專利名稱：一種重組腺病毒及其在腫瘤治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說是涉及一種以串聯(lián)方式同時(shí)攜帶抑癌基因和腫瘤免疫相關(guān)基因的重組腺病毒及其在腫瘤治療中的應(yīng)用。
惡性腫瘤是目前嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，而其治愈率之低給醫(yī)學(xué)工作者帶來嚴(yán)重挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)治療手段(外科手術(shù)、放療、化療)常不能根治惡性腫瘤，且往往由于毒副作用而嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，因此人們迫切需要一種新的腫瘤治療手段?；蛑委熓窃诨蛩缴蠈?duì)疾病進(jìn)行預(yù)防和治療，即通過編碼相關(guān)遺傳信息的特異性脫氧核糖核酸(DNA)序列的轉(zhuǎn)移來達(dá)到治療目的。盡管目前人們對(duì)于腫瘤的發(fā)病機(jī)制還不甚明了，但已有諸多證據(jù)表明腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞遺傳物質(zhì)的改變有關(guān)，因此基因治療對(duì)于腫瘤是一種合理的且有著極好發(fā)展前景的治療手段。近年來基因治療日趨成熟，目前已在美國等發(fā)達(dá)國家廣泛進(jìn)入臨床試驗(yàn)，主要包括三類腫瘤抑制基因治療、腫瘤免疫基因治療和藥物敏感性基因治療。這些方案的共同之處是均通過向患者體內(nèi)導(dǎo)入單一基因(或相關(guān)DNA序列)來達(dá)到治療目的。但腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多階段的復(fù)雜過程，往往涉及多種基因的異常，不同腫瘤乃至患同種腫瘤的不同患者的基因異常情況都不盡相同，因此單靠一種基因或一類治療方案很難達(dá)到廣泛而有效的治療效果。在這種情況下，腫瘤的復(fù)合基因治療往往顯得更為有效，即聯(lián)合多種基因治療策略，通過向患者體內(nèi)導(dǎo)入多種目的基因，從多個(gè)環(huán)節(jié)控制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。
本發(fā)明的目的在于提供一種用于腫瘤復(fù)合基因治療的重組腺病毒。該重組腺病毒以串聯(lián)方式攜帶人抑癌基因和腫瘤免疫相關(guān)基因，因此同時(shí)具備腫瘤抑制基因治療和腫瘤免疫基因治療的雙重功效。
本發(fā)明的具體實(shí)施方案如下1.將人抑癌基因和腫瘤免疫相關(guān)基因以串聯(lián)方式插入到同一株腺病毒載體上，獲得重組腺病毒。
2.觀察到重組腺病毒可以有效地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。
3.觀察到該重組腺病毒介導(dǎo)的抑癌基因和腫瘤免疫相關(guān)基因可在腫瘤細(xì)胞中有效表達(dá)。
4.觀察到抑癌基因具有抑制腫瘤細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其凋亡的功能，即可實(shí)現(xiàn)腫瘤抑制基因治療；亦觀察到腫瘤免疫相關(guān)基因具有增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，進(jìn)而提高機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)的功能，即可實(shí)現(xiàn)腫瘤免疫基因治療。
本發(fā)明提供一種以串聯(lián)方式攜帶抑癌基因和腫瘤免疫相關(guān)基因的重組腺病毒，其中的抑癌基因可以是p53，腫瘤免疫相關(guān)基因可以是B7-1和GM-CSF。該重組腺病毒可以以液體形式被配成注射液、滴液、噴霧劑、涂抹液等用于治療腫瘤，其腫瘤類型可以是頭頸部腫瘤，頭頸部腫瘤的類型又可以是喉癌。實(shí)施例將通過描述以串聯(lián)方式攜帶p53，B7-1和GM-CSF基因的重組腺病毒及其對(duì)喉癌的基因治療作用來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
