專利名稱：庚型肝炎病毒基因組全長cDNA克隆及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是庚型肝炎病毒基因組全長cDNA的克隆及其構(gòu)建方法。
1995年，美國有兩個(gè)研究小組幾乎同時(shí)分別報(bào)道了一種新型肝炎病毒，分別命名為GB病毒C(GBV-C)和庚型肝炎病毒(HGV)，簡稱為GBV-C/HGV。GBV-C/HGV可經(jīng)血傳播，在商業(yè)獻(xiàn)血員、血透析患者、靜脈藥癮者及乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染者中都有較高的感染率，引起輸血后肝炎及其他急、慢性肝病。GBV-C/HGV屬于黃病毒科，為單股正鏈RNA病毒，基因組全長約9.4kb，基因組中儀有一個(gè)開放閱讀框架(ORF)，結(jié)構(gòu)基因C、E1和E2位于氨基端，編碼結(jié)構(gòu)蛋白；非結(jié)構(gòu)基因NS2、NS3、NS4、NS5a和NS5b位于羧基端，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白；在開放閱讀框的兩側(cè)分別為5’非編碼區(qū)和3’非編碼區(qū)(圖1中方框圖所示)。雖然報(bào)道的GBV-C/HGV全序列有11株之多，但全序列的讀取是根據(jù)分段克隆的基因片段的序列，迄今沒有具有整體功能的GBV-C/HGV基因組全長cDNA單個(gè)克隆?；蚱慰寺〔荒軓恼w上反映病毒的真正特性，影響了對(duì)GBV-C/HGV的深入研究。
本發(fā)明的目的是提供GBV-C/HGV基因組全長cDNA的克隆及其構(gòu)建方法。
本發(fā)明構(gòu)建的庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)基因組全長cDNA克隆包含了GBV-C/HGV基因組從5’非編碼區(qū)，結(jié)構(gòu)基因C、E1、E2，非結(jié)構(gòu)基因NS2、NS3、NS4、NS5a和NS5b及3’非編碼區(qū)的全長基因。
庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)基因組全長cDNA克隆的構(gòu)建，采用重疊延伸PCR拼接基因片段和酶切、連接相結(jié)合的方法，包括如下步驟(1)合成擴(kuò)增和拼接GBV-C/HGV基因片段的引物；(2)擴(kuò)增和拼接GBV-C/HGV基因片段；(3)GBV-C/HGV基因片段的分段克隆(4)GBV-C/HGV基因組全長cDNA的先隆。
構(gòu)建GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆的基礎(chǔ)材料是含有GBV-C/HGV基因組不同區(qū)域基因片段的五個(gè)重組質(zhì)粒Iw5、Iwq2、Iwh6、Iw3’和Iw3(詳見文獻(xiàn)Li Shao et al.Biochem Biophys.Res.Commun1996；228785-791)。五個(gè)同名基因片段從3’至5’端相鄰片段互相重疊，覆蓋整個(gè)基因組(見圖1)，其中Iwq2和Iwh6兩個(gè)基因片段是用長PCR方法從病人血清中擴(kuò)增而來，Iw5、Iw3’和Iw3基因片段則由5’或3’RACE方法從同一病人血清中擴(kuò)增而來。
本發(fā)明利用重疊延伸PCR(SOEing and PCR)方法，將Iw5和Iwq2基因片段拼接為Iw5-q2基因片段；將Iw3和Iw3基因片段拼接得到Iw3’-3基因片段后，再與Iwh6基因片段拼接獲得Iwh6-3基因片段；將Iwq2和Iwh6拼接得到Iwq2-h6基因片段。拼接Iwq2-h6基因片段時(shí)，要求Iwq2-h6基因片段5’端與Iw5-q2基因片段的3’端互相重疊，且包括共同而且唯一的酶切位點(diǎn)；Iwq2-h6基因片段的3’端與Iwh6-3的5’端互相重疊，同樣包括共同且唯一的酶切位點(diǎn)。利用上述酶切位點(diǎn)及在擴(kuò)增Iw5基因片段的上游引物和擴(kuò)增Iw3基因片段的下游引物中加入的酶切位點(diǎn)，先進(jìn)行GBV-C/HGV基因片段Iw5-q2、Iwq2-h6和Iwh6-3的分段克隆，獲得重組質(zhì)粒pUC-5-q2、pUC-q2-h6和pGEM-h6-3。待分段克隆成功后，再以此為基礎(chǔ)，利用限制性內(nèi)切酶酶切和連接酶連接的方法構(gòu)建GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆pHGVqz。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明采用重疊延伸PCR(SOEing and PCR)拼接、限制性內(nèi)切酶酶切和連接酶連接基因片段相結(jié)合的方法，構(gòu)建GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆，技術(shù)方案構(gòu)思巧妙。既避免了由數(shù)個(gè)小基因片段起始、經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、再由連接酶連接的繁雜過程，又因?yàn)椴捎孟确侄慰寺≡龠M(jìn)行全長基因克隆的途徑而降低了實(shí)驗(yàn)難度。GBV-C/HGV基因組全長cDNA的克隆成功，為廣泛深入地研究該病毒提供了重要實(shí)驗(yàn)材料。利用GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆，可以從細(xì)胞水平到分子水平，從細(xì)胞模型到動(dòng)物模型，從局部到整體等多方位、多角度地展開對(duì)GBV-C/HGV的致病性及致病機(jī)制，復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯機(jī)制，形態(tài)及形態(tài)發(fā)生等廣泛而深入的研究。


