專利名稱：表達(dá)插入痘病毒基因組中的同源基因的重組痘病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠表達(dá)兩個(gè)或多個(gè)同源外源基因的重組痘病毒，其中所述基因與病毒基因組異源，但相互之間具有同源性。所述基因尤其來(lái)源于微生物非常相關(guān)的變種或亞型。本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備這種重組痘病毒的方法以及這種重組痘病毒作為藥物或疫苗的應(yīng)用。此外，本發(fā)明還提供一種對(duì)活體動(dòng)物包括人的免疫反應(yīng)進(jìn)行影響優(yōu)選為誘導(dǎo)的方法。
背景技術(shù)：
每一個(gè)活生物體經(jīng)常受感染性或致病因子如細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲(chóng)的挑戰(zhàn)。生物體的所謂免疫系統(tǒng)能夠阻止它們免受這些致病因子引起的持久感染、疾病或中毒。
哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)可分成特異性和非特異性部分，雖然這兩部分緊密交聯(lián)。非特異性免疫反應(yīng)能夠介導(dǎo)對(duì)廣泛不同的病原體或感染因子(agent)的即時(shí)防御。特異性免疫反應(yīng)在當(dāng)生物體第一次受到物質(zhì)的挑戰(zhàn)后，于遲滯期后形成。特異性免疫反應(yīng)主要是因?yàn)楫a(chǎn)生了抗原特異性抗體，并形成巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，如細(xì)胞毒素T-細(xì)胞(CTL)。之所以稱為特異性免疫反應(yīng)，是基于下述事實(shí)，生物體個(gè)體受到特異性感染后能夠痊愈，但對(duì)其它感染病仍然易感。通常，同樣的或非常類似的感染因子的第二次感染引起非常溫和的癥狀或根本沒(méi)有發(fā)病的癥狀。這種所謂的免疫持續(xù)非常長(zhǎng)的時(shí)間，有的甚至持續(xù)終生。這種潛在效果通常稱為免疫記憶，對(duì)此可以用于接種疫苗。
術(shù)語(yǔ)接種疫苗描述一種方法，其中用無(wú)毒、部分或失活形式的感染因子攻擊個(gè)體，影響優(yōu)選誘導(dǎo)所述個(gè)體的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致即使不是終生但長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)的對(duì)特異感染因子的免疫抵抗。
人所患的天花疾病是由于天花(Variola)病毒引起的。天花病毒屬于痘病毒科(Poxviridae)，這是具有復(fù)雜DNA大的病毒科，可在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制。
根據(jù)寄生在脊椎動(dòng)物和昆蟲(chóng)的不同宿主范圍，可將痘病毒科分成兩個(gè)亞科即脊椎動(dòng)物痘病毒亞科(Chordopoxvirinae)和昆蟲(chóng)痘病毒亞科(Entomopoxvirinae)。脊椎動(dòng)物痘病毒亞科包括正痘病毒屬(Orthopoxviruese)和禽痘病毒屬(Avipoxviruse)以及其它一些屬的病毒(Fields Virology，ed.byFields B.N.，Lippincott-Raven Publishers，3rd edition 1996，ISBN0-7817-0253-4，Chapter 83)。
正痘病毒屬包括引起人患天花的病原即天花病毒，和其它非常重要的病毒，如駱駝痘病毒、牛痘病毒、綿羊痘病毒、山羊痘病毒、猴痘病毒和痘苗病毒。該屬中的所有成員具有遺傳相關(guān)性，相似的形態(tài)和宿主范圍。限制性內(nèi)切酶圖譜甚至表明正痘病毒屬的不同成員之間具有高至90％的序列同一性(Mackett & Archard，，J Gen Virol，45683-701)。
使用了至少100年的針對(duì)天花的疫苗接種的疫苗稱為痘苗病毒(VV)。不清楚的是，VV是否是來(lái)源于通過(guò)延長(zhǎng)的連續(xù)傳代的痘苗病毒或牛痘病毒-目前已根除的活的代表物或者是遺傳重組的產(chǎn)物。此外，在VV的歷史過(guò)程中，形成了許多痘苗株系。不同株系表現(xiàn)出不同的免疫原性，并涉及不同程度的潛在的并發(fā)癥，最嚴(yán)重的可引起接種后腦炎。然而，許多這些株系用于針對(duì)天花的接種。例如NYCBOH、Western Reserve或Wyeth株系主要在美國(guó)使用，而Ankara、Bern、Copenhagen、Lister和MVA菌株在歐洲使用。WHO在1980年實(shí)施的VV不同株系的全球接種計(jì)劃而最終宣告天花病毒被成功根除。
至今，VV主要在實(shí)驗(yàn)室中使用的實(shí)驗(yàn)菌株，除此之外，仍然被認(rèn)為是正痘病毒屬的原型，這也是為什么VV成為研究最為詳細(xì)的病毒之一的原因所在(Fields Virology，ed.by Fields B.N.，Lippincott-Raven Publishers，3rdedition 1996，ISBN0-7817-0253-4，Chapter 83 and 84)。VV和其它最近應(yīng)用的痘病毒已被用于插入和表達(dá)外源基因。將外源基因插入到活的感染性痘病毒的基本技術(shù)包括，供體質(zhì)粒上位于側(cè)接外源遺傳元件的痘病毒DNA序列與拯救痘病毒中存在的同源序列之間的重組。遺傳重組通常是兩條DNA鏈中的同源部分之間的交換。某些病毒RNA可以取代DNA。核酸的同源部分可以是具有相同核苷酸堿基序列的核酸序列(DNA或RNA)。在被感染的宿主細(xì)胞中，新病毒基因組的產(chǎn)生和復(fù)制過(guò)程中可能自然發(fā)生遺傳重組。因此，宿主細(xì)胞被兩個(gè)或更多不同病毒或其它遺傳構(gòu)建體感染時(shí)，在病毒的復(fù)制循環(huán)過(guò)程中，病毒基因之間可能發(fā)生遺傳重組。來(lái)自第一基因組的DNA序列部分在構(gòu)建與第二共感染的病毒中交換使用，其中所述DNA與第一病毒基因組的DNA之間具有同源性。
通過(guò)修飾感染性病毒而使插入的DNA遺傳序列的成功表達(dá)要求兩個(gè)條件。第一，插入在病毒的非必需區(qū)域以使被修飾病毒仍然能夠成活。表達(dá)所插入DNA的第二個(gè)條件是存在著與插入DNA合適關(guān)聯(lián)的啟動(dòng)子。通常，啟動(dòng)子位于要表達(dá)的DNA序列的上游。
利用重組VV表達(dá)，如肝炎B病毒表面抗原(HBsAg)、流感病毒血凝素(InfHA)、或諾爾斯氏瘧原蟲(chóng)孢子體抗原(Plasmodium knowlesi sporozoiteantigen)，以作為活性疫苗預(yù)防疾病的感染，這些用途已被證實(shí)并已有綜述(Smith，et al.Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2，383-407)。
