的給藥中一般不是必需的。
在下面的5.1節(jié)中描述本發(fā)明的酵母細胞和其制造方法。5.2節(jié)中描述本發(fā)明生物組合物在患HIV和/或愛滋病的主體中的應用。
5.1酵母細胞培養(yǎng)物的制備該生物組合物中的酵母細胞是在交變電磁場的存在下、在合適的培養(yǎng)基中，在一段時間內(nèi)培養(yǎng)多個酵母細胞而制備的。該方法包括第一個步驟-活化酵母細胞，和第二個步驟-調(diào)理或馴化已活化的酵母細胞?；罨^程包括在一組特定頻率和場強的五個電磁場中培養(yǎng)酵母細胞。該活化過程使酵母孢子發(fā)芽，酵母細胞生長并分裂。調(diào)理過程包括在電磁場存在下、在含植物提取物和動物胃液的培養(yǎng)基內(nèi)進一步培養(yǎng)已活化的酵母細胞。活化并調(diào)理的酵母細胞可以在合適的條件下干燥后以干細胞的形式儲存?；罨⒄{(diào)理的干酵母細胞日后可以用于本發(fā)明生物組合物的大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)過程。本發(fā)明的各種培養(yǎng)過程可以是批次過程，也可以是連續(xù)過程。
5.1.1酵母在各種實施方案中，酵母屬(Saccharomyces)、假絲酵母屬(Candida)、Crebrothecium、地霉菌屬(Geotrichum)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克勒克酵母屬(Kloechera)、油脂酵母屬(Lipomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、紅酵母屬(Rhodotorula)、球擬酵母屬(Torulopsis)、絲孢酵母屬(Trichosporon)和維克氏酵母屬(Wicherhamia)等屬類的酵母可用于本發(fā)明。通常優(yōu)選用于食品加工的真菌。
酵母菌株的非限定性例子包括酵母屬菌株AS2.311；栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe Linder)AS2.214、AS2.248、AS2.249、AS2.255、AS2.257、AS2.259、AS2.260、AS2.274、AS2.994、AS2.1043、AS2.1149、AS2.1178、IFFI 1056；清酒酵母(Saccharomyces sake Yabe)ACCC2045；葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum Beijer)IFFI 1023、IFFI1032、IFFI 1036、IFFI 1044、IFFI 1072、IFFI 1205、IFFI 1207；魯氏酵母(Saccharomyces rouxii Boutroux)AS2.178、AS2.180、AS2.370、AS2.371；釀酒酵母卵形變種(Saccharomyces cerevisiae Hansen Var.ellipsoideus)ACCC2043、AS2.2、AS2.3、AS2.8、AS2.53、AS2.163、AS2.168、AS2.483、AS2.541、AS2.559、AS2.606、AS2.607、AS2.611、AS2.612；卡爾斯伯根糖酵母(Saccharomyces carlsbergensis Hansen)AS2.162、AS2.189、AS2.200、AS2.216、AS2.265、AS2.377、AS2.417、AS2.420、AS2.440、AS2.441、AS2.443、AS2.444、AS2.459、AS2.595、AS2.605、AS2.638、AS2.742、AS2.745、AS2.748、AS2.1042；橙黃紅酵母(Rhodotorulaaurantiaca(Saito)Ladder)AS2.102、AS2.107、AS2.278、AS2.499、AS2.694、AS2.703、AS2.704和AS2.1146；釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeHansen)ACCC2034、ACCC2035、ACCC2036、ACCC2037、ACCC2038、ACCC2039、ACCC2040、ACCC2041、ACCC2042、AS2.1、AS2.4、AS2.11、AS2.14、AS2.16、AS2.56、AS2.69、AS2.70、AS2.93、AS2.98、AS2.101、AS2.109、AS2.110、AS2.112、AS2.139、AS2.173、AS2.182、AS2.196、AS2.242、AS2.336、AS2.346、AS2.369、AS2.374、AS2.375、AS2.379、AS2.380、AS2.382、AS2.393、AS2.395、AS2.396、AS2.397、AS2.398、AS2.399、AS2.400、AS2.406、AS2.408、AS2.409、AS2.413、AS2.414、AS2.415、AS2.416、AS2.422、AS2.423、AS2.430、AS2.431、AS2.432、AS2.451、AS2.452、AS2.453、AS2.458、AS2.460、AS2.463、AS2.467、AS2.486、AS2.501、AS2.502、AS2.503、AS2.504、AS2.516、AS2.535、AS2.536、AS2.558、AS2.560、AS2.561、AS2.562、AS2.576、AS2.593、AS2.594、AS2.614、AS2.620、AS2.628、AS2.631、AS2.666、AS2.982、AS2.1190、AS2.1364、AS2.1396、IFFI 1001、IFFI 1002、IFFI 1005、IFFI1006、IFFI 1008、IFFI 1009、IFFI 1010、IFFI 1012、IFFI 1021、IFFI 1027、IFFI 1037、IFFI 1042、IFFI 1045、IFFI 1048、IFFI 1049、IFFI 1050、IFFI1052、IFFI 1059、IFFI 1060、IFFI 1062、IFFI 1202、IFFI 1203、IFFI 1209、IFFI 1210、IFFI 1211、IFFI 1212、IFFI 1213、IFFI 1215、IFFI 1220、IFFI1221、IFFI 1224、IFFI 1247、IFFI 1248、IFFI 1251、IFFI 1270、IFFI 1277、IFFI 1289、IFFI 1290、IFFI 1291、IFFI 1292、IFFI 1293、IFFI 1297、IFFI1300、IFFI 1301、IFFI 1302、IFFI 1307、IFFI 1308、IFFI 1309、IFFI 1310、IFFI 1311、IFFI 1331、IFFI 1335、IFFI 1336、IFFI 1337、IFFI 1338、IFFI1339、IFFI 1340、IFFI 1345、IFFI 1348、IFFI 1396、IFFI 1397、IFFI 1399。優(yōu)選的酵母菌株包括但不限于釀酒酵母AS2.501、AS2.502、AS2.503、AS2.504、AS2.535、AS2.558、AS2.560、AS2.561、AS2.562。