應(yīng)用本發(fā)明提供的重組腺病毒治療腫瘤是從腫瘤發(fā)生與發(fā)展的機(jī)理入手，聯(lián)合腫瘤抑制基因治療和腫瘤免疫基因治療策略，同時(shí)向患者體內(nèi)導(dǎo)入抑癌基因和腫瘤免疫相關(guān)基因。一方面通過抑癌基因來抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡；另一方面通過腫瘤免疫相關(guān)基因來提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性，進(jìn)而調(diào)動(dòng)機(jī)體自身的抗腫瘤免疫反應(yīng)來殺死殘余或轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞。因此應(yīng)用本發(fā)明提供的重組腺病毒治療腫瘤比以往的腫瘤治療手段更具有科學(xué)性和邏輯性，療效將更持久和徹底。若本發(fā)明得以應(yīng)用，將為目前尚無成熟治療方法的腫瘤的臨床治療提供一種新的治療策略。
結(jié)合附圖進(jìn)一步說明本發(fā)明

圖1為以串聯(lián)方式攜帶抑癌基因和腫瘤免疫相關(guān)基因的重組腺病毒的結(jié)構(gòu)示意圖。1——代表腺病毒基因組2
代表抑癌基因，包括一種或多種的組合A1，A2，...，An。此類基因具有抑制腫瘤細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其凋亡的功能，即可實(shí)現(xiàn)腫瘤抑制基因治療。3
代表腫瘤免疫相關(guān)基因，包括一種或多種的組合B1，B2，...，Bn。此類基因具有增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，進(jìn)而提高機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)的功能，即可實(shí)現(xiàn)腫瘤免疫基因治療。圖2攜帶人野生型抑癌基因p53，免疫共刺激分子B7-1和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF三種外源基因的穿梭質(zhì)粒pBB-102的構(gòu)建示意圖1.poly A；2.GM-CSF基因；3.內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(IRES)；4.p53基因；5.CMV啟動(dòng)子；6.B7-1基因；7.RSV啟動(dòng)子圖3攜帶人野生型p53，B7-1和GM-CSF三種外源基因的重組腺病毒BB-102的結(jié)構(gòu)示意圖1——腺病毒基因組； 2.GM-CSF geneGM-CSF基因；3p53基因；4.B7-1基因圖4免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Ad-p53和BB-102介導(dǎo)的p53基因在喉癌細(xì)胞Hep-2中的表達(dá)1.對(duì)照細(xì)胞，p53表達(dá)陰性；2.攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒Ad-GFP感染的細(xì)胞，p53表達(dá)陰性3.攜帶人野生型p53基因的重組腺病毒Ad-p53感染的細(xì)胞，p53表達(dá)陽性4.BB-102感染的細(xì)胞，p53表達(dá)陽性。圖5流式細(xì)胞分析法檢測(cè)BB-102介導(dǎo)的B7-1基因在Hep-2細(xì)胞中的表達(dá)圖6ELISA檢測(cè)BB-102介導(dǎo)的GM-CSF基因在Hep-2細(xì)胞中的表達(dá)圖7BB-102對(duì)Hep-2細(xì)胞生長的抑制作用圖8TdT法原位檢測(cè)Ad-p53和BB-102介導(dǎo)的p53基因?qū)ep-2細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用
1.對(duì)照細(xì)胞，細(xì)胞無凋亡；2.Ad-GFP感染的細(xì)胞，細(xì)胞無凋亡；3.Ad-p53感染的細(xì)胞，細(xì)胞發(fā)生凋亡；4.BB-102感染的細(xì)胞，細(xì)胞發(fā)生凋亡。圖9透射電鏡觀察Ad-p53和BB-102所介導(dǎo)的p53基因?qū)ep-2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。
1.對(duì)照細(xì)胞細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，無凋亡；2.Ad-GFP感染的細(xì)胞細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，無凋亡；3.Ad-p53感染的細(xì)胞細(xì)胞出現(xiàn)凋亡特征，如染色質(zhì)固縮邊移，線粒體腫脹，富含溶酶體，核破碎等；4.BB-102感染的細(xì)胞；細(xì)胞出現(xiàn)凋亡特征，如染色質(zhì)固縮邊移，線粒體腫脹，富含溶酶體，核破碎等。圖10細(xì)胞毒分析。以BB-102感染Hep-2細(xì)胞而制備的瘤苗可在體外誘導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞(PBL)形成細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)，CTL對(duì)正常Hep-2細(xì)胞具有裂解活性。
