專利名稱：大黃素類似物emd－31在腫瘤治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將大黃素類似物與化療藥物阿霉素(ADM)或長春新堿(VCR)聯(lián)合使用產(chǎn)生抗腫瘤協(xié)同作用，以期用于臨床腫瘤的治療。
本發(fā)明的目的是將EMD-31與化療藥物阿霉素(ADM)或長春新堿(VCR)合用，以期發(fā)揮協(xié)同作用，取得更好的療效。
使用藍(lán)四唑法進(jìn)行檢測，觀察的細(xì)胞系包括人口腔鱗癌KB細(xì)胞、多藥抗藥性的KB細(xì)胞(KBv200細(xì)胞)、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞和多藥抗藥性的MCF-7細(xì)胞(MCF-7/ADM細(xì)胞)。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化，計(jì)數(shù)，鋪96孔板，24h后加入不同濃度的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)72h，加入藍(lán)四唑鹽，37℃孵育4h，加入二甲基亞砜以充分溶解藍(lán)紫色顆粒，在酶標(biāo)儀上測定560nm處吸光值，以判斷藥物活性并計(jì)算兩藥相互作用指數(shù)CDI(CDI＝AB/(A×B)。其中AB為兩藥聯(lián)合作用組的T/C比值(T給藥組吸光值—空白組吸光值，C陰性對照組吸光值—空白組吸光值)，A、B是藥物單獨(dú)作用組的T/C比值。理論上當(dāng)CDI＜1時兩藥有協(xié)同作用。本研究設(shè)定當(dāng)CDI≤0.85時存在協(xié)同作用，CDI＜0.70時協(xié)同作用非常顯著)。結(jié)果表明，在無細(xì)胞毒劑量下的EMD-31即能顯著提高ADM(表1)，(圖2)，(圖3)，(圖4)，(圖5)和VCR(表2)，(圖6)，(圖7)，(圖8)，(圖9)對人口腔鱗癌KB細(xì)胞、多藥抗藥性的KB細(xì)胞(KBv200細(xì)胞)、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞和多藥抗藥性的MCF-7細(xì)胞(MCF-7/ADM細(xì)胞)的增殖抑制作用，CDI小于0.8。且等劑量的EMD-31對敏感和抗藥細(xì)胞都具有同等明顯的增效作用，顯示出EMD-31在今后用于抗藥性腫瘤治療中的前景。
表1阿霉素(ADM)單用及與EMD-31合用對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用ADM IC50(μM)藥物KB KBv200 MCF-7 MCF-7/ADMADM 0.075 3.00 0.2535.40ADM+EMD-31 20μM0.027 0.70 0.059.87ADM+EMD-31 50μM0.023 0.21 0.025.24表2長春新堿(VCR)單用及與EMD-31合用對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用VCR IC50(μM)藥物KBKBv200MCF-7 MCF-7/ADMVCR 0.010 1.60 0.10 5.45VCR+EMD-31 20μM0.0030 0.22 0.0132.23VCR+EMD-31 50μM0.0015 0.0160.0023 0.79
2.EMD-31與化療藥物VCR或ADM合用在體內(nèi)對小鼠移植性腫瘤生長的協(xié)同抑制作用在昆明種小鼠腋部皮下接種小鼠肝癌22，每只動物接種1.5×106細(xì)胞，24h后腹腔給藥，每天一次，連續(xù)給藥10天。隔天稱體重，量瘤體積。接種腫瘤21天后處死動物，稱瘤重。以公式1/2ab2(a長徑，b短徑)計(jì)算瘤體積。以公式(1-T/C)×100(T給藥組瘤重，C對照組瘤重)計(jì)算抑瘤率。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1)按腫瘤重量(表3)和瘤體積(

