專利名稱：用儲存的紅血球改善氧傳送的方法
相關(guān)的專利申請這份申請是2001年9月10日申請的美國專利申請第09/950,270號的繼續(xù)申請并且要求賦予該申請的優(yōu)先權(quán)。在此通過引證將上述申請的教導(dǎo)全部并入本文。
本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)儲存的血隨著時(shí)間的流逝遭受許多有害的生物化學(xué)變化，被統(tǒng)稱為“儲藏?fù)p害”。這些變化能包括細(xì)胞的微聚集作用、溶血作用、泡囊形成、降低細(xì)胞膜柔性、降低穩(wěn)定性和增加血紅蛋白-氧親和力。這些變化降低給病人使用包含儲存的血或紅血球的血液產(chǎn)品的全部利益，而且在給病人輸血的時(shí)候甚至可能引起有害的作用。例如，增加微聚集體形成和喪失紅血球細(xì)胞膜柔性可能引起造成局部缺血和肺部功能失調(diào)的微循環(huán)脈管堵塞。
此外，在紅血球中喪失2，3-二磷酸甘油酯(2，3-DPG)實(shí)質(zhì)上將導(dǎo)致增大的血紅蛋白-O2親和力。儲存一星期以上的血液呈現(xiàn)在2，3-DPG水平方面的顯著減少。在兩個星期之后，只有大約40％的2，3-DPG保留，經(jīng)過三個星期只有大約10％殘留。S.P.Masouredis，“Preservation and Clinical Use of Erythrocytesand Whole Blood(紅血球和全血的保存和臨床使用)”，第164章，在Williams、Beutler、Erslev和Lichtman編輯的“Hemology第三版中，McGraw-Hill，NY，pp1529-1549(1983)。2，3-DPG的喪失造成P50相伴的下降。例如，在保護(hù)性的檸檬酸鹽磷酸鹽葡萄糖(CPD)中儲藏四個星期之后，其中的紅血球的P50下降到大約15mmHgWells等人，“Transfusion(輸血)”，21709-714(1981)。由于來自紅血球的氧的釋放通常與P50成正比，所以儲存的紅血球遞送氧的能力也隨著時(shí)間流逝逐漸降低。
儲藏?fù)p害能通過減少對流和擴(kuò)散遞送氧兩者在輸送氧方面引起有害的改變。微聚集體和僵硬的細(xì)胞可能滯留在微脈管中，從而阻斷向下游組織的流動。此外，包含氧親和力比較高的血紅蛋白的紅血球具有降低的對組織釋放氧的能力。對氧有高親和力的儲存的紅血球能在經(jīng)輸血進(jìn)入人體之后隨著時(shí)間流逝“返老還童”。2，3-DPG的水平經(jīng)過4小時(shí)恢復(fù)到正常值的30％到50％，用大約24小時(shí)回到正常水平，雖然這個比率可能是可變的。Valeri和Hirsch，J.Lab.Clin.Med.，73722-733(1969)；Beutler和Wood，J.Lab.Clin.Med.，74300-304(1969)。2，3-DPG的恢復(fù)比率可能取決于病人的代謝狀態(tài)。O′Brien和Watkins，J.Thor.& Cardiovas.Surg.，40611(1960)。令人啼笑皆非的是輸儲存的紅血球是為了滿足治療急性病的需要，但卻蒙受急性病的損害。
盡管這些細(xì)胞在循環(huán)中“返老還童”，在數(shù)小時(shí)的時(shí)間周期內(nèi)恢復(fù)柔性并且降低氧親和力，但是仍然存在可能對病人(尤其是對那些危急病人)造成不利影響的減少氧輸送的窗口。此外，盡管年輕的無癥病人可能彌補(bǔ)儲藏?fù)p害；但是彌補(bǔ)能力降低或缺乏的病人將面臨進(jìn)一步受傷害或降低治療效果的危險(xiǎn)。自相矛盾的是，有對氧的高親和力的紅血球的這種輸血補(bǔ)償反應(yīng)在某些情況下可能引起減少局部的充氧作用。Marik和Sibbald，JAMA2693024-30(1993)。微栓塞的產(chǎn)生也是儲藏?fù)p害的一部份。已知微栓塞是在儲藏期間和在注入時(shí)在板結(jié)紅血球中形成的，阻塞微循環(huán)，造成對肺部毛細(xì)管內(nèi)皮和肺泡上皮的傷害Liu等人，Ann.Thorac.Surg.，541196-1202(1992)；Gay等人，Trauma1980-84(1979)。
