專(zhuān)利名稱(chēng)：豬tt病毒1型cjny株基因組的核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬TT病毒1型(TTVl) CJNY株(指環(huán)病毒屬(AnelIovirus))的核苷酸序列，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
1997年日本學(xué)者Nishizawa等運(yùn)用代表性差異分析技術(shù)(Itepresentational diference allalysis)，從一例非甲——非庚型輸血后肝炎患者的血清中克隆到一個(gè) 500bp的片段N22。通過(guò)分子流行病學(xué)研究，證實(shí)了 N22與輸血后肝炎有高度相關(guān)性。由于 該克隆來(lái)源于這名姓名為T(mén)T的輸血后肝炎患者，認(rèn)為該病毒與肝炎有關(guān)，故命名為T(mén)T病 毒，因TTV與經(jīng)輸血傳播病毒(transfusion transmitted virus, TTV)英語(yǔ)單詞的三個(gè)字 首字母縮略詞巧合，因此，該病毒又稱(chēng)輸血傳播病毒。TTV是一種無(wú)囊膜的單股環(huán)狀負(fù)鏈的球形DNA病毒，目前歸指環(huán)病毒屬 (Anellovirus)，直徑為30nm 32nm。TTV基因組長(zhǎng)3. 6kb 3. 8kb，分為編碼區(qū)和非編碼 區(qū)(UTR)兩部分，非編碼區(qū)特定區(qū)域內(nèi)核酸序列十分保守，此區(qū)域可能與病毒的復(fù)制及蛋 白質(zhì)的表達(dá)有關(guān)。TTV編碼區(qū)由6個(gè)開(kāi)放閱讀框架(0RF1 0RF6)組成，其中ORFl和0RF2 相對(duì)研究得比較清楚，ORFl位于該基因組的589位 2898位核苷酸，編碼770個(gè)氨基酸， 為病毒的衣殼蛋白，具高度親水性；0RF2位于107位 712位核苷酸，編碼202個(gè)氨基酸， 為病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，與病毒復(fù)制有關(guān)；此外，0FR3編碼剪接蛋白，為T(mén)TV所必須。TTV在各類(lèi)人群中感染比例非常高，據(jù)各國(guó)對(duì)不同人群TTV感染的流行病學(xué)調(diào)查， 歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家正常獻(xiàn)血者的感染率約33% 76%，亞洲、非洲和南美洲等正常獻(xiàn)血者的 感染率為90 % 100 %。TTV的感染率雖然不低，但總的來(lái)講，絕大多數(shù)TTV感染者都表現(xiàn)為 無(wú)癥狀的攜帶者，無(wú)明顯的肝炎生化改變，肝穿活檢亦無(wú)明顯病理變化。在少數(shù)有ALT (谷 丙轉(zhuǎn)氨酶)升高的病例中，TTV也常被較快清除而表現(xiàn)為急性的或一過(guò)性的感染。但也有 報(bào)道提示TTV感染和暴發(fā)型肝炎、肝炎后肝硬化等有一定的關(guān)系。TTV感染后能否引起肝臟 炎癥反應(yīng)，目前報(bào)道結(jié)果各異，存在較大爭(zhēng)議。除了人感染TTV以外，已經(jīng)證實(shí)TTV感染宿主很廣，包括靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(黑猩猩、類(lèi) 人猿和猴)、家畜(豬、牛、羊、犬、貓、雞)和其它動(dòng)物(老鼠、兔和駱駝)。TTV主要通過(guò)輸 血、性接觸和糞一口等途徑傳播，在血液、唾液、糞便和乳汁等分泌物和排泄物中能檢測(cè) 到病毒。在目前對(duì)家養(yǎng)動(dòng)物的TTV感染研究中，針對(duì)豬TTV感染的研究較多。至今為止，在 豬體內(nèi)有兩種明顯不同的TTV基因型被證實(shí)，分別是基因1型和基因2型(TTV1和TTV2)， 兩者基因組長(zhǎng)度及其開(kāi)放閱讀框的位置與人的TTV不盡相同。同人類(lèi)的感染狀況相似，豬 的TTV感染率也很高。豬TTV的兩種基因型已經(jīng)在豬血清、血漿、精液、糞便、鼻腔和直腸棉 拭中被檢測(cè)到。TTV在豬群中廣泛傳播，同樣，糞一口途徑被認(rèn)為是病毒傳播的主要途徑。由于TTV歸類(lèi)于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)，而同科病毒豬圓環(huán)病毒2型(PCV2) 是目前影響豬群健康的重要傳染病——豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCVAD)的病原，由此引發(fā)獸 醫(yī)界人士的聯(lián)想，在PCV2引起的斷奶后仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)等臨床病癥的過(guò)程中，TTV或許參與了協(xié)同作用或次要角色。