專利名稱：一種分離差異表達基因的方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物工程技術領域，具體的講是一種分離差異表達基因的方法。
目前，在確認和比較差異表達基因研究方面，已有一些相關方法報道。Welsh等(Welsh J et al.Nucleic Acids Res,20:4965-4970,1992)發(fā)表了RNA指紋分析法，用同一個20mer的隨機引物分別進行反轉錄和PCR。Liang和Pardee(Liang P,Pardee AB.Science,257:967-971,1992)報道了mRNA差別顯示技術，用3’端T11VN引物進行cDNA第一條鏈的合成，并用3’端相應T11VN引物和5’端10mer隨機引物進行PCR擴增。這兩種方法，均需要經測序膠分離同位素標記的PCR擴增產物，并用放射自顯影來識別50-100條小于500堿基對(bp)的擴增帶。這兩種方法相對操作繁瑣，實驗過程中接觸放射性同位素，且假陽性率過高。
隨后，很多研究者在mRNA差別顯示技術的基礎上，通過優(yōu)化反應條件形成了一系列的改進方法，使分離克隆差異表達基因的研究工作日趨完善。Sokolov等(SokolovBP,Prockop DJ.Nucleic Acids Res,22:4009-4015,1994)報道了一種快速、簡單的mRNA差別顯示方法，用6mer隨機引物對mRNA進行反轉錄cDNA合成，其cDNA需用核糖核酸酶(RNase)消化殘留的信使核糖核酸(mRNA)，隨后以2-3個10-13mer隨機引物進行PCR擴增，用瓊脂糖凝膠電泳分離擴增的cDNA帶。該方法需要大量mRNA，且需要RNase H處理cDNA庫中殘留的mRNA，實驗操作復雜。
本發(fā)明的目的是提出一種新的分離差異表達基因的方法，該方法為分子生物學實驗室新基因的分離提供了一種有效的工具，本發(fā)明的主要特點是假陽性率低，避免使用同位素，實驗步驟簡單，能克隆到大于500bp的差異表達cDNA。
本發(fā)明將對應細胞群體的總體核糖核酸(總RNA)，用一組6堿基(6mer)的隨機引物進行反轉錄(RT)合成互補脫氧核糖核酸(cDNA)，隨后選用單一、序列確定的10-12堿基的隨機引物(10-12mer)進行聚合酶鏈反應(PCR)，在分離差異表達基因時，使用瓊脂糖凝膠電泳，避免了使用同位素，能在紫外光下直接觀察電泳結果，同時切除差異表達cDNA帶。隨后，進行再擴增、克隆、Northern雜交鑒定和測序。
本發(fā)明的具體實施方式
包含下列各步驟(1)常規(guī)方法提取2個或2個以上相對應細胞群體的總RNA；(2)將總RNA用一組6mer隨機引物進行反轉錄合成cDNA，隨后將該cDNA選用單一、序列確定隨機引物(10-12mer)進行RT-PCR；(3)瓊脂糖凝膠電泳分離差異表達的cDNA片段；(4)將差異表達的cDNA片段PCR再擴增，并直接克隆至pCRⅡ克隆載體；(5)使用Northern雜交鑒定差異表達的cDNA片段的特異性并測序進行同源性比較。
如上述步驟(2)中的反轉錄反應，依次加入下列各組分，在其反應體系中，含0.10-0.25μg/μL總RNA,5μM 6mer隨機引物，1mM dNTP,20U RNase抑制劑，10U AMV反轉錄酶和其1x反應緩沖液。應用DNA擴增儀(PE-2400型)進行反轉錄反應合成cDNA，其反應條件為25℃,8分鐘；42℃,30分鐘；隨后，95℃處理5分鐘。
如上述步驟(2)中的RT-PCR反應，依次加入下列各組分，在其RT-PCR反應體系中，含1-2μL上述反轉錄反應產物(cDNA),2μM 10-12mer單一隨機引物，0.8mM dNTP,1.5mM MgCl2,1U Taq DNA聚合酶和其1×PCR反應緩沖液。應用DNA擴增儀(PE-2400型)進行RT-PCR反應，其反應條件為94℃,5分鐘。94℃,15秒；37℃,30秒；72℃,30秒。重復上述過程共35個循環(huán)。之后，72℃,5分鐘。
如上述步驟(3)中PCR擴增產物在含0.5μg/mL溴化乙錠的1-2％瓊脂糖凝膠上，電泳分離差異表達的cDNA。
