層粘連蛋白用DMEM/F12稀釋成20yg/ mL。將10 ml稀的層粘連蛋白溶液加入IOcm組織培養(yǎng)皿中。然后將培養(yǎng)皿在37°C、5% C02 培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。臨用前，吸取層粘連蛋白溶液，用無(wú)菌DPBS溶液沖洗一次。將hNSC在 37°C、5% C02 培養(yǎng)箱中在補(bǔ)充 20 ng/mL bFGF 和 20 ng/mL EGF 的 ReNcell NSC 維持培養(yǎng) 基（Millipore)中培養(yǎng)。之后每隔一天用含有bFGF和EGF的新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。在 該步驟后2-3天，細(xì)胞達(dá)到80%匯合。
[0211] 在hNSC達(dá)到80%匯合后，hNSC準(zhǔn)備好用于分化實(shí)驗(yàn)。在接種前，將96孔板現(xiàn)用 20 Pg/mL層粘連蛋白溶液新鮮包被，接著如上所述短暫的DPBS沖洗。小心地除去培養(yǎng)基， 在37°C、5% C02培養(yǎng)箱中，將hNSC在3ml Accutase (Millipore)內(nèi)解離3分鐘。然后加 入 5ml 補(bǔ)充 20 ng/mL bFGF 和 20 ng/mL EGF 的 ReNcell NSC 維持培養(yǎng)基（Millipore)。然 后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌15ml錐形管中，通過(guò)以300 X g離心5分鐘使細(xì)胞沉淀。除去 上清液。然后將2ml培養(yǎng)基加入管中，使hNSC充分地再懸浮。以IxlO4個(gè)細(xì)胞/ml (1000 個(gè)細(xì)胞/孔，100 μL/孔）的密度將hNSC接種到96孔板中。
[0212] 在粘附在培養(yǎng)表面上后，更換培養(yǎng)基為在CDP-膽堿或DHA存在下或無(wú)處理的 無(wú)血清分化培養(yǎng)基。在更換前現(xiàn)制備無(wú)血清分化培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包括40 ml DMEM/F12 (Millipore)、400 μL 濃度為 200mM 的 L-谷氨酰胺（Life Technologies，Carlsbad，CA)、 400 μL B27 溶液（Life Technologies，Carlsbad，CA)和 40 μL 濃度為 10mg/mL 的 Heperin (Sigma-Aldrich，St. Louis, MI)溶液。
[0213] 在倒置熒光顯微鏡下，在72小時(shí)后觀察細(xì)胞的形態(tài)改變。將整個(gè)96孔板放置在 Leica DMI4000B熒光顯微鏡下，在用UV光源的顯微鏡下用GFP濾光片拍攝照片。
[0214] 當(dāng)與無(wú)處理相比時(shí)，4μΜ的⑶P-膽堿顯著促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生。參見(jiàn)圖4E。所觀察到的 hNSC具有皺縮細(xì)胞體，突出的神經(jīng)突，并正出現(xiàn)樹(shù)突。參見(jiàn)圖4F。在CDP-膽堿存在下，神 經(jīng)突向外生長(zhǎng)的長(zhǎng)度與20 μΜ DHA的相當(dāng)，這表明對(duì)神經(jīng)發(fā)生的良好作用。參見(jiàn)圖4G。
[0215] 此外，12. 5 μΜ的⑶P-膽堿與包括以下的其它腦營(yíng)養(yǎng)物協(xié)同起作用，以快速方式 顯著地促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生：5 μΜ DHA、0. 1 μΜ N-辛?；?D-蘇型-鞘氨醇、20 μΜ尿苷、25 μΜ膽 固醇、8.8 μΜ白藜蘆醇和0.3 μΜ葉黃素。圖4Η所示形態(tài)改變，表示用⑶P-膽堿和這些其 它的腦營(yíng)養(yǎng)物處理后hNSC的神經(jīng)元形態(tài)改變。這些形態(tài)改變包括更多少突膠質(zhì)細(xì)胞分化 的出現(xiàn)，這表明髓鞘形成功能。
[0216] 實(shí)施例4 該實(shí)施例描述了與DHA和陰性對(duì)照相比由神經(jīng)酰胺引起的hADSC的神經(jīng)發(fā)生。用于 下列實(shí)驗(yàn)的神經(jīng)酰胺為N- (R，S) - α -羥基十二烷酰基-D-赤型鞘氨醇、乳糖苷神經(jīng)酰胺和 N-辛酰基-D-蘇型-鞘氨醇。