圖1為本發(fā)明中GBV-C/HGV基因組結(jié)構(gòu)及cDNA基因片段的位置，上部的方框圖代表GBV-C/HGV基因組結(jié)構(gòu)及各區(qū)基因的位置。下部的粗線圖及粗線上端的數(shù)字代表五個(gè)基因片段及其在基因組中的位置。
圖2為重組質(zhì)粒pUC-5-q2的構(gòu)建流程圖。
圖3為重組質(zhì)粒pUC-q2-h6的構(gòu)建流程圖。
圖4為重組質(zhì)粒pGEM-h6-3的構(gòu)建流程圖。
圖5為重組質(zhì)粒pHGVqz的構(gòu)建流程圖。
圖2～5中的圓圖代表環(huán)狀質(zhì)粒，粗線代表基因片段，Yx(x為1-12)代表引物。粗線兩端所標(biāo)數(shù)字代表該基因片段在GBV-C/HGV基因組中的位置。
圖6 GBV-C/HGV基因組全長cDNA序列GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆的具體構(gòu)建方法見如下實(shí)施例一、合成擴(kuò)增和拼接基因片段的引物(見表1)，引物的設(shè)計(jì)及合成參照5個(gè)基因片段的大小，同時(shí)要盡量滿足引物設(shè)計(jì)的一般條件。
表1.擴(kuò)增及拼接GBV-C/HGV基因片段的引物引物序列(5’-3’)引物在基因組中的位置極性Y1GCG AAT TCG CGG CCG CCC CCC CCC1-26 +CGG CAC TGG GTG CAA GCY2AGA GAG ACA TTG AAG GGC GAC321-341 -Y3GAC AGG GTT GGT AGG TCG TAA ATCC 109-133 +Y4CCG TCC TTG ATG ATG GAA CTG TC 4399-4421-Y5TAT GGG CAT GGC ATA CCC CT 4261-4280+Y6GAG GGC CAC GAT GAT GTT AG 8696-8715-Y7TTC TGC TCC ACT TGG CTC GCT GAGT 8416-8440+Y8CTG GAT GCC ACA ACA GGC CCC T 8881-8902-Y9AGG GGC CTG TTG TGG CAT CCAG 8881-8902+Y10 GCT CTA GAC TCG AGA ATA AAA CCCGGC CTT TGG GCC G 9353-9375-Y11 TTG TTC GAT CAT ATG GGG TCC TTC TCG C 2977-3004+Y12 GAC CGG AGT CCC TTC AAG TAT CTC CTG G 7737-7764-二、以質(zhì)粒Iw5、Iwq2、Iwh6、Iw3’和Iw3為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增5個(gè)同名基因片段，PCR反應(yīng)條件按常規(guī)根據(jù)預(yù)擴(kuò)增基因片段的長度和所用引物的Tm(解鏈溫度)值進(jìn)行調(diào)整。PCR擴(kuò)增和拼接反應(yīng)均應(yīng)用ExpandTMLong Template PCR系統(tǒng)。
1、Iw5基因片段的擴(kuò)增(圖2)(1)Iw5質(zhì)粒(50ng/ul) 1ul10mM dNTP 1.75ulY1(30uM)0.5ulY2(30uM)0.5ul滅菌重蒸水21.25ul------------------------------------(2)10X緩沖液15ul
DNA聚合酶混合液(3.5單位/ul) 0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然后再將(1)(2)混合，按下述條件進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃2分鐘預(yù)變性，94℃30秒.65℃30秒、68℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前延伸68℃10分鐘。
2、Iwq2基因片段的擴(kuò)增(圖2，圖3)(1)Iwq2質(zhì)粒(50ng/ul)1ul10mM dNTP 1.75ulY3(30uM) 0.5ulY4(30uM) 0.5ul滅菌重蒸水 21.25ul---------------------------------------(2)10X緩沖液I 5ulDNA聚合酶混合液(3.5單位/ul) 0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然后再將(1)(2)混合，按下述條件進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃2分鐘預(yù)變性，94℃ 30秒、65℃ 30秒、68℃ 6分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前延伸68℃10分鐘。