McKeown等認(rèn)為T(mén)TV與豬的其它已知病原共感 染可導(dǎo)致疾病嚴(yán)重化。Krakowka等對(duì)2 4日齡的無(wú)菌豬接種TTV1，于1周后再分別接種 PCV2和PRRSV，對(duì)照組則分別單獨(dú)接種TTV1、PCV2和PRRSV，結(jié)果TTVl和PCV2混合接種組 的仔豬中50%發(fā)展為急性PMWS感染，TTVl和PRRSV混合接種組的仔豬死亡率達(dá)到23%， 并呈現(xiàn)PRRS的典型病癥，而對(duì)照組均未產(chǎn)生PRRS或PMWS的臨床病變，說(shuō)明TTVl可能參與 了豬的PCV2和PRRS的感染。雖然TTV在PMWS等疾病的發(fā)展中可能扮演了一定角色，但由于上述研究用的是豬 感染TTVl的病料，很難排除掉病料本身是否含有其它病原的可能。因此，對(duì)于研究TTVl的 生物學(xué)特性，必須有TTVl某一特定毒株的完整核苷酸序列和有效性的全長(zhǎng)克隆。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是確定豬TTVl JSNY毒株的完整核苷酸序列。本發(fā)明的另一目的是 確定3個(gè)基因推導(dǎo)的氨基酸序列。技術(shù)方案豬TT病毒1型CJNY株基因組的核苷酸序列，其特征為SEQ ID NO :1，其所編碼的 蛋白質(zhì)，具有序列為=SEQ ID NO :2。所述豬TT病毒1型CJNY株基因組的0RF2編碼區(qū)域，其核苷酸序列為SEQ ID NO 3，所編碼的蛋白質(zhì)，具有序列為SEQ ID NO :4。所述豬TT病毒1型CJNY株基因組的0RF3編碼區(qū)域，其核苷酸序列為SEQ ID NO 5，所編碼的蛋白質(zhì)，具有序列為SEQ ID NO :6。有益效果具有一種豬TT病毒1型的完整基因組，可用于以該病毒為基礎(chǔ)的研究和開(kāi)發(fā)。本發(fā)明獲得了由SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 5及其生物學(xué)等效物 構(gòu)成完整的核苷酸序列。這些核苷酸分子編碼特定的蛋白質(zhì)，且選自SEQ ID NO=U SEQ IDNO 3 和 SEQ ID NO :5。編碼具有選自 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 6 及其 生物學(xué)等效的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。可用于PCR技術(shù)直接測(cè)定病毒核酸，用于合成肽或表 達(dá)蛋白ELISA檢測(cè)試劑，構(gòu)建完整基因組的分子克隆還可用于拯救病毒等。
具體實(shí)施例方式考慮到豬TTVl核苷酸序列存在高度變異情況，本發(fā)明以目前公開(kāi)發(fā)表的三條豬 TTVl 基因組序列(Sd-TTV31，AB076001 ； lp, AY823990 ； swSTHY-TT27, GQ120664)為基礎(chǔ)，首 先通過(guò)擴(kuò)增病毒相對(duì)保守的非編碼區(qū)特定區(qū)域核苷酸序列，然后根據(jù)獲得的核苷酸序列再 設(shè)計(jì)一對(duì)反向引物，用來(lái)擴(kuò)增病毒完整基因組的核苷酸序列。首先，按常規(guī)的酚-氯仿法提取豬血清樣品DNA，即取300 μ L血清，加入等體積的裂解緩沖液及 ο μ L的蛋白酶K(10mg/mL)，50 V消化2h，加入600 μ L Tris飽和酚， 充分振蕩混勻，12，000r/min，離心IOmin ；取上層水相，加入等體積的酚氯仿異戊醇 (25 24 1)混勻后，12，OOOr/min，離心IOmin ；用酚氯仿異戊醇重復(fù)抽提一次；取上 層水相，加入1/10體積的3mol/L醋酸鈉(pH 5. 2)和2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，在_20°C放置Ih 2h以沉淀病毒DNA ；12, OOOr/min，離心lOmin，棄取上清，用70%乙醇洗滌沉淀，自然風(fēng)干；用無(wú)菌三蒸水溶解沉淀，-20°C保存?zhèn)溆?。然后，按如下程序分兩階段PCR進(jìn)行豬TTVl測(cè)序第一階段PCR:引用文獻(xiàn)所設(shè)計(jì)的引物，即上游引物 5' -CGGGTTCAGGAGGCTCAAT-3‘，下游引物5' -GCCATTCGGAACTGCACTTACT-3‘，可擴(kuò)增出 TTVl 5' UTR的大約300bp的片段。