通常，本發(fā)明可用的酵母菌株可以從私人或公共實驗室培養(yǎng)物中獲得，或者從公共菌種保藏中心獲得，如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，美國弗吉尼亞州，馬納薩斯，大學路10801號，郵編20110-2209；以及中國科學院微生物研究所中國微生物保藏管理委員會中國普通微生物保藏管理中心(CGMCC)，中國北京海淀區(qū)2714信箱，郵編100080。
下述第6和第7節(jié)中給出了使用釀酒酵母菌株AS2.558的本發(fā)明的非限定性實施例。
雖然優(yōu)選使用純酵母菌株，但并不限于以純酵母菌株開始制備本發(fā)明的酵母細胞。該生物組合物中的酵母細胞可以通過不同種或菌株的酵母細胞混合培養(yǎng)獲得。酵母細胞混合物的成分可以用本領(lǐng)域熟知的標準酵母鑒定技術(shù)來確定。
在本發(fā)明的各種實施方案中，應用了酵母處理、轉(zhuǎn)移和儲存的標準技術(shù)。當該生物組合物用于人類消費時，在無菌條件或干凈的環(huán)境中實施本發(fā)明的生產(chǎn)方法是必需的。這里描述的生產(chǎn)方法可以采用本領(lǐng)域的標準操作，以符合產(chǎn)品安全和質(zhì)量控制的行政要求。
5.1.2電磁場本文使用的術(shù)語“交變電磁場”、“電磁場”或“EM場”是同義詞。本發(fā)明可用的電磁場可以通過本領(lǐng)域熟知的各種方法產(chǎn)生。圖1是示范裝置的說明圖。電磁波源(3)產(chǎn)生具有所需頻率和場強的電磁場。該電磁波源由一個或多個能產(chǎn)生電磁波的信號發(fā)生器組成，所述電磁波優(yōu)選為正弦波，優(yōu)選頻率范圍為7000MHz-13000MHz。這樣的信號發(fā)生器為本領(lǐng)域所熟知。也可以使用能夠產(chǎn)生較窄頻率范圍信號的信號發(fā)生器。如果需要，可以用信號放大器來增強輸出信號，由此增加電磁場的強度。
電磁場可以通過多種方式作用于培養(yǎng)物，包括將酵母細胞緊靠與電磁波源相連的信號發(fā)射器放置。一般將酵母細胞置于由非電導體材料制成的容器中，這些材料包括塑料、樹脂、玻璃和陶瓷，但不僅限于此。
在一個實施方案中，由浸沒于酵母細胞培養(yǎng)物(1)中的電極(4)形式的信號發(fā)射器施加電磁場。在優(yōu)選的實施方案中，一塊金屬板置于絕緣容器底部(2)，形成一個電極；另一個電極由多個置于容器內(nèi)部的金屬線或金屬管組成，它們的排列使電磁場的能量能夠均勻分布于培養(yǎng)物中。優(yōu)選銅制電極。在垂直設置的培養(yǎng)容器中，金屬線或金屬管的末梢位于距離容器底部3-30厘米的位置(即距底部為容器高度的2％至10％)。所用電極線的數(shù)目取決于培養(yǎng)物的體積和電極線的直徑。例如，10升或10升以下的培養(yǎng)物可以使用2到3條直徑在0.5-2.0毫米之間的電極線。對于10-100升的培養(yǎng)物，電極線或管的直徑可以為3.0-5.0毫米。對于100-1000升的培養(yǎng)物，電極線或管的直徑可以為6.0-15.0毫米。對于1000升以上的培養(yǎng)物，電極線或管的直徑可以為20.0-25.0毫米。
5.1.3酵母細胞的活化根據(jù)本發(fā)明，制備本發(fā)明活化酵母細胞的方法包括在一組五個交變電磁場中培養(yǎng)酵母細胞。
培養(yǎng)過程首先是將1毫升所選的酵母菌株接種物(例如5.1.1節(jié)中描述的酵母細胞中的一種)以約105細胞/毫升的細胞密度接種于100毫升培養(yǎng)基中。例如，可以使用釀酒酵母AS2.558菌株。本發(fā)明的所有培養(yǎng)過程優(yōu)選在無菌條件下進行。初始培養(yǎng)物可以為更大規(guī)模的培養(yǎng)提供菌種。培養(yǎng)物的溫度保持在28℃到32℃的范圍，培養(yǎng)22到30小時后再置于電磁場中，典型的情況是在30℃培養(yǎng)27小時。
培養(yǎng)過程優(yōu)選在溶解氧濃度為0.025到0.08mol/m3的條件下進行，更優(yōu)選0.04mol/m3。氧氣水平可以通過本領(lǐng)域所知的任何常規(guī)方法來控制，包括攪拌和/或發(fā)泡，但不僅限于此。
最優(yōu)選該培養(yǎng)過程在含有能被酵母細胞吸收的養(yǎng)分源的液體培養(yǎng)基中進行。表1提供了本發(fā)明中用來培養(yǎng)酵母細胞的一種示例性的培養(yǎng)基。
表1
通常，糖類等碳水化合物，例如蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麥芽糖、木糖等以及淀粉，可以單獨或聯(lián)合作為培養(yǎng)基中可吸收碳的來源使用。培養(yǎng)基中碳水化合物的精確用量部分取決于培養(yǎng)基中的其它成分，但通常介于培養(yǎng)基重量的約0.1％到5％之間，優(yōu)選大約0.2％到2％，最優(yōu)選約0.8％。這些碳源在培養(yǎng)基中可以單獨或聯(lián)合使用?？梢該饺肱囵B(yǎng)基中的無機鹽包括能夠提供鈉、鈣、磷酸根、硫酸根、碳酸根等離子的常規(guī)鹽。營養(yǎng)性的無機鹽的非限制性實例有KH2PO4、(KH4)2HPO4、CaCO3、MgSO4、NaCl和CaSO4。
需要注意的是，表1中提供的培養(yǎng)基的成分不是限定性的。該方法的規(guī)模可以根據(jù)需要按比例增減，并應該在無菌條件下進行。考慮到操作的和經(jīng)濟上的因素，例如培養(yǎng)的規(guī)模和培養(yǎng)基成分的本地供應等，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對培養(yǎng)基進行各種不同的改進。
在一個實施方案中，一組五個電磁場作用于酵母細胞培養(yǎng)物，每個電磁場具有在一給定范圍內(nèi)的不同頻率組和在一給定范圍內(nèi)的不同場強組。
第一個電磁場的頻率范圍在7845±0.5MHz，場強范圍在270到310mV/cm之間，可以通過本領(lǐng)域所知的任何方法作用于培養(yǎng)物，如5.1.2節(jié)中描述的設備。酵母培養(yǎng)物置于第一個電磁場中約10-12個小時，優(yōu)選12個小時。