如上述步驟(4)中瓊脂糖凝膠電泳分離得到的差異表達的cDNA片段的PCR再擴增反應，依次加入下列各組分，其反應體系中含1ng/μL差異表達cDNA,1μM 10mer相應隨機引物，0.2mM dNTP,1.5mM MgCl2,1U Taq DNA聚合酶和其1×PCR反應緩沖液。應用DNA擴增儀(PE-2400型)進行PCR反應，其反應條件為94℃,5分鐘。94℃,15秒；42℃,30秒；72℃,30秒。重復上述過程共35個循環(huán)。之后，72℃,5分鐘。該再擴增反應產物，按照Invitrogen公司的克隆試劑盒說明直接克隆至pCRⅡ克隆載體，并用EcoRⅠ酶切鑒定重組子。
如上述步驟(5)中Northern雜交分析，首先，分別將相對應細胞群體的10-30μg總RNA經1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，然后，轉移至尼龍膜(Amersham公司)。用α-[32]P-dCTP(福瑞公司)經隨機引物法標記差異表達的cDNA片段作為探針。然后，將該尼龍膜封入含預雜交液的塑料袋中預雜交，預雜交液含50％去離子甲酰胺，10％硫酸葡聚糖，1％SDS和1M NaCl。42℃下預雜交4小時后，直接將該標記探針加入塑料袋中至少雜交12小時。最后，根據雜交膜上所測同位素的放射活性，于-20℃放射自顯影。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的表達量作為內對照。Northern雜交結果用Image Master VDS影像分析攝錄系統(Pharmacia公司)照相并用其軟件進行圖像掃描分析，以積分光密度值(IOD)顯示雜交信號的相對強度。
經Northern雜交分析證實是差異表達的陽性克隆，用AutoReadTM測序盒(Pharmacia公司)從克隆片段兩端雙向測序，所得測序結果采用BLAST SEARCH與DNA數據庫(GenBank、EMBL、DDBJ和PDB)進行同源性比較。
本發(fā)明適用于動物或植物、細胞系或組織，是一種適用范圍廣的分離差異表達基因的方法。
本發(fā)明在分離差異表達cDNA帶時，使用瓊脂糖凝膠電泳，避免了使用同位素，這樣減少了放射性物質的污染及其對人體的損害，同時實驗費用亦相對降低。并可以在紫外光下直接觀察電泳結果。利用本發(fā)明提供的方法，我們已克隆到2個與細胞癌變相關的新基因。因此，本發(fā)明具有設備簡單、價格低廉、操作方便與分離和克隆效率高的特點。
本發(fā)明突出的實質性特點可從下述實施例得以體現，但是它們并不是對本發(fā)明作任何限制。
實例1．總RNA提取采用異硫氰酸胍酸酚法，提取R6#13-8和T2細胞的總RNA。具體操作步驟如下(1)用400μl異硫氰酸胍裂解液裂解5×106個細胞(R6#13-8或T2)，加入40μl 2M pH4.0的醋酸鈉，混勻；(2)加入440μl水飽和酚，混勻；(3)加入80μl氯仿-異戊醇(49∶1)，混勻；(4)冰浴15分鐘后，于4℃、14000轉，離心15分鐘，移上層水相(約450μl)于另一離心管中；(5)加入100μl氯仿-異戊醇(49∶1)，混勻；(6)于4℃、14000轉離心10分鐘后，將上層水相移入另一離心管中；(7)加入500μl異丙醇，混勻，使RNA沉淀，于-20℃保存至少2個小時；(8)于4℃、14000轉離心20-30分鐘，棄去上清液，盡量去凈異丙醇；(9)加入0.3mL 75％的酒精漂洗RNA沉淀兩次，去凈酒精，自然干燥10分鐘；(10)加入20μl由DEPC處理過的水，于65℃保溫10分鐘，溶解總RNA。
結果T2細胞得到126.17微克總RNA,R6#13-8細胞得到126.17微克總RNA。

圖1是1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳圖示，其檢測總RNA的完整性，可見R6#13-8和T2的總RNA完整，28S條帶是18S條帶的二倍。測定R6#13-8和T2總RNA的OD.260/OD.280比值分別為1.96和1.99。
