專利名稱：組織工程神經(jīng)移植物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學和生物醫(yī)學工程領(lǐng)域，具體涉及含有細胞或者組織的組織工程神經(jīng)移植物及其用途。
背景技術(shù)：
現(xiàn)實社會中交通事故、工傷事故、運動意外及臨床手術(shù)等事件均會造成周圍神經(jīng)損傷，臨床上但當中長距離的神經(jīng)缺損不能依靠端對端的縫合來彌補神經(jīng)缺失時，就不得不依靠移植物來橋接修復。近年來，基于生命科學與工程學的原理和技術(shù)發(fā)展起來的組織工程學為構(gòu)建神經(jīng)移植替代品提供了一條新的出路。采用組織工程技術(shù)修復神經(jīng)損傷的研究主要集中在設(shè)計和構(gòu)建新的組織工程神經(jīng)橋接裝置，目前這類橋接物通常是單獨采用生物材料，通過將其加工成管狀結(jié)構(gòu)的神經(jīng)引導通道，為神經(jīng)的再生提供適當?shù)目臻g和引導作用。但對于長距離、粗大神經(jīng)缺損，這類單純由生物材料組成的導管由于缺乏神經(jīng)營養(yǎng)因子等微環(huán)境物質(zhì)的支持，取得的修復效果非常有限。這可能是因為長距離神經(jīng)缺損修復早期，神經(jīng)斷端內(nèi)細胞分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子有限，難以在長距離或較粗的神經(jīng)導管中發(fā)揮作用。目前臨床上自體神經(jīng)移植仍然是治療這類疾病最好的方法。因為供移植用的自體神經(jīng)來源有限、產(chǎn)生新的創(chuàng)傷、組織結(jié)構(gòu)和尺寸難以相匹配和移植供區(qū)長期失神經(jīng)支配等原因， 導致自體神經(jīng)移植應(yīng)用的很大局限性。但自體神經(jīng)移植治療周圍神經(jīng)缺損良好的效果提示我們在神經(jīng)缺損修復中需要有相關(guān)細胞提供生物微環(huán)境的作用，如果人工神經(jīng)移植物上含有相關(guān)的細胞和組織，將能夠提高缺損神經(jīng)的修復效果。因此，理想的組織工程人工神經(jīng)移植物應(yīng)該包含支架材料、神經(jīng)營養(yǎng)因子和種子細胞三部分。中國專利公開號CN1589913公開了一種用于修復周圍神經(jīng)缺損的組織工程化周圍神經(jīng)，使用神經(jīng)膠質(zhì)細胞或向神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化的干細胞作為種子細胞，采用生物可降解材料構(gòu)成的神經(jīng)導管，同時應(yīng)用復合有神經(jīng)營養(yǎng)因子的控制釋放微球，并含有細胞外基質(zhì)。由于神經(jīng)干細胞研究起步較晚，目前建立的神經(jīng)干細胞系絕大多數(shù)來源于鼠，而鼠與人之間存在明顯的種屬差異，利若用自體細胞，由于神經(jīng)干細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，取材難度非常大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種帶有活細胞或者組織的的殼聚糖人工神經(jīng)移植物及其用途。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是
一種組織工程神經(jīng)移植物，其特征在于，所述的移植物包括(a)管狀本體，所述管狀本體是指用殼聚糖加工而成的管壁內(nèi)分布豐富孔隙的導管，(b)包繞或者分布在所述管狀本體孔隙內(nèi)和表面的細胞或組織，所述的細胞包括骨髓干細胞、骨隨間沖質(zhì)干細胞、雪旺細胞或者背跟神經(jīng)節(jié)組織一種或幾種組合。上述管狀本體為孔隙率50-90%、孔徑50-300Mm的具有多孔結(jié)構(gòu)、抗拉強度高的神
經(jīng)導管。