[0217] 本文公開(kāi)了用于測(cè)試N- (R，S) - α -羥基十二烷酰基-D-赤型鞘氨醇對(duì)hADSC的神 經(jīng)發(fā)生的方法和所得到的結(jié)果。
[0218] N_(R，S)_a -羥基十二烷?；?D-赤型鞘氨醇購(gòu)自Matreya? (目錄號(hào)2042)，以 ImM溶于100%乙醇中，并作為原液保存在-80°C下以避免物理和化學(xué)性質(zhì)改變。采用實(shí)施例 1中概述的相同方法培養(yǎng)，傳代，接種細(xì)胞，并使之經(jīng)歷N-(R，S) - α -羥基十二烷?；?D-赤 型鞘氨醇處理，不同的是以2χ104個(gè)細(xì)胞/ml (1x10 4細(xì)胞/孔）的密度將細(xì)胞接種在含有 聚-L-鳥(niǎo)氨酸和牛血漿纖連蛋白覆蓋層的24孔培養(yǎng)板中。
[0219] 在處理后24小時(shí)，在相襯顯微鏡下，測(cè)試濃度為20 μΜ和40 μΜ的N-(R，S)_a-羥 基十二烷?；?D-赤型鞘氨醇的處理，并與陽(yáng)性對(duì)照、10 μΜ DHA和陰性對(duì)照進(jìn)行比較。實(shí) 驗(yàn)以一式三份重復(fù)。
[0220] 在更換到神經(jīng)分化培養(yǎng)基中后24小時(shí)，用濃度為1〇μΜ DHA處理，最先觀察到早期 神經(jīng)發(fā)生。參見(jiàn)圖5A。
[0221] 在用濃度為4〇μΜ的N_(R，S)_a -羥基十二烷?；?D-赤型鞘氨醇處理hADSC后 24小時(shí)，也觀察到早期神經(jīng)發(fā)生，參見(jiàn)圖5B。
[0222] 在無(wú)處理的對(duì)照孔中hADSC保持其推定形態(tài)，為培養(yǎng)表面上大而扁平的鋪展細(xì) 胞，表明了在該時(shí)間點(diǎn)上無(wú)明顯的神經(jīng)發(fā)生。參見(jiàn)圖5C。
[0223] 此外，當(dāng)與DHA比較時(shí)，N-(R，S)-a -羥基十二烷?；?D-赤型鞘氨醇的處理顯示 促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的中等作用。此外，用N-(R，S)-a -羥基十二烷酰基-D-赤型鞘氨醇處理的 hADSC就形態(tài)而目的確顯不明顯的神經(jīng)兀改變，表明了 N- (R, S) - a -羥基十二燒醜基-D-赤 型鞘氨醇可具有與DHA不同的神經(jīng)發(fā)生途徑。
[0224] 同樣，發(fā)現(xiàn)乳糖苷神經(jīng)酰胺在hADSC中促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生。在大多數(shù)動(dòng)物組織中發(fā)現(xiàn) 少量的乳糖苷神經(jīng)酰胺，亦稱(chēng)乳糖腦苷脂，但其具有多種重要的生物功能，并且作為大多數(shù) 神經(jīng)寡糖基神經(jīng)酰胺、硫腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂的生物合成前體具有重要性。
[0225] 乳糖苷神經(jīng)酰胺獲自Metreya (目錄號(hào)1500)，將其以9mM濃度溶于100%乙醇。 采用針對(duì)N- (R，S) - α -羥基十二烷?；?D-赤型鞘氨醇的上述方法，發(fā)現(xiàn)測(cè)試濃度為1〇μΜ 的乳糖苷神經(jīng)酰胺顯示對(duì)hADSC的神經(jīng)發(fā)生作用。參見(jiàn)圖
[0226] 此外，發(fā)現(xiàn)N-辛?；?D-蘇型-鞘氨醇在hNSC中促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生。將N-辛酰 基-D-蘇型-鞘氨醇以11. 7 mM溶于100%乙醇中，并作為原液保存在-80°C下。人神經(jīng)元 干細(xì)胞購(gòu)自Millipore?，具有組成型表達(dá)綠色熒光蛋白的遺傳修飾。按照實(shí)施例3中所述 的方法，hNSC經(jīng)培養(yǎng)，接種，并暴露于N-辛?；?D-蘇型-鞘氨醇中。
[0227] 1〇μΜ N-辛?；?D-蘇型-鞘氨醇顯著促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生，因?yàn)閔NSC出現(xiàn)皺縮細(xì)胞體， 突出的神經(jīng)突和形成中的樹(shù)突。參見(jiàn)圖5E。