第二個電磁場的頻率范圍在7879±0.5MHz，場強范圍在270到300mV/cm之間。酵母培養(yǎng)物置于第二個電磁場中約22-28個小時，優(yōu)選25個小時。
第三個電磁場的頻率范圍在12141±0.5MHz，場強范圍在325到366mV/cm之間。酵母培養(yǎng)物置于第三個電磁場中約22-25小時，優(yōu)選21小時。
第四個電磁場的頻率范圍在12842±0.5MHz，場強范圍在386到412mV/cm之間。酵母培養(yǎng)物置于第四個電磁場中約18-26個小時，優(yōu)選22個小時。
第五個電磁場的頻率范圍在12866±0.5MHz，場強范圍在290到320mV/cm之間。酵母培養(yǎng)物置于第五個電磁場中約12-20個小時，優(yōu)選15個小時。
在次優(yōu)選的實施方案中，酵母細胞可以按照不同順序在這五個電磁場中培養(yǎng)。在其它實施方案中，磁場特征在上述范圍內(nèi)的一組電磁場可以用來激活酵母細胞。從一個電磁場切換到另一個電磁場時，酵母細胞可以在同一個容器中、使用同一套電磁波發(fā)生器和發(fā)射器?；罨慕湍讣毎梢酝ㄟ^本領(lǐng)域所知的多種方法從培養(yǎng)物中回收，并在低于約0℃到4℃的溫度儲存。從液體培養(yǎng)物中回收的活化的酵母細胞可以經(jīng)干燥處理以粉末的形式保存。優(yōu)選每克酵母細胞粉末中所含酵母細胞數(shù)量大于約1010個。
5.1.4酵母細胞的調(diào)理根據(jù)本發(fā)明，通過在有動物胃提取物(例如胃液)的條件下培養(yǎng)活化的酵母細胞，可以對其性能加以優(yōu)化。上述動物的生理學特點應與將服用此生物組合物的主體相似。該額外的調(diào)理或馴化過程使活化的酵母細胞可以適應并耐受主體胃中的酸性環(huán)境。調(diào)理或馴化本發(fā)明活化酵母細胞的方法包括在至少一組兩個交變電磁場存在下在上述物質(zhì)中進行培養(yǎng)。
培養(yǎng)過程開始時，將每克含約1010個細胞的干燥的活化酵母約10克(按5.1.3節(jié)中所述方法制成)接種于1000毫升的調(diào)理培養(yǎng)基中。培養(yǎng)中的相同數(shù)目的酵母細胞也可以作為接種物。每1000毫升調(diào)理培養(yǎng)基中含大約700毫升動物胃液和約300毫升野山楂汁。該方法的規(guī)?？筛鶕?jù)需要按比例增減。該調(diào)理過程在無菌條件下進行。
動物的胃液可以從新鮮屠宰動物的胃內(nèi)容物中獲得。該動物在潔凈的環(huán)境中飼養(yǎng)，并喂以標準飼料，優(yōu)選無菌飼料。例如，將120天的豬的胃內(nèi)容物與2000毫升蒸餾水混合，無攪拌、靜置6小時。取上清液作為調(diào)理培養(yǎng)用的胃液。豬的胃液可以對多種哺乳動物包括人類使用的酵母細胞進行調(diào)理。其它收集胃液的方法包括將混合物離心或過濾以去除碎屑和/或微生物。通過以上方法獲得的胃液可以儲存于4℃。這些收集步驟和儲存在無菌條件下進行。
野山楂汁是野山楂果實的提取物。將果實切片，風干，優(yōu)選水分小于約8％(如果需要可以使用商用干燥器)，粉碎干果實至小于約20目，每500克粉碎的野山楂與1500毫升水混合。將混合物無攪拌地靜置6小時，收集上清液作為調(diào)理過程用的野山楂汁。其它收集山楂汁的方法包括將混合物離心或過濾。在無菌條件下進行收集和儲存步驟。
將被活化的酵母細胞置于第一個電磁場中進行培養(yǎng)。該電磁場可以利用5.1.2節(jié)中描述的設備或本領(lǐng)域所知的其它方法施加。該電磁場的頻率范圍是10141±0.5MHz，場強范圍是380到420mV/cm。溫度保持在28℃到32℃，典型溫度是30℃。酵母培養(yǎng)物置于該第一個電磁場中約36到42小時，優(yōu)選38小時。
然后，將活化的酵母細胞置于第二個電磁場中進行培養(yǎng)，其電磁場特性為頻率12866±0.5MHz，場強約340到380mV/cm。溫度保持在28℃到32℃，典型溫度是30℃。酵母培養(yǎng)物置于第二個電磁場中約18到28小時，優(yōu)選22小時。
在次優(yōu)選的實施方案中，酵母細胞可以按照不同順序置于上述電磁場中進行培養(yǎng)。在其它實施方案中，磁場特性在上述范圍內(nèi)的一組電磁場可以用來調(diào)理酵母細胞。從一個電磁場切換到另一個電磁場時，酵母細胞可以在同一個容器中、使用同一套電磁波發(fā)生器和發(fā)射器?；罨慕湍讣毎梢酝ㄟ^本領(lǐng)域所知的多種方法從培養(yǎng)物中回收，并在低于約0℃到4℃的溫度下儲存。
活化并調(diào)理的酵母細胞可以在生物組合物中直接使用，或作為大規(guī)模生產(chǎn)的初始培養(yǎng)物。從液體培養(yǎng)物中回收的活化的酵母細胞可以經(jīng)干燥處理以粉末的形式儲存。優(yōu)選該粉末中酵母細胞的數(shù)量大于約每克1010個。
5.1.5大規(guī)模生產(chǎn)本發(fā)明還包括生產(chǎn)本發(fā)明生物組合物的方法。按5.1.3和5.1.4節(jié)方法制備的活化并調(diào)理的酵母細胞經(jīng)過大規(guī)模繁殖，制成本發(fā)明的生物組合物。該方法包括在一個或多個電磁場中培養(yǎng)酵母細胞一段時間，用新鮮培養(yǎng)液稀釋生長中的酵母細胞，并重復此過程。該方法可以是批次的也可以是連續(xù)的。
在一個優(yōu)選的實施方案中，安裝一套三個容器(5，6，7)，每個容器中有一組電極可以產(chǎn)生5.1.2節(jié)中所述的電磁場，并各含1000升培養(yǎng)基，見圖2。培養(yǎng)基包含列于表2中的可被酵母細胞吸收的營養(yǎng)物質(zhì)。
表2
野山楂汁是新鮮野山楂果實的提取物。將果實洗凈、風干或用商用干燥器干燥至水分含量小于約8％。將干燥的果實粉碎至小于約20目，按照每500克粉碎果實2升水的比例與水混合，在28℃到30℃條件下連續(xù)攪拌12小時?；旌衔锝?jīng)200g離心10分鐘，收集上清液，按上述方法使用。這些步驟在無菌條件下進行。
酸棗汁是新鮮酸棗樹果實的提取物。將果實洗凈、干燥至水分含量小于約8％。將干燥的果實粉碎至小于約20目，按照每500克粉碎果實2升水的比例與水混合，在28℃到30℃條件下連續(xù)攪拌12小時?；旌衔锝?jīng)200g離心10分鐘，收集上清液，按上述方法使用。這些步驟在無菌條件下操作。
五味子汁是中國五味子屬(Schisandra chinensis)植物新鮮漿果的提取物。將果實洗凈、干燥至水分含量小于約8％。將干燥的果實粉碎至小于約20目，按照每500克粉碎果實2升水的比例與水混合，在28℃到30℃條件下連續(xù)攪拌12小時?；旌衔锝?jīng)200g離心10分鐘，收集上清液，按上述方法使用。這些步驟在無菌條件下進行。