PCR體系包括0. 5 μ M的上、下游引物，0. ImM的dNTPs 和2. 5u Taq DNA聚合酶。在94°C預(yù)變性5min后進(jìn)入以下循環(huán)94°C，15s ；54°C,20s ；72°C, 30s。共進(jìn)行50個(gè)循環(huán)，72°C再延伸10分鐘。在1. 8%的瓊脂糖凝膠上電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，切下目的條帶，按DNA膠回收試劑盒 說(shuō)明回收；然后將回收產(chǎn)物與PMD18-T載體于4°C連接過(guò)夜；轉(zhuǎn)化TOPO 10感受態(tài)細(xì)胞；根 據(jù)藍(lán)白斑篩選重組子，將重組子進(jìn)行菌落PCR，將能擴(kuò)增出與目的片段大小相同的重組質(zhì)粒 送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序。第二階段PCR 根據(jù)第一階段測(cè)出的序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增豬TTVl完整基因組的引物，針 對(duì)其中一株 CJNY 毒株(http //www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/256858080)，其上游引物5‘ -TCTGATTGGTCGGGAACTCAAGCCCTCATT-3 ‘，下游引物5‘ -TTTGACTCCTCCTACTTTGCATAAATTAAA-3 ‘，PCR 體系包括 0. 5 μ M 的上、下游引物，0. ImM 的 dNTPs 和 2. 5u TaKaRa LA TaqDNA 聚合酶。在94°C預(yù)變性3min后進(jìn)入以下循環(huán)94°C，45s ；60°C,45s ；72°C，3min。共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)，72°C再延伸10分鐘。在1. 0%的瓊脂糖凝膠上電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，切下目的條帶，按DNA膠回收試劑盒 說(shuō)明回收；然后將回收產(chǎn)物與PMD18-T載體于4°C連接過(guò)夜；轉(zhuǎn)化TOPO 10感受態(tài)細(xì)胞；根 據(jù)藍(lán)白斑篩選重組子，將重組子進(jìn)行菌落PCR，將能擴(kuò)增出與目的片段大小相同的重組質(zhì)粒 送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序。對(duì)克隆重復(fù)測(cè)序3次，得到的序列是一致的。豬TT病毒1型CJNY株的完整基因組總共2879個(gè)核苷酸(SEQ ID NO 1)，這是首 次描述國(guó)內(nèi)豬TT病毒1型的完整核苷酸序列。以目前登錄的全部三株TTVl基因組序列 (Sd-TTV31, AB076001 ；lp, AY823990 ；swSTHY_TT27，GQ120664)為比對(duì)對(duì)象，使用 DNAMAN 軟 件分析核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列的同源性。GQ120664全長(zhǎng)2875個(gè)核苷酸，與CJNY株同源 性為86.7% ；AY823990全長(zhǎng)2872個(gè)核苷酸(其中2719-2732為η)，與CJNY株同源性為 85. 46% ；ΑΒ076001全長(zhǎng)2878個(gè)核苷酸，與CJNY株同源性為68. 14%。CJNY基因組中至少 存在三個(gè)編碼區(qū)域，ORFl編碼區(qū)域核苷酸517-1764，編碼病毒的衣殼蛋白，415個(gè)氨基酸 (SEQ ID NO 2) ；0RF2編碼區(qū)域核苷酸428-646，編碼病毒復(fù)制相關(guān)的酶，71個(gè)氨基酸(SEQ ID NO 4) ；0RF3編碼區(qū)域核苷酸428-1039，203個(gè)氨基酸(SEQ ID NO :6)[第一剪接的氨基 酸在殘基72，核苷酸641-643]。在以下方面，SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2與目前已登錄GenBank的三株 TTVl(Sd-TTV31, AB076001 ；lp, AY823990 ；swSTHY_TT27，GQ120664)的 ORFl 的核苷酸和氨
基酸序列不同。_密碼子氨基酸