[0228] 而且，實(shí)驗(yàn)濃度為10 μΜ的N-辛?；?D-蘇型-鞘氨醇與10 μΜ DHA協(xié)同作用進(jìn) 一步促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生。參見(jiàn)圖5G。將其與只含有DHA的陽(yáng)性對(duì)照組（參見(jiàn)圖5F)和含有無(wú)處 理的陰性對(duì)照組（參見(jiàn)圖5Η)進(jìn)行比較。
[0229] 此外，發(fā)現(xiàn)早在應(yīng)用后3小時(shí)，N-辛?；?D-蘇型-鞘氨醇能夠與其它腦營(yíng)養(yǎng)物 協(xié)同作用以顯著促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生。參見(jiàn)圖51，在應(yīng)用0.1 μΜ N-辛?；?D-蘇型-鞘氨醇以 及12. 5μΜ⑶P-膽堿和包括以下的其它腦營(yíng)養(yǎng)物后3小時(shí)，其顯示神經(jīng)元形態(tài)改變：5 μΜ DHA、20 μΜ尿苷、25 μΜ膽固醇、8. 8 μΜ白藜蘆醇和0. 3 μΜ純化的或天然形式的葉黃素。神 經(jīng)元形態(tài)改變顯示為出現(xiàn)更趨向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，這表明了髓鞘形成功能。
[0230] 實(shí)施例5 該實(shí)施例描述了與DHA和陰性對(duì)照相比由尿苷引起的hADSC的神經(jīng)發(fā)生。該實(shí)施例還 描述了由尿苷引起的hNSC的神經(jīng)發(fā)生。
[0231] 尿苷購(gòu)自Sigma-Aldrich? (目錄號(hào)U3003)，在層流罩超凈臺(tái)中，將其溶于無(wú)菌水 中至50 mg/ml，得到清澈原液。按照實(shí)施例1中描述的方法，將hADSC培養(yǎng)，傳代，接種，并 暴露于尿苷中。
[0232] 分別測(cè)試2〇μΜ尿苷，并與陽(yáng)性對(duì)照、2〇μΜ DHA和作為陰性對(duì)照的無(wú)處理進(jìn)行比 較。在hADSC接種到包被的培養(yǎng)表面上后3天，將尿苷和DHA直接加入神經(jīng)分化培養(yǎng)基中。 在處理后3小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)，在相襯顯微鏡下觀察樣品。實(shí)驗(yàn)以一式三份重復(fù)。
[0233] 在無(wú)處理的對(duì)照孔中，hADSC保持其推定的形態(tài)為在培養(yǎng)表面上大而扁平的鋪展 細(xì)胞，這表明在該時(shí)間點(diǎn)上無(wú)明顯的神經(jīng)發(fā)生。參見(jiàn)圖6A。
[0234] 在更換為含20 μΜ尿苷的神經(jīng)分化培養(yǎng)基后3小時(shí)觀察到早期神經(jīng)發(fā)生。參見(jiàn)圖 6Β〇
[0235] 值得注意的是，實(shí)驗(yàn)濃度為0. 5mM的尿苷顯示增強(qiáng)早期神經(jīng)發(fā)生的最強(qiáng)作用。而 且，所述神經(jīng)元形態(tài)改變持續(xù)直到48小時(shí)培養(yǎng)時(shí)程。
[0236] 同樣，發(fā)現(xiàn)尿苷在hNSC中促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生。按照實(shí)施例3中所述方法，將hNSC培養(yǎng)， 傳代，接種，并暴露于尿苷中。
[0237] 2〇μΜ的尿苷顯著促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生，因?yàn)閔NSC顯得具有皺縮細(xì)胞體、突出的神經(jīng)突和 發(fā)生中的樹(shù)突。參見(jiàn)圖6C。在尿苷存在下神經(jīng)突向外生長(zhǎng)的長(zhǎng)度表明神經(jīng)發(fā)生的良好作 用。
[0238] 此外，還發(fā)現(xiàn)尿苷能夠與其它腦營(yíng)養(yǎng)物協(xié)同作用，以快速方式顯著促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生。 參見(jiàn)圖6D，其顯示在應(yīng)用尿苷以及5 μΜ DHA、0. 1 μΜ N-辛?；?D-蘇型-鞘氨醇、25 μΜ 膽固醇、8.8 μΜ白藜蘆醇和0.3 μΜ純化的或天然形式的葉黃素后的神經(jīng)元形態(tài)改變。神經(jīng) 元形態(tài)改變顯示為表現(xiàn)更趨向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，這表明了髓鞘形成功能。
