專利名稱：產(chǎn)蛋白酶的菌株、制備蛋白酶液的方法及使用該酶液于改善低次等煙葉品質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株產(chǎn)蛋白酶的細(xì)菌菌株、制備蛋白酶液方法及使用其蛋白酶液改善低次等煙葉品質(zhì)，具體地說是利用來自煙葉上的優(yōu)勢菌株發(fā)酵蛋白酶液改善低次等煙葉品質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
我國是烤煙生產(chǎn)和消費大國，烤煙生產(chǎn)在煙草的發(fā)展中占據(jù)重要地位。目前我國煙葉質(zhì)量與生產(chǎn)水平同國際先進(jìn)水平相比，仍然有較大差距，還遠(yuǎn)不能滿足提高國內(nèi)卷煙質(zhì)量和擴大出口的需要。提高煙葉品質(zhì)和可用性直接關(guān)系到我國煙草行業(yè)持續(xù)、穩(wěn)定、健康發(fā)展，也是增強我國煙葉國際市場競爭力的必由之路。由于煙的品種、種植和烘烤等原因，我國烤煙蛋白質(zhì)、淀粉等大分子物質(zhì)含量往往 偏高。蛋白質(zhì)含量與煙葉品質(zhì)優(yōu)劣存在緊密相關(guān)性，蛋白質(zhì)含量過高，不僅會降低煙制品的燃燒性，而且有似燒焦羽毛的臭味，同時伴有辛辣、苦澀的感覺。此外會使煙氣中有害成分如HCN等含量增加，嚴(yán)重影響煙葉的香味品質(zhì)和吸食安全性。另一方面煙葉蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化生成有利于煙葉品質(zhì)的致香物質(zhì)。因此，降低煙葉中蛋白質(zhì)含量對改善煙葉品質(zhì)、提高煙葉可用性和吸食安全性極為重要。在蛋白酶催化作用下煙葉上的蛋白質(zhì)可以被水解為氨基酸等小分子物質(zhì)，不但降解了蛋白質(zhì)，且水解產(chǎn)物和進(jìn)一步轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物又可以產(chǎn)生煙草致香物質(zhì)。蛋白酶來源即可購買商品酶也利用微生物發(fā)酵制備，但商品酶價格較高，這無形中增加了卷煙成本，而利用細(xì)菌發(fā)酵蛋白酶液操作方便且工藝簡單。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株產(chǎn)蛋白酶的細(xì)菌菌株及利用細(xì)菌發(fā)酵蛋白酶液，使用經(jīng)過濾除菌及超濾濃縮液作為改善低次等煙葉品質(zhì)的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一株短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) 0855-9菌株,菌株保藏號是(CGMCC No. 5310)，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期2011年9月29日，該菌株分離自醇化煙葉，產(chǎn)蛋白酶能力較強。該0855-9菌株篩選培養(yǎng)基采用酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基酪蛋白10g，牛肉膏3g，Na2HP042g，NaCl 5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，0. 4%溴麝香草酚藍(lán)溶液12. 5mL,pH7. 4，觀察水解圈產(chǎn)生情況，復(fù)篩采用福林-酚法測定蛋白酶的酶活。細(xì)菌發(fā)酵制備蛋白酶液具體步驟為①芽孢桿菌的活化和培養(yǎng)該芽孢桿菌的菌株保藏號是(CGMCC No. 5310)，經(jīng)LB培養(yǎng)基活化后接入滅菌的種子培養(yǎng)基，于37°C、150rpm恒溫?fù)u床培養(yǎng)12h，按I : 100的比例轉(zhuǎn)接于IL搖瓶中發(fā)酵60h制得發(fā)酵蛋白酶液；
