專利名稱：降低煙草特有亞硝胺含量的生物制劑及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及降低煙草特有亞硝胺含量的生物制劑及制備方法和應用，屬生物技術領域。
背景技術：
煙草特有亞硝胺(Tobacco-specific nitrosamines，簡稱TSNA)是一組僅發(fā)現(xiàn)于煙草及其制品的致癌物質(zhì)，主要包括N-亞硝基去甲基煙堿(NNN)，4-(N-甲基-亞硝基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)，N-亞硝基新煙草堿(NAT)和N-亞硝基假木賊堿(NAB)等4種成分。其中NNN和NNK具有顯著的致癌作用，而NAB和NAT則無明顯的致癌作用。TSNA在不同煙草類型中的含量以白肋煙最高，香料煙和烤煙含量都較低。研究證明，TSNA的主要前體物質(zhì)是生物堿和硝酸鹽、亞硝酸鹽，在收獲前的綠色煙葉中沒有TSNA存在，它們產(chǎn)生于收獲后的調(diào)制和發(fā)酵過程中。過去20年以來，TSNA成為煙草科學研究中最受關注的領域之一。
隨著人們對吸煙與健康問題的廣泛關注及全世界戒煙和控煙等反吸煙運動的興起，煙草業(yè)如何在既能滿足消費者的需求，又能減少吸煙給消費者帶來危害上面臨嚴重挑戰(zhàn)。TSNA是煙草及其制品中的主要有害物質(zhì)之一，減少或消除TSNA含量是生產(chǎn)低危害、安全型卷煙的基礎。TSNA的控制途徑目前主要有良種選育、降低施氮水平、改革調(diào)制工藝、硝酸鹽清除劑及抗生素的使用等。由于這些方法存在一定的局限性，目前尚未得到普遍推廣應用。因此，研究開發(fā)具有實際應用價值的降低TSNA含量的新技術具有重要的現(xiàn)實意義和廣闊的應用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是克服現(xiàn)有技術之不足，研究開發(fā)降低煙草特有亞硝胺含量的生物制劑，為生產(chǎn)低危害、安全型卷煙提供優(yōu)質(zhì)原料。
本發(fā)明采用的細菌是銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa KenLXP30菌株，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京.中關村；保藏日期2003年7月28日；保藏登記入冊的編號CGMCC NO.0985。
KenLXP30菌株屬于煙草內(nèi)生細菌，系本發(fā)明人從大量煙草內(nèi)生細菌菌株中篩選出來的，具有顯著降低TSNA含量的能力，經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)進行鑒定，確定是銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa KenLXP30菌株。
本發(fā)明Pseudomonas aeruginosa KenLXP30菌株主要特征為桿狀，無芽孢，革蘭氏染色陰性，葡萄糖發(fā)酵陰性，接觸酶陽性，氧化酶陽性，甲基紅試驗陰性，VP試驗陰性，硝酸鹽還原陽性，亞硝酸鹽還原陽性，抗100μg/ml的利福平和鏈霉素。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的KenLXP30菌株的試管種培養(yǎng)，搖床擴大培養(yǎng)制備為生物制劑，將制劑應用于煙草上，測定降低TSNA的功能。
本發(fā)明細菌KenLXP30菌株的培養(yǎng)方法(以下為重量百分比)1、試管種培養(yǎng)試管斜面培養(yǎng)基配方為酪蛋白1-2％，大豆蛋白胨0.5-1％，氯化鈉0.3-0.8％，瓊脂1.5-2％，pH 7-8。
將KenLXP30菌株接種到試管斜面培養(yǎng)基上，28～35℃恒溫培養(yǎng)1-2天，獲得試管種。
2、液體發(fā)酵培養(yǎng)液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為酪蛋白1-2％，大豆蛋白胨0.3-0.8％，氯化鈉0.2-0.7％，磷酸氫二鉀0.2-0.4％，葡萄糖0.2-0.6％，pH 7-8。