VV的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是單VV基因組能夠攜帶多個(gè)外源序列、基因或抗原的能力(Smith & Moss，Gene，25(1)21-28)。而且，已有報(bào)道稱用多價(jià)疫苗的單次接種能夠激發(fā)對(duì)多個(gè)異源感染性疾病的免疫(Perkus et al.，，Science，Vol.229，981-984)。
利用單個(gè)VV表達(dá)多個(gè)抗原的一個(gè)實(shí)例如Bray等所描述。重組VV能夠表達(dá)登革(Dengue)病毒血清型4的三個(gè)不同結(jié)構(gòu)蛋白，即衣殼(C)、pre-membrane(prM)、包膜(E)蛋白，以及登革病毒血清型4的兩個(gè)不同的非結(jié)構(gòu)蛋白，即NS1和NS2a，其保護(hù)鼠抵抗對(duì)同源的登革病毒血清型4的攻擊(Bray et al.，，Virology 2853-2856)。
登革病毒有4個(gè)血清型，即登革病毒血清型1(Den-1)至登革病毒血清型4(Den-4)。對(duì)于能夠感染人而言，登革病毒是黃病毒(Flavivirus)屬中重要的成員之一。登革病毒感染導(dǎo)致的疾病范圍可以是從類流感癥狀疾病到嚴(yán)重疾病或致死疾病，休克癥狀(DSS)的登革出血熱(DHF)。登革病毒爆發(fā)仍然是熱帶和亞熱帶人口密集地區(qū)公共健康的主要問(wèn)題，因?yàn)檫@些地區(qū)有大量的傳播媒介-蚊。
由于登革病毒感染和其它由蚊介導(dǎo)黃病毒導(dǎo)致的疾病在全球許多地區(qū)傳播，因此投入很大努力來(lái)能阻止登革熱(DF)和登革出血熱(DHF)的登革病毒疫苗的進(jìn)展，并使接種的個(gè)體能夠抵抗由某些或所有蚊介導(dǎo)黃病毒導(dǎo)致的疾病。
而DF的大多數(shù)情況顯現(xiàn)在4種血清型中任何一種的第一次感染，比較多的DHF病情發(fā)生在被不同于第一次登革病毒感染的血清型的血清型的第二次感染的受試者中。這種現(xiàn)象使得認(rèn)為，具有對(duì)一個(gè)登革病毒血清型抗體的個(gè)體受不同病毒血清型在適當(dāng)間隔的連續(xù)感染時(shí)，可能導(dǎo)致在相當(dāng)多的情況下發(fā)生DHF。
因而，針對(duì)一種血清型接種疫苗，不能產(chǎn)生針對(duì)登革病毒感染完全保護(hù)，而只能針對(duì)的是同一登革病毒株系的感染。更為重要的是，接種了針對(duì)一種血清型的人，當(dāng)該人受到不同血清型登革病毒的感染時(shí)更可能發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥如登革出血熱。
因此，需求包括針對(duì)所有4個(gè)登革病毒血清型的多價(jià)疫苗。
至今有人建議通過(guò)一組重組VV制備多價(jià)疫苗，其中每一個(gè)VV編碼不同病毒的序列(Moss，Immunology，2，317-327)。然而，這種多價(jià)疫苗有幾個(gè)缺點(diǎn)。首先，獲得數(shù)個(gè)獨(dú)立的重組VV非常麻煩。除分別的產(chǎn)生程序之外，質(zhì)量控制和質(zhì)量保證非常耗費(fèi)時(shí)間。其次，用表達(dá)不同序列的重組病毒的混合物進(jìn)行感染總是存在感染不是特別平衡的問(wèn)題。主要的風(fēng)險(xiǎn)在于只是單個(gè)重組體而不是多價(jià)疫苗中包含的所有不同的重組體感染靶細(xì)胞。其中一個(gè)原因可能是重組病毒分布不均勻。另一個(gè)原因是，在感染單細(xì)胞時(shí)，不同重組病毒之間可能存在干擾。這種干擾現(xiàn)象就是已知的稱為超感染現(xiàn)象。這種情況下，只有某些抗原而不是多價(jià)疫苗中的所有不同抗原由被感染細(xì)胞最終表達(dá)，由此而呈遞到患者的免疫系統(tǒng)。結(jié)果，只獲得針對(duì)某些抗原的免疫保護(hù)，而遠(yuǎn)不能提供針對(duì)通過(guò)多價(jià)疫苗呈遞或可呈遞的各種不同抗原的完全免疫保護(hù)。
在針對(duì)登革病毒感染的疫苗中，不同序列的表達(dá)量不同或以未知的方式表達(dá)，也是使得多價(jià)疫苗具有缺點(diǎn)，如登革病毒2的包膜蛋白就顯示有這種情況(Deuble et al.，，J.Virol 652853)，故這種接種對(duì)患者而言非常危險(xiǎn)。利用重組痘苗病毒組的不完全接種，只能提供針對(duì)某些而不是所有血清型的登革病毒免疫保護(hù)。不幸的還有，在登革病毒的情況下不完全接種非常不能被接受，因?yàn)檫@增加了諸如登革出血熱等致死并發(fā)癥出現(xiàn)的機(jī)率。
發(fā)明目的因此本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定、有效和可靠的疫苗，可針對(duì)由多于一個(gè)株系、分化體(clade)、變種、亞型或血清型的致病微生物引起的感染性疾病的免疫保護(hù)。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供一種穩(wěn)定、有效和可靠的針對(duì)登革病毒感染的疫苗，針對(duì)所有登革病毒血清型提供可靠的接種。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明是基于來(lái)源于不同株系、分化體、變體、亞型或血清型的致感染病微生物包括在痘病毒同源基因中。正如上面已提到的，例如登革病毒的4個(gè)組、亞型或血清型均包括同一類型的基因，如編碼衣殼(C)蛋白基因，編碼pre-membrane(PrM)或包膜(E)蛋白的基因。然而，在4個(gè)血清型病毒的同一類型基因的核酸序列之間并不完全相同，也不完全同源，例如登革病毒血清型1、2、3和4(PrM1-4)的PrM基因之間的序列比較(Lasergene4.05 Magalign，Macintosh)揭示序列同一性為66.5-72.9％，即同源性為65-75％?？梢栽O(shè)想致感染病微生物的不同亞型的基因之間存在區(qū)別和變異，這是導(dǎo)致針對(duì)一種亞型的疫苗接種不能自發(fā)的提供針對(duì)同一微生物的其它變種感染的保護(hù)。因此，可以產(chǎn)生包括來(lái)源于不同株系、分化枝、變種、亞型或血清型的致傳染病微生物的非常相關(guān)或同源基因的重組病毒。然而，正如上面已提及的，同源序列之間的同源重組可在病毒生活周期中發(fā)生，甚至不是完全同源的DNA序列部分之間也能發(fā)生。因而，可以預(yù)期同源基因的插入到單個(gè)病毒基因組中可以引起同源重組，由此，在插入的同源基因中產(chǎn)生缺失。
然而，當(dāng)產(chǎn)生重組痘病病毒，其中包括在其基因組中至少兩個(gè)具有至少60％同源性的外源基因時(shí)，未料到插入在病毒基因組中的所述同源基因仍然保持穩(wěn)定。