上述管狀本體內(nèi)徑為0. 5-8mm，壁厚0. l_3mm。上述管狀本體在于是在不添加任何發(fā)泡劑、交聯(lián)劑的情況下，通過弱酸溶解、注模、冷凍成型、中和固定、清洗、冷凍干燥等工藝制得。在制造過程中，通過改變殼聚糖溶液的濃度來調(diào)節(jié)導管管壁的孔隙率；通過改變冷凍成型溫度和冷凍速度調(diào)節(jié)所生成的冰晶大小以控制殼聚糖導管管壁的孔徑；通過改變殼聚糖的乙?；潭纫钥刂茖Ч艿慕到馑俣取Ｉ鲜鼋M織工程神經(jīng)移植物包繞或者分布在所述管狀本體孔隙內(nèi)和表面的細胞或組織密度為1XIO6-IX 108/ml，來源于自體或異體。上述的組織工程神經(jīng)移植物用于周圍神經(jīng)缺損和脊髓損傷，尤其是對粗大神經(jīng)干長距離的缺損和陳舊性周圍神經(jīng)缺損。骨髓干細胞是存在于骨髓中的多能干細胞，包括造血干細胞和間充質(zhì)干細胞兩類。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)是骨髓內(nèi)造血干細胞以外的非造血干細胞，是造血微環(huán)境的重要組成部分。近年來的研究表明MSCs具有全能干細胞的特點，有報道MSCs可跨胚層分化為星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞、神經(jīng)細胞、雪旺氏細胞，并表達神經(jīng)組織細胞表型蛋白如NGF、MAP-2、CNPase, GFAP, 0X-42及 SlOO等相關(guān)因子，以改善神經(jīng)再生過程中的微環(huán)境。近年來研究顯示，MSCs在體內(nèi)、外可誘導分化為雪旺氏樣細胞，并可促進周圍神經(jīng)損傷的修復。研究發(fā)現(xiàn)，將MSCs植入硅膠管內(nèi)， 可以促進大鼠及犬坐骨神經(jīng)再生。雪旺氏細胞的主要功能之一是形成髓鞘。髓鞘是脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)圍繞神經(jīng)軸突高度特化的膜性結(jié)構(gòu)，生理功能主要是促使鈉離子順利通過、傳導神經(jīng)沖動和防止神經(jīng)沖動擴散的絕緣作用。髓鞘再生，使軸突重新獲得包繞是恢復軸突生理功能的前提。同時， 雪旺氏細胞還具有分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子如NGF、BDNF CNTF、FGF，產(chǎn)生細胞外基質(zhì)CEM和細胞黏附分子CAM等功能，為支持和引導軸突再生，軸突再生提供良好的環(huán)境。本發(fā)明采用種子細胞相對于現(xiàn)有技術(shù)中采用的神經(jīng)干細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞而言， 骨髓間充質(zhì)干細胞具有自我更新、高度增殖等干細胞特點，并具有分化為雪旺氏細胞的潛能，骨髓干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞和雪旺氏細胞來源豐富，取材方便，容易分離純化，而且為同種同體細胞來源，無免疫排斥反應(yīng)，更適于作為良好的種子細胞，用于構(gòu)建組織工程化神經(jīng)，特別是用于對粗大神經(jīng)干長距離的缺損和陳舊性周圍神經(jīng)缺損的修復。此外，骨髓間充質(zhì)干細胞和雪旺氏細胞具有分泌表達神經(jīng)營養(yǎng)因子的功能，與現(xiàn)有技術(shù)相比，采用本發(fā)明所述的組織工程神經(jīng)移植物無需再附加外源的神經(jīng)營養(yǎng)因子就能夠提高缺損神經(jīng)的修復效果，其制備工藝與現(xiàn)有技術(shù)相比也更簡便。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
具體實施例方式
實施例1自體骨髓干細胞的殼聚糖組織工程神經(jīng)的制備