圖10)計(jì)算，EMD-31與ADM合用對皮下移植的肝癌22的生長有顯著的協(xié)同抑制作用。在EMD-31(50mg/kg)組對腫瘤生長無明顯抑制的情況下，1.5mg/kgADM單用組抑制率為45.3％，與EMD-31合用組的抑制率為65.3％，CDI＝0.5。2.0mg/kg ADM單用組抑制率為64.7％，與EMD-31合用組的抑制率為81.3％，CDI＝0.5。對照組、EMD-31組、ADM給藥組及其與EMD-31合并用藥組無動物死亡，且小鼠的體重均有增加，表明上述用藥在體內(nèi)無明顯毒性。
表3.EMD-31與ADM合用對小鼠移植肝癌22的生長抑制作用動物數(shù)劑量 體重變化抑瘤率藥物瘤重(g)開始結(jié)束 (mg/kg) (g)Δ(％)對照 10 10+5.3 15.0±4.60EMD-31 10 10 50+7.4 16.0±3.70ADM10 10 1.5 +5.5 8.2±2.4 45.3*ADM10 10 2.0 +13.45.3±1.3 64.7*EMD-31 5010 10+6.9 5.2±1.6 65.3*#+ADM +1.5EMD-31 5010 10+12.42.8±1.1 81.3*##+ADM +2.0皮下接種腫瘤，第2天起每日腹腔注射給藥一次，共10次，*P＜0.01與對照組比較，#CDI＝0.6，##CDI＝0.5，Δ體重減去瘤重。
2)按腫瘤重量(表4)和瘤體積(圖11)計(jì)算，EMD-31與VCR合用對皮下移植的肝癌22的生長有顯著的協(xié)同抑制作用。在EMD-31(50mg/kg)組對腫瘤生長無明顯抑制的情況下，0.2mg/kg VCR單用組抑制率為34.7％，與EMD-31合用組的抑制率為37.3％，CDI＝0.9。0.3mg/kg VCR單用組抑制率為40.0％，與EMD-31合用組抑制率為62.0％，CDI＝0.6。對照組、EMD-31組、VCR給藥組及合并用藥組均無動物死亡，且小鼠的體重均有增加，表明上述用藥在體內(nèi)無明顯毒性。
表4.EMD-31與VCR合用對小鼠移植肝癌22的生長抑制作用動物數(shù)劑量 體重變化 抑瘤率藥物瘤重(g)開始結(jié)束 (mg/kg) (g)Δ (％)對照10 10 +5.315.0±4.6 0EMD-31 10 10 50 +7.416.0±3.7 0VCR 10 10 0.2 +5.99.8±2.734.7*VCR 10 10 0.3 +3.09.0±1.440.0*EMD-31 5010 10 +7.79.4±3.837.3*#+VCR +0.2EMD-31 5010 10 +13.3 5.7±1.262.0*##+VCR +0.3皮下接種腫瘤，24h后腹腔注射給藥，每天一次，共10次，*P＜0.01與對照組比較，#CDI＝0.9，##CDI＝0.6，Δ體重減去瘤重。發(fā)明效果本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與積極效果是開拓了大黃素類似物EMD-31作為抗腫瘤藥物的新用途，該化合物毒性低，它與化療藥物阿霉素(ADM)和長春新堿(VCR)聯(lián)合有協(xié)同抗腫瘤作用，是有開發(fā)應(yīng)用前景的抗腫瘤化合物。
圖3-MTT法檢測EMD-31與阿霉素(ADM)合用對多藥抗藥性的人口腔鱗癌KB細(xì)胞(KBv200細(xì)胞)的增殖抑制作用其中-◆-ADM-■-ADM+EMD-31 20μM-▲-ADM+EMD-31 50μM*CDI＜0.75，**CDI＜0.8圖4-MTT法檢測EMD-31與阿霉素(ADM)合用對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用其中-◆-ADM-■-ADM+EMD-31 20μM-▲-ADM+EMD-31 50μM*CDI＜0.75，**CDI＜0.8圖5-MTT法檢測EMD-31與阿霉素(ADM)合用對多藥抗藥性的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞(MCF-7/ADM細(xì)胞)的增殖抑制作用其中-◆-ADM-■-ADM+EMD-31 20μM-▲-ADM+EMD-31 50μM*CDI＜0.75，**CDI＜0.8圖6-MTT法檢測EMD-31與長春新堿(VCR)合用對人口腔鱗癌KB細(xì)胞的增殖抑制作用其中-◆-VCR-■-VCR+EMD-31 20μM-▲-VCR+EMD-31 50μM*CDI＜0.75，**CDI＜0.8圖7-MTT法檢測EMD-31與長春新堿(VCR)合用對多藥抗藥性的人口腔鱗癌KB細(xì)胞(KBv200細(xì)胞)的增殖抑制作用其中-◆-VCR-■-VCR+EMD-31 20μM-▲-VCR+EMD-31 50μM*CDI＜0.75，**CDI＜0.8