實例2．用瓊脂糖凝膠電泳分離差異表達的cDNA片段首先，分別將R#13-8和T2的總RNA反轉錄成cDNA。其20μL反轉錄反應體系中，依次加入下列個組份，含5μg總RNA,5μM 6mer隨機引物(Sangon公司)，1mMdNTP,20U RNase抑制劑，10U AMV反轉錄酶和其1x反應緩沖液(Promega公司)。使用DNA擴增儀PE-2400型進行反轉錄反應，其反應條件為25℃,8分鐘；42℃,30分鐘。95℃處理5分鐘。隨后，將上述反轉錄成的cDNA進行RT-PCR反應。其25μL RT-PCR反應體系中，依次加入下列個組份，含1μL上述反轉錄產物(cDNA),2μM 10mer或12mer單一隨機引物(N1-N12,Gibco公司；S450-S470,Sangon公司)，0.8mM dNTP,1.5mM MgCl2,1U Taq DNA聚合酶和其1×PCR反應緩沖液(天津醫(yī)藥生物工程公司)。使用DNA擴增儀PE-2400型進行RT-PCR反應，其反應條件為94℃,5分鐘。94℃,15秒；37℃,30秒；72℃,30秒。上述過程共重復35個循環(huán)。之后，72℃,5分鐘。最后，取10μL上述RT-PCR擴增產物在含0.5μg/mL溴化乙錠的1.2％瓊脂糖凝膠上電泳分離差異表達的cDNA片段。在紫外光下觀察，并切下差異表達的cDNA帶。
結果發(fā)現使用一組6mer隨機引物進行cDNA合成，選用33個單一、確定隨機引物(10或12mer)分別進行RT-PCR，用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳分離T2(T)和R6#13-8(R)差異表達的cDNA。由電泳結果可知，R6#13-8和T2之間無差異帶的引物20個，有差異帶的引物3個，電泳帶淺或無的引物有10個。有帶的引物PCR擴增所顯示的電泳帶數介于1-11條之間，共獲得90多條清晰、可辨的電泳帶，長度為300bp-3000bp。發(fā)現3個差異表達的cDNA片段是#6、#7和#8(圖2箭頭所示)，2個片段(#6和#8)在R6#13-8中高表達，1個片段(#7)在T2中高表達。
實例3．差異表達cDNA的再擴增及克隆將上述實例2中分離得到的3個差異表達cDNA片段#6、#7和#8，進行PCR再擴增。依次加入下列各組份，其25μ LPCR反應體系中，含20ng差異表達的cDNA,1μM10mer相應隨機引物，0.2mM dNTP,1.5mM MgCl2,1U Taq DNA聚合酶和其1×PCR反應緩沖液。其反應條件與上述實例2中RT-PCR的反應條件相同。PCR再擴增結果用1.2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定差異片段#6、#7和#8的特異性(見圖3a箭頭所指)，#6為800bp、#7為1600bp和#8為900bp。然后，分別將#6和#8 PCR再擴增產物直接克隆至pCRⅡ克隆載體(Invitrogen公司)，并以EcoRⅠ酶切鑒定，酶切片段大小與預期結果一致如圖3b所示，M為DNA分子量標準λDNA/EcoRⅠ+HindⅢmarker)。
實例4．Northern雜交結果分析及同源性比較從瓊脂糖凝膠中分離得到的差異表達的cDNA帶，要經過Northern雜交確定其特異性，排除假陽性。首先，分別將R6#13-8和T2的20μg總RNA經1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳后，轉移至尼龍膜(Amersham公司)。隨后，以差異表達片段#6和#8為摸板，用α-[32]P-dCTP(福瑞公司)經隨機引物法標記探針。最后，分別用#6和#8的標記探針，與上述尼龍膜進行預雜交和雜交。預雜交液含50％去離子甲酰胺，10％硫酸葡聚糖，1％SDS和1M NaCl。42℃預雜交4小時后，分別直接加入#6和#8的標記探針至少雜交12小時。雜交反應之后，根據雜交膜上所測同位素的放射活性，于-20℃放射自顯影1-14天。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的表達量作為內對照。Northern雜交結果用Image Master VDS影像分析攝錄系統(Pharmacia公司)照相并用其軟件進行圖像掃描分析，以積分光密度值(IOD)顯示雜交信號的相對強度。
用Northern雜交分析差異片段#6和#8的特異性。其中分別以差異cDNA#6和#8為模板探針，與T2和R6#13-8的總RNA雜交，箭頭所指為雜交信號的位置。結果發(fā)現#6和#8的雜交信號與RT-PCR結果一致，均在R6#13-8中高表達。#6的雜交信號是2條帶，其兩個轉錄子#6-1為4300bp,#6-2為2900bp。#8的雜交信號是1條帶，轉錄子大小為900bp(圖4a)。Northern雜交結果圖像掃描分析見圖4b，將圖4a從上到下掃描，橫坐標為從圖4a上端到雜交信號的相對距離；縱坐標以IOD值表示雜交信號的相對強度，粗線代表R6#13-8，細線代表T2。雜交信號強度(IOD)的定量分析，參照GAPDH內對照，當GAPDH雜交信號在R6#13-8和T2中相同時，差異轉錄子在R6#13-8中的表達量，#6-1是T2中的1.8倍，#6-2是T2中的4.0倍，#8是T2中的1.8倍。