_AGC (826-828)SerAACACAACTCTTGGG (838-852)AsnThrThrLeuGlyAAC (856-858)AsnΑΤΑ (1000-1002)lieAGT(1078-1080)SerAGT (1147-1149)SerCTTCAAACA(1411-1419)LeuGlnThrCAA (1426-1428)GlnCCCTCGGGATAT(1432-1443)ProSerGlyTyrAAA (1450-1452)LysTAC (1456-1458)TyrAAC (1462-1464)AsnCCA(1480-1482)ProATG (1510-1512)MetAGCGCT(1576-1581)SerAlaACA(1657-1659)ThrAATGTA (1681-1686)AsnValCTG(1690-1692)LeuAGA (1702-1704)ArgTTC (1708-1710)Phe_SEQ ID NO 2與目前公開(kāi)發(fā)表的三條豬TTVl基因組序列(Sd_TTV31，AB076001 ； lp，AY823990 ；swSTHY-TT27,GQ120664)編碼相應(yīng)634、636、638氨基酸最大的不同在于其氨 基酸數(shù)目，由于其1762位的堿基突變，使ORFl編碼提前終止，僅有415個(gè)氨基酸。豬TTVl的基本生物學(xué)特性取決于基因組的特定核苷酸序列，因此，病毒間完整的 差異鑒定必須確定病毒的核苷酸序列，本發(fā)明可提供鑒定方法，該方法包括采用PCR方法 檢測(cè)豬TTVl基因組DNA的核苷酸序列的一部分，以及制備蛋白用于ELISA檢測(cè)。以本發(fā)明所述的TT病毒1型核苷酸序列為基礎(chǔ)，用以合成PCR引物，提取測(cè)試樣 品DNA，隨后PCR擴(kuò)增所選的DNA區(qū)域，在凝膠上鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，并用特異性核苷酸探 針通過(guò)雜交或通過(guò)測(cè)序來(lái)驗(yàn)證它們的特異性。以本發(fā)明所述的TT病毒1型核苷酸序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)并選擇出包含一個(gè)或多個(gè) 不同殘基的肽，然后將這些肽偶聯(lián)于半抗原用于免疫動(dòng)物(如兔)，以產(chǎn)生特異性多克隆抗 體，用于“捕獲ELISA”以檢測(cè)該病毒節(jié)段產(chǎn)生的蛋白質(zhì)?；蚋鶕?jù)序列，構(gòu)建重組ORFl特定 區(qū)域的表達(dá)載體，用表達(dá)的蛋白建立間接ELISA，用于豬TT病毒1型的流行病學(xué)及制備單克 隆抗體的研究。具有豬TTVl基因組的完全核苷酸序列的分子克隆，可用于研究難于細(xì)胞培養(yǎng)的 病毒的生物學(xué)特性。以本發(fā)明所述的TT病毒1型核苷酸序列為基礎(chǔ)，構(gòu)建至少含0RF1、0RF2和0RF3在內(nèi)的基因組克隆，通過(guò)轉(zhuǎn)染特定細(xì)胞，拯救完整的豬TT病毒1型，也可將確定的突變引入 上述序列的一個(gè)或多個(gè)節(jié)段中，通過(guò)定點(diǎn)突變來(lái)研究豬TT病毒1型的生物學(xué)特性?？傊哂幸环N豬TT病毒1型的完整基因組，對(duì)以該病毒為基礎(chǔ)的研究和開(kāi)發(fā)是 有利的。本文將所引用的參考文獻(xiàn)全部納入作為參考。Nishizawa TiOkamoto H，Konishi KiYoshizawa HiMiyakawa YiMayumi M. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology. BiochemBiophys Res Commun. 1997，241(1) :92_7.Yokoyama H，Yasuda J，Okamoto H, Iwakura Y. Pathological changes of renal epithelial cells in micetransgenic for the TT virus ORFl gene. J Gen Virol. 2002, 83 (Pt 1) :141-50.Leary TPiErker JC,Chalmers MLiDesai SMiMushahwar IK. Improved detection systems for TT virusreveal high prevalence in humans， non-human primates and farm animals. J Gen Virol. 