實(shí)施例以串聯(lián)方式攜帶p53，B7-1和GM-CSF基因的重組腺病毒及其對(duì)喉癌的基因治療作用1.腺病毒的構(gòu)建攜帶人野生型p53，B7-1和GM-CSF三種外源基因的穿梭質(zhì)粒(命名為pBB-102)的構(gòu)建過程如圖2所示。將pBB-102與攜帶腺病毒基因組DNA的重組質(zhì)粒GT4050共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，二者在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組，形成攜帶人野生型p53，B7-1和GM-CSF三種外源基因的重組腺病毒，命名為BB-102，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖3所示。
攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒(Ad-GFP)和攜帶人野生型p53基因的重組腺病毒(Ad-p53)由美國百特醫(yī)療用品公司基因治療部(Gene TherapyUnit，Baxter Healthcare Company，USA)惠贈(zèng)，293細(xì)胞系購自ATCC。
2.病毒擴(kuò)增與純化將293細(xì)胞接種于150毫米平皿中，待細(xì)胞生長至90％匯合狀態(tài)時(shí)，按10個(gè)空斑形成單位(pfu)/細(xì)胞的量加入病毒，36～48小時(shí)后，細(xì)胞出現(xiàn)完全病變效應(yīng)(CPE)，收集細(xì)胞，凍存于-80℃，待累計(jì)到50～60個(gè)平皿時(shí)，統(tǒng)一純化病毒。
將出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)的293細(xì)胞于-80℃和37℃間反復(fù)凍融三次，2500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片；配制1.5克/毫升氯化銫溶液(秤取30克氯化銫，加PBS至終體積42.5毫升)、1.35克/毫升氯化銫溶液(取15毫升1.5克/毫升的氯化銫液，加PBS至終體積21毫升)和1.25克/毫升氯化銫溶液(取11毫升1.5克/毫升的氯化銫液，加PBS至終體積20毫升)；制備氯化銫密度梯度依次將0.5毫升1.5克/毫升氯化銫溶液、2.5毫升1.35克/毫升氯化銫溶液和2.5毫升1.25克/毫升氯化銫溶液加入超速離心管中；將6毫升凍融后的待純化病毒加于各管的氯化銫梯度液之上；150,000g，10℃離心1小時(shí)，于1.35克/毫升氯化銫溶液和1.25克/毫升氯化銫溶液之間出現(xiàn)白色霧狀病毒帶；收集病毒帶，并與1.35克/毫升氯化銫溶液混和；150,000g，10℃離心18小時(shí)；吸出病毒帶，以1～2倍體積的Hanks液稀釋病毒，以Hanks液為透析液于4℃透析病毒，每2小時(shí)更換一次透析液，共換液5次；取出純化的病毒液，空斑實(shí)驗(yàn)確定其滴度分別為BB-1022×1010空斑形成單位/毫升；Ad-p532×1011空斑形成單位/毫升；Ad-GFP9×1010空斑形成單位/毫升；加10％無菌甘油，-80℃凍存。
3.腺病毒載體對(duì)喉癌細(xì)胞Hep-2的轉(zhuǎn)染率將Hep-2細(xì)胞接種于6孔板，接種量為5×105細(xì)胞/孔，24小時(shí)后將培養(yǎng)液(含5％胎牛血清的DMEM)吸出，分別用0、20、40、60、80和100空斑形成單位/細(xì)胞的Ad-GFP(稀釋于0.5毫升培養(yǎng)液)感染細(xì)胞，1～2小時(shí)后吸去病毒液，每孔加3毫升培養(yǎng)液，24～48小時(shí)后，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)GFP表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)，同時(shí)計(jì)數(shù)該視野內(nèi)的全部細(xì)胞數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染率。結(jié)果表明喉癌細(xì)胞對(duì)腺病毒高度敏感。隨著病毒量的加大，其轉(zhuǎn)染率提高，當(dāng)病毒量為50空斑形成單位/細(xì)胞時(shí)，轉(zhuǎn)染率達(dá)90％以上。