新鮮的紅血球已被推薦用于大量輸血、給嬰兒、老年病人和有心血管病和肺病的病人輸血Masouredis，S.P.，“Preservationand Clinical Use of Blood and Blood Components(血液和血液成份的保存和臨床使用”，在Willams，W.J.，Beutler，E.，Erslev，A.J.和Lichtman，M.A.編輯的“Hemology”中，McGraw-Hill，NY，pp.1529-1549；Sugarman，H.J.等人，Surg.Gynecol.Obstet.，131733-741(1970)；Valeri，G。R.，等人，Transfusion，20263-276(1980)；Hess，W.，Anaesthetist.，36455-467(1987)。然而，新鮮血球的可用性往往是有限的。
所以，存在對提高儲存的紅血球的氧輸送和遞送效率的產(chǎn)品和方法的需求。
本發(fā)明的概述本發(fā)明涉及通過給病人使用儲存的紅血球和血紅蛋白溶液對病人進(jìn)行治療的方法。
在一個實(shí)施方案中，先給病人使用血紅蛋白溶液，然后給病人使用儲存的紅血球，其中血紅蛋白溶液包含聚合的血紅蛋白，而儲存的紅血球已被儲存大約48小時(shí)以上。
在另一個實(shí)施方案中，所述方法包括先給病人使用儲存的紅血球，然后在儲存的紅血球給藥的大約8小時(shí)之內(nèi)給病人使用血紅蛋白溶液，其中血紅蛋白溶液包含聚合的血紅蛋白，而儲存的紅血球已被儲存大約48小時(shí)以上。
本發(fā)明被進(jìn)一步涉及包括血紅蛋白溶液和儲存的紅血球的組合物，其中儲存的紅血球已被儲存大約48小時(shí)以上。
如同在本文中論證的那樣，雖然紅血球的儲藏隨著時(shí)間的推移減少從紅血球釋放氧的比率，但是除了儲存的紅血球之外血紅蛋白溶液的給藥逆轉(zhuǎn)這種效果而且恢復(fù)氧遞送給儲存的紅血球的潛力。由此產(chǎn)生的混合物在氧釋放方面的行為更像新鮮的紅血球。令人驚訝的是，這種效果即使在以總血紅蛋白的大約百分之十(10％)那樣少的血紅蛋白溶液的形式給病人使用的時(shí)候也被獲得。作為在本文中描述的研究結(jié)果，我們認(rèn)為血紅蛋白溶液連同儲存的紅血球一起添加將在氧釋放方面導(dǎo)致超過同樣總量的血紅蛋白以新分離的紅血球形式給藥的實(shí)質(zhì)性增加。
本發(fā)明方法和組合物與可能以別的方式可能達(dá)到的相比能更迅速地恢復(fù)儲存的紅血球的氧遞送能力。本發(fā)明在急性病、嬰兒和老年病人的治療方面可能是特別有用的。此外，依照本發(fā)明的方法添加血紅蛋白和儲存的紅血球不管微栓塞是否出現(xiàn)都將引起增大的組織充氧作用，因?yàn)楸容^小的血紅蛋白分子能夠穿過障礙而且遞送氧。本發(fā)明的方法和組合物提高儲存的紅血球的氧輸送和遞送效率并且能延長儲存的紅血球的有用的儲藏期。
附圖簡要說明

圖1是隨著時(shí)間流逝氧釋放的曲線，它將來自儲存的人類紅血球的實(shí)際的和預(yù)測的氧釋放與新分離的人類紅血球的氧釋放進(jìn)行比較，其中各個點(diǎn)代表實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，而曲線代表來自理論模型的輸出。
圖2是把基于血紅蛋白的氧傳遞體(HBOC)添加到儲存的紅血球中和添加到新鮮紅血球中對氧釋放的影響的劑量響應(yīng)曲線。
圖3是新鮮紅血球和儲存的紅血球的樣品獨(dú)自地和在與兩種不同數(shù)量的基于血紅蛋白的氧傳遞體組合中的氧釋放隨著時(shí)間流逝的概要描述。
圖4是儲存的和新分離的紅血球懸浮液的氧攝取數(shù)據(jù)的曲線，其中點(diǎn)代表實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，而曲線代表理論模擬。
圖5是儲存的紅血球獨(dú)自的和在與基于血紅蛋白的氧傳遞體組合中的和新鮮紅血球獨(dú)自的氧攝取曲線。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明的方法包括通過給病人使用儲存的紅血球和血紅蛋白溶液對病人進(jìn)行治療。術(shù)語“儲存的紅血球”包括與野生型血紅蛋白或紅血球相比較具有大幅度被減少的P50，其中野生型血紅蛋白具有至少大約為25mmHg的P50?！癙50”如同在本文中定義的那樣意味著大約50％的血紅蛋白與氧結(jié)合時(shí)氧的分壓。在一個實(shí)施方案中，儲存的紅血球可能是由于遺傳基因變化或疾病自然地具有遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于大約25mmHg的P50的天然的或新鮮的血液。具有減少的P50的儲存的紅血球的例子是P50等于或少于大約25mmHg、等于或少于大約15mmHg的血液。儲存的紅血球能具有與來自健康個體的新分離的血液相比較被減少的2，3-DPG水平，從而造成減少的P50。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，儲存的紅血球在給病人使用之前已與供體分離至少大約48小時(shí)。在另一個實(shí)施方案中，儲存的紅血球在給病人使用之前已與供體分離至少大約7天。在又一個實(shí)施方案中，儲存的紅血球已與供體分離至少大約35天。在另外一個實(shí)施方案中，儲存的紅血球在用本發(fā)明的方法給病人使用之前已與供體分離至少42天。