用濃度為2%的乳酸溶解殼聚糖得到殼聚糖的濃度為1.5%溶液。然后將溶液注入模具，經(jīng)-60°C冷凍預成型后，將材料退出模具，放入5%氫氧化鈉溶液，中和材料中的酸，固定成型后，用蒸餾水將過量的堿及生成的鹽清洗干凈后，后經(jīng)冷凍干燥得到含神經(jīng)營養(yǎng)因子的殼聚糖人工神經(jīng)移植物，孔隙率87%，平均孔徑為220-289 μ m。自體骨髓干細胞富集流程抽取受試者骨髓約40ml，肝素抗凝，注意盡量避免凝塊形成，將骨髓在超凈臺內(nèi)轉(zhuǎn)移到2支50ml無菌離心管內(nèi)，分別用PBS等比稀釋并混勻，吸取FIC0LL10-20ml/管X4管，傾斜離心管，將骨髓懸液分別沿壁緩慢加到FICOLL表面，使之形成清晰的分界面，220C，1350轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘，關(guān)剎車，平穩(wěn)取出離心管，于超凈臺中將中間白膜層吸出，至于無菌離心管中，加入PBS至40ml混勻，1500轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，
棄上清；
一次性注射器吸取預先制備好的自體骨髓干細胞懸液，通過輸液軟管注入細胞懸液， 注滿為止。保持移植入殼聚糖導管內(nèi)的細胞密度是lX108/ml，將導管內(nèi)注滿為止。根據(jù)殼聚糖導管的內(nèi)徑和長度規(guī)格的不同注入的細胞總量不同。這樣得到含自體骨髓干細胞的殼聚糖組織工程神經(jīng)。實施例2自體骨髓間沖質(zhì)干細胞(MSCs)的殼聚糖組織工程神經(jīng)
用濃度為2%的醋酸溶解殼聚糖得到殼聚糖的濃度為洲溶液。然后將溶液注入模具， 經(jīng)-70°C冷凍預成型后，將材料退出模具，放入到10%碳酸鈉溶液中，中和材料中的酸固定成型后，用蒸餾水將過量的堿及生成的鹽清洗干凈后，然后經(jīng)冷凍干燥得到殼聚糖人工神經(jīng)移植物，孔隙率72%，平均孔徑為130-180 μ m。自體骨髓間沖質(zhì)干細胞富集流程
(一)細胞分離
1.抽取受試者骨髓約40ml，肝素抗凝，注意盡量避免凝塊形成
2.將骨髓在超凈臺內(nèi)轉(zhuǎn)移到2支50ml無菌離心管內(nèi)，分別用PBS等比稀釋并混勻
3.吸取FIC0LL10-20ml/管X4管，傾斜離心管，將骨髓懸液分別沿壁緩慢加到FICOLL 表面，使之形成清晰的分界面
4.22°C，1350轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘，關(guān)剎車
5.平穩(wěn)取出離心管，于超凈臺中將中間白膜層吸出，至于無菌離心管中
6.加入PBS至40ml混勻，1500轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，棄上清
7.重復步驟6
8.加入MESENCULT培養(yǎng)液IOml，吹打均勻
9.取細胞懸液20μ 1于EP管中，再加入白細胞稀釋液ISOul稀釋，于振蕩器混勻，取 20 μ 1加到細胞計數(shù)板上
10.計數(shù)四象限細胞總數(shù)的均數(shù)XIO-E6為總細胞數(shù)
11.以2-5X IOE7/皿的密度計算所需培養(yǎng)的皿數(shù)
12.加入培養(yǎng)液及細胞懸液保證終體積為7-8ml，輕輕搖勻放入孵箱
(二)M小時第一次換液
1.觀察細胞狀態(tài)，是否污染，污染的細胞直接丟棄，禁止于操作間打開培養(yǎng)皿
2.沒有污染的細胞放在超凈臺中，將培養(yǎng)液反復沖洗培養(yǎng)皿底后吸出所有培養(yǎng)液
3.鏡下觀察，若發(fā)現(xiàn)紅細胞很多，可用PBS再沖洗一遍
4.加入培養(yǎng)液7-8ml，放入孵箱
5.以后每3天換液一次，每次半量換液，直到細胞生長達到培養(yǎng)皿底部的70-80%傳代
(三)MSCs傳代
1.觀察細胞狀態(tài)(同上) 2.未污染的培養(yǎng)皿置于超凈臺中，吸出所有培養(yǎng)液并保存于無菌離心管中
3.以PBS3-細1/皿沖洗培養(yǎng)皿底并棄去(洗去殘留培養(yǎng)液)4.每皿加入3-鈿1，37度預溫的胰酶，置于孵箱保溫
5.3分鐘后鏡下觀察細胞是否變圓，若仍為梭形，可繼續(xù)消化1-2分鐘
6.取出培養(yǎng)皿，每皿加入5-6ml舊培養(yǎng)液中和胰酶
7.吹打至所有細胞懸浮
8.收集細胞懸液，1500轉(zhuǎn)/分離心，棄上清
9.加入Iml新鮮培養(yǎng)液，混勻
10.計數(shù)(可不加白細胞稀釋液，其余同上)
11.按2-5XIOE5/皿將細胞接種到培養(yǎng)皿中，并加入新鮮培養(yǎng)液，使終體積達7-8ml， 放入孵箱
