以1L計(jì)，由以下量的組分組成：
[0041] 丨丨衡十 100?150mL; 蔗糖 5.0g; 瓊脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
[0042] 所述的豆芽汁的制備：剛出芽的大豆500g，加水2500mL，煮沸濃縮至1000mL后過 濾，得到豆芽汁。
[0043] 該平板豆芽汁甘薯汁固體培養(yǎng)基的配方有利于納豆芽孢桿菌菌落形成和高通量 篩選。該斜面豆芽汁甘薯汁固體培養(yǎng)基的配方有利于納豆芽孢桿菌保藏。
[0044] 本發(fā)明中，采用基因組重排技術(shù)選育納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-303時(shí)，選育平 板中添加一定比例的發(fā)酵培養(yǎng)基組分（甘薯汁），而發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定比例的選育平 板組分（豆芽汁），使得選育與發(fā)酵兩環(huán)節(jié)之間形成關(guān)聯(lián)，促使選育環(huán)節(jié)表現(xiàn)出高產(chǎn)表型的 菌株在發(fā)酵時(shí)依然表現(xiàn)出高產(chǎn)表型，此即為本發(fā)明的底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略。
[0045] 步驟2)中，所述的從中篩選出甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型的干酪乳桿菌，具體包括：① 制備2個(gè)平板MRS固體培養(yǎng)基，其中一個(gè)將甲硫氨酸（Met)配入（Met添加量為10-15mg/ L)，為平板C，另一個(gè)為單純MRS固體培養(yǎng)基平板（平板D)，為平板D;②將誘變后的干酪乳 桿菌（LactobacilluscaseiShirota)涂布其中一個(gè)平板后，再用纖維素膜影印至另一個(gè) 平板，使平板C和平板D互為影印平板；③在平板C與平板D的同一位置，平板C出現(xiàn)菌落 而平板D未出現(xiàn)菌落，或平板C上的菌落顯著大于平板D上的菌落，則該菌落為甲硫氨酸營 養(yǎng)缺陷型干酪乳桿菌，命名為干酪乳桿菌LcS-Mef，保藏于斜面MRS固體培養(yǎng)基中。
[0046] 所述的平板MRS固體培養(yǎng)基和斜面MRS固體培養(yǎng)基以1L計(jì)，由以下量的組分組 成：
[0047] 蛋白胨 l〇.〇g; 牛肉膏 l〇.〇g; 酵母膏 5.0g; 檸檬酸氫二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 〇.58g; 硫酸猛 0.25g; 瓊脂 20g; 吐溫.80 l.OmL； 水 余量； 該MRS固體培養(yǎng)基的pH值保持在6.2?6.4。
[0048] 該MRS固體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌菌落形成和甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型干酪乳桿 菌的篩選。
[0049] 本發(fā)明中，采用隨機(jī)誘變技術(shù)獲得甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷（Me〇的干酪乳桿 菌（LactobacilluscaseiShirota-Met，LcS-Met)。LcS-Met在生長速度上高于 BN-NKPQQ-RWX-303,但前者對(duì)后者營養(yǎng)依賴，兩者之間形成穩(wěn)定共生關(guān)系，通過構(gòu)建共生關(guān) 系的策略實(shí)現(xiàn)納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌的共發(fā)酵，獲得富含NK和PQQ的甘薯汁。
[0050] 步驟3)中，在共發(fā)酵之前，將BN-NKPQQ-RWX-303和LcS-Met_*別進(jìn)行活化培 養(yǎng)，BN-NKPQQ-RWX-303在豆芽汁甘薯汁液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為34? 36°C(優(yōu)選35°C)，LcS-Met-在MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為36?38°C(優(yōu) 選 37。。）。