將試管種接種到500ml三角瓶液體培養(yǎng)基中，每瓶裝200ml，于28～35℃搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)時間2～3天，轉(zhuǎn)速為150～200rpm，培養(yǎng)液下?lián)u床后用稀釋平板計數(shù)法測定菌懸液濃度，菌濃度為每ml活菌數(shù)≥108。即得具有降低TSNA功能的生物制劑。
本發(fā)明生物制劑降低TSNA的功能試驗1、制備生物制劑按前述KenLXP30菌株的培養(yǎng)方法制備試驗用制劑；以未接種KenLXP30菌株的液體培養(yǎng)基處理作為對照。
2、生物制劑對煙草處理方法(1)煙葉粉碎處理采集生長成熟的白肋煙新鮮煙葉，用粉碎機粉碎，充分混勻，按1∶100比例將供試菌劑和粉碎煙葉充分混勻，置于30-35℃恒溫培養(yǎng)7天后，于烘箱50℃烘干粉碎。
(2)葉面噴霧處理采集生長成熟的白肋煙新鮮煙葉，將供試菌劑均勻噴霧接種于煙葉表面，然后在室溫下自然調(diào)制3周，于烘箱50℃烘干粉碎。
(3)葉柄浸泡處理將采集的新鮮煙葉葉柄基部浸泡于供試菌劑中48小時，然后在室溫下自然調(diào)制3周，于烘箱50℃烘干粉碎。
(4)灌根接種處理將供試菌劑灌根接種于正常生長的白肋煙煙株，按常規(guī)栽培調(diào)制方法調(diào)制后于烘箱50℃烘干粉碎。
3、TSNA測定方法按國際通用的熱能分析儀(TEA)和氣相色譜儀(GC)聯(lián)用方法測定各處理樣品的TSNA含量。所用儀器為GC Autosystem XL型氣相色譜儀(美國PE公司)、Tubrochrom色譜工作站(美國PE公司)和TEA 543熱能檢測器(美國Chelmsford公司)。降低TSNA百分率的計算方法為降低百分率％＝(對照處理TSNA含量-制劑處理TSNA含量)/對照處理TSNA含量×1004、試驗結(jié)果(1)煙葉粉碎處理結(jié)果表1生物制劑處理粉碎煙葉后TSNA含量測定結(jié)果TSNA含量(單位μg/g)處理 降低百分率NNN TSNANATNABNNKKenLXP30菌株0.26 2.69 98.72％0.93 0.01 1.48對照13.27 210.62-60.52 1.55 135.38結(jié)果表明，生物制劑處理粉碎煙葉后白肋煙TSNA含量減少98.72％，表明本發(fā)明生物制劑能夠顯著降低白肋煙TSNA含量。
(2)葉面噴霧處理結(jié)果表2生物制劑葉面噴霧處理后TSNA含量測定結(jié)果TSNA含量(單位μg/g)處理 降低百分率NNN TSNANATNABNNKKenLXP30菌株1.022.54 86.03％1.24 0.02 0.26對照5.2118.18-10.62 0.17 2.18結(jié)果表明，生物制劑葉面噴霧處理后白肋煙TSNA含量減少86.03％，表明本發(fā)明生物制劑能夠顯著降低白肋煙TSNA含量。
(3)葉柄浸泡處理結(jié)果表3生物制劑葉柄浸泡處理后TSNA含量測定結(jié)果TSNA含量(單位μg/g)處理 降低百分率NNN TSNANATNABNNKKenLXP30菌株0.93 2.85 95.53％1.39 0.03 0.49對照26.5963.83 -24.65 0.44 12.15
結(jié)果表明，生物制劑葉柄浸泡處理后，TSNA含量減少95.53％。表明本發(fā)明制劑通過葉柄浸泡處理仍然具備顯著降低白肋煙TSNA含量的功能。
(4)灌根接種處理結(jié)果表4生物制劑灌根接種處理后TSNA含量測定結(jié)果TSNA含量(單位μg/g)處理降低百分率NNN NATNAB NNK TSNAKenLXP30菌株1.641.43 0.070.513.66 78.23％對照7.576.93 0.222.1016.81-結(jié)果表明，生物制劑灌根接種處理白肋煙后，TSNA含量減少78.23％，表明本發(fā)明制劑夠降低白肋煙TSNA含量，但效果明顯低于煙葉粉碎處理和葉柄浸泡處理。