大豆汁的制備是將大豆洗凈、干燥至水分含量小于約8％。將干燥的大豆粉碎至小于約20目，按照每30公斤粉碎大豆130升水的比例與水混合，在28℃到30℃條件下連續(xù)攪拌12小時?；旌衔锝?jīng)200g離心10分鐘，收集上清液，按上述方法使用。
將活化并調(diào)理的酵母細胞分階段培養(yǎng)，其中在每個階段，將細胞置于至少一組兩個電磁場中(h)頻率范圍為10141±0.5MHz、場強為210-450mV/cm的電磁場；和(h)頻率范圍為12866±0.5MHz、場強為120-400mV/cm的電磁場。
可以在無菌條件下在三個容器中進行培養(yǎng)。
將活化并調(diào)理的酵母細胞接種于第一個容器中。將按照5.1.3節(jié)和5.1.4節(jié)方法制備的酵母干粉約1000克加入1000升培養(yǎng)基中。每克酵母干粉約含約1010個酵母細胞。也可以使用液體培養(yǎng)基中等量的酵母細胞替代脫水酵母細胞。
第一個容器(5)中，酵母細胞被置于一組兩個電磁場中。第一個電磁場，可以通過5.1.2節(jié)中的設備施加，頻率范圍是10141±0.5MHz，場強范圍是420到450mV/cm。酵母培養(yǎng)物置于第一個電磁場中約16小時。然后，將酵母培養(yǎng)物置于第二個電磁場中約12小時，該磁場的頻率范圍是12866±0.5MHz，場強范圍是360到400mV/cm。將酵母細胞從第一個容器轉(zhuǎn)移至第二個容器中，該容器內(nèi)有約1000升培養(yǎng)基。實際上首批酵母培養(yǎng)物被新鮮培養(yǎng)基稀釋了約50％。
第二個容器(6)中，酵母細胞再被置于一組兩個電磁場中，頻率與第一個容器中的電磁場頻率相似，但場強略低。第一個電磁場的場特性如下頻率范圍10141±0.5MHz，場強范圍320到350mV/cm。酵母培養(yǎng)物置于該電磁場中約14小時。然后，酵母培養(yǎng)物被置于第二個電磁場中約10小時。該電磁場的頻率范圍是12866±0.5MHz，場強范圍是230到270mV/cm。將第二個容器中的酵母細胞轉(zhuǎn)移至第三個容器中，該容器內(nèi)有另外1000升培養(yǎng)基。第二批酵母培養(yǎng)物再次被新鮮培養(yǎng)基稀釋了約50％。
在第三個容器(7)中，酵母細胞仍被置于一組兩個電磁場中，頻率與在第一個容器和第二個容器中所用的電磁場頻率相似，但是場強較低。第一個電磁場的場特性如下頻率范圍10141±0.5MHz，場強范圍210到250mV/cm。酵母培養(yǎng)物置于該電磁場中約24小時。其后，酵母培養(yǎng)物被置于第二個電磁場中約12小時。該電磁場的頻率范圍是12866±0.5MHz；場強范圍約是120到150mV/cm。
此階段最后的酵母細胞培養(yǎng)物可以直接作為本發(fā)明的生物組合物使用，或用于制成本發(fā)明中所包含的其它組合物。能夠加強組合物保健作用、藥理學特性和/或感官特性的其它成分也可以加入其中。為了保持組合物的生物存活力和新鮮程度，后續(xù)和包裝工藝優(yōu)選在低于室溫的溫度下進行，更優(yōu)選0℃到4℃。在本發(fā)明的一個實施方案中應用了質(zhì)量控制和包裝的標準方法，口服組合物包裝在盛裝液體的容器中，每個容器內(nèi)約30毫升或100毫升的活酵母細胞培養(yǎng)物。酵母細胞的濃度為每毫升至少1×103個細胞。
在另一個實施方案中，活化并調(diào)理的酵母細胞可以按照下述方法干燥。首先將酵母細胞培養(yǎng)物在75到100g條件下離心10到20分鐘，去除上清液。該含水量最高85％的沉淀物在第一個干燥器中干燥5分鐘，溫度不超過60±2℃，使酵母細胞迅速進入休眠狀態(tài)。然后將酵母細胞在第二個干燥器中干燥約8分鐘，溫度不超過65±2℃，以進一步去除水分。將該含水量最高12％的干燥酵母細胞冷卻至室溫。用標準制藥方法將干燥酵母細胞以不同固體劑型進行包裝，每個劑量形式中含預定量的干燥物質(zhì)。優(yōu)選每克干燥物中含至少1×106個酵母細胞。
通常將活性成分與液態(tài)載體或細粉末狀固態(tài)載體均勻、密切混合，制成組合物。
5.1.6優(yōu)選實施方案在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種制備含活化并調(diào)理酵母細胞的生物組合物的方法，所述方法包含任何順序的下列步驟(a)在頻率為7845MHz和場強為295mV/cm的第一電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞；(b)在頻率為7879MHz和場強為281mV/cm的第二電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞；(c)在頻率為10141MHz和場強為343mV/cm的第三電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞；(d)在頻率為12842MHz和場強為403mV/cm的第四電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞；(e)在頻率為12866MHz和場強為302mV/cm的第五電磁場和電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞；在上述五個步驟最后一步完成后，以任何順序進行下列步驟(f)在頻率為10141MHz和場強為386mV/cm的第六電磁場或電磁場組中，在含野山楂汁和哺乳動物胃液的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母細胞；(g)在頻率為12866MHz和場強為356mV/cm的第七電磁場或電磁場組中，在含野山楂汁和哺乳動物胃液的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母細胞。
本發(fā)明包括上述方法結(jié)束后獲得的活化并調(diào)理的酵母細胞。酵母細胞優(yōu)選為釀酒酵AS2.558菌株。這些酵母細胞可以用于下述方法，進一步增加活化并調(diào)理的酵母細胞數(shù)量。
在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種大規(guī)模生產(chǎn)含活化并調(diào)理酵母細胞的生物組合物的方法，所述方法包括在含野山楂汁、酸棗汁、五味子汁和大豆汁的培養(yǎng)基中，在一組或多組電磁場中培養(yǎng)用本節(jié)上文所述優(yōu)選實施方案制備的活化并調(diào)理的酵母細胞。