[0239] 制劑實(shí)施例 表1提供可摻入或加入本文所述營(yíng)養(yǎng)組合物中的神經(jīng)組分實(shí)施例實(shí)施方案。該實(shí)施例 提供包括在營(yíng)養(yǎng)組合物每IOOkcal份量中各成分的量。
[0240] 表1.實(shí)施例神經(jīng)組分的營(yíng)養(yǎng)概況
表2提供本公開(kāi)內(nèi)容的營(yíng)養(yǎng)組合物的實(shí)施例實(shí)施方案并描述了每100 kcal份量中包 括的各成分的量。
[0241] 表2.實(shí)施例營(yíng)養(yǎng)組合物的營(yíng)養(yǎng)概況
本說(shuō)明書(shū)引用的所有參考文獻(xiàn)，包括而不限于所有的論文、出版物、專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、簡(jiǎn) 報(bào)、教科書(shū)、報(bào)告、底稿、小冊(cè)子、書(shū)籍、互聯(lián)網(wǎng)文章、雜志文章、期刊等，通過(guò)引用以其整體結(jié) 合到本說(shuō)明書(shū)中。本文的參考文獻(xiàn)的闡述僅僅意在概括其作者所做出的斷言，并非承認(rèn)任 何參考文獻(xiàn)構(gòu)成先有技術(shù)。申請(qǐng)人保留對(duì)所引用的參考文獻(xiàn)的準(zhǔn)確性和相關(guān)性提出異議的 權(quán)利。
[0242] 雖然使用特定術(shù)語(yǔ)、裝置和方法描述了本公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案，但是這類(lèi)描述只 用于說(shuō)明目的。所用詞匯是描述詞匯而不是限制詞匯。要了解，在不偏離隨附權(quán)利要求書(shū) 中闡述的本公開(kāi)內(nèi)容的精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可進(jìn)行變動(dòng)和改變。另 外，應(yīng)了解，不同實(shí)施方案的方面可全部或部分互換。例如，雖然舉例說(shuō)明了用于生產(chǎn)按照 所述方法制備的商品化無(wú)菌液體營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑的那些方法，但是也考慮了其它用途。因此，隨 附權(quán)利要求書(shū)的精神和范圍不應(yīng)限于其中所含形式的描述。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種營(yíng)養(yǎng)組合物，其包含： (i) 碳水化合物源； (ii) 蛋白質(zhì)源； (iii) 脂肪源；和 (iv) 選自以下的神經(jīng)組分：磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、胞苷二磷酸-膽堿、神經(jīng)酰胺、尿 苷、至少一種神經(jīng)節(jié)苷脂及其一種或多種的組合。2. 權(quán)利要求1的營(yíng)養(yǎng)組合物，其中磷脂酰乙醇胺以約3. 7 mg/100 kcal-約37 mg/100 kcal的量存在。3. 權(quán)利要求1的營(yíng)養(yǎng)組合物，其中鞘磷脂以約0.15 mg/100 kcal-約73 mg/100 kcal 的量存在。4. 權(quán)利要求1的營(yíng)養(yǎng)組合物，其中胞苷二磷酸-膽堿以約7 mg/100 kcal-約295 mg/100 kcal的量存在。 5?權(quán)利要求1的營(yíng)養(yǎng)組合物，其中神經(jīng)酰胺以約2. 2 mg/100 kcal-約22 mg/100 kcal 的量存在。6. 權(quán)利要求1的營(yíng)養(yǎng)組合物，其中尿苷以約0.15 mg/100 kcal-約37 mg/100 kcal 的量存在。7. 權(quán)利要求1的營(yíng)養(yǎng)組合物，其中神經(jīng)酰胺選自N-辛酰基-D-蘇型-鞘氨醇、N-(R，S) a _羥基十二烷酰基-D-赤型-鞘氨醇和乳糖苷神經(jīng)酰胺。8. 權(quán)利要求1的營(yíng)養(yǎng)組合物，其還包含選自以下的營(yíng)養(yǎng)物：益生菌、益生元、0-葡聚 糖、鐵源及其一種或多種的組合。9. 權(quán)利要求1的營(yíng)養(yǎng)組合物，其還包含選自以下的營(yíng)養(yǎng)物：二十二碳六烯酸、花生四 烯酸、白藜蘆醇、膽固醇、葉黃素及其至少一種或多種的組合。10. 權(quán)利要求1的營(yíng)養(yǎng)組合物，其中所述營(yíng)養(yǎng)組合物是嬰兒配方奶粉。