圖8-MTT法檢測EMD-31與長春新堿(VCR)合用對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用其中-◆-VCR-■-VCR+EMD-31 20μM-▲-VCR+EMD-31 50μM*CDI＜0.75，**CDI＜0.8圖9-MTT法檢測EMD-31與長春新堿(VCR)合用對多藥抗藥性的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞(MCF-7/ADM細(xì)胞)的增殖抑制作用其中-◆-VCR-■-VCR+EMD-31 20μM-▲-VCR+EMD-31 50μM*CDI＜0.75，**CDI＜0.8圖10-EMD-31(50mg/kg)與阿霉素(ADM)(1.5mg/kg)合用對小鼠移植肝癌22的生長抑制作用其中-◆-對照-■-EMD-31(50mg/kg)-▲-ADM(1.5mg/kg)-×-ADM(1.5mg/kg)+EMD-31(50mg/kg)*CDI＜0.75圖11-EMD-31(50mg/kg)與長春新堿(VCR)(0.3mg/kg)合用對小鼠移植肝癌22生長抑制作用其中-◆-對照-■-EMD-31(50mg/kg)-▲-VCR(0.3mg/kg)-×-VCR(0.3mg/kg)+EMD-31(50mg/kg)*CDI＜0.7權(quán)利要求
1.大黃素類似物EMD-31[9(10H)蒽酮]在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所說的大黃類似物與化療藥物阿霉素(ADM)或長春新堿(VCR)聯(lián)合使用具有抗腫瘤協(xié)同作用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是體外實(shí)驗(yàn)采用藍(lán)四唑法，將腫瘤細(xì)胞鋪于96孔板，過夜后加入不同濃度的藥物培養(yǎng)，加入藍(lán)四唑鹽進(jìn)行反應(yīng)，除去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜，以充分溶解反應(yīng)產(chǎn)生的藍(lán)紫色顆粒，酶標(biāo)儀上測定560nm處吸光值，計(jì)算細(xì)胞的存活率及IC50值，并根據(jù)兩藥相互作用指數(shù)判定EMD-31與化療藥物長春新堿或阿霉素合用產(chǎn)生抑制腫瘤細(xì)胞增殖的協(xié)同作用。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，是在小鼠皮下接種小鼠肝癌22，通過腹腔注射連續(xù)給藥，按腫瘤體積或重量計(jì)算，EMD-31分別與化療藥物阿霉素或長春新堿合用對小鼠皮下移植性肝癌22的生長抑制的協(xié)同作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及已知結(jié)構(gòu)的大黃素類似物EMD－31在腫瘤治療中的應(yīng)用，該化合物化學(xué)名為9(10)蒽酮，本身毒性低，體外實(shí)驗(yàn)顯示了它與化療藥物長春新堿或阿霉素抑制腫瘤細(xì)胞增殖的協(xié)同作用，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)用于治療小鼠移植性肝癌，EMD－31與化療藥物阿霉素或長春新堿的合用組顯示出比同等劑量的化療藥物阿霉素、長春新堿或EMD－31組更強(qiáng)的腫瘤生長抑制作用，因此，EMD－31有望成為一個有特點(diǎn)的具有開發(fā)前景的抗腫瘤化合物。
文檔編號A61K31/7028GK1443537SQ03122028
公開日2003年9月24日 申請日期2003年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月22日
發(fā)明者黃云虹, 宋丹青, 甄永蘇 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所