專利名稱：異種心臟植入物膠原組織的光氧化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種膠原組織的交聯(lián)方法。
背景技術(shù)：
目前，對(duì)異種心臟植入物膠原組織進(jìn)行交聯(lián)處理的目的主要是為了得到人工心臟瓣膜。這種由動(dòng)物膠原組織得到的人工心臟瓣膜，又常稱為異種生物瓣。交聯(lián)方法主要是加入化學(xué)交聯(lián)劑。交聯(lián)劑通過(guò)摻入到蛋白質(zhì)的構(gòu)架中，使蛋白質(zhì)的賴氨酸、羥基賴氨以及其它的氨基酸的氨基交聯(lián)而起作用。通常使用的交聯(lián)劑主要有甲醛、戊二醛，還可以使用鄰苯二甲酰、半己二酰、硫醇等。其中，以戊二醛最為常見(jiàn)。其機(jī)理主要是通過(guò)對(duì)膠原組織的氧化，產(chǎn)生二硫鍵而起作用。
這種方法存在一些局限性，如容易鈣化，具有生物毒性，耐久性較差，因而不能達(dá)到使用要求。中國(guó)專利ZL 92100096.0對(duì)這種方法進(jìn)行了改進(jìn)。該專利公開(kāi)了一種先以戊二醛進(jìn)行預(yù)處理，然后以羥基鉻溶液對(duì)異種生物瓣進(jìn)行交聯(lián)處理的方法。雖然，得到的生物瓣的性能有所改進(jìn)，但耐久性差的問(wèn)題并沒(méi)有得到根本的解決。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種光氧化方法，對(duì)異種心臟植入物膠原組織進(jìn)行交聯(lián)處理，以得到性能優(yōu)異的異種生物瓣。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下方案首先對(duì)異種心臟植入物膠原組織進(jìn)行預(yù)處理，以增強(qiáng)交聯(lián)組織的抗降解性。然后，將異種心臟植入物膠原組織浸泡于光氧化處理液中，并進(jìn)行光照處理。
在光氧化處理后，還需要碘復(fù)合溶液(0.1wt％碘、0.1wt％碘化鈉、0.1wt％碘化鉀PBS溶液)消毒，并保存于50wt％酒精溶液中。
本發(fā)明主要是用于異種心臟植入物膠原組織，如牛心包、豬心包、豬主動(dòng)脈瓣和牛頸靜脈等。一般來(lái)說(shuō)，含有酪氨酸、色氨酸和組氨酸殘基的蛋白類(lèi)物質(zhì)易于用此方法固定。
本文所稱的PBS液，為磷酸緩沖溶液。
預(yù)處理采用10-30wt％蔗糖PBS液，PH值在6.8-8.6之間，滲透壓為393-800mosm。處理溫度為0-20℃，處理時(shí)間為10-16小時(shí)。
光氧化催化劑可以是美藍(lán)、亞甲綠、孟加拉玫瑰紅、核黃素、原黃素、熒光素、伊紅和5磷酸吡哆醛中的一種。將光氧化催化劑與PBS液混合即可配制光氧化處理液。光氧化催化劑濃度為0.01-0.1wt％。光氧化處理液和異種心臟植入物膠原組織的重量比為10∶1至30∶1。
在進(jìn)行光氧化處理時(shí)，氧體積比濃度為0-25％，優(yōu)選為5-20％；處理溫度為0-25℃，光照的強(qiáng)度在100-20000流明小時(shí)。
因?yàn)樗嵝缘沫h(huán)境容易使蛋白質(zhì)變性，所以光氧化處理液應(yīng)為中性或堿性。即，PH值應(yīng)在6.5以上，優(yōu)選PH值為6.8-8.6，最優(yōu)選PH值為7.4-8.0。
交聯(lián)物的評(píng)價(jià)方法如下1.消化實(shí)驗(yàn)包括把交聯(lián)物和化學(xué)消化劑或胃蛋白酶等一起孵育，隨后離心，上清液電泳，提示這種交聯(lián)方法固定的組織有很好的生物穩(wěn)定性。
2.鼠皮下埋植試驗(yàn)，把材料埋植于大鼠皮下，分別在第4周和第12周取出材料，了解組織是否被吸收，進(jìn)行鈣含量測(cè)定，組織學(xué)檢查了解炎性浸潤(rùn)程度。進(jìn)一步證明光氧化固定的組織具有生物穩(wěn)定性，抗鈣化性，低免疫原性。
3.內(nèi)皮細(xì)胞種植試驗(yàn)，證明光氧化固定的材料沒(méi)有細(xì)胞毒性。
把光氧化固定的瓣膜或管道植入大動(dòng)物如狗、羊體內(nèi)，監(jiān)測(cè)血液動(dòng)力學(xué)性能，6個(gè)月至1年之后取出，進(jìn)行大體觀察及組織學(xué)檢查、鈣含量測(cè)定等。證明光氧化法固定的材料與戊二醛固定的材料相比，具有抗鈣化性、低免疫原性和無(wú)生物毒性。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是以光氧化方法對(duì)異種心臟植入物膠原組織進(jìn)行交聯(lián)處理，處理中不使用戊二醛。因而，光氧化法得到的交聯(lián)膠原組織，具有抗鈣化性、低免疫原性和無(wú)生物毒性等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
1.試劑配制1)PBS溶液稱取NaCl(A.R)16克，KCl(A.R)0.4克，NaHPO4H2O(A.R)3.12克，KH2PO4(A.R)0.4克，加于2000ml容量瓶后加去離子水至刻度線。
2)美藍(lán)PBS溶液