儲存的紅血球可以是被保護(hù)的血液。術(shù)語“被保護(hù)的血液”如同在本文中定義的那樣意味著為了儲藏和后來供輸血使用已被處理的血液。適合保存血液的方法是眾所周知的。適合保存血液的物理方法的例子是冷藏和冷凍。適合保存血液的化學(xué)方法的例子包括添加諸如酸式檸檬酸鹽葡萄糖(ACD)或檸檬酸鹽磷酸鹽葡萄糖(CPD)之類的化合物。進(jìn)而，血溶液可以添加諸如腺嘌呤、葡萄糖、甘露醇或它們的組合之類的增強(qiáng)成份。保存血液的方法的附加實(shí)例可以在Holme等人的美國專利第5,487,971號中找到，在此通過引證將其教導(dǎo)全部并入本文。
在另一個實(shí)施方案中，儲存的紅血球可以來源于冷凍的紅血球。冷凍紅血球的方法在技術(shù)上是眾所周知的。這樣的方法通常包括在低溫下迅速凝固和保存，例如在液氮中，或者在有甘油之類低溫保護(hù)劑存在的情況下凝固。通常，低溫保護(hù)劑在輸血之前被從紅血球中除去。
在另一個實(shí)施方案中，儲存的紅血球已被處理，以便除去至少大約80％的白血球。適當(dāng)?shù)膬Υ娴募t血球來源的其它例子包括板結(jié)紅血球和洗過的紅血球。
在本文中也被稱為“基于血紅蛋白的氧傳遞體”或“HBOC”的“血紅蛋白溶液”意味著血紅蛋白(無細(xì)胞的血紅蛋白)的液體懸浮液。適合在本發(fā)明中使用的血紅蛋白可以得自來自人和/或其它哺乳動物來源(例如，牛、豬、羊或犬)的新鮮的、陳舊的或過時(shí)的血液。除此之外，諸如在Bio/Technology，1255-59(1994)中描述的用轉(zhuǎn)基因法生產(chǎn)的血紅蛋白和在Nature，356258-260(1992)中描述的用重組法生產(chǎn)的血紅蛋白之類用轉(zhuǎn)基因法生產(chǎn)的血紅蛋白也適合在本文描述的血紅蛋白溶液中使用。
優(yōu)選的是，血紅蛋白是在分子間和/或分子內(nèi)交聯(lián)的。非必選的或作為替代的是，血紅蛋白能被結(jié)合到諸如聚乙二醇或戊二醛之類的另一個分子上。優(yōu)選的血紅蛋白溶液的例子是在Rausch等人的美國專利第5,618,919號、Rausch等人的美國專利第5,905,141號、Rausch等人的美國專利第5,084,558號、Rausch等人的美國專利第5,296,465號、Rausch等人的美國專利第5,840,852號、Rausch等人的美國專利第5,753,616號、Light等人的美國專利第5,895,810號、Gawryl等人的美國專利第5,691,452號、Wertz等人的美國專利第5,691,453號和Gawryl等人的美國專利第5,808,011號中描述的，在此通過引證將它們的教導(dǎo)全部并入本文。血紅蛋白可以具有大約25mmHg的P50，或大于25mmHg的P50。在特定的實(shí)施方案中，血紅蛋白具有至少大約38mmHg的P50。
在一個實(shí)施方案中，血紅蛋白溶液與戊二醛聚合，而且具有按重量計(jì)不足大約15％的高鐵血紅蛋白含量，少于大約每毫升0.5個內(nèi)毒素單位的內(nèi)毒素濃度，而且具有按重量計(jì)少于或者等于大約15％的分子量超過大約500,000道爾頓的聚合血紅蛋白、按重量計(jì)少于或等于大約10％的分子量少于或等于大約65,000道爾頓的聚合血紅蛋白。非必選的是，血紅蛋白溶液可以有不足每毫升大約0.5內(nèi)毒素單位的內(nèi)毒素含量。
在一個實(shí)施方案中，來自血紅蛋白溶液的血紅蛋白與來自儲存的紅血球的血紅蛋白的比例按重量計(jì)介于大約1∶9和大約1∶1之間。在其它的實(shí)施方案中，游離血紅蛋白與細(xì)胞締合血紅蛋白的比例按血紅蛋白濃度計(jì)是大約1∶4或大約2∶3。
儲存的紅血球和血紅蛋白溶液可以按任何次序給病人使用。血紅蛋白溶液和儲存的紅血球也可以以交替的方式給藥，其中某個數(shù)量的血紅蛋白溶液在一輪或多輪中先于某個數(shù)量的儲存的紅血球給藥。在替代方案中，儲存的紅血球可以被首先給藥。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括在血紅蛋白溶液給藥的大約36小時(shí)之內(nèi)完成儲存的紅血球的給藥。作為替代，儲存的紅血球可以是在血紅蛋白溶液給藥的大約24小時(shí)之內(nèi)或8小時(shí)之內(nèi)給藥的。在又一個實(shí)施方案，儲存的紅血球和血紅蛋白溶液是同時(shí)給藥的。優(yōu)選的是，在給病人使用儲存的紅血球之前完成血紅蛋白溶液的給藥。
