專利名稱：骨代謝改善劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種骨代謝改善劑，尤其涉及一種含有發(fā)酵豆?jié){的骨代謝改善劑，其對治療和預防與骨代謝減少相關的疾病如骨質疏松癥有效。
背景技術：
婦女非常容易患與骨代謝失衡相關的疾病，如骨質疏松癥，尤其是在絕經(jīng)期后，當雌性激素減少時更容易患上述疾病。由于患骨質疏松癥的人骨質密度低，所以他們非常容易骨折。特別是老年人，會因為骨折而臥床不起。避免這些問題已經(jīng)成為迫切需要。
對骨質密度有下降趨勢的人來說，由于通過改善骨代謝來提高骨質密度是令人滿意的，已有一些以改善骨代謝為目的的技術報道。例如，豆?jié){有提高鈣吸收的效果和豆?jié){中有提高鈣吸收的物質已經(jīng)在日本專利申請?zhí)亻_平6-46797和特開平7-75525等中有報道。然而，還沒有達到一個滿意的效果。
也有報道，異黃酮和一種含有異黃酮及鋅或肽的組合物，可增加骨代謝(日本專利申請?zhí)亻_平10-114653和特開2000-139411)。然而，獲得這些成分需要一個復雜的過程。雖然異黃酮或這種組合物可以作為藥物使用，但很難說異黃酮或這種組合物適合于長期持續(xù)施用以改善骨代謝。
目前，還沒有提供一種能夠改善骨代謝，并滿足有效、經(jīng)濟且易于消化這些所有優(yōu)點的方法。本發(fā)明的一個目的就是提供一種這樣的方法。

發(fā)明內容
作為為達到上述目的而進行廣泛實驗的結果，本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)，如果已被認為有改善鈣吸收效果的豆?jié){被發(fā)酵后，骨代謝改善的效果將快速增加。這一發(fā)現(xiàn)導致本發(fā)明的完成。
具體地說，本發(fā)明提供一種骨代謝改善劑，該改善劑含有發(fā)酵豆?jié){作為活性成分，所述發(fā)酵豆?jié){通過用一種乳酸菌或一種雙歧桿菌使豆?jié){發(fā)酵而獲得。
本發(fā)明進一步提供一種用于改善人和動物骨代謝的方法，其包括施用一種含有針對人和動物的骨代謝改善劑的吸收劑，所述骨代謝改善劑含有作為活性成分的發(fā)酵豆?jié){，所述發(fā)酵豆?jié){可通過用一種乳酸菌或一種雙歧桿菌使豆?jié){發(fā)酵而獲得。


圖1顯示尿液中排泄的脫氧吡啶啉的測量結果。
圖2顯示脛骨骨質密度的測量結果。
圖3顯示股骨骨質密度的測量結果。
圖4顯示脛骨礦物質含量的測量結果。
圖5顯示股骨礦物質含量的測量結果。
圖6顯示脛骨骨質密度的測量結果。
圖7顯示股骨鈣含量的測量結果。
具體實施例方式
本發(fā)明的骨代謝改善劑調節(jié)骨吸收，因此，可增加骨質密度和骨中礦物質含量。本發(fā)明的骨代謝改善劑中作為活性成分使用的發(fā)酵豆?jié){是通過在豆?jié){中轉接入微生物如一種乳酸菌和一種雙歧桿菌使豆?jié){發(fā)酵來制備的。只要大豆成分懸浮或溶解在液體中，作為發(fā)酵豆?jié){原材料的豆?jié){可以通過任何方法獲得。例如，將完整的大豆或脫脂大豆浸泡在水或水合物中，研磨成漿狀，然后過濾以除去不溶的成分，這樣可獲得溶解或懸浮在水中的大豆蛋白質。