3、Iwh6基因片段的擴(kuò)增(圖3，圖4)(1)Iwh6質(zhì)粒(50ng/ul) 1ul10mM dNTP1.75ulY5(30uM) 0.5ulY6(30uM) 0.5ul滅菌重蒸水 21.25ul---------------------------------------(2)10X緩沖液1 5ulDNA聚合酶混合液(3.5單位/ul) 0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然后再將(1)(2)混合，按下述條件進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃ 2分鐘預(yù)變性，94℃ 30秒、60℃ 30秒、68℃ 6分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前延伸68℃ 10分鐘。
4、Iw3’基因片段的擴(kuò)增(圖4)(1)Iw3’質(zhì)粒(50ng/ul) 1ul10mM dNTP1.75ulY7(30uM) 0.5ulY8(30uM) 0.5ul滅菌重蒸水 21.25ul---------------------------------------(2)10X緩沖液1 5ulDNA聚合酶混合液(3.5單位/ul) 0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然后再將(1)(2)混合，按下述條件進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃2分鐘預(yù)變性，94℃30秒、60℃ 30秒、68℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前延伸68℃10分鐘。
5、Iw3基因段的擴(kuò)增(圖4)(1)Iw3質(zhì)粒(50ng/ul)1ul10mM dNTP1.75ulY9(30uM) 0.5ulY10(30uM) 0.5ul
滅菌重蒸水 21.25ul---------------------------------------(2)10X緩沖液1 5ulDNA聚合酶混合液(3.5單位/ul) 0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然后再將(1)(2)混合，按下述條件進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃ 2分鐘預(yù)變性，94℃ 30秒、60℃ 30秒、68℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前延伸68℃ 10分鐘。
三、PCR的5個(gè)基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后，分別用DNA聚合酶I大片段(Klenow)處理37℃1小時(shí)，去除基因片段3’端存在的“A”(腺嘌呤核苷)。
例Iw5基因片段的Klenow酶處理(圖2)Iw5基因片段(0.1ug/ul) 50ul10X Klenow緩沖液 10ulKlenow酶(10單位/ul)1ul滅菌重蒸水39ul混勻后置37℃1小時(shí)，然后酚/氯仿抽提，無水乙醇沉淀。Iwq2、Iwh6、Iw3’和Iw3基因片段的Klenow酶處理依照此例進(jìn)行(圖2，圖3，圖4)。
四、重疊延伸PCR拼接Iw5-q2、Iwq2-h6、Iw3’-3和Iwh6-3基因片段，PCR反應(yīng)條件根據(jù)預(yù)拼接基因片段的長度和所用引物的Tm值進(jìn)行調(diào)整。
1、Iw5-q2基因片段的拼接(圖2)(1)經(jīng)Klenow酶處理后的Iw5基因片段(0.1ug/ul)2ul經(jīng)Klenow酶處理后的Iw q2基因片段(0.1ug/ul) 2ul10mM dNTP1.75ulY1(30uM) 0.5ulY4(30uM) 0.5ul滅菌重蒸水1 8.25ul--------------------------------(2) 10X緩沖液1 5ul聚合酶混合液(3.5單位/ul) 0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然后再將(1)(2)混合，按下述條件進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃2分鐘預(yù)變性，94℃30秒、60℃1分鐘、68℃6分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前延伸68℃10分鐘。
2、Iw3’-3基因片段的拼接(圖4)(1)經(jīng)Klenow酶處理的Iw3’基因片段(0.1ug/ul)2ul經(jīng)Klenow酶處理的Iw3基因片段(0.1ug/ul) 2ul10mM dNTP 1.75ulY7(30uM)0.5ulY10(30uM) 0.5ul滅菌重蒸水18.25ul(2) 10X緩沖液15ul聚合酶混合液(3.5單位/ul)0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然后再將(1)(2)混合，按下述條件進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃2分鐘預(yù)變性，94℃30秒、60℃30秒、68℃2分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前延伸68℃10分鐘。