2克美藍(lán)(A.R)加PBS液至200ml。
2.材料的制備取新鮮的牛頸靜脈，沖洗掉殘余的血液，去除表面的脂肪和疏松結(jié)蒂組織，4℃條件下，PBS液浸泡12小時(shí)。
3.處理過(guò)程1)預(yù)處理，材料浸泡于20％蔗糖PBS液，4℃條件下12小時(shí)，PBS液沖洗。
2)預(yù)處理之后的材料浸泡于0.1wt％美藍(lán)PBS溶液，置于恒溫水浴，4℃，150瓦白熾燈，離液面7厘米，光照96小時(shí)。
3)氧化之后的材料，先使用PBS溶液沖洗，脫去殘留的美藍(lán)及殘?jiān)?。然后?jīng)碘復(fù)合溶液消毒后，保存于50wt％酒精溶液備用。
4.交聯(lián)物的評(píng)價(jià)光氧化固定后的牛帶瓣頸靜脈經(jīng)化學(xué)和酶消化之后的上清液電泳之后出現(xiàn)極淡的蛋白條帶，明顯淡于新鮮的未處理的材料，戊二醛固定的材料幾乎不出現(xiàn)蛋白條帶，如

圖1所示。
圖1中，第一條帶是新鮮牛頸靜脈組，第二條帶是戊二醛固定組，第三條帶是光氧化固定組，第四條帶是蛋白標(biāo)記物。
皮下埋植3周后，經(jīng)鈣含量測(cè)定，光氧化組顯著低于戊二醛組，統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異有顯著性意義，如圖2所示。
鈣染色，戊二醛組可見(jiàn)大量的鈣沉積，光氧化組只見(jiàn)少量鈣沉積。詳見(jiàn)圖3和圖4。其中，圖3為戊二醛固定組，圖4為光氧化固定組。
組織學(xué)檢查提示光氧化組細(xì)胞浸潤(rùn)明顯少于其他兩組(圖5為光氧化固定組，圖6為新鮮牛頸靜脈組，圖7為戊二醛固定組)。細(xì)胞種植實(shí)驗(yàn)提示細(xì)胞在光氧化固定牛頸靜脈血管片生長(zhǎng)良好(圖8)。
權(quán)利要求
1.一種異種心臟植入物膠原組織的光氧化方法，其特征在于對(duì)異種心臟植入物膠原組織進(jìn)行預(yù)處理，然后將異種心臟植入物膠原組織浸泡于光氧化處理液中，并進(jìn)行光照處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異種心臟植入物膠原組織的光氧化方法，其特征在于所述的預(yù)處理采用10-30wt％蔗糖PBS液，PH值在6.8-8.6之間，滲透壓為393-800mosm，處理溫度為0-20℃，處理時(shí)間為10-16小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異種心臟植入物膠原組織的光氧化方法，其特征在于所述的光氧化處理液由光氧化催化劑和PBS液混合而成，光氧化劑濃度為0.01-0.1wt％，光氧化處理液的PH值為6.8-8.6。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的異種心臟植入物膠原組織的光氧化方法，其特征在于所述的光氧化催化劑可以是美藍(lán)、亞甲綠、孟加拉玫瑰紅、核黃素、原黃素、熒光素、伊紅和5磷酸吡哆醛中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的異種心臟植入物膠原組織的光氧化方法，其特征在于所述的光氧化處理液的PH值為7.4-8.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的異種心臟植入物膠原組織的光氧化方法，其特征在于所述的光氧化催化劑是美藍(lán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異種心臟植入物膠原組織的光氧化方法，其特征在于所述的光氧化處理液和異種心臟植入物膠原組織的重量比為10∶1至30∶1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異種心臟植入物膠原組織的光氧化方法，其特征在于所述的光照處理中，氧體積比濃度為0-25％，處理溫度為0-25℃，光照的強(qiáng)度為100-20000流明小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的異種心臟植入物膠原組織的光氧化方法，其特征在于所述的光照處理中，氧體積比濃度為5-20％。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種異種心臟植入物膠原組織的光氧化方法。該方法先對(duì)異種心臟植入物膠原組織進(jìn)行預(yù)處理，然后將異種心臟植入物膠原組織浸泡于光氧化處理液中，并進(jìn)行光照處理。由于在處理中不使用戊二醛，所以光氧化法得到的交聯(lián)異種心臟植入物膠原組織，具有抗鈣化性、低免疫原性和無(wú)生物毒性等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61L27/00GK1439431SQ03121540
公開(kāi)日2003年9月3日 申請(qǐng)日期2003年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月1日
發(fā)明者胡盛壽, 李勝利, 汪勝 申請(qǐng)人:北京市普惠生物醫(yī)學(xué)工程公司