一種檢測(cè)溶液中mmp9蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)溶液中MMP9蛋白的方法，該方法包括以下步驟：⑴設(shè)計(jì)MMP9特異性小分子配體；⑵小分子配體的化學(xué)合成：①制備KF-CaF2熔融物：②制備對(duì)甲基苯磺酰氟；③采用催化劑LDA進(jìn)行反應(yīng)得化合物Ⅰ；④HCL氣體脫去反應(yīng)物上Boc基團(tuán)，得化合物Ⅱ；⑤采用催化劑三乙胺進(jìn)行反應(yīng)得化合物Ⅲ；⑥化合物Ⅱ與化合物Ⅲ反應(yīng)得化合物Ⅳ；⑦化合物Ⅳ與NaOH溶液進(jìn)行反應(yīng)得化合物Ⅴ；⑧采用催化劑為O-(四氫-2H-吡喃-2-基)羥基胺、NMM、HOBT和EDC進(jìn)行反應(yīng)得化合物Ⅵ；⑨化合物Ⅵ脫去保護(hù)基團(tuán)得MMP9小分子配體；⑶SPR法檢測(cè)溶液中的MMP9：ⅰ裸金膜芯片的修飾；ⅱ小分子配體的固定；ⅲ非特異性小分子吸附的排除；ⅳ檢測(cè)溶液中的MMP9蛋白；ⅴMMP9非特異性蛋白吸附的排除。本發(fā)明方法靈敏度高。
【專利說(shuō)明】—種檢測(cè)溶液中MMP9蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及化學(xué)醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)溶液中MMP9蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]分子對(duì)接技術(shù)(Molecular docking technology)從分子水平上模擬生物大分子特異性的活性中心與配體小分子之間的相互作用，計(jì)算出大分子和小分子之間的結(jié)合自由能，用于設(shè)計(jì)新的能和大分子物質(zhì)特異性結(jié)合的、親和性強(qiáng)的配體小分子，可節(jié)省大量時(shí)間，縮短實(shí)驗(yàn)過(guò)程分子。對(duì)接技術(shù)是計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)中常用的一種方法和手段，近年來(lái)在藥物設(shè)計(jì)方面取得了很大的成功，分子對(duì)接技術(shù)的引入成為解決特定蛋白的特異性識(shí)別的一種可能。
[0003]合成化學(xué)是有機(jī)化學(xué)、無(wú)機(jī)化學(xué)、藥物化學(xué)、高分子化學(xué)、材料化學(xué)等學(xué)科的基礎(chǔ)和核心。合成化學(xué)提供了很多藥物生產(chǎn)的新途徑，合成了磺胺類、抗生素類、維生素類以及口服避孕藥等。現(xiàn)在很多鎮(zhèn)痛劑、麻醉劑、防腐劑、催眠劑等都是合成出來(lái)的。合成化學(xué)與生物學(xué)、物理學(xué)等學(xué)科的密切配合，預(yù)計(jì)將來(lái)在征服疾病如癌癥、精神病，以及控制遺傳，延長(zhǎng)人類的壽命等方面會(huì)發(fā)揮重要作用。
[0004]表面等離子體共振(surface plasmon resonance, SPR)技術(shù)利用全反射時(shí)入射光可以和金屬表面的等離子發(fā)生共振的原理，探測(cè)生物分子之間是否發(fā)生作用以及反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，是發(fā)生在光學(xué)介質(zhì)界面(SPR芯片)上的非常靈敏的光學(xué)現(xiàn)象。SPR技術(shù)由瑞典科學(xué)家Liedberg等于80年代首次運(yùn)用于IgG抗體與其抗原相互反應(yīng)的測(cè)定。隨后，該技術(shù)被引入生物傳感器領(lǐng)域并迅速滲透到基礎(chǔ)生命科學(xué)研究中?；赟PR技術(shù)的光學(xué)生物傳感器具有其它相互作用技術(shù)所無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn):如高靈敏度(無(wú)需逐級(jí)放大試驗(yàn)，檢測(cè)靈敏度就可達(dá)到Pg水平)，不需對(duì)分子進(jìn)行標(biāo)記、能實(shí)時(shí)檢測(cè)生物分子結(jié)合反應(yīng)的全過(guò)程等，其發(fā)展非常迅速，已經(jīng)成為一種成熟的檢測(cè)生物分子間相互作用的方法。研究發(fā)現(xiàn)SPR較ELISA方法相比有著無(wú)需逐級(jí)放大反應(yīng)即可達(dá)到相似的檢測(cè)敏感度(ng/ml )，且無(wú)需標(biāo)記，步驟簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，從而達(dá)到對(duì)所檢測(cè)微量蛋白質(zhì)的無(wú)需標(biāo)記、無(wú)需逐級(jí)放大反應(yīng)的直接檢測(cè)。SPR生物傳感器目前在生物分子相互作用、藥物篩選、食物檢測(cè)及環(huán)境監(jiān)控等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。