活化并調(diào)理的酵母細胞分三個階段培養(yǎng)。在第一個容器(5)中，酵母細胞被置于一組兩個電磁場中。第一個電磁場，頻率是10141MHz，場強是442mV/cm，施加于培養(yǎng)物16小時。酵母培養(yǎng)物置于第二個電磁場中12小時，該磁場的頻率是12866MHz，場強是384mV/cm。將酵母細胞從第一個容器轉(zhuǎn)移至第二個容器中，該容器內(nèi)有相同體積的培養(yǎng)基。因此實際上培養(yǎng)物稀釋了約50％。
第二個容器(6)中，酵母細胞再被置于一組兩個電磁場中，其頻率與第一個容器中的電磁場頻率相似，但場強略低。第一個電磁場的場特性如下頻率10141MHz，場強335mV/cm。酵母培養(yǎng)物置于該電磁場中約14小時。然后，酵母培養(yǎng)物被置于第二個電磁場中約10小時。該電磁場的頻率是12866MHz，場強是約252mV/cm。將第二個容器中的酵母細胞轉(zhuǎn)移至第三個容器中，用新鮮培養(yǎng)基再次稀釋約50％。
在第三個容器(7)中，酵母細胞仍被置于一組兩個電磁場中，其頻率與在第一個容器和第二個容器中所用的電磁場頻率相似，但是場強較低。第一個電磁場的場特性如下頻率10141MHz，場強227mV/cm。酵母培養(yǎng)物置于該電磁場中約24小時。其后，酵母培養(yǎng)物被置于第二個電磁場中，其頻率是12866MHz，場強是146mV/cm。將酵母培養(yǎng)物置于該第二電磁場中約12小時，然后收獲酵母細胞。
5.2使用方法5.2.1制劑本發(fā)明的生物組合物含有按上述制備的活化并調(diào)理的活酵母，并可以任選地含有藥物可接受的載體或賦形劑、和/或其他成分?？梢约尤朐诒景l(fā)明生物組合物中的其他成分可包括(但不限于)草藥提取物、維生素、氨基酸、金屬鹽、金屬螯合物、著色劑、增味劑、防腐劑等。
在一個實施方案中，適于口服給藥的本發(fā)明組合物可以呈獨立的單元如膠囊、扁囊劑、或片劑(每個單元含有預定量的活化并調(diào)理的酵母細胞)，呈粉劑或顆粒劑，或者為水性液體、非水性液體中的溶液或懸液，水包油乳液或油包水乳液。一般而言，這些組合物這樣制備的將活性成分與液體載體或細碎的固體載體或兩者均勻地緊密地混合，然后需要時將產(chǎn)品成型，轉(zhuǎn)變呈所希望的形式。這種產(chǎn)品可以用作藥物或飲食補充劑，這取決于劑量和其使用的環(huán)境。
本發(fā)明的口服組合物還可以包含粘合劑(如預膠凝玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；粘合或填充劑(乳糖、戊聚糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(如硬脂酸鎂、滑石或二氧化硅)；崩解劑(如馬鈴薯淀粉或羥基乙酸淀粉鈉)；或潤濕劑(如十二烷基硫酸鈉)。這些片劑或膠囊可以按本領(lǐng)域熟知的方法進行包衣。
用于口服給藥的液體制劑可以是例如溶液、糖漿或懸浮液的形式，或者它們可以是用于在臨用前用水或其他事宜載體配制的干產(chǎn)品。用于重配干產(chǎn)品的液體的溫度應低于65℃。這種液體制劑可以用藥物可接受的添加劑按常規(guī)方法制備，所述添加劑如為懸浮劑(如山梨糖醇漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)；乳化劑(如卵磷脂或阿拉伯膠)；非水載體(如扁桃油、油性酯、乙醇或分餾植物油)；和防腐劑(如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。如下所述，這些制劑還可以制成類似食品的形式，適當時含有緩沖鹽、嬌味劑、著色劑和增甜劑。
可以使用任何劑型來為主體提供有效劑量的生物組合物。劑型包括片劑、膠囊劑、分散劑、懸浮劑、溶液、膠囊等。一般而言，由于易于服用，片劑和膠囊劑為最有利的口服劑量單位形式，其中使用如上所述的固體藥物載體。可以通過任選地與一種或多種輔助成分一起壓制或模制來制備片劑。可以將自由流動形式如粉末或顆粒的干燥活化并調(diào)理的酵母細胞任選地與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、表面活性劑或分散劑混合，然后在適當?shù)臋C器中壓縮來制備片劑。優(yōu)選本發(fā)明組合物是含有500-700毫克粉末形式的活酵母細胞(每克含4×105個細胞)的膠囊。在另一實施方案中，優(yōu)選的制劑形式是細胞懸液，其中含有至少4×103個酵母細胞/毫升。
在另一實施方案中，可以直接將含有被活化并調(diào)理的酵母細胞的生物組合物加入到食物中，使得在正常飲食中攝取有效量的酵母細胞?？梢允褂萌魏伪绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法向天然或加工食品中加入或摻入生物組合物，只要活化并調(diào)理的酵母細胞保持存活即可。優(yōu)選，本發(fā)明的營養(yǎng)組合物在例如約0-4℃的條件下制備和保存。這里所用的術(shù)語“食物”廣義地指任何供動物食用、用于支持動物(包括人)正?；蚣铀偕L的液體或固體材料。許多種類的食品或飲料，如(但不限于)果汁、草藥提取物、茶飲料、乳制品、大豆制品(如豆腐)和稻米產(chǎn)品，都可以用于形成含有本發(fā)明活化并調(diào)理酵母細胞的營養(yǎng)組合物。
5.2.2在患HIV和/或AIDS的主體中的應用本發(fā)明還提供本發(fā)明生物組合物的使用方法。在一個實施方案中，本發(fā)明的生物組合物用作治療HIV感染和/或艾滋病的藥物。在另一實施方案中，本發(fā)明的生物組合物用作飲食補充劑、保健食品或保健飲品。所述方法包括給予有需要的主體以有效量的生物組合物。所述生物組合物可以以液體或固體形式口服給藥，或通過飼管腸內(nèi)給藥。這里所用的術(shù)語“有效量”指足以對患HIV和/或AIDS的主體提供治療或有益健康效果的量。
根據(jù)本發(fā)明，所述生物組合物可以在患HIV和/或AIDS的主體中產(chǎn)生有益健康效果。優(yōu)選所述主體是人類。有需要的主體是被診斷患有HIV感染和/或AIDS的主體，可以有或沒有繼發(fā)性并發(fā)癥，可以是該疾病的任何階段。這里所用的術(shù)語“AIDS”(艾滋病)包括每立方毫米血液中少于200 CD4+T細胞的所有感染HIV的人。(健康成人一般CD4+細胞計數(shù)為500-1200/mm3)。HIV感染的主體可以通過檢測其血液中是否存在HIV抗體來診斷，抗體的檢測方法是本領(lǐng)域已知的，例如ELISA和蛋白質(zhì)印跡分析。許多晚期HIV患者罹患機會性細菌、病毒、真菌和原生動物感染，這些機會感染經(jīng)常是嚴重的，有時是致命的，但通常不會感染健康人。機會感染的非限定性例子包括白色念珠菌、煙曲霉、新型隱球菌、卡潤氏肺孢子蟲和巨細胞病毒。艾滋病病人共有的機會感染癥狀包括咳嗽、氣短、癲癇發(fā)作和協(xié)調(diào)缺如、吞咽困難或痛苦、精神錯亂和健忘等精神癥狀、嚴重持續(xù)性腹瀉、發(fā)熱、視力喪失、惡心、異常痙攣、以及嘔吐、體重減輕和極度疲勞、嚴重頭痛和昏迷。這些患者還可能易于患上各種癌癥，特別是由病毒引起的癌癥如卡波西肉瘤和宮頸癌，或淋巴瘤。