在R6#13-8中高表達的2個克隆片段#6和#8，分別用AutoreadTM測序盒從克隆片段的兩端雙向測序。經DNA數據庫(GenBank、EMBL、DDBJ和PDB)國際聯網查詢，得知與已知序列無同源性，推測為2個與細胞癌變相關的新基因。
權利要求
1．一種分離差異表達基因的方法，其特征在于它包含下列各步驟(1)常規(guī)提取2個或2個以上相對應細胞群體的總RNA；(2)將總RNA用一組6堿基隨機引物進行反轉錄合成cDNA，隨后，用該cDNA選用單一、10-12堿基的序列確定隨機引物進行RT-PCR；(3)瓊脂糖凝膠電泳分離差異表達的cDNA片段；(4)將差異表達的cDNA片段PCR再擴增，并直接克隆至pCRⅡ克隆載體；(5)使用Northern雜交鑒定差異表達cDNA片段的特異性并測序進行同源性比較。
2．如權利要求書1所述的分離差異表達基因的方法，其特征在于所述的反轉錄反應，依次加入下列各組分，在其反應體系中，含0.10-0.25μg/μL總RNA,5μM 6mer隨機引物，1mM dNTP,20U RNase抑制劑，10U AMV反轉錄酶和其1x反應緩沖液；應用DNA擴增儀(PE-2400型)進行反轉錄反應合成cDNA，其反應條件為25℃,8分鐘；42℃,30分鐘；隨后，95℃處理5分鐘；所述的RT-PCR反應，依次加入下列各組分，在其RT-PCR反應體系中，含1-2μL上述反轉錄反應產物(cDNA),2μM 10-12mer單一隨機引物，0.8mM dNTP,1.5mM MgCl,1U Taq DNA聚合酶和其1×PCR反應緩沖液；應用DNA擴增儀(PE-2400型)進行RT-PCR反應，其反應條件為94℃,5分鐘。94℃,15秒；37℃,30秒；72℃,30秒；重復上述過程共35個循環(huán)；之后，72℃,5分鐘；所述的RT-PCR反應的擴增產物在含0.5μg/mL溴化乙錠的1-2％瓊脂糖凝膠上，電泳分離差異表達的cDNA片段；所述的瓊脂糖凝膠電泳分離得到的差異表達的cDNA片段，其PCR再擴增反應依次加入下列各組分，其反應體系中含1ng/μL DNA,1μM 10mer相應隨機引物，0.2mM dNTP,1.5mM MgCl2,1U Taq DNA聚合酶和其1×PCR反應緩沖液；應用DNA擴增儀(PE-2400型)進行PCR反應，其反應條件為94℃,5分鐘；94℃,15秒；42℃,30秒；72℃,30秒；重復上述過程共35個循環(huán)；之后，72℃,5分鐘。
3．一種分離差異表達基因的方法，其特征在于它的優(yōu)選條件為其反轉錄反應體系中含總RNA為0.25μg/μL；其RT-PCR反應體系中，含1μL反轉錄反應產物(cDNA)；RT-PCR反應的擴增產物在含0.5μg/mL溴化乙錠的1.2％瓊脂糖凝膠上，電泳分離差異表達的cDNA片段。
4．如權利要求書1或2所述的分離差異表達基因的方法，其特征在于所述的進行比較的2個或2個以上相對應細胞群體的細胞適于各種生物的細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離差異表達基因的方法。本方法首先將對應細胞群體的總體核糖核酸(總RNA),用一組6堿基(6mer)的隨機引物進行反轉錄(RT)合成互補脫氧核糖核酸(cDNA),隨后選用單一、序列確定的10—12堿基的隨機引物(10－12mer)進行聚合酶鏈反應(PCR),在分離差異表達基因時,用瓊脂糖凝膠電泳,避免了使用同位素,能在紫外光下直接觀察電泳結果,同時切除差異表達的cDNA帶。隨后,進行再擴增、克隆、Northern雜交鑒定和測序。本發(fā)明適用于所有生物的2個或2個以上相對應細胞群體,是一種簡單、快速和經濟的基因分離方法。
文檔編號C12N15/10GK1225391SQ99100349
公開日1999年8月11日 申請日期1999年1月25日 優(yōu)先權日1999年1月25日
發(fā)明者鄭堅瑜, 陳晶, 鮑云鶴, 肖文鸞 申請人:南開大學