甚至優(yōu)選為至少50％同源性的同源基因插入到病毒基因組的不同插入位點(diǎn)，插入在病毒基因組中的所述同源基因仍然保持穩(wěn)定插入到病毒基因組。這種情況中，期望所述同源基因之間發(fā)生的重組事件能夠另外分別導(dǎo)致對(duì)于病毒的擴(kuò)增或病毒生活周期重要的病毒基因的缺失，即期望病毒生活周期將嚴(yán)重受到損害。因此，此外，重組頻率與兩個(gè)連鎖基因的距離成比例，預(yù)期位于不同插入位點(diǎn)的兩個(gè)或多個(gè)同源基因之間的重組頻率將非常高，且進(jìn)而導(dǎo)致所述基因的缺失和/或受到嚴(yán)重干擾。相應(yīng)地，非常吃驚的發(fā)現(xiàn)沒(méi)有發(fā)生重組事件，而插入在病毒基因組中不同插入位點(diǎn)的所述同源基因仍然保持穩(wěn)定。
根據(jù)以前技術(shù)，包含來(lái)自黃病毒，如日本腦炎病毒(JapaneseEncaphalitis)(JEV)、黃熱病毒(YFV)和登革病毒的外源DNA的重組痘病毒是已知的(美國(guó)5514 375)。然而，每個(gè)來(lái)自黃病毒的基因只單次插入，且在同一個(gè)插入位點(diǎn)。此外，用適合的計(jì)算機(jī)軟件(Lasergene 4.05 Magalign，Macintosh)進(jìn)行序列比較揭示插入到痘病毒基因組中的基因的同源性，表明來(lái)自JEV的基因具有20.2％-29.6％、來(lái)自YFV的具有29.2％-45.3％、來(lái)自登革病毒的具有22.8％-29.5％。
在WO 98/13500中有類似公開(kāi)，其描述了登革病毒抗原插入到修飾痘苗病毒(Modified Vaccinia Virus)Ankara(MVA)的同一插入位點(diǎn)，尤其是插入到缺失位點(diǎn)II。
美國(guó)專利5338683描述了皰疹病毒(herpesvirus)的糖蛋白基因gp13和14插入到單個(gè)痘病毒的兩個(gè)不同位點(diǎn)，然而，兩個(gè)基因只具有25.2％的同源性。
流感病毒血細(xì)胞凝集素和插入到修飾痘苗病毒Ankara(MVA)的同一插入位點(diǎn)(缺失位入點(diǎn)III)核蛋白基因，兩者的序列同源性為49.1％(美國(guó)專利5,676,950；Sutter et al.，，Vaccine 121032)。
美國(guó)專利5,891,442披露了包含infectious bursal disease的多蛋白VP2、VP3和VP4的編碼序列的重組病毒。所述基因經(jīng)過(guò)融合，插入到單個(gè)插入位點(diǎn)，所述基因之間的同源性為41.9％-50.3％。
最后美國(guó)專利6,217,882描述了包含插入到同一個(gè)位點(diǎn)，相互之間具有52.7％的同源性的假狂犬病抗原gp50和gp63的重組豬痘病毒載體。
總之，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可以認(rèn)為，具有至少50％同源性的同源基因或序列都是插入到病毒基因組的同一個(gè)或單個(gè)插入位點(diǎn)。
根據(jù)本發(fā)明，具有至少50％同源性的同源基因或序列，即是指同源性為50-100％，即至少有50％的核苷酸堿基相同。低于50％同源性的基因或序列被認(rèn)為是異源的。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語(yǔ)“同源”或“同源性”是用于描述當(dāng)基因或序列之間進(jìn)行比較時(shí)的情形，而術(shù)語(yǔ)“外源”基因、“外源性”或“異源”序列是當(dāng)基因或序列與痘病毒基因組進(jìn)行比較時(shí)的情形，即該術(shù)語(yǔ)指DNA序列在自然情況下與本發(fā)明使用的痘病毒通常不具有相關(guān)性。因此，本發(fā)明涉及包含至少兩個(gè)相對(duì)于病毒基因組是異源的基因的重組痘病毒，但所述兩個(gè)基因相互之間具有同源性。術(shù)語(yǔ)“基因”指編碼序列，編碼了如蛋白質(zhì)、多肽、肽、抗原等。由同源基因翻譯而來(lái)的蛋白質(zhì)、多肽或肽完成相同的作用(task)，且表現(xiàn)出相同的功能特性。同源基因通常來(lái)自不同但相關(guān)的來(lái)源或生物體。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，編碼序列的同源性優(yōu)選為70％至80％，更優(yōu)選為80％至90％或90％至100％。最優(yōu)選地，具有65％至75％的同源性。
由于根據(jù)本發(fā)明的重組痘病毒，僅在單個(gè)感染單元或同一個(gè)病毒顆粒中包含了相關(guān)的遺傳信息，因此不存在不均勻感染和不同的同源序列的不平衡表達(dá)的問(wèn)題。因而，根據(jù)本發(fā)明的重組痘病毒，在一個(gè)感染細(xì)胞中包含并能表達(dá)幾個(gè)緊密或甚至非常緊密的相關(guān)基因或幾乎完全相同的序列，這對(duì)于產(chǎn)生多價(jià)疫苗尤其有好處。
該好處對(duì)于研制針對(duì)由幾個(gè)緊密相關(guān)的株系或血清型的病毒如登革病毒引起的疾病的疫苗中非常有意義。包含不同登革病毒血清型的同源基因的重組痘病毒將在實(shí)施例中進(jìn)行描述。
根據(jù)本發(fā)明的同源基因或序列可以來(lái)源于任何微生物，如除載體病毒之外的任何病毒、任何細(xì)菌、真菌或寄生蟲(chóng)。優(yōu)選地，同源基因或序列來(lái)源感染性或病原微生物，最優(yōu)選來(lái)源于所述微生物不同的株系或分化枝、變種、亞型或血清型。
術(shù)語(yǔ)“株系”或“分化枝”作為技術(shù)術(shù)語(yǔ)，用于描述微生物分類級(jí)別，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言非常熟知。至今分類體系將所有已鑒定的微生物分類到hierarchic順序，科、屬、種、株系(Fields Virology，ed.by Fields B.N.，Lippincott-Raven Publishers，4th edition 2001)。對(duì)科的成員的分類標(biāo)準(zhǔn)是它們的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，屬包括具有共同特性的所有成員，種被定義為多特性類(polythetic class)，組成復(fù)制譜系并存在于特定的生態(tài)位。術(shù)語(yǔ)“株系”或“分化枝”用于描述微生物即病毒的分類級(jí)別，是指具有共同特性，諸如基本形態(tài)或基因組結(jié)構(gòu)或組織，但生物學(xué)性質(zhì)，如宿主范圍、組織向性、地理分布、減毒或致病性等方面不同。術(shù)語(yǔ)“變種”或“血清型”是對(duì)同一株系的成員作進(jìn)一步區(qū)分，也叫“亞型”，對(duì)由于微小的基因組變異而表現(xiàn)出單個(gè)感染譜或抗原特性不同的成員進(jìn)行區(qū)分。