發(fā)酵豆?jié){用作本發(fā)明的骨代謝改善劑中的活性成分，其制備可使用的乳酸菌(lactic acid bacterium)和雙歧桿菌(bifidobacterium)的例子有乳酸桿菌屬(Lactobacillus bacteria)，如嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidphilus)、加氏乳桿菌(L.gasseri)、馬里乳桿菌(L.mali)、植物乳桿菌(L.plantarum)、戊糖乳桿菌(L.pentosus)、布氏乳桿菌(L.buchneri)、干酪乳桿菌(L.casei)、約氏乳桿菌(L.johnsonii)、雞乳桿菌(L.gallinarum)、食淀粉乳桿菌(L.amylovorus)、短乳桿菌(L.brevis)、鼠李糖乳酸菌(L.rhamnosus)、高加索酸奶乳桿菌(L.kefir)、類干酪乳桿菌(L.paracasei)、卷曲乳桿菌(L.crispatus)、保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)、發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)、路氏乳桿菌(L.reuteri)、消化乳桿菌(L.alimentarius)和麥芽香乳桿菌(L.maltaromicus)；鏈球菌屬(Streptococcus bacteria)，如嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)；乳球菌屬(Lactococcus bacteria)，如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)；明串珠菌屬(Leuconostoc bacteria)，如乳脂明串珠菌(Leuconostoc cremoris)；雙歧桿菌屬(Bifidobacterium bacteria)，如雙歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)、長雙歧桿菌(B.longum)、假長雙歧桿菌(B.pseudolongum)、球雙歧桿菌(B.globosum)、青春雙歧桿菌(B.adolescentis)、嬰兒雙歧桿菌(B.infantis)、短雙歧桿菌(B.breve)、鏈狀雙歧桿菌(B.catenulatum)、假鏈狀雙歧桿菌(B.pseudocatenulatum)、乳酸雙歧桿菌(B.lactis)、動物雙歧桿菌(B.animalis)、角形雙歧桿菌(B.angulatum)和高盧雙歧桿菌(B.gallicum)等等，并無限制。
其中，優(yōu)選單獨或兩個或多個組合使用干酪乳桿菌、馬里乳桿菌、短雙歧桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳酸菌、類干酪乳桿菌、卷曲乳桿菌、乳酸乳球菌、青春雙歧桿菌和假鏈狀雙歧桿菌，這是因為它們可增加骨代謝改善的效果和發(fā)酵豆?jié){好的口味。特別優(yōu)選干酪乳桿菌、馬里乳桿菌和短雙歧桿菌。這些細菌中具體的例子有干酪乳桿菌YIT9029菌株(FERM BP-1366)、YIT0078菌株(ATCC393)和YIT0123菌株(ATCC27216)，馬里乳桿菌YIT0243菌株(ATCC27304)，短雙歧桿菌YIT4065菌株(FERM BP-6223)、YIT4014菌株(ATCC15700)和YIT4063菌株(FERM BP-2823)，植物乳桿菌YIT0103菌株(ATCC10241)，鼠李糖乳酸菌YIT105菌株(ATCC7469)，類干酪乳桿菌YIT0209菌株(ATCC25302)，卷曲乳桿菌YIT0212菌株(ATCC33820)，乳酸乳球菌YIT2027菌株(FERM P-16074)，青春雙歧桿菌YIT4011菌株(ATCC15703)，假鏈狀雙歧桿菌YIT4072菌株(ATCC27919)等等。