總體結(jié)果表明，本發(fā)明制劑通過4種不同方式接種處理后均可有效降低白肋煙TSNA含量，其降低百分率為78.23％～98.72％，可大部分減少或基本消除TSNA在白肋煙中的含量，為生產(chǎn)低危害、安全型卷煙提供優(yōu)質(zhì)原料。該制劑4種處理方式降低TSNA含量的能力表現(xiàn)為煙葉粉碎處理＞葉柄浸泡處理＞葉面噴霧處理＞灌根接種處理。
具體實施例方式下面用實施例來進一步詳述本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實施例一將銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)KenLXP30菌株接種到試管瓊脂斜面上，培養(yǎng)基配方為酪蛋白1.2％，大豆蛋白胨0.8％，氯化鈉0.5％，瓊脂1.7％，pH 7.5。30℃恒溫培養(yǎng)1天，獲得試管種。
將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為酪蛋白1.5％，大豆蛋白胨0.5％，氯化鈉0.5％，磷酸氫二鉀0.025％，葡萄糖0.3％，pH7.5。將接好種的三角瓶于30℃下?lián)u床(轉(zhuǎn)速為180rpm)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間2天，待菌濃度為達到每ml活菌數(shù)≥108時，即得具有降低TSNA功能的生物制劑。
實施例二基本同實施例一，不同之處在于液體培養(yǎng)基配方，其配方為酪蛋白1％，大豆蛋白胨0.8％，氯化鈉0.2％，磷酸氫二鉀0.2％，葡萄糖0.6％，pH 7。
實施例三基本同實施例一，不同之處在于液體培養(yǎng)基配方，其配方為酪蛋白2％，大豆蛋白胨0.3％，氯化鈉0.7％，磷酸氫二鉀0.4％，葡萄糖0.2％，pH 7.2。
權利要求
1.降低煙草特有亞硝胺含量的生物制劑，其特征在于該制劑的生產(chǎn)菌株為銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa KenLXP30，KenLXP30菌株已于2003年7月28日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC NO.0985。
2.降低煙草特有亞硝胺含量生物制劑的制備方法，由常規(guī)液體發(fā)酵方法生產(chǎn)，其特征在于2.1試管斜面培養(yǎng)基配方為酪蛋白1-2％，大豆蛋白胨0.5-1％，氯化鈉0.3-0.8％，瓊脂1.5-2％，瓊脂1.5-2％，pH 7-8；2.2液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為酪蛋白1-2％，大豆蛋白胨0.3-0.8％，氯化鈉0.2-0.7％，磷酸氫二鉀0.2-0.4％，葡萄糖0.2-0.6％，pH 7-8；2.3本發(fā)明生物制劑為含菌懸浮液，菌濃度為每ml活菌數(shù)≥108。
3.按照權利要求1和權利要求2所述的生物制劑，其特征在于該制劑能夠降低白肋煙煙草特有亞硝胺含量，處理粉碎煙葉降低率達98.72％，葉柄浸泡處理降低率達95.53％，葉面噴霧處理降低率達86.03％，灌根接種處理降低率達78.23％。
全文摘要
本發(fā)明涉及降低煙草特有亞硝胺含量的生物制劑及其制備方法和應用，屬生物技術領域。本發(fā)明的生產(chǎn)菌株銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa KenLXP30已于2003年7月28日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CCTCC NO.0985。本發(fā)明從大量煙草內(nèi)生細菌中篩選出一株能夠顯著降低煙草特有亞硝胺含量的菌株KenLXP30，通過液體發(fā)酵制備成煙草降害生物制劑。本制劑可顯著降低白肋煙煙草特有亞硝胺含量，在煙草工業(yè)上具有較好的應用價值。
文檔編號A24B15/00GK1579260SQ0313560
公開日2005年2月16日 申請日期2003年8月13日 優(yōu)先權日2003年8月13日
發(fā)明者祝明亮, 李天飛, 汪安云, 王東丹 申請人:云南煙草科學研究院