一種適用于狗牙根基因差異表達(dá)研究的cDNA-AFLP方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種適用于狗牙根基因差異表達(dá)研究的cDNA-AFLP方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 狗牙根(Cynodondactylon(L. )Pers.)是禾本科虎尾草亞科狗牙根屬植物，是一 種重要的暖季型草坪草、牧草及水土保持植物，抗旱、抗鹽、抗寒性、耐踐踏性強(qiáng)，病蟲害少， 生長快，草層厚，廣泛使用于暖溫帶、亞熱帶及熱帶的運(yùn)動場草坪、公園、道路和廠區(qū)綠化、 河道和山坡等護(hù)坡、放牧草地等，在草坪和牧草生產(chǎn)中具有十分重要的地位。
[0003]分子標(biāo)記能在DNA水平上反映植物遺傳基礎(chǔ)的差異，是植物遺傳育種領(lǐng)域內(nèi)的一 項(xiàng)新興技術(shù)。AFLP技術(shù)是種高效的分子標(biāo)記技術(shù)，是基于PCR技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA限制性片 段，基因組DNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和 相鄰的限制性位點(diǎn)序列，作為引物結(jié)合位點(diǎn)。它結(jié)合了RFLP和PCR技術(shù)特點(diǎn)，具有RFLP技術(shù) 的可靠性和PCR技術(shù)的高效性，可在一次單個(gè)反應(yīng)中檢測到大量的片段。
[0004] cDNA-AFLP技術(shù)結(jié)合了RT-PCR和AFLP技術(shù)，較傳統(tǒng)的AFLP技術(shù)相比，cDNA-AFLP以 mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)而借鑒AFLP的方法，進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增，并將擴(kuò)增 產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示。cDNA-AFLP不需要預(yù)先知道任何序列信息，且多態(tài)性 強(qiáng)，成本低，速度快，更適合對生物體轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行全面分析。一些研究者已經(jīng)利用此技術(shù)從 多種植物上分離了許多跟目標(biāo)性狀相關(guān)的差異表達(dá)基因，尤其是在抗逆和發(fā)育相關(guān)基因的 挖掘中利用（尚雨絲，羅蕊，王文躍，王超，陳永勝，cDNA-AFLP技術(shù)在植物差異基因表達(dá)研究 上的應(yīng)用，內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，29(3) : 319-322.)。
[0005]然而cDNA-AFLP技術(shù)流程復(fù)雜，操作繁瑣，引物設(shè)計(jì)常常根據(jù)植物基因組的不同而 有所差異，同時(shí)Mg2+和dNTPs的比例更會直接影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，使得體系開發(fā)及其困難，限制 了cDNA-AFLP技術(shù)在植物研究領(lǐng)域的應(yīng)用（ChristianW.B.Bachem,RonaldJ.F.J. Oomen,RichardG.F.Visser,TranscriptimagingwithcDNA-AFLP:astep-by-step protocol,PlantMolecularBiologyReporter, 1998，16: 157-173·)。狗牙根到目前 為止還沒有全基因組信息，也沒有開展利用cDNA-AFLP技術(shù)進(jìn)行不同性狀的差異表達(dá)基因 研究。因此，如果根據(jù)狗牙根基因組的表達(dá)特點(diǎn)，開發(fā)狗牙根特有且成熟的cDNA-AFLP技術(shù)， 將會對狗牙根重要基因的發(fā)掘、克隆及分子標(biāo)記輔助選擇育種和比較基因組學(xué)研究等起重 要推動作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對狗牙根基因組的表達(dá)特點(diǎn)，提供一種成熟cDNA-AFLP技術(shù)。
[0007]本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