另外，其他微生物可以與上述的乳酸菌和雙歧桿菌組合，用來生產本發(fā)明的發(fā)酵豆?jié){。例如，芽孢桿菌屬(Bacillus bacteria)，如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)；醋酸桿菌屬(Acetobacter bacteria)，如醋化醋桿菌(Acetobacter aceti)和膠醋桿菌(Acetobacter xylinum)；酵母屬(Saccharomyces)、有孢圓酵母屬(Torulaspora)和假絲酵母屬(Candida)的酵母菌，如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、單室孢子酵母(Saccharomyces unisporus)、馬克思克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)、德氏有孢圓酵母(Torulaspora delbrueckii)和乳酒假絲酵母(Candida kefyr)。
在本發(fā)明中使用的發(fā)酵豆?jié){可用傳統(tǒng)方法生產。例如，用巴斯德殺菌法處理豆?jié){之后，將上述乳酸菌和雙歧桿菌接種其中，培養(yǎng)，然后攪勻，可獲得發(fā)酵豆?jié){。使豆?jié){發(fā)酵的培養(yǎng)條件可適當選擇。例如，如果所用細菌是厭氧性的，培養(yǎng)基中的氧氣可以用一種惰性氣體替代，如二氧化碳氣體或氮氣，或者在培養(yǎng)細菌之前用一種氧反應劑除去培養(yǎng)基中的氧氣以提供厭氧條件。如果所用細菌是好氧性的，可以選擇有氧條件培養(yǎng)細菌。
其他條件應根據(jù)所使用的微生物的類型適當設置。例如，當使用乳酸菌或雙歧桿菌時，可在25℃-37℃培養(yǎng)15-48小時，為了確保發(fā)酵豆?jié){改善骨代謝的效果，優(yōu)選使用固體濃度1-20％的豆?jié){。
各種不同的糖類、營養(yǎng)素和成分，可按0.01-99重量％的比例加到用作原材料的豆?jié){中。舉例來說，碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、果糖-葡萄糖糖漿和葡萄糖-果糖糖漿；營養(yǎng)素，如肉膏、酵母提取物、肽和礦物質；植物成分，如谷粒、谷粒幼芽、蔬菜、水果、堅果和草藥；動物成分以及微生物培養(yǎng)成分。
制備本發(fā)明的骨代謝改善劑需提供如上獲得的適當形式和適當狀態(tài)的發(fā)酵豆?jié){，適當形式如藥物或食物，適當狀態(tài)如液體、膏劑或固體。發(fā)酵豆?jié){可按原狀使用，或濃縮到一定程度，或凍干以形成固體粉末。為使本發(fā)明的骨代謝改善劑達到預想的效果，每人每天按10-1000克的劑量攝入含6％大豆固體成分的發(fā)酵豆?jié){，優(yōu)選每人每天攝入100-300克。
當使用本發(fā)明的骨代謝改善劑作為一種改善人和動物骨代謝的方法時，上述劑量被施用于人和動物。
當以食物形式使用骨代謝改善劑時，可加入和混合各種添加劑，例如改善口味，和提供一種需要的形態(tài)。另外，也可以加入香料。
加入到本發(fā)明的骨代謝改善劑并與之混合的添加劑包含各種碳水化合物、乳化劑、增稠劑、甜味劑、增酸劑、果汁等等。這些添加劑中具體的例子有糖類，如葡萄糖、蔗糖、果糖、塔格糖、海藻糖、trehalulose、乳果糖、寡聚木醣、寡聚異麥芽糖、乳糖、寡聚半乳糖、寡聚果糖、棉子糖、水蘇糖、葡萄糖胺、菊糖、蜂蜜、楓糖漿和日式糙米糖漿(amazake)；糖醇，如山梨醇、木糖醇、赤蘚醇、乳糖醇和異麥芽糖醇；高甜度甜味劑，如三氯蔗糖(sucralose)和阿斯巴甜糖；天然甜味劑，如甘草、甜菊糖和甘草酸糖苷；乳化劑，如蔗糖脂肪酸酯、甘油糖脂肪酸酯和卵磷脂；增稠劑(穩(wěn)定劑)，如瓊脂、明膠、卡拉膠、瓜耳膠、黃原膠、果膠和刺槐豆膠。