②發(fā)酵蛋白酶液的加工發(fā)酵好的蛋白酶液經(jīng)O. 22 μ m中空纖維管過濾除菌，再經(jīng)10000MWC0超濾濃縮制得粗酶液；以上所述的種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基均是LB培養(yǎng)基，其主要組分為NaCl IOg,酵母粉5g，胰蛋白胨10g，加蒸餾水至1000ml，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，121°C高壓滅菌 20min。酶活性測定細(xì)菌發(fā)酵蛋白酶液采用福林-酚法測定酶活性，其活力單位定義(U):在37°C每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生I μ g酪氨酸，定義為I個酶活力單位。使用制備的蛋白酶液作為改善低次等煙葉步驟是將上部煙葉回潮后抽去煙梗，切絲，稱取一定量的煙絲，分為兩份；其中一份煙絲在室溫下(24°C左右)按2%的比例均勻地噴施值得的粗酶液和蒸餾水，置于自封袋中在室溫下使酶作用12h ;然后于90°C條件下烘干30mins使酶失活，置于22°C、相對濕度55%的恒溫恒濕箱平衡煙絲水分24h ;以此煙絲為單一原料卷煙后進(jìn)行評吸鑒定，另一份煙絲作 為該組比對參照物使用。本發(fā)明菌株發(fā)酵的蛋白酶液可以改善煙葉香氣質(zhì)，雜氣減輕，質(zhì)感、口感較好，煙葉品質(zhì)明顯改善。煙草科技工作者研究表明煙葉上微生物所產(chǎn)酶能促進(jìn)煙葉上大分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，有利于提高煙葉品質(zhì)，所以利用分離自煙葉的產(chǎn)酶菌株發(fā)酵蛋白酶液改善低次等煙葉品質(zhì)有重要的研究價值，為利用細(xì)菌發(fā)酵酶液改善煙葉品質(zhì)、提高煙葉可用性提供了一種途徑。


圖I :蛋白酶酶活測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實施例方式本發(fā)明的發(fā)酵蛋白酶液來源產(chǎn)酶菌株是短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)0855-9菌株，菌株保藏號是(CGMCC No. 5310)。該菌株分離自醇化煙葉，產(chǎn)蛋白酶能力較強，能有效地改善煙葉品質(zhì)。I、細(xì)菌發(fā)酵蛋白酶液的制備①芽孢桿菌的活化和培養(yǎng)該芽孢桿菌的菌株保藏號是(CGMCC No. 5310)，經(jīng)LB培養(yǎng)基活化后接入滅菌的種子培養(yǎng)基，于37°C、150rpm恒溫?fù)u床培養(yǎng)12h，按I : 100的比例轉(zhuǎn)接于IL搖瓶中發(fā)酵60h制得發(fā)酵蛋白酶液。以上所述的種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基均是LB培養(yǎng)基，其主要組分為NaCl IOg,酵母粉5g，胰蛋白胨10g，加蒸餾水至1000ml，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，121°C高壓滅菌 20min。②發(fā)酵蛋白酶液的加工發(fā)酵好的蛋白酶液經(jīng)O. 22 μ m中空纖維管過濾除菌，再經(jīng)10000MWC0超濾濃縮制得粗酶液。2、酶活性測定細(xì)菌發(fā)酵蛋白酶液采用福林-酚法測定酶活性，其活力單位定義(U):在37°C每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生I μ g酪氨酸，定義為I個酶活力單位。3、改善低次等煙葉品質(zhì)的方法
將上部煙葉回潮后抽去煙梗，切絲，稱取一定量的煙絲，分為兩份。在室溫下(24°C左右)按2%的比例均勻地噴施值得的粗酶液和蒸餾水，置于自封袋中在室溫下使酶作用12h ;然后于90°C條件下烘干30mins使酶失活，置于22°C、相對濕度55%的恒溫恒濕箱平衡煙絲水分24h ;以此煙絲為單一原料卷煙后進(jìn)行評吸鑒定。實施例I :產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選及鑒定短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus) 0855-9 菌株，菌株保藏號是(CGMCC No. 5310)，分離自優(yōu)質(zhì)品種紅大自然醇化煙葉上。菌株篩選培養(yǎng)基采用酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(酪蛋白IOg,牛肉膏3g, Na2HPO4 2g, NaCl 5g,瓊脂15g,蒸懼水1000mL,0. 4%溴磨香草酹藍(lán)溶液12. 5mL, pH7. 4)，觀察水解圈產(chǎn)生情況，復(fù)篩采用福林-酚法測定蛋白酶的酶活。