[0051] 所述的豆芽汁甘薯汁液體培養(yǎng)基以1L計(jì)，由以下量的組分組成：
[0052] 甘薯汁 100 ?150mL;
[0053] 鹿糖 4. 0 ?6. 0g;
[0054] 豆芽汁 余量。
[0055] 所述的豆芽汁甘薯汁液體培養(yǎng)基以1L計(jì)，優(yōu)選的，由以下量的組分組成：
[0056] 甘薯汁 100 ?150mL;
[0057] 鹿糖 5. 0g;
[0058] 豆芽汁 余量。
[0059] 該豆芽汁甘薯汁液體培養(yǎng)基的配方有利于納豆芽孢桿菌增殖培養(yǎng)。豆芽汁制備： 剛出芽的大豆500g，加水2500mL，煮沸濃縮至1000mL后過濾，得到豆芽汁。
[0060] 所述的MRS液體培養(yǎng)基以1L計(jì)，由以下量的組分組成：
[0061] 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 檸檬酸氫二銨 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸鈉 5.0g; 磷酸氫二鉀 2.0g; 硫酸鎂 0.58g; 硫酸錳 0.25g; 吐溫 80 l.OmL； 水 余量； 該MRS液體培養(yǎng)基的pH值保持在6.2?6.4。
[0062] 該MRS液體培養(yǎng)基有利于干酪乳桿菌增殖培養(yǎng)。
[0063] 將BN-NKPQQ-RWX-303和LcS-Met_*發(fā)酵含甘薯汁的發(fā)酵培養(yǎng)基，具體包括：將活 化后的BN-NKPQQ-RWX-303和LcS-Met_混合，形成混合菌液，將混合菌液接種至含甘薯汁的 發(fā)酵培養(yǎng)基，紗布封口培養(yǎng)后得到富含NK和PQQ的甘薯汁。
[0064] 所述的含甘薯汁的發(fā)酵培養(yǎng)基以1L計(jì)，由以下量的組分組成：
[0065] 薦糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麥芽糖 20.0g; 「人芽計(jì) 100mL； 甘薯汁 余量。
[0066] 所述的甘薯汁的制備包括：水中加甘薯塊，浸泡2?12小時(shí)后，90°C?99°C以上 碾磨成漿汁，得到甘薯汁，其中，所述的水的體積與甘薯塊的質(zhì)量之比為100mL:10?25g。 具體地，如100mL水中加10?25g甘薯塊，浸泡2小時(shí)以上后，90°C以上碾磨成漿汁。
[0067] 混合菌液中，所述的BN-NKPQQ-RWX-303和LcS-Mef的混合密度比為1:2?1:5。
[0068] 所述的混合菌液接種至含甘薯汁的發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量為1 %?5%。
[0069] 所述的紗布封口培養(yǎng)的條件為：37°C?42°C六層紗布封口培養(yǎng)24h?36h。
[0070] 共發(fā)酵時(shí)，在含甘薯汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加酪氨酸和谷氨酸對(duì) BN-NKPQQ-RWX-303進(jìn)行代謝調(diào)控，促進(jìn)PQQ合成，添加麥芽糖對(duì)BN-NKPQQ-RWX-303進(jìn)行代 謝調(diào)控，促進(jìn)NK生成，添加豆芽汁促進(jìn)BN-NKPQQ-RWX-303在甘薯汁發(fā)酵過程中的增殖。本 發(fā)明中，納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌選育及其共發(fā)酵制備的發(fā)酵甘薯汁富含納豆激酶和吡 咯喹啉醌，具有甘薯汁固有的滋味和發(fā)酵后特有的風(fēng)味。
[0071] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0072] -、本發(fā)明使用的納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌均屬于食品級(jí)安全微生物。