血紅蛋白溶液和儲存的紅血球可以對病人按任何適當(dāng)?shù)难t蛋白濃度或血球比容給藥。例如，血紅蛋白溶液可以處在大約10g/dL的濃度下。在另一個實(shí)施方案中，血紅蛋白溶液處在14g/dL的濃度下。儲存的紅血球可以是這樣提供的，例如，按大約30到大約80的血球比容。
血紅蛋白溶液、儲存的紅血球或它們的組合的適當(dāng)?shù)慕o藥速率實(shí)例是介于每分鐘大約0.5毫升和每分鐘大約100毫升之間。在一個實(shí)施方案中，血紅蛋白溶液、儲存的紅血球或它們的組合能以低速率(例如，大約每分鐘2.5毫升)給藥。適合血紅蛋白溶液給藥的時(shí)間周期的例子是每大約九(9)小時(shí)大約2.5分鐘。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括血紅蛋白和儲存的紅血球的組合物。該組合物可以被裝在任何適合儲存或保存血紅蛋白或紅血球的容器中。優(yōu)選的是，血紅蛋白是聚合的。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，血紅蛋白與戊二醛聚合。
形成組合物的方法包括將適當(dāng)?shù)难t蛋白溶液與適當(dāng)?shù)膬Υ娴募t血球合并。適當(dāng)?shù)难t蛋白溶液和適當(dāng)?shù)膬Υ娴募t血球是前面描述過的。血紅蛋白和儲存的紅血球可以被合并，然后立刻被本發(fā)明的方法用來對病人進(jìn)行治療，或者被合并的血紅蛋白和紅血球可以被儲存起來供以后使用。
例證樣品的準(zhǔn)備新鮮的紅血球(Frbc)懸浮液是這樣制備的，即把血從健康的供體抽到肝素中(0.1毫升/10毫升)，冷卻到4℃，離心分離，并且將血漿和淡黃色的涂層除去。這些細(xì)胞是用兩個體積的等滲磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)[pH值為7.4]再次懸浮的。離心分離和用PBS再次懸浮被完成三次，以便除去殘留水平的血漿和淡黃色的涂層材料。然后，新鮮的紅血球被稀釋到30％的血球比容(hct)并且在使用前在4℃下儲存。如果超過48小時(shí)(2天)不被使用，那么這些細(xì)胞被丟棄。
儲存的紅血球(Srbc)本質(zhì)上是從Gulf Coast Blood Center，Houston，TX.購買的板結(jié)紅血球單位。標(biāo)準(zhǔn)的可臨床使用的單位是在四、五個星期的儲藏時(shí)間之后從血庫取出的。儲存的細(xì)胞借助先前就新鮮紅血球描述的重復(fù)的離心分離和再次懸浮的方法用PBS(pH7.4)洗滌。不同于新鮮的紅血球，在第一次離心分離之后就有溶血的證據(jù)。洗滌被重復(fù)(高達(dá)六次)，直到?jīng)]有可見的溶血作用或細(xì)胞碎片為止。經(jīng)過洗滌的儲存的紅血球被稀釋到30％的hct并且在使用前在4℃下保存。
在人造毛細(xì)管中使用之前(圖1)，樣品被抽到微毛細(xì)管血球比容計(jì)的管之中，以便搜尋溶血作用和再次檢驗(yàn)血球比容。紅血球血紅蛋白的P50是用Hemox分析儀(TCS Medical Products Co.，New Hope，PA)測量的。
在這項(xiàng)研究中使用的HBOC是由Biopure Corp.，Cambridge，MA提供的。HBOC由在生理溶液中的與戊二醛聚合的超純牛血紅蛋白組成。HBOC具有38的P50和大約1.4的Hill系數(shù)。HBOC的樣品是用真空瓶提供的并且在使用前在室溫下保存。
在即將使用之前，經(jīng)過洗滌的儲存的紅血球與HBOC混合，以便制成儲存的紅血球/HBOC混合物。這些混合物被命名為“儲存的紅血球/HBOC1-1”和“儲存的紅血球/HBOC9-1”。儲存的紅血球/HBOC1-1由等量(克)的紅血球血紅蛋白(作為細(xì)胞)和無細(xì)胞血紅蛋白(HBOC)組成，對應(yīng)于15％血球比容和5g/dl血紅蛋白溶液的最終組合物。儲存的紅血球/HBOC9-1由90％紅血球血紅蛋白(作為細(xì)胞)和10％無細(xì)胞血紅蛋白(HBOC)組成，對應(yīng)于27％血球比容和1g/dl血紅蛋白溶液的最終組合物。兩個樣品都具有10g/dl的總血紅蛋白濃度。