4.腺病毒載體介導(dǎo)的外源基因在喉癌細(xì)胞中的表達(dá)Hep-2細(xì)胞以5×104細(xì)胞/孔的量接種于12孔培養(yǎng)板，每孔底部加一小塊蓋玻片，使細(xì)胞能夠自然生長于玻片上，24小時(shí)后分別以50空斑形成單位/細(xì)胞的BB-102、或Ad-p53、或Ad-GFP感染細(xì)胞，48小時(shí)后將玻片取出，以丙酮固定細(xì)胞，通過免疫組化法可檢測(cè)到BB-102或Ad-p53所介導(dǎo)的p53基因在Hep-2細(xì)胞中均可高效表達(dá)(圖4)。
Hep-2細(xì)胞以1×106細(xì)胞/皿的量接種于60毫米平皿中，24小時(shí)后以50空斑形成單位/細(xì)胞的BB-102感染細(xì)胞，48小時(shí)后將細(xì)胞消化下來，用Hanks液洗兩遍，重懸于100～200微升Hanks液中，加20微升FITC標(biāo)記的鼠抗人B7-1單克隆抗體，室溫孵育30分鐘，用Hanks液洗兩遍，重懸于1～2毫升Hanks液中，通過流式細(xì)胞分析可檢測(cè)到BB-102介導(dǎo)的B7-1基因在Hep-2細(xì)胞膜上的表達(dá)(圖5)。
Hep-2細(xì)胞以5×105細(xì)胞/皿的量接種于60毫米平皿中，24小時(shí)后以50空斑形成單位/細(xì)胞的BB-102感染細(xì)胞，此后每24小時(shí)收集上清，更換新鮮培養(yǎng)液，連續(xù)12天。ELISA檢測(cè)BB-102介導(dǎo)的GM-CSF在Hep-2細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果表明(圖6)以50空斑形成單位/細(xì)胞的BB-102感染Hep-2細(xì)胞2-4天時(shí)，GM-CSF表達(dá)至高峰，隨后呈下降趨勢(shì)。
5.BB-102介導(dǎo)的p53基因?qū)ep-2細(xì)胞的生長抑制作用Hep-2細(xì)胞以5×104細(xì)胞/孔的量接種于6孔培養(yǎng)板，24小時(shí)后以50空斑形成單位/細(xì)胞的BB-102或Ad-GFP感染細(xì)胞，此后每天觀察細(xì)胞生長狀況，隨后將細(xì)胞消化下來，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)活細(xì)胞，繪制細(xì)胞生長曲線。結(jié)果表明(圖7)與正常Hep-2細(xì)胞相比，以50空斑形成單位/細(xì)胞的BB-102感染的細(xì)胞，其生長受到明顯抑制，而該劑量的對(duì)照病毒Ad-GFP則對(duì)細(xì)胞生長不產(chǎn)生影響。
6.BB-102和Ad-p53介導(dǎo)的人野生型p53基因?qū)ep-2細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞以5×104細(xì)胞/孔的量接種于12孔培養(yǎng)板，每孔底部加一小塊蓋玻片，使細(xì)胞能夠自然生長于玻片上，24小時(shí)后分別以50空斑形成單位/細(xì)胞的BB-102、或Ad-p53、或Ad-GFP感染細(xì)胞，72小時(shí)后將玻片取出，以中性福爾馬林固定細(xì)胞，通過3’末端標(biāo)記法原位檢測(cè)細(xì)胞凋亡(TdT FragELTMDNA Fragmentation Detection Kit，Oncogene)。結(jié)果如圖8所示感染BB-102或Ad-p53的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而感染Ad-GFP的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞則無凋亡。
Hep-2細(xì)胞以1×106細(xì)胞/瓶的量接種于培養(yǎng)瓶，24小時(shí)后以50空斑形成單位/細(xì)胞的BB-102、或Ad-p53、或Ad-GFP感染細(xì)胞，72小時(shí)后固定細(xì)胞，通過透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖9所示BB-102或Ad-p53感染的細(xì)胞均可見染色質(zhì)固縮邊移，線粒體空虛，富含溶酶體，核破碎等等。而感染Ad-GFP的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞則無此現(xiàn)象。