根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式，同源基因或序列選自于病毒，優(yōu)選的是屬于黃病毒屬的病毒，如優(yōu)選但不局限于登革病毒、西尼羅(West Nile)病毒或日本腦炎病毒；屬于反轉(zhuǎn)錄病毒(Retroviruses)屬的病毒，如優(yōu)選但不局限于人免疫缺陷病毒(HIV)；屬于腸道病毒(Enteroviruses)屬的病毒，如優(yōu)選但不局限于手(Hand)、足(Foot)和口腔(Mouth)疾病、EV71；屬于輪狀病毒(Rotaviruses)屬的病毒或?qū)儆谡巢《?Orthomyxoviruses)屬的病毒，如優(yōu)選但不局限于流感病毒。最優(yōu)選來(lái)源于黃病毒的同源基因。
根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式，同源基因選自于登革病毒基因，優(yōu)選為C、NS1和/或NS2，或優(yōu)選為E，更優(yōu)選為PrM。最優(yōu)選來(lái)源于病毒的不同血清型的同源基因，其中所述基因可來(lái)自登革病毒所有4個(gè)血清型中的1、2、3或4個(gè)血清型。
根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式，同源基因選自不同HIV株系或分化枝。優(yōu)選的同源基因選自gag/pol編碼序列，更優(yōu)選為env編碼序列或更進(jìn)一步優(yōu)選為HIV的結(jié)構(gòu)和/或調(diào)控性編碼序列。
本發(fā)明所用的合適病毒載體選自痘病毒，它可容易的在所選擇的宿主細(xì)胞如鳥(niǎo)宿主細(xì)胞中培養(yǎng)，但在人體或人細(xì)胞中高度復(fù)制缺陷型或?qū)嶋H上不能復(fù)制。
根據(jù)某些優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的痘病毒選自金絲雀痘(canarypox)病毒(Plotkin et al.Dev Biol Stand.vol 84pp 165-170.Taylor et al.Vaccine，Vol 13.No.6pp 539-549)、禽痘病毒(Afonso et al.J Virol，pp3815-3831.Fields Virology，ed.by Fields B.N.，Lippincott-Raven Publishers，4th edition 2001，Chapter 85page 2916)、企鵝痘(penguin pox)(Stannard et al.J Gen Virol，79，pp 1637-1649)或它們衍生物。由于這些病毒屬于禽痘病毒(Avipoxviruses)屬，因而在禽細(xì)胞中非常容易培養(yǎng)和增殖。然而，在人體或人細(xì)胞中它們屬于復(fù)制缺陷型，而基本上不能或幾乎不能產(chǎn)生感染性子代病毒。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式，痘苗病毒，優(yōu)選為減毒痘苗病毒用于產(chǎn)生包含兩個(gè)或多個(gè)同源基因的重組痘病毒。
雖然，已知痘苗病毒(VV)在存在短的同源序列時(shí)即可進(jìn)行產(chǎn)生同源重組，進(jìn)而缺失同源序列(Howley et al.，，Gene 172233-237)，本發(fā)明提供包括穩(wěn)定插入到其基因組中的同源序列或基因的重組痘苗病毒。該發(fā)現(xiàn)尤其預(yù)料不到，因?yàn)楦鶕?jù)Howely等，短序列長(zhǎng)至300堿基對(duì)(bp)即足以誘發(fā)痘苗病毒的基因組重排和同源序列的缺失。因而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)想更長(zhǎng)的序列將會(huì)有更大可能性地誘發(fā)重組。然而，根據(jù)本發(fā)明甚至包含完全同源基因的序列都能穩(wěn)定的插入到痘苗病毒基因組中。
一個(gè)痘苗病毒的例子，是高度減毒且宿主范圍受限的痘苗株系，即修飾痘苗病毒Ankara(MVA)(Sutter，G.et al.，Vaccine 121032-40)，但不局限于該例子。MVA是通過(guò)痘苗病毒Ankara(CVA)株系在雞胚胎纖維原細(xì)胞中連續(xù)約570傳代而獲得的(綜述參見(jiàn)Mayr，A.，et al.，Infection3，6-14)。由于長(zhǎng)期傳代的CVA缺失了大約31kb的基因組序列。所獲得的病毒株系，即MVA，被描述為宿主細(xì)胞高度受限(Meyer，H.et AL.，J.Gen.Virol.72，1031-1038)。典型MVA株系是MVA 575，保藏于歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures)，其保藏號(hào)為ECACC V00120707。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，MVA-Vero株系或其衍生物可以用于本發(fā)明。MVA-Vero株系保藏于歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)ECACCV99101431和ECACC 01021411。MVA-Vero的生物學(xué)、化學(xué)和物理特性所反應(yīng)出的安全性可參見(jiàn)國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/EP01/02703。與常規(guī)MVA相比，MVA-Vero基因組還有另外一個(gè)缺失。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)病毒的“衍生物”指子代病毒具有與親本病毒相同的特征，但在其基因組中有一或多個(gè)部分的差異。
根據(jù)本發(fā)明的另外實(shí)施方式，使用MVA-BN。MVA-BN保藏于歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)ECACC V00083008。通過(guò)使用MVA-BN或其衍生物，來(lái)產(chǎn)生特別安全的病毒疫苗，因?yàn)镸VA-BN病毒是來(lái)自修飾痘苗Ankara病毒，且表現(xiàn)出極其減毒的病毒。因此，在最優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的包含兩個(gè)或多個(gè)同源基因的MVA-BN或其衍生物用作病毒載體。術(shù)語(yǔ)“MVA-BN的衍生物”是指與MVA-BN有相同功能特性的病毒。WO02/42480中描述了MVA-BN的特征、用于評(píng)價(jià)MVA是否是MVA-BN或其衍生物的生物學(xué)分析方法及產(chǎn)生MVA-BN或其衍生物的方法(在此將該文獻(xiàn)引入作為參考)。一個(gè)簡(jiǎn)便的檢測(cè)MVA-BN或其衍生物的功能特性的方法是檢測(cè)它對(duì)人HaCat細(xì)胞的減毒特性和在其中缺乏復(fù)制。