[0073] 二、首次采用基因組重排技術(shù)優(yōu)化NK和PQQ合成途徑，對(duì)納豆芽孢桿菌所有可能 與NK和PQQ合成有關(guān)的主流及旁支途徑統(tǒng)籌優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)協(xié)同突變，進(jìn)而通過高通量 篩選使多位點(diǎn)協(xié)同突變的表型從突變庫中凸顯。同時(shí)，在基因組重排技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步采 用底物誘導(dǎo)適應(yīng)性策略，保障了選育環(huán)節(jié)表現(xiàn)出高產(chǎn)表型的菌株在發(fā)酵時(shí)依然表現(xiàn)出高產(chǎn) 表型，獲得能夠在甘薯汁發(fā)酵中高產(chǎn)NK兼PQQ的納豆芽孢桿菌BN-NKPQQ-RWX-303。
[0074] 三、首次采用構(gòu)建共生關(guān)系的策略實(shí)現(xiàn)納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌的共發(fā)酵。通 過隨機(jī)誘變獲得甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷（Met_)干酪乳桿菌LcS_Met_。LcS_Met_在生長速度上 高于BN-NKPQQ-RWX-303,但前者對(duì)后者營養(yǎng)依賴，兩者之間形成穩(wěn)定共生關(guān)系，保障了共發(fā) 酵順利完成，從而獲得富含NK和PQQ的甘薯汁。
[0075] 四、從結(jié)構(gòu)上看，PQQ通過酪氨酸和谷氨酸之間形成肽鍵連接環(huán)化而成。本發(fā)明通 過在含甘薯汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加酪氨酸和谷氨酸對(duì)BN-NKPQQ-RWX-303進(jìn)行代謝調(diào)控， 促進(jìn)PQQ合成。通過在含甘薯汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加麥芽糖對(duì)BN-NKPQQ-RWX-303進(jìn)行代謝 調(diào)控，促進(jìn)NK生成。通過在含甘薯汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加豆芽汁促進(jìn)BN-NKPQQ-RWX-303在 甘薯汁發(fā)酵過程中的增殖，從而得到富含NK和PQQ的甘薯汁，PQQ含量達(dá)到59-70ng/mL，高 于天然食品中含量最高的納豆（55-63ng/mL)和豆腐（25-30ng/mL)。疆活力達(dá)到454-897U/ mL。所獲得的甘薯汁富含納豆激酶和吡咯喹啉醌，具有甘薯汁固有的滋味和發(fā)酵后特有的 風(fēng)味。
【具體實(shí)施方式】
[0076] 在實(shí)施例中，有關(guān)培養(yǎng)基配制如下，
[0077] (a)所述的豆芽汁甘薯汁液體培養(yǎng)基配制完成后，121°C滅菌15min，以1L計(jì)，由以 下量的組分組成：
[0078]甘薯汁 130mL;
[0079]蔗糖 5.0g;
[0080] 豆芽汁 余量；
[0081] 該豆芽汁甘薯汁液體培養(yǎng)基的配方有利于納豆芽孢桿菌增殖培養(yǎng)。豆芽汁制備： 剛出芽的大豆500g，加水2500mL，煮沸濃縮至1000mL后過濾，得到豆芽汁。
[0082] (b)所述的豆芽汁甘薯汁固體培養(yǎng)基（平板）配制完成后，121°C滅菌15min，以1L 計(jì)，由以下量的組分組成：
[0083] 甘薯汁 130mL; 鹿糖 5_0g;
[0084] 瓊脂 1.8g; 豆芽汁 余量；
[0085] 該豆芽汁甘薯汁固體培養(yǎng)基（平板）的配方有利于納豆芽孢桿菌菌落形成和高通 量篩選。
[0086] (c)所述的豆芽汁甘薯汁固體培養(yǎng)基（斜面）配制完成后，121°C滅菌15min，以1L 計(jì)，由以下量的組分組成：
[0087] 甘薯汁 130mL; 蔗糖 5.0g; 瓊脂 1.8g; 豆芽汁 余量； 倒試管斜面
[0088] 該豆芽汁甘薯汁固體培養(yǎng)基（斜面）的配方有利于納豆芽孢桿菌的保藏。
[0089] ⑷所述的MRS液體培養(yǎng)基配制完成后，121°C滅菌15min，以1L計(jì)，由以下