[0008] -種適用于狗牙根基因差異表達(dá)研究的cDNA-AFLP的方法，包括： 1)雙鏈cDNA的合成及純化。
[0009]提取狗牙根總RNA，做DNA消化，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA質(zhì)量檢測，稀釋成 相同濃度后進(jìn)行cDNA第一鏈的合成試劑盒進(jìn)行第一鏈的合成，第二鏈cDNA的合成使用DNA polymerasel和RNaseΗ進(jìn)行，合成完畢后加入5yL200mmol/LEDTA終止反應(yīng)，并加入苯 酚/氯仿/異戊醇（25: 24:1)溶液進(jìn)行純化，經(jīng)離心和異丙醇沉淀、75%的乙醇洗滌后，溶解 于20yL的ddH20中，雙鏈cDNA即成。再用1.5%的瓊脂糖快速電泳檢測，并測定0D值，RNA濃度 稀釋至800-1200ng/μL后用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
[0010] 2)限制性酶切。
[0011] 根據(jù)狗牙根轉(zhuǎn)錄組的特點(diǎn)，選擇EcoRI和MseI限制性內(nèi)切酶，使用酶切體系參照 內(nèi)切酶說明書進(jìn)行。
[0012] 3)酶切產(chǎn)物的接頭連接。
[0013]向酶切產(chǎn)物中加入EcoRI接頭、MseI接頭、ATP、T4DNALigaseBuffer、T4DNA Ligase等，混勻后稍離心，與37°C連接3h后保存于-20°C冰箱，其中所述的EcoRI限制性內(nèi)切 酶所述的接頭序列為SEQIDNo.l和SEQIDNo.2，MseI限制性內(nèi)切酶接頭序列為SEQID No.3和SEQIDNo.4。
[0014] 4)連接產(chǎn)物PCR預(yù)擴(kuò)增。
[0015]預(yù)擴(kuò)增體系為
混勻，稍離心，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增程序?yàn)?4°C2min; 94°C30s，56°C30s， 72°C60s，共25個(gè)循環(huán);72°C10min。反應(yīng)結(jié)束后取5yL，用1.0 %的瓊脂糖檢測。其中上述 的預(yù)擴(kuò)增引物序列為E00:SEQIDNo.5;M00:SEQIDΝο·6。
[0016] 5)PCR選擇性擴(kuò)增。
[0017]根據(jù)狗牙根轉(zhuǎn)錄組特點(diǎn)，將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍，使用選擇性擴(kuò)增堿基引物進(jìn)行 擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下。
[0018] 混勻，稍離心，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增程序?yàn)?4°C2min;94°C30s，65°C(每循環(huán)降 低0·7°C)30s，72°C60s，共12個(gè)循環(huán)；94°C30s，56°C30s，72°Clmin共23個(gè)循環(huán)；72°C10min。 其中上述的引物序列為引物 1:E-AAC:SEQIDNo.7;E-AAG:SEQIDNo.8;E-ACA:SEQID No.9；E-ACT：SEQIDNo.10；E-ACC：SEQIDNo.11；E-ACG：SEQIDNo.12；E-AGC：SEQID No·13;E-AGG:SEQIDNo·14和引物：M-CAA:SEQIDNo·15;M-CAC:SEQIDNo·16;M-CAG: SEQIDNo.l7；M-CAT：SEQIDNo.18；M-CTA：SEQIDNo.19；M-CTC：SEQIDN〇.20；M-CTG： SEQIDNo.21 ;M-CTT:SEQIDNo.22中的任意一對。
[0019] 6)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。
[0020] 選擇性擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物加入2yLloadingbuffer，以100bpDNAladder為 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，采用8%的變性聚丙烯酰胺進(jìn)行電泳，電泳緩沖液為0.5XTBE，200V穩(wěn)壓電 泳2-2.5h，至loadingbuffer移到凝膠底部時(shí)電泳結(jié)束。電泳結(jié)束后，采用銀染法染色，最 后將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)上拍照。所有數(shù)據(jù)重復(fù)兩次，選擇80_800bp內(nèi)有重復(fù)條帶的數(shù) 據(jù)為"1"，沒有條帶的為"0"。