11. 一種營(yíng)養(yǎng)組合物，其每1〇〇 kcal包含： (i) 介于約6 g和約22 g之間的碳水化合物源； (ii) 介于約I g和約7 g之間的蛋白質(zhì)源； (iii) 介于約I. 3 g和約7. 2 g之間的脂肪源；和 (iv) 神經(jīng)組分，其包含： (a) 介于約3. 7 mg和約37 mg之間的磷脂酰乙醇胺； (b) 介于約0? 15 mg和約73 mg之間的鞘磷脂； (c) 介于約37 mg和約295 mg之間的胞苷二磷酸-膽堿； (d) 介于約2. 2 mg和約22 mg之間的神經(jīng)酰胺； (e) 介于約0? 7 mg和約37 mg之間的尿苷； (f) 介于約〇? 9 mg和約14. 8 mg之間的至少一種神經(jīng)節(jié)苷脂；或 (g) 前述一種或多種的混合物。12. 權(quán)利要求11的營(yíng)養(yǎng)組合物，其還包含每100 kcal介于約9. 60 X IO5 cfu和約 3.80 X IO8 cfu之間的益生菌。13. 權(quán)利要求11的營(yíng)養(yǎng)組合物，其還包含每100 kcal介于約0. 3 g和約I. 2 g之間 的益生元。14. 權(quán)利要求11的營(yíng)養(yǎng)組合物，其中所述營(yíng)養(yǎng)組合物還包含每100 kcal介于約4 mg 和約50 mg之間的二十二碳六烯酸。15. 權(quán)利要求11的營(yíng)養(yǎng)組合物，其還包含至少一種選自以下的營(yíng)養(yǎng)物：二十二碳六稀 酸、花生四烯酸、葉黃素、白藜蘆醇和膽固醇。16. -種促進(jìn)腦和神經(jīng)系統(tǒng)健康的方法，所述方法包括： 向目標(biāo)受試者提供包含碳水化合物源、蛋白質(zhì)源、脂肪源和神經(jīng)組分的營(yíng)養(yǎng)組合物，其 中所述神經(jīng)組分選自磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、胞苷二磷酸-膽堿、尿苷、神經(jīng)酰胺、至少一種 神經(jīng)節(jié)苷脂或前述的至少一種或多種的混合物。17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述目標(biāo)受試者是兒童受試者。18. 權(quán)利要求16的方法，其中所述營(yíng)養(yǎng)組合物是嬰兒配方奶粉。19. 權(quán)利要求16的方法，其中所述營(yíng)養(yǎng)組合物還包含至少一種選自以下的營(yíng)養(yǎng)物： 二十二碳六烯酸、花生四烯酸、葉黃素、白藜蘆醇和膽固醇。20. 權(quán)利要求16的方法，其中所述營(yíng)養(yǎng)組合物還包含至少一種選自以下的營(yíng)養(yǎng)物：益 生菌、益生元、e-葡聚糖和鐵源。
【專(zhuān)利摘要】本公開(kāi)內(nèi)容涉及包含神經(jīng)組分的營(yíng)養(yǎng)組合物，其中神經(jīng)組分可促進(jìn)腦和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，且還提供神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)。神經(jīng)組分可包括磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、胞苷二磷酸-膽堿、神經(jīng)酰胺、尿苷、至少一種神經(jīng)節(jié)苷脂及其混合物。本公開(kāi)內(nèi)容還涉及通過(guò)向目標(biāo)受試者(包括兒童受試者)提供所述營(yíng)養(yǎng)組合物以促進(jìn)腦和神經(jīng)系統(tǒng)健康的方法。
【IPC分類(lèi)】A61K31/7032, A61K31/164, A61K31/7072, A61K31/7068, A23L1/30, A61K31/685, A61K31/688, A23L1/29
【公開(kāi)號(hào)】CN104883909
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380070178
【發(fā)明人】C.鄺, Y.肖, E.K.佩爾斯, Z.朱尼, D.洪曼
【申請(qǐng)人】Mjn 美國(guó)控股有限責(zé)任公司
【公開(kāi)日】2015年9月2日
【申請(qǐng)日】2013年12月12日
【公告號(hào)】CA2912246A1, EP2943079A1, US20140199265, WO2014109862A1