實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)裝置先前已被描述過，例如，在Page，T.C.等人的“Oxygen Transport by Erythrocyte/Hemoglobin Solution Mixturesin an in Vitro Capillary as a Model of Hemoglobin-Based OxygenCarrier Performance(作為基于血紅蛋白的氧傳遞體性能的模型用紅血球/血紅蛋白溶液混合物在體外毛細(xì)管中輸送氧)”，Microvasc.Res.，5554-64(1998)；Page，T.C.等人的“Prediction ofMicrocirculatory Oxygen Transport by Erythrocyte /HemoglobinSolution Mixtures(用紅血球/血紅蛋白溶液混合物預(yù)測微循環(huán)氧輸送)”Microvasc.Res.，56113-126(1998)和Page，T.C.等人的“Experimental and Mathematical Simulation of Oxygen Transportby Hemoglobin-Based Blood Substitute(用基于血紅蛋白的血液代用品輸送氧的實(shí)驗(yàn)和數(shù)學(xué)模擬)”，Blood Substitutes-Present andFuture Perspectives，E.Tsuchida(編輯)第11章，pp.135-145(1998)中，在此通過引證將它們的教導(dǎo)全部并入本文。
實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)該系統(tǒng)包括定義直徑大約為25微米的毛細(xì)管的有機(jī)硅橡膠毛細(xì)管薄膜。有機(jī)硅橡膠是因?yàn)樗哂袑ρ醯母呓感杂志哂性试S借助反光鏡確定血紅蛋白氧飽和狀態(tài)的充份的光學(xué)透明性而被選定的。毛細(xì)管薄膜被裝在顯微鏡的載物臺上。毛細(xì)管薄膜在每個末端都被插入導(dǎo)管并且被灌注紅血球懸浮液、血紅蛋白溶液或和它們的混合物。雙波長的微量分光光度法被用來沿著毛細(xì)管測定樣品在各種不同的軸線位置的氧飽和狀態(tài)。測量是沿著毛細(xì)管在每個位置按已知的0％和100％氧飽和狀態(tài)進(jìn)行的。這些標(biāo)度被用來就實(shí)驗(yàn)測量結(jié)果計(jì)算沿著毛細(xì)管部分氧飽和隨位置的變化。
測量就氧攝取實(shí)驗(yàn)而言，樣品先在血壓計(jì)中脫氧，然后通過8微米核孔過濾器被送入原料容器(the feed reservoir)。當(dāng)樣品被拉過毛細(xì)管內(nèi)腔的時(shí)候，充氧氣體在毛細(xì)管薄膜上吹過。在氧釋放實(shí)驗(yàn)中，空氣平衡的樣品被拉過毛細(xì)管，同時(shí)用潮濕的氮布滿有機(jī)硅橡膠薄膜表面。包含HBOC-301的樣品是用50％氧平衡的，以便實(shí)現(xiàn)完全飽和(部分飽和計(jì)算所需要的)。在飼養(yǎng)容器中的時(shí)候，樣品被不斷地?cái)嚢?，以避免沉淀。?shù)據(jù)是沿著毛細(xì)管在五個不同的位置對四種流速獲取的。數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)換成部分氧飽和并且被表示成部分飽和對視在駐留時(shí)間。進(jìn)行這些計(jì)算的方法是在前面識別的關(guān)于使用的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的參考文獻(xiàn)中詳細(xì)討論的。
結(jié)果儲存的細(xì)胞需要大量洗滌而且是易碎的。在用Hemox分析儀(TCS Medical Products，New Hope，PA)測量時(shí)觀測到的P50是15±1mmHg。經(jīng)過洗滌的儲存的紅血球樣品在儲存24小時(shí)之后有值得注意的溶血而且不得不被再次洗滌。
氧釋放用儲存的和新鮮的紅血球(通常分別用Srbc和Frbc表示，或用rbc表示)進(jìn)行氧輸送研究的結(jié)果呈現(xiàn)在圖1中。數(shù)據(jù)被表示成平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。將這些觀察結(jié)果與用對于新鮮的和儲存的紅血球?qū)50分別設(shè)定在在26mmHg和15mmHg的數(shù)學(xué)模型預(yù)測的曲線相比較。這些樣品的血球比容是30％。來自Srbc的氧釋放與人類的新鮮紅血球相比較被大大減少。模型結(jié)果對于新鮮的紅血球與釋放數(shù)據(jù)一致，但是略微低于從儲存的紅血球預(yù)測的釋放。