根據(jù)本發(fā)明的重組痘病毒，其外源序列表達(dá)的控制優(yōu)選通過(guò)痘病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，更優(yōu)選通過(guò)MVA、金絲雀痘病毒、禽痘病毒或企鵝痘病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，或最優(yōu)選通過(guò)痘苗病毒啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)控。根據(jù)本發(fā)明的痘病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件進(jìn)一步包括在痘病毒系統(tǒng)中起作用的每一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。
根據(jù)本發(fā)明，外源序列優(yōu)選插入到病毒基因組的非必需區(qū)域。非必需區(qū)域例如是痘病毒的基因座(loci)或開(kāi)放閱讀框(ORF)，這些區(qū)域?qū)Χ徊《镜纳钪芷诓皇潜匦璧?。在本發(fā)明中，基因間序列即兩個(gè)ORF之間的區(qū)域也認(rèn)為是非必需區(qū)域。在本發(fā)明的另外實(shí)施方式中，外源序列插入到MVA基因組天然發(fā)生的缺失位點(diǎn)(公開(kāi)于PCT/EP96/02926，將其引入本申請(qǐng)作為參考)。
插入DNA的方向?qū)Ρ景l(fā)明的重組病毒的功能或穩(wěn)定性沒(méi)有影響。
由于根據(jù)本發(fā)明的重組痘病毒，其生長(zhǎng)非常有限，因而高度減毒，因此是理想的適合治療哺乳動(dòng)物包括甚至免疫失常的人的候選疫苗。因此，本發(fā)明也提供一種藥物組合物，和疫苗，用于誘導(dǎo)活動(dòng)物體包括人的免疫反應(yīng)。
藥物組合物通?？砂ㄒ换蚨喾N藥物學(xué)可接受和/或認(rèn)可的載體、添加劑、抗生素、防腐劑(preservative)、佐劑、稀釋劑和/或穩(wěn)定劑。這些輔助成分可以是水、鹽、甘油、乙醇、潤(rùn)濕劑(wetting)或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。合適的載體典型的是分子量高、代謝緩慢的分子如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸交酯酸(polyglycollic acids)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂質(zhì)聚集體(lipid aggregates)等。
為了制備疫苗，本發(fā)明的重組痘病毒被轉(zhuǎn)換成一種生理學(xué)可接受形式。可基于針對(duì)天花的免疫接種中使用的痘病毒疫苗的制備經(jīng)驗(yàn)來(lái)完成這一目的(可見(jiàn)于Stickl，H.et al.Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392)。例如，純化病毒以5×10E8 TCID50/ml的效價(jià)，制成約10mM Tris，140mM NaCl pH7.4劑型，于-80℃保存。為制備疫苗顆粒(shot)，如在每一針?biāo)幑?ampoule)中，優(yōu)選為玻璃針?biāo)幑苤袑?0E2-10E8個(gè)病毒顆粒于含有2％蛋白胨和1％人血蛋白的100ml磷酸鈉緩沖液(PBS)中冷凍。任選地，疫苗顆粒(shot)也可通過(guò)逐步凍干制劑中病毒來(lái)獲得。這種制劑可以包含額外的適于體內(nèi)給藥的添加劑，如甘露醇、右旋糖苷、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮，或其它酸如抗氧化劑或惰性氣體、穩(wěn)定劑或重組蛋白(例如人血清蛋白)。然后將玻璃針?biāo)幑苊芊猓稍?℃至室溫下保存數(shù)月。然而，不需要使用的針?biāo)幑軆?yōu)選在低于-20℃保存。
為了免疫接種或治療之用，凍干物可以溶解于0.1至0.5ml水溶液中，優(yōu)選溶于生理鹽水或Tris緩沖液中，可通過(guò)系統(tǒng)或局部給藥，即腸胃外給藥、皮下、靜脈、肌肉、通過(guò)破皮(scarification)給藥或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式進(jìn)行給藥。給藥形式、劑量和給藥次數(shù)可通過(guò)本領(lǐng)域已知方式來(lái)進(jìn)行優(yōu)化。然而，最常見(jiàn)的接種方式是在第一次接種后，隔約1月至6周進(jìn)行第二次接種。
本發(fā)明的重組病毒可用于將外源編碼序列導(dǎo)入到靶細(xì)胞中。將外源編碼序列導(dǎo)入到靶細(xì)胞中可分別產(chǎn)生體外蛋白、多肽、肽、抗原和抗原表位。此外，同源或異源序列導(dǎo)入到細(xì)胞中的方法可適用于體外和體內(nèi)治療。對(duì)于體外治療，分離事先(ex vivo)被本發(fā)明重組痘病毒感染的細(xì)胞，對(duì)活體動(dòng)物給藥以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。對(duì)于體內(nèi)治療，本發(fā)明重組痘病毒直接對(duì)活體動(dòng)物給藥以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。在這種情況中，接種位點(diǎn)周圍的細(xì)胞直接被本發(fā)明病毒或其重組體所感染。感染之后，細(xì)胞合成外源編碼序列編碼的蛋白質(zhì)、多肽、肽或抗原，繼而這些物質(zhì)或其部分呈遞在細(xì)胞表面。免疫系統(tǒng)的特異性細(xì)胞識(shí)別上述蛋白質(zhì)、多肽、肽、抗原和抗原表位的存在，進(jìn)而啟動(dòng)特異的免疫反應(yīng)。
獲得重組痘病毒或?qū)⑼庠淳幋a序列插入痘病毒基因組中的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員非常熟知的。此外，實(shí)施例中也描述了這些方法，并且可以從下述參考文獻(xiàn)中推導(dǎo)出或完全獲得這些方法-Molecular Cloning.A laboratory Manual.Second Edition.By J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis.Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989描述了標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)及知識(shí)，如DNA克隆、DNA和RNA的分離、Western印跡分析、RT-PCR和PCR擴(kuò)增技術(shù)。
-Virology Methods Manual.Edited by Brian WJ Mahy and Hillar OKangro.Academic Press.1996描述了處理和操作病毒的技術(shù)。
-Molecular VirologyA Practical Approach.Edited by AJ Davison andRM Elliott.The Practical Approach Series.IRL Press at Oxford University Press.Oxford 1993.Chapter 9利用痘病毒載體表達(dá)基因。