另外，礦物質，如鈣、鎂、鋅、鐵和白云石；酸類，如檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、醋酸和氨基酸；填充材料，如膠原蛋白、硫酸軟骨素、羥脯氨酸、黃酮、黃酮醇、異黃酮、花色素、兒茶酸和原花青素；維生素，如維生素A、維生素B類、維生素C、維生素E、維生素D類、維生素K類、β-胡蘿卜素、視黃酸和葉酸；植物草藥提取物，如黑升麻、大豆、胡桃仁、石榴子、金絲桃、西番蓮、纈草、米葛、迷迭香、薄荷、蜜蜂花和金盞花；谷粒及谷粒幼芽，如水稻、小麥、大麥、黑麥、燕麥和玉米；蔬菜，如馬鈴薯、甘薯、紫甘薯、山藥、南瓜、茄子、番茄、苦瓜、青椒、芝麻籽、卷心菜、花莖甘藍、花椰菜、萵苣、紅豆、蠶豆、大豆、毛豆、青豌豆、生姜、牛蒡、芹菜、蘿卜、日本山葵、鱷梨、胡蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、百合、蔥、紫蘇、韭菜、歐防風、蕨菜、竹筍、香菇和蘑菇；水果，如檸檬、蘋果、葡萄、草莓、桔子、柿子、番石榴、香蕉、藍莓、鳳梨番石榴(pineapple guava)、樹番茄、山楂果(acerola)、酸橙、柚子、甜瓜、桃、芒果、香橙(yuzu orange)、番木瓜、鳳梨、梨、李子、葡萄柚、木瓜、杏、西瓜、石榴、獼猴桃和橘子；堅果，如花生、杏仁、椰子、腰果、澳洲堅果、可可豆、栗子、白果和核桃；乳制品，如牛奶、脫脂牛奶、乳清、奶油、發(fā)酵牛奶和酸奶酪?？梢蕴砑舆@些物質以獲得可口的味道。
另外，作為一種香料而被添加到本發(fā)明的骨代謝改善劑的可以有酸奶酪、漿果、桔子、木瓜、紫蘇、柑橘、蘋果、薄荷、葡萄、梨、乳蛋糕乳脂、桃、甜瓜、香蕉、熱帶植物、香草、茶、咖啡等等。這些香料可單獨使用，也可兩種或多種組合使用。
保存采用本方法獲得的本發(fā)明的骨代謝改善劑的容器，可以用具有低或高氧氣滲透率的密閉容器。另外，這些密閉容器里的氣體可以用惰性氣體替代。
實施例采用實施例進一步詳細描述本發(fā)明，這些實施例不應解釋為限定本發(fā)明。
實施例1豆?jié){飼料和發(fā)酵豆?jié){飼料的生產(1)(1)豆?jié){粉末和發(fā)酵豆?jié){粉末的生產將20升基本豆?jié){(由Shikoku Kakoki有限公司生產，含有0.8％葡萄糖-果糖糖漿)置于平板滅菌器中，135℃滅菌3.5秒。取此無菌豆?jié){10升4℃保存。在剩余10升中轉接入含0.01％干酪乳桿菌YIT 9029菌株和1％馬里乳桿菌YIT 0243菌株的細菌溶液，然后30℃培養(yǎng)24小時，得到發(fā)酵豆?jié){。將保存的豆?jié){和發(fā)酵的豆?jié){分別凍干、研磨，得到豆?jié){和發(fā)酵豆?jié){的粉末。
(2)飼料制備下列實驗使用的飼料依表1中的組分制備。使用AIN-93G組合物作為對照飼料，該組合物被部分改變，成為鈣含量為0.1％的低鈣飼料。分別混合入4％的豆?jié){粉末和發(fā)酵豆?jié){粉末以形成豆?jié){飼料和發(fā)酵豆?jié){飼料。對豆?jié){和發(fā)酵豆?jié){粉末的礦物質含量進行分析，制成三類具有相同鈣磷鎂含量的飼料。表1

數(shù)值代表重量％實施例2骨代謝改善能力試驗(1)購得36只八周齡的SD-型大鼠(雌性)，對27只大鼠實施卵巢切除術除去雙側卵巢，其余9只實施安慰劑手術。在兩周的恢復階段使用對照飼料喂養(yǎng)，之后將去卵巢大鼠分為三組(n＝9)去卵巢-對照飼料組(以下稱為對照組)；去卵巢-豆?jié){飼料組(以下稱為豆?jié){組)；去卵巢-發(fā)酵豆?jié){飼料組(以下稱為發(fā)酵豆?jié){組)。實施安慰劑手術的大鼠命名為安慰劑手術組。