利用16S rRNA基因的一對通用引物進(jìn)行PCR擴增，連接載體轉(zhuǎn)化并進(jìn)行測序，結(jié)果提交NCBI，通過BLAST進(jìn)行序列同源性檢索分析，然后用CLUSTAL X軟件進(jìn)行多序列比對并計算供試菌株與參比菌株之間的序列相似性，采用鄰位相接法，應(yīng)用M EGA4軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。對該菌株進(jìn)行測序分析，將其初步鑒定為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus) 0855-9 菌株，菌株保藏號是(CGMCC No. 5310)。實施例2 :蛋白酶粗酶液的制備發(fā)酵蛋白酶來源為菌株保藏號為(CGMCC No. 5310)短小芽孢桿菌(Bacilluspumi lus) 0855-9菌株，經(jīng)LB培養(yǎng)基活化后接入滅菌的種子培養(yǎng)基，于37 °C 150rpm恒溫?fù)u床培養(yǎng)12h，按I : 100的比例轉(zhuǎn)接于IL搖瓶中發(fā)酵60h制得發(fā)酵蛋白酶液。以上所述的種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基均是LB培養(yǎng)基，其主要組分為NaCl 10g，酵母粉5g，胰蛋白胨10g，加蒸餾水至1000ml，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，121 °C高壓滅菌20min。發(fā)酵好的蛋白酶液經(jīng)O. 22 μ m中空纖維管過濾除菌，再經(jīng)10000MWC0超濾濃縮制得粗酶液。細(xì)菌發(fā)酵蛋白酶液采用福林-酚法測定酶活性，其活力單位定義(U):在37°C每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生Iyg酪氨酸，定義為I個酶活力單位。首先制備酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖I)，然后將含有蛋白酶的發(fā)酵液用pH7. 2,50mmol/L的磷酸鹽緩沖液經(jīng)適當(dāng)?shù)南♂尯?，取稀釋的酶液IOOul在37°C下保溫2min，加入2%干酪素lOOul，37 °C下保溫IOmin后，加入O. 4mol/L的三氯乙酸終止反應(yīng),繼續(xù)保溫15min使殘余蛋白沉淀完全，13000rpm離心Imin,取上清液lOOul，然后加入0. 4mol/L的碳酸鈉500ul，福林酚試劑IOOul混勻后，于37°C發(fā)色I(xiàn)Omin,用分光光度計測定660nm處的吸光值。同時做一份空白對照，唯在添加2%干酪素之前先加三氯乙酸使酶失活，測定660nm處的吸光值。實施例3 :蛋白酶粗酶液改善低次等煙葉品質(zhì)的方法將上部煙葉回潮后抽去煙梗，切絲，稱取50克的煙絲，分為兩份。在室溫下(24°C左右)按2%的比例均勻地噴施值得的粗酶液和蒸餾水，0855-9發(fā)酵酶液的施酶量為48U/g煙葉，置于自封袋中在室溫下使酶作用12h，然后于90°C條件下烘干30min使酶失活，置于22 °C、相對濕度55%的恒溫恒濕箱平衡煙絲水分24h。以平衡好的煙絲為單一原料卷煙后進(jìn)行評吸鑒定，由紅塔集團技術(shù)中心評吸員完成評吸，采用《玉溪優(yōu)質(zhì)烤煙單料煙感官質(zhì)量評吸方法》(云南省地方標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)編號DB53/T182. 3-2006)(表 I)。從評析結(jié)果可以看出(表2):對照煙氣濃度較高，雜氣顯，回味稍差，酸、澀，略有毛刺感，質(zhì)粗糙；LB發(fā)酵培養(yǎng)基對煙葉感官質(zhì)量無不良影響，也沒有改善煙葉品質(zhì)，所以LB發(fā)酵培養(yǎng)基不影響蛋白酶液處理煙葉的結(jié)果。評吸結(jié)果表明，該菌株發(fā)酵的蛋白酶液對煙葉品質(zhì)的改善較為明顯，表現(xiàn)為香氣質(zhì)改善，雜氣減輕，質(zhì)感、口感均較好，勁頭略有下降，刺激性有所改善。表I :紅塔集團單體煙葉感觀質(zhì)量評價方法及指標(biāo)
權(quán)利要求