-Current Protocols in Molecular Biology.PublisherJohn Wiley and SonInc.1998.Chapter 16，section IVExpression of proteins in mammalian cellsusing Vaccinia viral vector描述了對(duì)MVA進(jìn)行處理、操作和遺傳工程技術(shù)及知識(shí)。
為產(chǎn)生本發(fā)明的重組痘病毒，可以使用不同的方法將欲插入到病毒的DNA序列置于E.coli質(zhì)粒構(gòu)建體，該質(zhì)粒中已插入與痘病毒DNA部分同源的DNA。另外，欲插入的DNA序列連接有啟動(dòng)子。啟動(dòng)子-基因的連鎖在質(zhì)粒構(gòu)建體中的方向以使該啟動(dòng)子-基因連鎖兩側(cè)是與包含非必需基因座的區(qū)側(cè)接的DNA序列同源的DNA。所獲得的質(zhì)粒構(gòu)建體通過(guò)在大腸桿菌中生長(zhǎng)而擴(kuò)增和分離。分離出的包含欲插入的DNA基因序列的質(zhì)粒與痘病毒一起轉(zhuǎn)染到細(xì)胞培養(yǎng)物，如雞胚胎纖維原細(xì)胞(CEF)中。質(zhì)粒中的同源pox DNA與病毒基因組之間發(fā)生重組分別得到含外源DNA序列的修飾痘病毒。
根據(jù)一個(gè)更優(yōu)選的方式，合適的細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞，如CEF細(xì)胞，被痘病毒感染。被感染的細(xì)胞接著用包含外源基因的第一質(zhì)粒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其中外源基因優(yōu)選地受痘病毒表達(dá)調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。如上所解釋，質(zhì)粒載體也包括這種序列，該序列能夠指導(dǎo)將外源序列插入到痘病毒基因組中選定部位?？蛇x地，質(zhì)粒載體也可包括含可操作連接于痘病毒啟動(dòng)子的標(biāo)記和/或選擇基因的表達(dá)盒。合適的標(biāo)記或選擇基因例如是編碼綠色熒光蛋白、β-半乳糖苷酶、新霉素、磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶或其它標(biāo)記的基因。使用選擇或標(biāo)記基因表達(dá)盒可簡(jiǎn)化對(duì)所產(chǎn)生的重組痘病毒的鑒定和分離。然而，也可用PCR技術(shù)來(lái)鑒定重組痘病毒。接下來(lái)，用上述獲得的重組痘病毒對(duì)細(xì)胞進(jìn)一步感染并用包含與包括在第一載體中的基因同源的基因的第二載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。這種情況中，該基因應(yīng)當(dāng)包括在痘病毒的不同的插入位點(diǎn)，第二載體的指導(dǎo)同源基因整合到痘病毒基因組的序列也是不同的。在同源重組發(fā)生后，可以分離包含兩個(gè)同源基因的重組病毒。用在先前感染步驟分離到的重組病毒和包括另外的用于轉(zhuǎn)染的同源基因的另一載體來(lái)重復(fù)進(jìn)行感染和轉(zhuǎn)染，這樣可以將兩個(gè)以上的同源基因?qū)氲街亟M病毒中。
任選地，上面描述的感染和轉(zhuǎn)染步驟可以互換，即可以首先用包含外源基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞，再用痘病毒感染該細(xì)胞。
進(jìn)一步可選地，也可以將每一個(gè)同源基因?qū)氩煌《荆儆盟蝎@得的重組病毒共感染細(xì)胞，再篩選出包括所有同源基因的重組體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包括兩個(gè)或更多個(gè)質(zhì)粒載體構(gòu)建體的試劑盒，可以將可表達(dá)的同源基因整合進(jìn)痘病毒基因組中。除有合適的克隆位點(diǎn)之外，這種質(zhì)粒載體包括能夠指導(dǎo)外源序列插入到痘病毒選定部位的序列。可選地，這種載體包括選擇或標(biāo)記基因表達(dá)盒。所述試劑盒進(jìn)一步包括選擇病毒的方法和說(shuō)明書(shū)，所述病毒是一或多個(gè)同源基因的重組體，并可選地選擇或標(biāo)記基因，通過(guò)所述載體構(gòu)建體而插入。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，包括來(lái)自于或同源于本發(fā)明重組痘病毒的DNA序列或其部分。這種序列至少包括本發(fā)明的至少一個(gè)同源基因的片段的外源序列部分和至少包括本發(fā)明痘病毒基因組序列的片段，所述痘病毒基因組序列優(yōu)選側(cè)接外源序列。
這種DNA序列可以用于鑒定或分離病毒或其衍生物，如利用它們來(lái)產(chǎn)生PCR引物、雜交探針或用于矩陣技術(shù)中(array technologies)附圖簡(jiǎn)述

圖1根據(jù)實(shí)施例1，4個(gè)PrM(＝pre-membrane)基因(血清型1-4)在MVA基因組中的插入位點(diǎn)的示意圖。
圖2-9和12-17顯示插入質(zhì)粒載體構(gòu)建體，并注明載體名稱、大小和目的序列位置，如AmpR＝氨芐青霉素抗性基因、bfp＝藍(lán)色熒光蛋白基因、dA＝缺失A、dE＝缺失E、d2＝缺失2、Ecogpt＝E.coli鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因、EGFP＝增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因、F1＝側(cè)翼序列1、F2＝側(cè)翼序列2，I4L＝間隔區(qū)I4L、IGR＝間隔區(qū)、NPT II＝新霉素抗性基因、P＝痘病毒啟動(dòng)子、pr7.5＝痘苗啟動(dòng)子7.5、PrM＝登革病毒的pre-membrane基因，數(shù)值表示來(lái)自4個(gè)血清型中的哪一個(gè)、rpt＝重復(fù)側(cè)翼序列。
圖10對(duì)4個(gè)不同插入載體(pBN49，PBN50，PBN40，PBN39)的載體克隆技術(shù)進(jìn)行的PCR驗(yàn)證。每一個(gè)質(zhì)粒用4個(gè)不同PCR引物組合進(jìn)行檢測(cè)。每一個(gè)組合特異于整合到一個(gè)明顯不同插入位點(diǎn)的一個(gè)明顯不同的PrM序列。
圖11包含4個(gè)同源登革病毒的PrM基因的重組痘病毒的PCR驗(yàn)證(實(shí)施例1)。在凝膠的上半部顯示了重組病毒的不同PCR結(jié)果，下半部顯示對(duì)照質(zhì)粒的相同PCR反應(yīng)的結(jié)果。包含在質(zhì)粒中的同源序列分別命名為pBN39、pBN49或pBN50。PrM代表插入的登革病毒pre-membrane基因，其中數(shù)值表示它來(lái)源于4個(gè)血清型中哪一個(gè)血型。dA＝缺失A、dE＝缺失E、d2＝缺失2、I4L＝間隔區(qū)I4L，用于描述外源DNA的插入位點(diǎn)。