12.傳代后的細胞3-4天半量換液1次，細胞生長面積達培養(yǎng)皿底部80-90%需再傳代
(四)MSCs凍存
1.1-8步驟同上
2.凍存細胞終濃度為2-5X10E6/ml，計算需要凍存的管數(shù)和體積
3.按(培養(yǎng)液+細胞)白蛋白DMS0=7:2:1凍存
4.注意DMSO要緩緩加入細胞懸液，并在加入過程中要不斷混勻
5.蓋緊凍存管管蓋，塑料膜封口，在瓶身記錄姓名、細胞代數(shù)及數(shù)目、凍存時間
6.凍存管外以2-3塊紗布包裹，先置于4度冰箱2小時，-20度冰箱4小時，最后放入-80度冰箱(可直接置于-80度冰箱)
(五)MSCs解凍
1.從冰箱取出凍存管，以冰塊運輸
2.解開紗布但保留塑料膜，手持凍存管于37度水浴中不斷晃動，以使細胞在1分鐘內(nèi)完全解凍
3.擦干水跡，酒精消毒后置于超凈臺中，揭開塑料膜，打開管蓋
4.將凍存管內(nèi)細胞懸液移入離心管，加入生理鹽水+5%白蛋白洗滌，混勻，1500轉(zhuǎn)/ 分離心5分鐘
5.重復上述步驟1次 (六)收集MSCs
1.在細胞傳代過程中直接收集MSCs或收集解凍后經(jīng)過洗滌的MSCs，加入含20%白蛋白的生理鹽水制成細胞懸液備用
2.取1滴計數(shù)
3.臺盼蘭等體積稀釋后計算細胞活性計數(shù)100個細胞，拒染數(shù)X1%
4.MSCs用于輔助治療前需進行流式細胞儀鑒定細胞類型；染色體檢測排除二倍體變異；輸注前行病原學檢測；細胞懸液皮試
一次性注射器吸取預先制備好的自體骨髓間充質(zhì)干細胞懸液，伸入殼聚糖導管內(nèi)，邊退邊注入細胞懸液，注滿為止，吻合口進針處縫合密封。保持移植入殼聚糖導管內(nèi)的MSCs 細胞密度是lX108/ml，將導管內(nèi)注滿為止。根據(jù)殼聚糖導管的內(nèi)徑和長度規(guī)格的不同注入的細胞總量不同。這樣得到含自體骨髓間沖質(zhì)干細胞的殼聚糖組織工程神經(jīng)。實施例3雪旺氏細胞的殼聚糖組織工程神經(jīng)用濃度為2%的檸檬酸酸溶解殼聚糖得到殼聚糖的濃度為5%溶液，然后將溶液注入模具，經(jīng)-80°C冷凍預成型后，將材料退出模具，放入到5%氫氧化鈉溶液中，中和材料中的酸固定成型后，用蒸餾水將過量的堿及生成的鹽清洗干凈后，然后經(jīng)冷凍干燥得到殼聚糖人工神經(jīng)移植物，孔隙率51%，平均孔徑為57-96 μ m。將上述制備的殼聚糖人工神經(jīng)導管高壓消毒備用。于實驗前一天，DMEM+15%FBS完全培養(yǎng)基中浸泡Mh。背根神經(jīng)節(jié)取自胚胎16d SD大鼠L4，5，6。在預備好的絲管兩端各植入3個DRG，于生物反應(yīng)器中用DMEM+15%FBS培養(yǎng)Id后，換成97%neurobasal+2%B27+l%g Iutaminate的神經(jīng)元培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6d。取新生Id SD大鼠坐骨神經(jīng)，通過反復植塊法得到較純的雪旺氏細胞將平均密度為8X 106/ml雪旺氏細胞用微量注射器注入已植有DRG 的管腔內(nèi)，于生物反應(yīng)器內(nèi)分別培養(yǎng)2、3和4周后，觀察絲管內(nèi)細胞的生長狀態(tài)。等雪旺氏細胞布滿導管后即為含雪旺氏細胞的組織工程神經(jīng)。實施例4用組織工程化周圍神經(jīng)修復SD大鼠坐骨神經(jīng)缺損3個月的動物實驗
使用含雪旺氏細胞的組織工程神經(jīng)修復SD大鼠坐骨神經(jīng)缺損1厘米3個月，術(shù)后M周通過電生理學、組織形態(tài)學、神經(jīng)示蹤技術(shù)、超微結(jié)構(gòu)觀察等多種手段、多指標綜合評價，電生理可以檢測到坐骨神經(jīng)復合動作電位，結(jié)果顯示再生的纖維排列整齊，坐骨神經(jīng)修復效果較好。實施例5用組織工程化周圍神經(jīng)修復犬坐骨神經(jīng)缺損5厘米的動物實驗