把數(shù)量逐漸增加的HBOC添加到儲存的細(xì)胞中的劑量響應(yīng)實(shí)驗(yàn)的釋放數(shù)據(jù)的概要描述呈現(xiàn)在圖2中。所有的樣品都已用潮濕的空氣平衡。為了清楚將圖1中的Srbc和Frbc的數(shù)據(jù)系列表示成擬合曲線。Srbc/HBOC9-1樣品的平衡飽和被計(jì)算出來是0.98，而Srbc/HBOC1-1的平衡氧飽和被計(jì)算出來是0.92。在氧釋放方面實(shí)質(zhì)性的增加甚至對Srbc/HBOC9-1樣品也被注意到，而且氧釋放效率在較高的HBOC分?jǐn)?shù)濃度下增加。起因于儲藏的氧輸送效率喪失在添加少量的HBOC的情況下被逆轉(zhuǎn)。
所有樣品(點(diǎn))的氧釋放的概要描述呈現(xiàn)在圖3中，與對于紅血球和rbc/HBOC混合物被證實(shí)的氧輸送數(shù)學(xué)模型(曲線)相比較。如同在圖3中能看到的那樣，由于添加HBOC被增大的氧釋放對于所有的Srbc和Frbc混合物都被觀察到。包含F(xiàn)rbc的樣品與相應(yīng)的包含Srbc的樣品相比卸下更多的氧。模型是對Frbc和Frbc與HBOC的混合物預(yù)測的，但是對于Srbc/HBOC1-1和Srbc/HBOC9-1，模型對所有的駐留時(shí)間的氧釋放都估計(jì)不足。所以，不管令人矚目的更大的對氧的親和力，在與基于血紅蛋白的氧傳遞體結(jié)合的時(shí)候，儲存的紅血球呈現(xiàn)比預(yù)測結(jié)果大得多的釋放率。進(jìn)而，與預(yù)測的行為相反，在與相同數(shù)量的基于血紅蛋白的氧傳遞體混合的時(shí)候，儲存的紅血球的氧釋放率與新鮮紅血球的相當(dāng)。
氧攝取Srbc和Frbc的氧攝取結(jié)果被展示在圖4中。數(shù)據(jù)點(diǎn)與理論模擬(曲線)進(jìn)行比較。曲線是用理論的紅血球懸浮液模型產(chǎn)生的。對于新鮮細(xì)胞，P50被設(shè)定在15mmHg，對于儲存的細(xì)胞，P50被設(shè)定在26mmHg。儲存的細(xì)胞(圓形)的氧攝取比新鮮細(xì)胞(三角形)快。相同的趨勢可以在數(shù)據(jù)的數(shù)學(xué)模擬中看到。對于新鮮紅血球，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與理論曲線一致，但是對于儲存的紅血球，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)展現(xiàn)在短駐留時(shí)間下比預(yù)測的高得多的氧攝取率。這種“猝發(fā)”效應(yīng)通常與血紅蛋白溶液相關(guān)。
“猝發(fā)”效應(yīng)在圖5中能看到。用Srbc/HBOC混合物的劑量響應(yīng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是在用于氧攝取的圖5中予以概要描述的。提出四個數(shù)據(jù)系列，包括Srbc、Srbc/HBOC1-1、Srbc/HBOC9-1和Frbc。Frbc的數(shù)據(jù)系列是為了進(jìn)行比較而展示的。Srbc和Srbc/HBOC混合物的氧攝取比Frbc樣品的快。純紅血球樣品飽和得比包含HBOC的樣品更完全。這部份地歸因于HBOC被減少的氧親和力(在室內(nèi)空氣中不完全飽和)。包含HBOC的樣品也比單獨(dú)的紅血球慢得多地接近平衡飽和值。這種行為先前已討論過Page等人(1998)，見上文。用于rbc/HBOC1-1和rbc/HBOC9-1的平衡值分別是92％和98％。用1.3秒的保留時(shí)間，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)系列沒有達(dá)到這些飽和水平。
討論如同在本文中論證的那樣，血紅蛋白溶液在添加到儲存的紅血球中的時(shí)候即使儲存的紅血球的血紅蛋白有高的氧親和力也將恢復(fù)氧輸送。如同前面展示的那樣，按九份重量的血紅蛋白來自儲存的紅血球?qū)σ环葜亓康难t蛋白來自血紅蛋白溶液的比例把血紅蛋白溶液添加到儲存的紅血球中將導(dǎo)致增大的氧釋放超過儲存的紅血球獨(dú)自的氧釋放。氧釋放被這樣恢復(fù)，以致與新分離的血液釋放的氧(圖2和圖3)相比較至少有一樣多的氧被儲存的紅血球/血紅蛋白溶液的混合物釋放。按一份重量的血紅蛋白來自儲存的紅血球?qū)σ环葜亓康难t蛋白來自HBOC的比例把HBOC添加到儲存的紅血球中將在氧釋放方面導(dǎo)致與9∶1的混合物相當(dāng)?shù)牟⑶遗c新鮮紅血球(圖2和3)相當(dāng)?shù)拇蠓仍黾?。這種恢復(fù)顯然是在儲存的血球中的2，3-DPG水平?jīng)]有恢復(fù)的情況下發(fā)生的。