所述主體可以是有HIV感染并正在同時接受其他形式的抗HIV感染和/或AIDS治療的人。繼發(fā)感染和推薦的治療因依據(jù)CD4+細胞計數(shù)判斷的疾病嚴重程度的不同而不同。當CD4+計數(shù)大于500/mm3時，一般推薦個體化的聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法。當CD4+計數(shù)為200-500/mm3時，帶狀皰疹、鵝口瘡、皮膚感染、細菌性竇和肺感染以及肺結(jié)核的危險增加，對CD4+計數(shù)小于350/mm3的推薦聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法。對CD4+計數(shù)為50-200/mm3的，PCP和其他機會感染的危險增加，推薦聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法。PCP的預防(TMP-SMX，氨苯砜，或氣溶膠噴他脒)以及CD4+計數(shù)小于100/mm3時弓形體病的預防是必要的。當CD4+計數(shù)低于50/mm3時，包括MAC和CMV的機會感染危險增加，需要預防MAC(阿奇霉素、克拉霉素或利福布汀)。
所述主體可以是還未被診斷為HIV感染者和/或AIDS患者，但由于家庭因素和/或環(huán)境因素(如輸血、毒品濫用、與HIV感染者的性接觸)對HIV感染和/或AIDS易感或?qū)俑呶Ｈ巳旱闹黧w。所述主體還可以是顯示HIV感染相關(guān)性特征的主體，例如有CD4+T細胞計數(shù)降低(低于500/mm3；免疫缺陷)和伴隨淋巴結(jié)增大的類似流感的疾病。
所述主體可以是已進行過治療并且疾病癥狀正在減退或臨床看來已無HIV和/或AIDS癥狀的HIV感染者和/或AIDS病人。本發(fā)明的組合物可以作為任何其他治療形式如(但不限于)化療和免疫療法的輔助治療。例如，正在接受一種和多種化療或免疫治療藥物，如核苷和非核苷類似物、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑，的病人可以使用本發(fā)明的生物組合物?？梢耘c本發(fā)明生物組合物一起使用的HIV藥物的例子包括AZT(也稱為齊多夫定或ZDV)、ddC(扎西他濱)、ddI(二脫氧肌苷)、d4T(stavudine)、3TC(拉米夫定)、delvaridine (Rescriptor)、奈韋拉平(Viramune)、efravirenz(Sustiva)、Invirase(沙奎那韋)、Norvir(ritonavir)、Crixivan(indinavir)、Viracept(nelfinavir)和Agenerase(amprenivir)，以及它們的組合。本發(fā)明的生物組合物也可以在其他治療方法結(jié)束后使用。
根據(jù)不同的主體，治療效果和有益健康效果可以是抑制或延緩HIV感染在體內(nèi)的擴散、延遲機會感染和某些腫瘤的發(fā)生、減輕HIV感染和/或AIDS的癥狀、改善HIV感染和/或AIDS主體的存活幾率、延長主體的預期壽命、改善主體的生活質(zhì)量和/或減低成功治療(手術(shù)和/或化療)后復發(fā)的幾率。與HIV感染和/或艾滋病有關(guān)的一些癥狀為精力缺乏、體重減輕、頻繁發(fā)熱和出汗、持續(xù)或頻繁的真菌感染(口腔或陰道)、持續(xù)的皮疹、皰疹感染、婦女骨盆炎性疾病、以及短期記憶喪失。
特別是，本發(fā)明提供一種減輕主體(如人)中HIV感染和/或AIDS嚴重性的方法，包括給所述主體口服本發(fā)明的生物組合物。疾病的嚴重性可以通過本領(lǐng)域中已知的許多方法來確定，例如測定循環(huán)病毒載量、CD4+T細胞計數(shù)，或者通過主體表現(xiàn)的癥狀來判斷。本發(fā)明還提供一種延長患HIV感染和/或AIDS主體(如人類患者)的存活時間的方法，包括給該主體口服本發(fā)明的生物組合物。
給予主體的有效劑量還因所治療的疾病和疾病的嚴重程度而不同。劑量，可能還有給藥頻率，還根據(jù)個體患者的年齡、體重和個體反應而變化。一般，活化并調(diào)理酵母細胞的總?cè)談┝糠秶鸀榧s5×104到約6×105，一次和分多次口服給藥。例如，優(yōu)選的口服日劑量為每日兩個膠囊(每個膠囊含500-700mg的活酵母細胞)。作為飲食補充劑，口服日劑量應為約5×104到約6×105。一個療程應該至少為13周。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，有時需要使用這些范圍之外的劑量?？梢猿掷m(xù)使用這些酵母細胞直到HIV感染和/或AIDS癥狀的嚴重性降低或得到了控制，或到HIV感染和/或AIDS已部分或完全消退。另外，營養(yǎng)學家、飲食學家、臨床醫(yī)生或主管治療的內(nèi)科醫(yī)生如何以及何時根據(jù)個體病人的反應中止、調(diào)節(jié)或終止使用作為藥物或飲食補充劑的生物組合物。
本發(fā)明生物組合物對HIV感染和/或AIDS的發(fā)生和進展的效果可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法監(jiān)測，包括但不限于測定病毒載量、CD4+細胞和CD8+細胞等。
通過以下實施例進一步描述本發(fā)明，該實施例詳細描述了已進行的臨床試驗，以研究本發(fā)明活化并調(diào)理酵母細胞的有效性和安全性。6.實施例在北京第二傳染病醫(yī)院進行的包含20名HIV感染者或AIDS病人的小型臨床試驗中對本發(fā)明的口服組合物進行了試驗。臨床醫(yī)生是徐蓮芝、吳昊和張可。根據(jù)1995年建立的中國國家艾滋病臨床標準選擇病例。這20名患者中，10名為HIV感染者，其他10名患有AIDS；12名為男性，8名為女性。年齡范圍為12到45歲；平均年齡為28±17。16名因性交感染了HIV，其中9名為同性戀；其余4名是通過輸血感染病毒的。這些患者沒有接受過其他形式的治療。
口服組合物是用釀酒酵母AS2.558如上述5.13到5.15節(jié)所述制備的?；罨⒄{(diào)理的酵母細胞的濃度大于1×103/毫升。每位患者每天3次接受30毫升的該口服組合物，在每餐前30分鐘服用?；颊呙刻旖邮苤委?，共進行3個月。檢查患者的下列臨床特征嗜睡、食欲、脫發(fā)、腹瀉、體重增加/減輕；和安全性指標肺和胃惡性病變、嘔吐、胃疼、發(fā)熱、惡心、皮疹、肝腎功能和血液學參數(shù)。同時監(jiān)測CD4+細胞和CD8+細胞。