3、Iwh6-3基因片段的拼接(圖4)(1)經(jīng)Klenow酶處理的Iw3’-3基因片段(0.1ug/ul)2ul經(jīng)Klenow酶處理的Iwh6基因片段(0.1ug/ul) 2ul10mM dNTP 1.75ulY5(30uM) 0.5ulY10(30uM) 0.5ul滅菌重蒸水 18.25ul---------------------------------(2) 10X緩沖液15ul聚合酶混合液(3.5單位/ul) 0.75ul滅菌重蒸水19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然后再將(1)(2)混合，按下述條件進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃2分鐘預(yù)變性，94℃30秒、65℃30秒、68℃6分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前延伸68℃10分鐘。
4、Iwq2-h6基因片段的拼接(圖3)(1)經(jīng)Klcnow酶處理的Iwq2基因片段(0.1ug/ul) 2ul經(jīng)Klenow酶處理的Iwh6基因片段(0.1ug/ul) 2ul10mM dNTP1.75ulY11(30uM)0.25ulY12(30uM) 0.5ul滅菌重蒸水 18.25ul--------------------------(2) 10X緩沖液1 5ul聚合酶混合液(3.5單位/ul)0.75ul滅菌重蒸水 19.25ul先分別混合(1)(2)中的各成分，然后再將(1)(2)混合，按下述條件進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃2分鐘預(yù)變性，94℃30秒、65℃45秒、68℃6分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前延伸68℃10分鐘。
五、將Iw5-q2基因片段經(jīng)EcoRI+BamHI酶切，回收約3301bp的基因片段，與經(jīng)EcoRI+BamHI酶切的pUC18載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，酶切鑒定轉(zhuǎn)化子得到重組質(zhì)粒pUC-5-q2(圖2)。Iwq2-h6基因片段經(jīng)BamHI+SalI酶切，回收約3298bp的基因片段與經(jīng)BamHI+SalI酶切的pUC18載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，酶切鑒定轉(zhuǎn)化子得到重組質(zhì)粒pUC-q2-h6(圖3)。Iwh6-3基因片段經(jīng)SalI+XbaI酶切，回收約2806bp的基因片段，與經(jīng)SalI+XbaI酶切的pGEM-3Zf(+)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，酶切鑒定轉(zhuǎn)化子得到重組質(zhì)粒pGEM-h6-3(圖4)。
六、將重組質(zhì)粒pUC-5-q2用EcoRI+BamHI酶切，回收約3301bp的基因片段；pUC-q2-h6用BamHI+SalI酶切，回收約3298bp的基因片段pGEM-h6-3用SalI+XbaI酶切，回收約2806bp的基因片段。將回收的三個(gè)基因片段與經(jīng)EcoRI+XbaI酶切的pGEM-3Zf(+)載體相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JMI09，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶切鑒定，初步確定克隆GBV-C/HGV基因組全長cDNA的重組質(zhì)粒pHGVqz(圖5)。
GBV-C/HGV全長基因片段與載體的連接pGEM-3Zf(+)/EcoRI+XbaI(0.1ug/ul)5-q2/EcoRI+BamHI(50ng/ul)q2-h6/BamHI+SalI(25ng/ul)h6-3/SalI+XbaI (60ng/ul)10X連接酶緩沖液 1.5ul連接酶(5u/ul) 1ul滅菌重蒸水 3.5ul混勻后14℃過夜。次日取連接物的三分之一進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
七、提取pHGVqz質(zhì)粒進(jìn)行核苷酸序列測定。GBV-C/HGV基因組全長cDNA序列長9373bp(圖6)，與報(bào)道的GBV-C/HGV序列高度同源，但部分核苷酸發(fā)生了改變，結(jié)果表明，我們已成功地構(gòu)建了GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆。
GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆的成功，為深入研究該病毒提供了重要實(shí)驗(yàn)材料。以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎(chǔ)可以進(jìn)行多方面的研究，例如(一)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎(chǔ)在原核、真核(含昆蟲)細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行基因表達(dá)。