[0005]近年來(lái)由于分子對(duì)接技術(shù)在大分子物質(zhì)的特異性識(shí)別優(yōu)勢(shì)，在藥物靶標(biāo)設(shè)計(jì)等方面獲得了廣泛應(yīng)用，并取得了良好的成績(jī)；但基于用分子對(duì)接原理設(shè)計(jì)的小分子配體在SPR芯片表面檢測(cè)特異性蛋白方面的研究上尚未見(jiàn)報(bào)道。因此尋找一種新的基于分子對(duì)接技術(shù)、合成化學(xué)和SPR技術(shù)相結(jié)合的方法對(duì)溶液中特異性蛋白進(jìn)行檢測(cè)不僅具有創(chuàng)新性，更具有重要的科研價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種高靈敏度的檢測(cè)溶液中MMP9蛋白的方法。[0007]為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所述的一種檢測(cè)溶液中MMP9蛋白的方法，包括以下步驟:
⑴應(yīng)用分子對(duì)接技術(shù)設(shè)計(jì)MMP9的特異性小分子配體，該MMP9的特異性小分子配體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下:
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)溶液中MMP9蛋白的方法，包括以下步驟: ⑴應(yīng)用分子對(duì)接技術(shù)設(shè)計(jì)MMP9的特異性小分子配體，該MMP9的特異性小分子配體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下:

2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)溶液中MMP9蛋白的方法，其特征在于:所述步驟②中的干燥乙腈是指在乙腈中加入五氧化二磷回流2~3天并用碳酸鉀蒸餾，最后用分餾柱分餾即得；所述五氧化二磷與所述乙腈的質(zhì)量體積比為0.5^1mg:1L ;所述碳酸鉀與所述乙腈的質(zhì)量體積比為Ig:1~2?0
3.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)溶液中MMP9蛋白的方法，其特征在于:所述步驟③中的石油醚-丙酮是指石油醚與丙酮按10~15mL:l mL的比例混合而成的混合物。
4.如權(quán)利要求1所述的 一種檢測(cè)溶液中MMP9蛋白的方法，其特征在于:所述步驟⑤中的石油醚-丙酮是指石油醚與丙酮按25~35mL:1 mL的比例混合而成的混合物。
5.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)溶液中MMP9蛋白的方法，其特征在于:所述步驟⑥中的石油醚-丙酮是指石油醚與丙酮按remL:1 mL的比例混合而成的混合物。
6.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)溶液中MMP9蛋白的方法，其特征在于:所述步驟⑧中的石油醚-丙酮是指石油醚與丙酮按f 1.5mL:1 mL的比例混合而成的混合物。
7.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)溶液中MMP9蛋白的方法，其特征在于:所述步驟⑨中的I，4 二氧六環(huán)-無(wú)水甲醇溶液是指I，4 二氧六環(huán)與無(wú)水甲醇按2~3mL:1 mL的比例混合而得。
8.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)溶液中MMP9蛋白的方法，其特征在于:所述步驟i中濃度為0.2^0.3%w/v的交聯(lián)劑對(duì)苯二異硫氰酸酯的溶液是指在IL吡啶-DMF混合液中加入`0.2^0.3mg的對(duì)苯二異硫氰酸酯，攪拌均勻所得；所述吡啶-DMF混合液是指吡啶與DMF按ImL:8~10mL的比例混合而得。
【文檔編號(hào)】G01N21/552GK103940784SQ201410180514
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】王志平, 劉映前, 姚小軍, 王靜, 張麗秀, 祁萍 申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)