根據(jù)基于疾病癥狀臨床觀察、CD4+細胞計數(shù)和其他臨床參數(shù)的積分確定療效。利用基于臨床觀察的積分，如果治療后的積分(n2)與治療前積分(n0)之比小于或等于0.67，視為治療有效；如果治療后積分(n2)與治療前積分(n0)之比大于0.67，視為治療無效。為了計算積分，根據(jù)每微升患者血液中CD4+細胞計數(shù)大于或小于50將患者分為兩組。對于每微升CD4+細胞計數(shù)大于50的患者，如果該細胞計數(shù)增加或者維持在每微升50以上，該治療視為有效；如果該細胞計數(shù)在每微升50上下波動，該治療視為無效；如果該細胞計數(shù)下降到每微升50以下，該疾病惡化。對于CD4+細胞計數(shù)低于每微升50的患者，如果該細胞計數(shù)增加或保持在每微升30以上，該治療視為有效；如果該細胞計數(shù)在每微升30上下波動，該治療視為無效；如果該細胞計數(shù)下降到每微升30以下，該疾病惡化。
在三個月的試驗期間和在試驗結(jié)束時，患者沒有表現(xiàn)出由本發(fā)明口服組合物引起的任何副作用。在試驗前后分別檢查肝腎功能以及15項血液學參數(shù)，發(fā)現(xiàn)一切正常。試驗結(jié)果示于表3和表4中。
表3治療前細胞計數(shù)低于每毫升50的8名患者的CD4+細胞計數(shù)治療后1個月和治療后3個月
*表示治療有效。
表4治療前細胞計數(shù)高于每微升50的12名患者的CD4+細胞計數(shù)治療后1個月和治療后3個月
*表示治療有效基于從CD4+細胞計數(shù)大于每微升50的12名患者獲得的上述結(jié)果，9個病例有效(75％)，3個病例無效(25％)。對于CD4+細胞低于每微升50的患者，本發(fā)明口服組合物對4個病例有效(50％)，對4個病例無效(50％)。
表5顯示基于治療前、治療過程中和治療后進行的有關(guān)胃腸功能如食欲和腹瀉的臨床觀察的積分
治療后總積分與治療前總積分之比(n2/n0)為0.18，小于0.67。在此試驗中，15例顯示臨床可觀察的癥狀，13例顯示胃腸功能相關(guān)的癥狀如食欲不振和腹瀉，這些癥狀在治療后得到了明顯的改善。該治療還對減輕嗜睡有效。在治療前，6名患者有嗜睡報告。治療后，這些患者報告有明顯的改善。
總之，本發(fā)明的口服組合物顯示三個月后能夠提高HIV感染者的CD4+細胞計數(shù)和/或改善胃腸功能。
本發(fā)明并不限于所述具體實施方案的范圍，它們只是本發(fā)明每個方面的舉例說明，功能等同的其他方法和成分也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實際上，在前述說明書和附圖基礎上，除文中顯示和描述的內(nèi)容外，本發(fā)明的各種改變對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。這種改變也應在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請引入本說明書中作為參考，這相當于具體地、單個地指明每篇單獨的出版物、專利或?qū)＠暾堃氡菊f明書作為參考。
權(quán)利要求
1.一種含有活化酵母細胞的生物組合物，其中所述酵母細胞通過包含任何順序的下列步驟的方法制備(a)在頻率為7845±0.5MHz和場強為270-310mV/cm的第一電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞；(b)在頻率為7879±0.5MHz和場強為270-310mV/cm的第二電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞；(c)在頻率為10141±0.5MHz和場強為325-366mV/cm的第三電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞；(d)在頻率為12842±0.5MHz和場強為386-412mV/cm的第四電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞；(e)在頻率為12866±0.5MHz和場強為290-320mV/cm的第五電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞。
2.一種含有活化并調(diào)理的酵母細胞的生物組合物，其中所述酵母細胞通過包含任何順序的下列步驟的方法制備(a)在頻率為7845±0.5MHz和場強為270-310mV/cm的第一電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞；(b)在頻率為7879±0.5MHz和場強為270-310mV/cm的第二電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞；(c)在頻率為10141±0.5MHz和場強為325-366mV/cm的第三電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞；(d)在頻率為12842±0.5MHz和場強為386-412mV/cm的第四電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞；(e)在頻率為12866±0.5MHz和場強為290-320mV/cm的第五電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞；在上述五個步驟最后一步完成后，還包含任何順序的下列步驟(f)在頻率為10141±0.5MHz和場強為380-420mV/cm的第六電磁場或電磁場組中，在含有野山楂汁和哺乳動物胃液的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母細胞；以及(g)在頻率為12866±0.5MHz和場強為340-380mV/cm的第七電磁場或電磁場組中，在含有野山楂汁和哺乳動物胃液的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母細胞。
3.一種含有活化并調(diào)理的酵母細胞的生物組合物，其中所述酵母細胞通過包含如下步驟的方法制備在任何順序的下述電磁場存在下，在含有野山楂汁、酸棗汁、五味子汁和大豆汁的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求2的活化并調(diào)理的酵母細胞(h)頻率為10141±0.5MHz和場強為210-450mV/cm的第八電磁場；和(i)頻率為12866±0.5MHz和場強為120-400mV/cm的第九電磁場或電磁場組。
4.權(quán)利要求1、2或3的生物組合物，其中所述活化的、或活化并調(diào)理的酵母細胞是酵母屬的細胞。