8周中，安慰劑手術組和對照飼料組用對照飼料喂養(yǎng)，豆?jié){組用豆?jié){飼料喂養(yǎng)，發(fā)酵豆?jié){組用發(fā)酵豆?jié){飼料喂養(yǎng)。動物用對飼法飼養(yǎng)，所以每組飼料攝入量基本相同，并允許其隨意攝取離子交換水。在第8周，用代謝籠收集24小時尿液。測量體積之后，尿液存于-20℃待用。為觀察角質化細胞的存在，在解剖前一周連續(xù)6天提取陰道黏膜上皮細胞，由此確證安慰劑手術組具有性興奮，其他組不具有性興奮。
在戊巴比妥麻醉下，腹主動脈放血處死大鼠，解剖后取出子宮，股骨和脛骨。脛骨和股骨置于100℃，24小時干燥后，通過測量骨的質量和體積計算其骨質密度。然后，脛骨和股骨置于550℃，24小時灰化，稱質量。此質量與體積的比值表示骨中的礦物質含量。作為統(tǒng)計學過程，在方差分析后用Tukey法進行多重比較(如圖所示，帶有不同字母的各組間有明顯差異(P＜0.05))。
(結果)圖1顯示尿液中排泄的脫氧吡啶啉的測量結果，它反映骨吸收的程度。圖2和圖3分別顯示脛骨和股骨骨質密度的測量結果。圖4圖5分別顯示骨中礦物質含量的測量結果。使用臨床檢查試劑盒(Pyrilinks-D，由Mettler-Toledo International公司生產)測量脫氧吡啶啉含量，在此之前用肌酸酐B檢測儀(由Wako Pure化學工業(yè)有限公司生產)測量并標明每單位數(shù)量肌酸酐的濃度。脫氧吡啶啉是用于交聯(lián)膠原蛋白的物質，主要存在于骨中。這種物質被認為是極好的骨吸收指示劑，因為它可響應骨吸收而被釋放出來，不被代謝而被排泄到尿中，不被消化道吸收，而且不受飲食影響。據(jù)報道，脫氧吡啶啉和骨減少率有明顯的負相關性(Fledelius C.等，Calcif.Tissue Int.54，381-384，1994)。
從這些結果可明顯看到，發(fā)酵豆?jié){組與對照組和豆?jié){組相比，尿液中具有明顯的低濃度的骨代謝指示劑脫氧吡啶啉，這一濃度與安慰劑手術組的濃度接近。同樣，發(fā)酵豆?jié){組的骨質密度和骨中礦物質含量的減少量比對照組和豆?jié){組的要少，脛骨骨質密度和股骨礦物質含量明顯高于對照組。另一方面，雖然由于卵巢被切除，子宮質量降低到11％，但在對照組、豆?jié){組和發(fā)酵豆?jié){組之間子宮質量沒有明顯差異。
實施例3發(fā)酵豆?jié){飼料的制備(2)(1)豆?jié){粉末和發(fā)酵豆?jié){粉末的制備170升基本豆?jié){(由Shikoku Kakoki有限公司生產)，100℃蒸氣滅菌90分鐘。取此無菌豆?jié){80升4℃保存。在剩余90升中轉接入含1％短雙歧桿菌YIT 4065菌株的細菌溶液，然后34℃培養(yǎng)15小時，得到發(fā)酵豆?jié){。保存的豆?jié){和發(fā)酵的豆?jié){凍干、研磨，得到豆?jié){和發(fā)酵豆?jié){的粉末。
(2).飼料制備使用AIN-76組合物作為對照飼料，該組合物已被部分改變，成為蛋白含量為25％和脂肪含量為17％的預備飼料。制備豆?jié){飼料和發(fā)酵豆?jié){飼料，其分別含有30％的豆?jié){粉末和30％的發(fā)酵豆?jié){粉末，(這兩種粉末均含有48％的粗蛋白和24.3％的粗脂肪)，并添加了酪蛋白、玉米油、碳酸鈣、磷酸二氫鉀、氧化鎂和蔗糖，使粗蛋白、粗脂肪、鈣、磷和鎂的含量與對照飼料中的相同。