1.一株短小芽孢桿菌(Bacillus pumi lus) 0855-9菌株，菌株保藏號是(CGMCCNo. 5310)，該菌株分離自醇化煙葉，產(chǎn)蛋白酶能力較強。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus),其特征在于該0855-9菌株篩選培養(yǎng)基采用酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基酪蛋白10g，牛肉膏3g，Na2HPO4 2g，NaCl 5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，0. 4%溴麝香草酚藍(lán)溶液12. 5mL, pH7. 4，觀察水解圈產(chǎn)生情況，復(fù)篩采用福林-酚法測定蛋白酶的酶活。
3.使用權(quán)利要求I所述的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)0855-9菌株制備蛋白酶液的方法，其特征在于細(xì)菌發(fā)酵制備蛋白酶液具體步驟為 ①芽孢桿菌的活化和培養(yǎng)該芽孢桿菌的菌株保藏號是(CGMCCNo. 5310)，經(jīng)LB培養(yǎng)基活化后接入滅菌的種子培養(yǎng)基，于37°C、150rpm恒溫?fù)u床培養(yǎng)12h，按I : 100的比例轉(zhuǎn)接于IL搖瓶中發(fā)酵60h制得發(fā)酵蛋白酶液； ②發(fā)酵蛋白酶液的加工發(fā)酵好的蛋白酶液經(jīng)O.22 μ m中空纖維管過濾除菌，再經(jīng)10000MWC0超濾濃縮制得粗酶液； 以上所述的種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基均是LB培養(yǎng)基，其主要組分為NaCl 10g，酵母粉5g，胰蛋白胨10g，加蒸餾水至1000ml，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，121 °C高壓滅菌20mino
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)0855-9菌株制備蛋白酶液，其特征在于酶活性測定細(xì)菌發(fā)酵蛋白酶液采用福林-酚法測定酶活性，其活力單位定義(U):在37°C每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生I μ g酪氨酸，定義為I個酶活力單位。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)0855-9菌株制備蛋白酶液，其特征在于使用制備的蛋白酶液作為改善低次等煙葉步驟是 將上部煙葉回潮后抽去煙梗，切絲，稱取一定量的煙絲，分為兩份；其中一份煙絲在室溫下(24°C左右)按2%的比例均勻地噴施值得的粗酶液和蒸餾水，置于自封袋中在室溫下使酶作用12h ;然后于90°C條件下烘干30mins使酶失活，置于22°C、相對濕度55%的恒溫恒濕箱平衡煙絲水分24h ;以此煙絲為單一原料卷煙后進(jìn)行評吸鑒定，另一份煙絲作為該組比對參照物使用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用細(xì)菌發(fā)酵蛋白酶液改善低次等煙葉品質(zhì)的方法。按以下步驟進(jìn)行1)細(xì)菌發(fā)酵蛋白酶液的制備①產(chǎn)蛋白酶的芽孢桿菌菌種經(jīng)LB培養(yǎng)基活化后接入滅菌的種子培養(yǎng)基，于37℃、150rpm恒溫?fù)u床培養(yǎng)12h，按1∶100的比例轉(zhuǎn)接于1L搖瓶中發(fā)酵60h制得發(fā)酵蛋白酶液；②發(fā)酵蛋白酶液的加工發(fā)酵好的蛋白酶液經(jīng)0.22μm中空纖維管過濾除菌，10000MWCO超濾濃縮制得粗酶液；2)改善低次等煙葉品質(zhì)粗酶液按一定2％的比例均勻地噴施于煙絲，置于自封袋中室溫下作用12h，90℃、30min使酶失活，置于22℃，相對濕度55％的恒溫恒濕箱平衡煙絲水分24h。感官評吸結(jié)果顯示，此菌株發(fā)酵的蛋白酶液可以改善煙葉香氣質(zhì)，雜氣減輕，質(zhì)感、口感較好，煙葉品質(zhì)明顯改善。
文檔編號A24B15/20GK102816710SQ20111043552
公開日2012年12月12日 申請日期2011年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月22日
發(fā)明者王毅, 魏云林, 馬永凱, 唐興宏, 季秀玲, 于會喜, 吳瀟 申請人:紅塔煙草(集團)有限責(zé)任公司