5.權(quán)利要求1、2或3的生物組合物，其中所述活化的、或活化并調(diào)理的酵母細胞是釀酒酵母菌株AS2.558的細胞。
6.權(quán)利要求1、2或3的生物組合物，其中所述活化的、或活化并調(diào)理的酵母細胞的濃度為約每毫升103個細胞。
7.權(quán)利要求1、2或3的生物組合物，其中所述活化的、或活化并調(diào)理的酵母細胞是干燥的。
8.含有權(quán)利要求2或3的活化并調(diào)理的酵母細胞的組合物，其中所述活化并調(diào)理的酵母細胞被包裝為固體劑型。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中每個固體劑量形式含有約5×105到7×105個酵母細胞。
10.一種藥物組合物，其含有權(quán)利要求2或3的活化并調(diào)理的酵母細胞和藥物可接受的載體。
11.一種飲食補充劑，其含有權(quán)利要求2或3的活化并調(diào)理的酵母細胞和選自下組的一種或多種成分維生素、氨基酸、金屬螯合物、植物提取物、著色劑、增味劑和防腐劑。
12.一種營養(yǎng)組合物，其含有權(quán)利要求2或3的活化并調(diào)理的酵母細胞和選自下組的食品果汁飲料、茶飲料、乳制品、大豆制品和稻米制品。
13.一種制備含活化酵母細胞的生物組合物的方法，所述方法包括任何順序的下列步驟(a)在頻率為7845±0.5MHz和場強為270-310mV/cm的第一電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞；(b)在頻率為7879±0.5MHz和場強為270-310mV/cm的第二電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞；(c)在頻率為10141±0.5MHz和場強為325-366mV/cm的第三電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞；(d)在頻率為12842±0.5MHz和場強為386-412mV/cm的第四電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞；(e)在頻率為12866±0.5MHz和場強為290-320mV/cm的第五電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞。
14.一種制備含有活化并調(diào)理的酵母細胞的生物組合物的方法，所述方法包括任何順序的下列步驟(a)在頻率為7845±0.5MHz和場強為270-310mV/cm的第一電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞；(b)在頻率為7879±0.5MHz和場強為270-310mV/cm的第二電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞；(c)在頻率為10141±0.5MHz和場強為325-366mV/cm的第三電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞；(d)在頻率為12842±0.5MHz和場強為386-412mV/cm的第四電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞；(e)在頻率為12866±0.5MHz和場強為290-320mV/cm的第五電磁場或電磁場組中培養(yǎng)酵母細胞；在上述五個步驟最后一步完成后，還包含任何順序的下列步驟(f)在頻率為10141±0.5MHz和場強為380-420mV/cm的第六電磁場或電磁場組中，在含有野山楂汁和哺乳動物胃液的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母細胞；以及(g)在頻率為12866±0.5MHz和場強為340-380mV/cm的第七電磁場或電磁場組中，在含有野山楂汁和哺乳動物胃液的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母細胞。
15.一種制備含活化并調(diào)理的酵母細胞的生物組合物的方法，所述方法包括在所述順序的下述電磁場存在下，在含有野山楂汁、酸棗汁、五味子汁和大豆汁的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)按權(quán)利要求13的方法制備的化活并調(diào)理的酵母細胞(h)頻率為10141±0.5MHz和場強為210-450mV/cm的第八電磁場；和(i)頻率為12866±0.5MHz和場強為120-400mV/cm的第九電磁場或電磁場組。
16.權(quán)利要求14或15的方法，其還包括在培養(yǎng)步驟后干燥所述活化并調(diào)理的酵母細胞。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述干燥步驟包括(i)在不超過65℃的溫度下干燥一段時間使酵母細胞休眠；和(b)在不超過70℃的溫度下干燥一段時間以將水分含量減低到5％以下。
18.一種減輕人的HIV感染和/或艾滋病嚴重程度的方法，包括口服給予所述人有效量的權(quán)利要求2或3的生物組合物。
19.一種提高患有HIV感染和/或艾滋病的人體內(nèi)CD4+細胞計數(shù)的方法，包括口服給予所述人有效量的權(quán)利要求2或3的生物組合物。
20.一種延長HIV感染的人生存時間的方法，包括口服給予所述人有效量的權(quán)利要求2或3的生物組合物。
21.權(quán)利要求13、14或15的方法，其中生物組合物中的所述酵母細胞為酵母屬的細胞。
22.權(quán)利要求13、14或15的方法，其中生物組合物中的所述酵母細胞為釀酒酵母細胞。
23.權(quán)利要求18的方法，其中生物組合物中的所述酵母細胞為釀酒酵母細胞。
24.權(quán)利要求19的方法，其中生物組合物中的所述酵母細胞為釀酒酵母細胞。
25.權(quán)利要求20的方法，其中生物組合物中的所述酵母細胞是釀酒酵母細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及能對人類免疫缺陷病毒感染者產(chǎn)生有益健康效果的含有酵母細胞的口服組合物。本發(fā)明還涉及制造該生物組合物的方法和使用該組合物的方法。
文檔編號A61P31/00GK1481824SQ0314838
公開日2004年3月17日 申請日期2003年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月28日
發(fā)明者張令玉 申請人:歐亞生物科技有限公司