儲存的紅血球樣品和儲存的紅血球/HBOC9-1混合物的氧釋放比用數(shù)學(xué)模型預(yù)測的高(圖3)。紅血球懸浮液對存在甚至更小量的高親和力的胞外血紅蛋白非常敏感。在實(shí)驗(yàn)期間任何溶血現(xiàn)象都造成增加細(xì)胞外的高親和力的血紅蛋白和相伴地增加氧釋放。紅血球和儲存的紅血球/HBOC9-1混合物對這種現(xiàn)象特別敏感，而儲存的紅血球/HBOC1-1混合物對小幅度增加胞外的血紅蛋白濃度較不敏感。
與在使用儲存的紅血球的實(shí)驗(yàn)期間對回收容器中的游離血紅蛋白的觀察結(jié)合，模型模擬和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的差異表明由于溶血作用細(xì)胞外的血紅蛋白水平有所增加。雖然由于溶血現(xiàn)象游離的血紅蛋白出現(xiàn)在儲存的臨床單位中，但是在臨床背景中，游離的血紅蛋白將被身體快速地除去。為此，在實(shí)驗(yàn)測試之前通過細(xì)胞洗滌將溶血水平降低。一些溶血現(xiàn)象仍然在實(shí)驗(yàn)期間發(fā)生，如同被游離的血紅蛋白出現(xiàn)在回收容器中證實(shí)的那樣。
等同物本發(fā)明的方法的特征和其它細(xì)節(jié)現(xiàn)在將被更具體地描述并且將在權(quán)利要求書中指出。人們將理解本發(fā)明的特定的實(shí)施方案是作為例證而不是作為本發(fā)明的限制被展示的。本發(fā)明的原則特征可以在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下被用在各種不同的實(shí)施方案中。除非另有說明，所有的份數(shù)和百分比都按重量計(jì)。
權(quán)利要求
1.一種治療病人的方法，其中包括給病人使用儲存的紅血球和血紅蛋白溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中血紅蛋白溶液是在儲存的紅血球給藥之前給藥的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中儲存的紅血球是在血紅蛋白溶液給藥的大約36小時(shí)之內(nèi)給藥的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中儲存的紅血球是在血紅蛋白溶液給藥的大約24小時(shí)之內(nèi)給藥的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中儲存的紅血球是在血紅蛋白溶液給藥的大約8小時(shí)之內(nèi)給藥的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中儲存的紅血球是與血紅蛋白溶液同時(shí)給藥的或者是在血紅蛋白溶液給藥之前給藥的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中血紅蛋白溶液是在儲存的紅血球給藥的大約8小時(shí)之內(nèi)給藥的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中血紅蛋白溶液中的血紅蛋白與儲存的紅血球中的血紅蛋白的比例按重量計(jì)介于大約1∶9和大約1∶1之間。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中儲存的紅血球已被儲存大約48小時(shí)以上。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中儲存的紅血球已被儲存大約7天以上。
11.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中儲存的紅血球已被儲存大約35天以上。