[0021] 有益效果本發(fā)明提供的cDNA-AFLP方法基于狗牙根的基因組特點(diǎn)，開發(fā)適用于狗牙 根基因差異表達(dá)研究的技術(shù)，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果。
[0022] (1)本發(fā)明利用首次開發(fā)的狗牙根cDNA-AFLP技術(shù)，獲得差異表達(dá)基因序列，克服 了狗牙根無該體系的問題，拓寬了狗牙根分子標(biāo)記輔助育種的思路和領(lǐng)域，擴(kuò)展了狗牙根 基因鑒定的方式。
[0023] (2)本發(fā)明不需要預(yù)先知道任何序列信息，且多態(tài)性強(qiáng)，本低，速度快，更適合對狗 牙根生物體轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行全面分析。
[0024] (3)引物序列、Mg2+和dNTPs的比例等因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響比較大，本發(fā)明在確定引 物序列和Mg2+和dNTPs比例的基礎(chǔ)上，提高了實(shí)驗(yàn)效率，節(jié)約了時(shí)間和資金。
[0025] (4)在本發(fā)明基礎(chǔ)上，使利用cDNA-AFLP標(biāo)記技術(shù)進(jìn)一步開展狗牙根遺傳育種研究 成為可能，同時(shí)還可結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)等手段對狗牙根進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的分析等，有 重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。
[0026]
【附圖說明】
[0027] 圖1用瓊脂糖凝膠電泳對提取的部分總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測（從左到右依次為Μ: Marker;沒有鹽處理時(shí)抗鹽型、中間型、敏鹽型狗牙根的根和葉片材料）。
[0028]圖2連接產(chǎn)物PCR預(yù)擴(kuò)增后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(從左到右依次為沒有鹽處 理時(shí)抗鹽型、中間型、敏鹽型狗牙根的根和葉片材料;M:Marker)。
[0029] 圖3PCR選擇性擴(kuò)增后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測（從左到右依次為M:Marker; 沒有鹽處理時(shí)抗鹽型、中間型、敏鹽型狗牙根的根和葉片材料）。
[0030] 圖4不同引物組合篩選檢測圖。
[0031] 圖5弓丨物組合(E-ACA+M-CTA)在不同狗牙根抗鹽型材料的根系和葉片不同鹽處理 時(shí)間材料上的實(shí)際擴(kuò)增效果(M:Marker)。
[0032]
【具體實(shí)施方式】
[0033]本發(fā)明提供的針對狗牙根基因組的表達(dá)特點(diǎn)，提供一種成熟cDNA-AFLP技術(shù)，其具 體實(shí)施方式如下。
[0034] 1)RNA的提取及雙鏈cDNA的合成及純化。
[0035]取狗牙根的葉和根，用紗布包裹并置于液氮罐里，速凍后置于_70°C冰箱內(nèi)保存。 使用Trizol試劑提取材料的總RNA。提取樣品總RNA后，做DNA消化，然后用瓊脂糖凝膠電泳 進(jìn)行RNA質(zhì)量檢測，稀釋成lOOOng/μL濃度后進(jìn)行cDNA第一鏈的合成試劑盒進(jìn)行第一鏈的 合成，PCR體系為：總RNA約5μg，01igo(dT)18(50μmol/L)lμL，dNTP(10mmol/L)lμL，DEPC-H20補(bǔ)足10yL。于65°C變性5min，置于冰上2min后向上述PCR管中繼續(xù)加入下列成分:5XRT Buffer4yL,RNaseInhibitor(40U/yL)0.5yL,M-MyLVReverseTranscriptase(5U/yL) lyL，ddH20 4.5yL，總體積20yL，混勻稍離心，42°C溫浴1h，70°C15min使酶失活，直接進(jìn) 行第二鏈合成。
[0036]cDNA第二鏈合成使用DNApolymerasel和RNaseΗ進(jìn)行，