實施例4骨代謝改善能力試驗(2)24只8周齡的經(jīng)產Wistar大鼠(雌性)，切除其卵巢并確證沒有性興奮，被分為三組(n＝8)對照組、豆?jié){組和發(fā)酵豆?jié){組。同樣，對八只確證有性興奮的同類大鼠實施安慰劑手術，形成安慰劑手術組。
安慰劑手術組和對照組用對照飼料喂養(yǎng)，豆?jié){組用豆?jié){飼料喂養(yǎng)，發(fā)酵豆?jié){組用發(fā)酵豆?jié){飼料喂養(yǎng)，共喂養(yǎng)12周。允許大鼠隨意攝取離子交換水。停止喂養(yǎng)四小時后，在戊巴比妥麻醉下，腹主動脈放血處死大鼠，然后解剖。取出子宮、股骨和脛骨。脛骨骨質密度測量方法與實施例2中一致。為測量股骨的鈣含量，股骨被凍干后在550℃灰化五小時。向灰分加入硝酸和高氯酸獲得濕灰，用連續(xù)式等離子光譜儀ICP-S2000(由Shimadzu公司生產)分析。
(結果)圖6顯示脛骨骨質密度的測量結果，圖7顯示股骨鈣含量的測量結果。發(fā)酵豆?jié){組每單位股骨干重中的鈣含量和每單位體積股骨中的鈣含量明顯高于對照組。豆?jié){組的鈣含量與對照組相同。同樣，發(fā)酵豆?jié){組每單位體積脛骨中的骨質密度和鈣含量明顯高于對照組。豆?jié){組顯示與對照組同樣的量。另外，切除卵巢的三個組的子宮質量沒有差異，初始體重、終體重和飼料攝入量沒有明顯差異。
從上述結果可明顯看到，與未發(fā)酵豆?jié){相比，發(fā)酵豆?jié){對于避免因卵巢切除而引起的骨質密度的下降有效。這表明未發(fā)酵豆?jié){不能改善骨代謝，而用短雙歧桿菌YIT4065菌株制成的發(fā)酵豆?jié){可有效地改善骨代謝。
工業(yè)適用范圍上述試驗顯示，發(fā)酵豆?jié){作為一種骨代謝改善劑，對處于絕經(jīng)期后，合成和分泌雌性激素能力下降的婦女是有益的。發(fā)酵豆?jié){作為一種食物，也有利于避免因雌性激素失調而引起的發(fā)生在絕經(jīng)期前的骨代謝損害。另外，從上述試驗明顯看到發(fā)酵豆?jié){與豆?jié){相比，對骨代謝有更突出的效果。
因此，本發(fā)明的骨代謝改善劑對于治療和預防與骨代謝減少相關的疾病如骨質疏松癥，是十分有效的。
權利要求
1.一種骨代謝改善劑，該改善劑含有發(fā)酵豆?jié){作為活性成分，所述發(fā)酵豆?jié){通過用一種乳酸菌或一種雙歧桿菌使豆?jié){發(fā)酵而獲得。
2.如權利要求1中的骨代謝改善劑，其中乳酸菌是干酪乳桿菌或馬里乳桿菌。
3.如權利要求1中的骨代謝改善劑，其中雙歧桿菌是短雙歧桿菌。
4.如權利要求1中的骨代謝改善劑，其中所述菌是干酪乳桿菌YIT9029菌株、馬里乳桿菌YIT0243菌株或短雙歧桿菌YIT4065菌株。
5.一種用于改善人和動物骨代謝的方法，其包括施用一種骨代謝改善劑，所述骨代謝改善劑含有對于人和動物來說作為活性成分的發(fā)酵豆?jié){，所述發(fā)酵豆?jié){用一種乳酸菌或一種雙歧桿菌使豆?jié){發(fā)酵而獲得。
全文摘要
一種骨代謝改善劑，其特征是含有發(fā)酵豆?jié){作為活性成分，該發(fā)酵豆?jié){通過用一種乳酸菌或一種雙歧桿菌使豆?jié){發(fā)酵而獲得。所述骨代謝改善劑對于治療和預防與骨代謝降低相關的疾病如骨質疏松癥有效，同時滿足對成本和平穩(wěn)攝入的要求。
文檔編號A61K36/48GK1469750SQ01817206
公開日2004年1月21日 申請日期2001年9月28日 優(yōu)先權日2000年10月13日
發(fā)明者松原智史, 早川弘子, 島川康久, 狩野光芳, 曾根春惠, 石川文保, 久, 保, 子, 惠, 芳 申請人:株式會社養(yǎng)樂多本社