12.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中儲存的紅血球已被儲存大約42天以上。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中儲存的紅血球中的血紅蛋白具有小于大約15mmHg的P50。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中儲存的紅血球中的血紅蛋白具有小于大約20mmHg的P50。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中儲存的紅血球中的血紅蛋白具有小于大約25mmHg的P50。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中血紅蛋白溶液中的血紅蛋白是聚合的。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中血紅蛋白是與戊二醛聚合的。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中聚合的血紅蛋白溶液具有(a)按重量計(jì)含量不足大約百分之十五的高鐵血紅蛋白；(b)濃度不足大約每毫升0.5內(nèi)毒素單位的內(nèi)毒素；(c)按重量計(jì)少于或等于百分之十五的聚合血紅蛋白，其分子量大于大約500,000個道爾頓；和(d)按重量計(jì)少于或等于大約的百分之十的聚合血紅蛋白，其分子量少于或等于大約65,000道爾頓。
19.一種給病人進(jìn)行治療的方法，其中包括下述步驟(a)給病人使用血紅蛋白溶液；并且在其后(b)給病人使用儲存的紅血球，其中血紅蛋白溶液包含聚合的血紅蛋白，而儲存的紅血球已被儲存...以上。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中儲存的紅血球已被儲存至少大約48個小時(shí)。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中血紅蛋白溶液中的血紅蛋白具有至少大約25mmHg的P50。
22.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中血紅蛋白溶液中的血紅蛋白已與戊二醛聚合。
23.一種給病人進(jìn)行治療的方法，其中包括下述步驟(a)給病人使用儲存的紅血球；并且在其后(b)給病人使用血紅蛋白溶液，其中血紅蛋白溶液包含聚合的血紅蛋白。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中血紅蛋白溶液是在儲存的紅血球給藥的大約8小時(shí)之內(nèi)給病人使用的。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中儲存的紅血球已被儲存至少大約48小時(shí)。
26.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中血紅蛋白具有至少大約25mmHg的P50。
27.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中血紅蛋白已與戊二醛聚合。
28.一種包含血紅蛋白溶液和儲存紅血球的組合物，其中血紅蛋白溶液包含聚合的血紅蛋白，而儲存的紅血球已被儲存大約48小時(shí)以上。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的組合物，其中血紅蛋白已與戊二醛聚合。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的組合物，其中儲存的紅血球已被儲存大約7天以上。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的組合物，其中儲存的紅血球已被儲存大約35天以上。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的組合物，其中儲存的紅血球已被儲存大約42天以上。
全文摘要
給病人進(jìn)行治療的方法包括給病人使用儲存的紅血球和血紅蛋白溶液。儲存的紅血球和血紅蛋白溶液可以同時(shí)給病人使用。作為替代，可以在給病人使用儲存的紅血球之前使用血紅蛋白溶液，或者可以在給病人使用血紅蛋白溶液之前使用儲存的紅血球。這項(xiàng)發(fā)明的組合物包括儲存的紅血球和血紅蛋白溶液。
文檔編號A61K35/18GK1553817SQ02817734
公開日2004年12月8日 申請日期2002年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月10日
發(fā)明者托馬斯·C·佩奇, 威廉·R·賴特, 小愛德華·E·雅各布斯, R 賴特, 華 E 雅各布斯, 托馬斯 C 佩奇 申請人:柏爾純公司