圖18根據(jù)實(shí)施例2，3個(gè)PrM基因(血清型2-4)在MVA基因組中的插入位點(diǎn)示意圖。
圖19包含3個(gè)同源登革病毒PrM基因插入到間隔區(qū)的重組痘病毒的PCR驗(yàn)證(Example 2)。上面凝膠圖顯示特異于PrM2的PCR反應(yīng)結(jié)果，中間的凝膠圖顯示特異于PrM3的PCR反應(yīng)結(jié)果，最下面的凝膠圖顯示特異于PrM4的PCR反應(yīng)結(jié)果。泳道8顯示對(duì)照質(zhì)粒的相同PCR反應(yīng)的結(jié)果。第2道顯示空載體對(duì)照MVA。PrM代表插入的登革病毒pre-membrane基因，其中數(shù)值表示它來(lái)源于4個(gè)血清型中哪一個(gè)血清型。M＝分子量標(biāo)記。
下面的實(shí)施例將進(jìn)一步闡明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解為所提供的實(shí)施例不以任何方式而將對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用限制在這些實(shí)施例。
實(shí)施例1插入載體缺失A的插入載體為了在MVA基因組中相應(yīng)的基因組位置7608-7609處的稱為缺失A或缺失1的位點(diǎn)插入外源序列，構(gòu)建了包含缺失位點(diǎn)A附近約600bp的側(cè)翼序列的質(zhì)粒載體。用合適的計(jì)算機(jī)程序(DNAsis，Hitashi softwareengeneering，San Bruno，USA)來(lái)設(shè)計(jì)合適PCR引物，以用于分離來(lái)自MVA-BN基因組的側(cè)翼序列。這種引物包括延長(zhǎng)有限制性酶切位點(diǎn)的突出(extension)，用于將側(cè)翼序列克隆到載體質(zhì)粒上。在側(cè)翼序列之間，引入選擇基因表達(dá)盒，如受痘病毒啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控下的NPT II基因(新霉素抗性基因)。此外，具有克隆位點(diǎn)以便插入另外的欲插入到缺失位點(diǎn)A的基因或外源序列。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)如此載體構(gòu)建體如圖2所示(pBNXl0)。
缺失E的插入載體為了在MVA基因組中相應(yīng)的基因組位置170480-170481處的稱為缺失E或缺失4的位點(diǎn)插入外源序列，構(gòu)建了包含缺失位點(diǎn)E附近約600bp的側(cè)翼序列的載體。按上述類似的方法設(shè)計(jì)和構(gòu)建載體。在側(cè)翼序列之間置有受痘病毒啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控下的EGFP基因(綠色熒光蛋白，Clonetech)。此外，具有克隆位點(diǎn)以便插入另外的欲插入到缺失位點(diǎn)A(E)的基因或外源序列。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)如此載體構(gòu)建體如圖3所示(pBNX32)。
缺失2的插入載體為了在MVA基因組中相應(yīng)于基因組位置120718-20719處的稱為缺失2的位點(diǎn)插入外源序列，構(gòu)建了包含缺失位點(diǎn)2附近約600bp的側(cè)翼序列的載體。按上述類似的方法設(shè)計(jì)和構(gòu)建載體。在側(cè)翼序列之間置有受痘病毒啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控下的hbfp基因(人源化藍(lán)色熒光蛋白，Pavalkis GN et al.)。此外，具有克隆位點(diǎn)以便插入另外的欲插入到缺失位點(diǎn)2的基因或外源序列。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)如此載體構(gòu)建體如圖4所示(pBNX36)。
間隔區(qū)I4L的插入載體為了在MVA基因組中的間隔區(qū)，即相應(yīng)于基因組位置為56760處的ORF I3L和I4L之間插入外源序列，構(gòu)建了包含在I4L基因座間隔區(qū)附近約600bp的側(cè)翼序列的載體。按上述類似的方法設(shè)計(jì)和構(gòu)建載體。在側(cè)翼序列之間置有受痘病毒啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控下的Ecogpt基因(或gpt，代表分離自大腸桿菌的磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶)。此外，其具有克隆位點(diǎn)以便插入另外的欲插入到I4L ORF之后間隔區(qū)的基因或序列。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)如此載體構(gòu)建體如圖5所示(pBNX39)。
構(gòu)建包含在其基因組中整合了數(shù)個(gè)同源基因的重組痘病毒插入載體為了將分別來(lái)自登革病毒4個(gè)血清型的4個(gè)PrM基因插入到MVA基因組中，使用了4個(gè)單獨(dú)的重組載體。
如上面的詳細(xì)描述，這些載體包含與MVA基因組同源的序列，以便通過(guò)同源重組而靶向插入。此外，每一個(gè)載體包含選擇或報(bào)道基因表達(dá)盒。
登革病毒的4個(gè)血清型的PrM序列是通過(guò)寡核苷酸(oligo)退火和PCR擴(kuò)增而合成的。將PrM序列克隆到痘病毒啟動(dòng)子元件的下游以形成表達(dá)盒。該表達(dá)盒接著克隆到相關(guān)插入載體構(gòu)建體中的克隆位點(diǎn)。
結(jié)果，缺失A的插入載體構(gòu)建體包含登革病毒血清型2的PrM基因(圖6-pBN39)。缺失2的插入載體構(gòu)建體包含登革病毒血清型1的PrM基因(圖7-pBN49)。間隔區(qū)I4L的插入載體包含登革病毒血清型3的PrM基因(圖8-pBN50)。對(duì)于缺失E的插入載體包含登革病毒血清型4的PrM基因(圖9-pBN40)插入載體的PCR驗(yàn)證為了檢驗(yàn)克隆策略是否成功，進(jìn)行了PCR分析。為進(jìn)行PCR分析，引物選擇對(duì)如下引物組合特異于結(jié)合與插入位點(diǎn)相關(guān)的側(cè)翼序列的引物，第二條引物特異結(jié)合登革病毒的高同源性PrM基因之一。
對(duì)于包含登革病毒血清型2的PrM基因的缺失A的插入載體，所用的篩選引物是oBN93(CGCGGATCCATGCTGAACATCTTGAACAGGAGACGCAGA.SEQ ID NO.1)和oBN477(CATGATAAGAGATTGTATCAG.SEQ ID NO.2)。