1999，80(Pt8) :2115_20·Kekarainen T， Sibila M， Segales J.Prevalence of swine Torque Teno virus in post-weanlng multisystemicwasting syndrome (PMWS)-afected and non-PMWS-affected pigs in Spain. J Gen Virol，2006，87，833-837.McKeown NE, Fenaux M，Halbur PG, Meng XJ. Molecular characterization of porcine TT virus, an orphanvirus，in pigs from six different countries. Vet Microbiol. 2004,104(1-2) :113_7Krakowka S，Ellis JiMacIntosh K，Ringler S S，Rings DM，Catherine Hartunian C，Yan Zhang YiAllan G. Porcine genogroup 1 torque teno virus (Gl-TTV) potentiates both PCV2 and PRRSV infections ingnotobiotic swine. Proceedings of the 20th IPVS Congress,Vollum 2 [C] .Durban :IPVS,2008,99. Kekarainen T, Martinez-GuinoL,Segales J. Swine torque teno virus detection in pig commercial vaccines, enzymes for laboratory use and human drugs containing components of porcine origin. J Gen Virol. 2009,90 (Pt 3) :648_53.Niel CiDiniz-Mendes LiDevalle S. Rolling-circle amplification of Torque teno virus (TTV)completegenomes from human andswine sera and identification of a novel swine TTV genogroup. J Gen Virol,2005,86 1343-7.
權(quán)利要求
豬TT病毒1型CJNY株基因組的核苷酸序列，其特征為SEQ ID NO1。
2.權(quán)利要求1所述豬TT病毒1型CJNY株基因組的ORFl編碼區(qū)域所編碼的蛋白質(zhì)，具 有序列為:SEQ ID NO :2ο
3.權(quán)利要求1所述豬TT病毒1型CJNY株基因組的0RF2編碼區(qū)域，其核苷酸序列為 SEQ ID NO :3。
4.權(quán)利要求3所述豬TT病毒1型CJNY株基因組的0RF2編碼區(qū)域所編碼的蛋白質(zhì)，具 有序列為:SEQ ID NO :4ο
5.權(quán)利要求1所述豬TT病毒1型CJNY株基因組的0RF3編碼區(qū)域，其核苷酸序列為 SEQ ID NO :5。
6.權(quán)利要求3所述豬TT病毒1型CJNY株基因組的0RF3編碼區(qū)域所編碼的蛋白質(zhì)，具 有序列為:SEQ ID NO :6ο
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了豬TT病毒1型CJNY株的完整核苷酸序列，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。該序列長(zhǎng)2879個(gè)堿基。與已報(bào)道的三株完整基因組序列的TT病毒1型(GQ120664、AY823990和AB076001)的核苷酸同源性為68.1％-86.7％，最大不同在于該序列所編碼的病毒核衣殼蛋白僅有415個(gè)氨基酸，與其它三株相比大大減少。這些序列可用于特異的檢測(cè)技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)，以及通過(guò)構(gòu)建感染性分子克隆用于病毒生物學(xué)特性的研究。
文檔編號(hào)C12N15/34GK101838657SQ20101012778
公開(kāi)日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2010年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月19日
發(fā)明者何孔旺, 俞正玉, 倪艷秀, 呂立新, 周俊明, 周萍, 張雪寒, 李成仁, 沈江萍, 溫立斌, 茅愛(ài)華, 郭容利 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院