(二)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎(chǔ)進(jìn)行基因檢測、抗原檢測和抗體檢測研究。
(三)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎(chǔ)進(jìn)行有關(guān)GBV-C/HGV在體外細(xì)胞系統(tǒng)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯機(jī)制、病毒形態(tài)及形態(tài)發(fā)生研究。
(四)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎(chǔ)進(jìn)行致病性與免疫性研究。
(五)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎(chǔ)進(jìn)行基因治療、反義核酸治療及生物(多肽)藥物研究。
(六)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎(chǔ)進(jìn)行核酸疫苗、重組基因工程疫苗及疫苗免疫研究。
(七)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎(chǔ)進(jìn)行各種動(dòng)物感染模型、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型及基因敲除動(dòng)物模型的研究。
(八)以GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆為基礎(chǔ)進(jìn)行肽庫及抗體庫的構(gòu)建、篩選研究。
權(quán)利要求
1.庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)基因組全長cDNA克隆，其特征在于該克隆包含了GBV-C/HGV基因組從5’非編碼區(qū)，結(jié)構(gòu)基因C、E1、E2，非結(jié)構(gòu)基因NS2、NS3、NS4、NS5a和NS5b及3’非編碼區(qū)9373bp的全長基因。
2.一種庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)基因組全長cDNA克隆的構(gòu)建方法，其特征在于采用的是重疊延伸PCR拼接基因片段和酶切、連接相結(jié)合的方法，包括如下步驟(1)合成擴(kuò)增和拼接GBV-C/HGV基因片段的引物；(2)擴(kuò)增和拼接GBV-C/HGV基因片段；(3)GBV-C/HGV基因片段的分段克??；(4)GBV-C/HGV基因組全長cDNA的克隆。
3.按權(quán)利要求2所述的庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)基因組全長cDNA克隆的構(gòu)建方法，其特征在于利用重疊延伸PCR方法，將Iw5和Iwq2基因片段拼接為Iw5-q2基因片段；將Iw3’和Iw3基因片段拼接得到Iw3’-3基因片段后，再與Iwh6基因片段拼接獲得Iwh6-3基因片段；將Iwq2和Iwh6拼接得到Iwq2-h6基因片段；拼接Iwq2-h6基因片段時(shí)，要求Iwq2-h6基因片段5’端與Iw5-q2基因片段的3’端互相重疊，且包括共同而且唯一的酶切位點(diǎn)；Iwq2-h6基因片段的3’端與Iwh6-3的5’端互相重疊，同樣包括共同且唯一的酶切位點(diǎn)，利用上述酶切位點(diǎn)及在擴(kuò)增Iw5基因片段的上游引物和擴(kuò)增Iw3基因片段的下游引物中加入的酶切位點(diǎn)，先進(jìn)行GBV-C/HGV基因片段Iw5-q2、Iwq2-h6和Iwh6-3的分段克隆，獲得重組質(zhì)粒pUC-5-q2、pUC-q2-h6和pGEM-h6-3；待分段克隆成功后，再以此為基礎(chǔ)，利用限制性內(nèi)切酶酶切和連接酶連接的方法構(gòu)建GBV-C/HGV基因組全長cDNA克隆pHGVqz。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域,是庚型肝炎病毒基因組全長cDNA的克隆及其構(gòu)建方法。以覆蓋GBV－C/HGV基因組全長cDNA的5個(gè)較小的基因片段為起始材料,經(jīng)過重疊延伸PCR、酶切、連接和轉(zhuǎn)化等,完成GBV－C/HGV基因組全長cDNA的克隆。GBV－C/HGV基因組全長cDNA克隆的成功,為研究GBV－C/HGV的致病性及致病機(jī)制、復(fù)制及轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制、形態(tài)及形態(tài)發(fā)生、基因及血清學(xué)特異診斷、核酸及基因工程疫苗和各種動(dòng)物模型的建立等提供了重要材料。
文檔編號(hào)C12N15/51GK1202524SQ9811089
公開日1998年12月23日 申請(qǐng)日期1998年6月15日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月15日
發(fā)明者戚中田, 朱分祿, 邵力, 何建文, 潘衛(wèi), 崔曉紅, 朱詩應(yīng), 宋燕斌 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)