使用含自體骨髓間沖質(zhì)的組織工程神經(jīng)修復犬大鼠坐骨神經(jīng)缺損5厘米，術(shù)后1周到 6個月，定期、動態(tài)觀察犬術(shù)肢運動功能恢復情況。結(jié)果顯示，術(shù)后所有動物左股手術(shù)創(chuàng)口處未見明顯感染跡象，體溫正常，飲食正常，體重逐漸增長，且活潑好動。術(shù)后6月，自體MSCs 組織工程化神經(jīng)組(TENG組)和自體神經(jīng)組(坐骨神經(jīng)切斷5cm后原位縫合，autologous 組)動物行走自如，上下樓梯和雙后肢站立時術(shù)肢能夠發(fā)力，整個運動姿態(tài)相當協(xié)調(diào)；結(jié)果顯示，自體MSCs組織工程化神經(jīng)成功修復犬坐骨神經(jīng)缺損5cm，術(shù)后6個月粗大的坐骨神經(jīng)干缺損被再生的神經(jīng)組織重建，肌復合動作電位恢復，軸突的物質(zhì)運輸功能得以重現(xiàn)，靶肌得到再生神經(jīng)的重新支配，實現(xiàn)結(jié)構(gòu)與功能的重建。
權(quán)利要求
1.一種組織工程神經(jīng)移植物，包括(a)管狀本體，所述管狀本體是指用殼聚糖加工而成的管壁內(nèi)分布豐富孔隙的導管，(b)包繞或者分布在所述管狀本體孔隙內(nèi)和表面的細胞或組織，其特征在于，所述細胞或組織包括骨髓干細胞、骨髓間沖質(zhì)干細胞、雪旺細胞或者背跟神經(jīng)節(jié)組織一種或幾種組合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述組織工程神經(jīng)移植物，其特征在于所述管狀本體為孔隙率 50-90%、孔徑50-300Mm的具有多孔結(jié)構(gòu)、抗拉強度高的神經(jīng)導管。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述組織工程神經(jīng)移植物，其特征在于所述管狀本體內(nèi)徑為 0. 5-8mm，壁厚 0. l_3mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述組織工程神經(jīng)移植物，其特征所述管狀本體在于是在不添加任何發(fā)泡劑、交聯(lián)劑的情況下，通過弱酸溶解、注模、冷凍成型、中和固定、清洗、冷凍干燥等工藝制得。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述組織工程神經(jīng)移植物，其特征在于所述包繞或者分布在所述管狀本體孔隙內(nèi)和表面的細胞或組織密度為1XIO6-IX 108/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述組織工程神經(jīng)移植物，其特征在于所述的細胞或者組織包括來源于自體或異體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述組織工程神經(jīng)移植物的用途，其特征在于所述的組織工程神經(jīng)移植物用于周圍神經(jīng)缺損和脊髓損傷的修復。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述組織工程神經(jīng)移植物的用途，其特征在于所述周圍神經(jīng)缺損和脊髓損傷為粗大神經(jīng)干長距離的缺損和陳舊性周圍神經(jīng)缺損。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含神經(jīng)營養(yǎng)因子的殼聚糖人工神經(jīng)移植物及制備方法，殼聚糖人工神經(jīng)移植物是在不添加任何發(fā)泡劑、交聯(lián)劑的情況下，通過弱酸溶解、注模、成型、中和固定、清洗、冷凍干燥等工藝，將殼聚糖加工成具有多孔結(jié)構(gòu)、抗拉強度高的神經(jīng)導管。在神經(jīng)導管中含有治療作用的包繞或者分布在所述管狀本體孔隙內(nèi)和表面的細胞或組織，包括自體骨髓干細胞、自體骨隨間沖質(zhì)干細胞、雪旺細胞或者背跟神經(jīng)節(jié)組織或其組合，該組織工程化神經(jīng)可用于修復周圍神經(jīng)缺損，同時也可應(yīng)用于脊髓損傷的修復。
文檔編號A61L27/36GK102343114SQ20111032447
公開日2012年2月8日 申請日期2011年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月24日
發(fā)明者丁斐, 劉紅, 楊宇民, 湯欣, 顧劍輝, 顧曉松 申請人:南通大學