7.BB-102介導(dǎo)的外源基因?qū)ep-2細(xì)胞免疫原性的影響取三瓶Hep-2細(xì)胞，其中一瓶為對(duì)照，另外兩瓶分別以50空斑形成單位/細(xì)胞的Ad-GFP或BB-102感染，12小時(shí)后三瓶細(xì)胞均以30戈瑞60Coγ射線照射滅活，并分別與來自自愿獻(xiàn)血者的外周血淋巴細(xì)胞(PBL)以1∶10的比例混合培養(yǎng)于含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中，加白介素2至終濃度為100單位/毫升，置于37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7天后將刺激后的淋巴細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)與Hep-2細(xì)胞(靶細(xì)胞)以不同的效靶比(100∶1，50∶1，25∶1，12.5∶1)混合培養(yǎng)于96孔板(每孔含1×104腫瘤細(xì)胞)，4小時(shí)后測(cè)定培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)的活性(CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit，Cat.#G4000，Promega)，計(jì)算效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的裂解活性。結(jié)果如圖10所示以BB-102感染Hep-2細(xì)胞而制備的瘤苗可在體外誘導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞生成細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)，這些CTL(效應(yīng)細(xì)胞)對(duì)野生型Hep-2細(xì)胞(靶細(xì)胞)具有殺傷活性，當(dāng)效靶比為100∶1時(shí)，其殺傷率可達(dá)60％以上。
權(quán)利要求
1.一種用于腫瘤治療的重組腺病毒，其特征在于該腺病毒以串聯(lián)方式同時(shí)攜帶抑癌基因和腫瘤免疫相關(guān)基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒，其特征是抑癌基因可以是p53。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒，其特征是腫瘤免疫相關(guān)基因可以是B7-1和GM-CSF。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒，其特征在于該腺病毒可以用于治療腫瘤。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組腺病毒，其特征是腫瘤可以是頭頸部腫瘤。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組腺病毒，其特征是頭頸部腫瘤可以是喉癌。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒，其特征是所述重組腺病毒可以以液體形式被配成注射液、滴液、噴霧劑、涂抹液等。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,具體地說是涉及一種串聯(lián)方式同時(shí)攜帶抑癌基因和腫瘤免疫相關(guān)基因的重組腺病毒及其在腫瘤治療中的應(yīng)用。將抑癌基因和腫瘤免疫相關(guān)基因以串聯(lián)方式插入到同一株腺病毒載體上,實(shí)驗(yàn)表明;該重組腺病毒同時(shí)具備雙重抗腫瘤功效:(1)抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡(2)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性進(jìn)而提高機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。據(jù)此認(rèn)為:此類重組腺病毒在腫瘤的基因治療中具有極好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1260998SQ9910030
公開日2000年7月26日 申請(qǐng)日期1999年1月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月20日
發(fā)明者邱兆華, 吳祖澤, 勞妙芬 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院百環(huán)生物醫(yī)學(xué)研究中心