對(duì)于包含登革病毒血清型1的PrM基因的缺失2的插入載體，所用的篩選引物是oBN194(ATGTTGAACATAATGAACAGGAGGAAAAGATCTGTGACCATGCTCCTCATGCTGCTGCCCACAGCCCTGGCGTTCCATCT.SEQ ID NO.3)和oBN476(GATTTT GCTATTCAGTGGACTGGATG.SEQ IDNO.4)。
對(duì)于包含登革病毒血清型3的PrM基因的間隔區(qū)I4L的插入載體，所用的篩選引物是oBN255(CCTTAATCGAATTCTCATGTCATGGATGGGGTAACCAGCATTAATAGT.SEQ ID NO.5)和oBN479(GCTCCCATTCAATTCACATTGG.SEQ ID NO.6)。
對(duì)于包含登革病毒血清型4的PrM基因的缺失E的插入載體，所用的篩選引物是oBN210(ATCCCATTCCTGAATGTGGTGTTAAAGCTACTGAGCGCTTCTCTCGTCTCCGTTCTCCGCTCTGGGTGCATGTCCCATAC.SEQ ID NO.7)和oBN478(GTACATGGATGATATAGATATG.SEQ ID NO.8)。
在PCR儀即Thermal cycler GeneAmp 9700(Perkin Elmer)中，用包含10xPCR緩沖液，MgCl2緩沖液和Taq DNA聚合酶的Taq DNA聚合酶試劑盒(Roche，Cat.no.201205)或相當(dāng)物來(lái)進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。通常，PCR反應(yīng)要求在50μl反應(yīng)總體積中包含45ul的mastermix、樣品DNA和ddH2O。其中應(yīng)當(dāng)由30.75μl DdH2O，5μL 10xbuffer，1μl dNTP混合物(每一種10mM)，2.5μl每一種引物(5pmol/μl)，3μl MgCl2(25mM)和0.25μl Taq-DNA聚合酶(5U/μl)來(lái)制備成mastermix。
按如下參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)1)變性4分鐘 94℃2)30個(gè)循環(huán)變性 30秒 94℃退火 30秒 55℃延伸 1-3分鐘72℃3)延伸7分鐘 72℃4)保存 94℃；根據(jù)插入基因的大小，延伸時(shí)間至少為1分鐘/kb。
圖10中顯示的PCR結(jié)果，表明對(duì)于單個(gè)插入而使用的引物組合具有特異性。
oBN194/oBN476引物組合特異于缺失2和插入其中的PrM1。對(duì)質(zhì)粒pBN49進(jìn)行PCR擴(kuò)增的片段預(yù)期為678bp(示于第3道，凝膠的上半部)。
oBN255/oBN479引物組合特異于間隔區(qū)I4L和插入其中的PrM3。對(duì)質(zhì)粒pBN50進(jìn)行PCR擴(kuò)增的片段預(yù)期為825bp(示于第9道，凝膠的上半部)。
oBN210/oBN478引物組合特異于缺失E和作為插入物的PrM4。對(duì)質(zhì)粒pBN40進(jìn)行PCR擴(kuò)增的片段預(yù)期大小為607bp(示于第5道，凝膠的下半部)。
oBN93/oBN477引物組合特異于缺失A和插入其中的PrM2。對(duì)質(zhì)粒pBN39進(jìn)行PCR擴(kuò)增的片段預(yù)期為636bp(示于第11道，凝膠的下半部)。
經(jīng)同源重組產(chǎn)生重組MVA為通過(guò)重組MVA中表達(dá)外源基因，可通過(guò)稱為同源重組的方法將需要表達(dá)的基因插入到病毒基因組中。為此目的，將目的外源基因克隆到如上所述的插入載體中。再將該載體轉(zhuǎn)染已被MVA-BN感染的細(xì)胞。在被感染和轉(zhuǎn)染的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生重組。利用包含在插入載體中的選擇和/或報(bào)道基因表達(dá)盒，可以鑒定和分離出含有重組病毒的細(xì)胞。
同源重組為進(jìn)行同源重組，BHK(幼倉(cāng)鼠腎Baby hamster kidney)細(xì)胞或CEF(原生雞胚胎纖維原)細(xì)胞在6孔平板上接種培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基是DMEM(Dulbecco`s Modified Eagles Medium，Gibco BRL)+10％牛胎血清(FCS)或?yàn)榱藷o(wú)血清生產(chǎn)程序，則用VP-SFM(Gibco BRL)+4mmol/l L-谷氨酸作培養(yǎng)基。
為了保持細(xì)胞處于生長(zhǎng)階段，并因此應(yīng)當(dāng)在轉(zhuǎn)染那天達(dá)到60-80％融合(confluence)，在進(jìn)行接種培養(yǎng)之前對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，作為已知細(xì)胞數(shù)來(lái)確定感染復(fù)數(shù)(moi)。
為了進(jìn)行感染，MVA母液在DMEM/FCS或VP-SFM/L-谷氨酸中稀釋至500μl稀釋液中大約含有的合適病毒數(shù)可獲得0.01的moi?？稍O(shè)想細(xì)胞在培種培養(yǎng)后會(huì)分裂一次。去除培養(yǎng)基，于室溫用500μl稀釋病毒液感染1小時(shí)。去除接種物后，用DMEM/VP-SFM洗滌。被感染細(xì)胞分別置于1.6mlDMEM/FCS和VP-SFM/L-谷氨酸以用于轉(zhuǎn)染反應(yīng)(Qiagen Effectene Kit)。
使用“Effectene”轉(zhuǎn)染試劑盒(Qiagen)來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。1-5μg線性化插入載體(多次轉(zhuǎn)染的總量)于最終體積為150μl的緩沖液EC中而制備轉(zhuǎn)染混合液。每μg DNA加入8.0μl Enhancer，旋渦后于室溫培育5分鐘。然后，在旋渦母液試管后，每μg DNA加入25μl Effectene，通過(guò)旋渦充分混勻溶液，并于室溫培育10分鐘。分別加入600μ DMEM/FCS或VP-SFM/L-谷氨酸，混勻，接著整個(gè)轉(zhuǎn)染混合液加入到已用培養(yǎng)基履蓋的細(xì)胞。輕輕搖動(dòng)平板，混合以進(jìn)行轉(zhuǎn)染反應(yīng)。于37℃和5％CO2條件下培育過(guò)夜。第二天去除培養(yǎng)基，用新鮮DMEM/FCS或VP-SFM/L-谷氨酸代替。持續(xù)培育直到第3天。
為了收集細(xì)胞，將細(xì)胞刮到培養(yǎng)基中進(jìn)而懸浮，并將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到適當(dāng)試管中，若短期保存可于-20℃冷凍保存，若長(zhǎng)期保存則在-80℃冷凍保存。
將PrM4插入到MVA中在第一輪中，按上述程序用MVA-BN感染細(xì)胞，再用包含登革病毒血清型4的PrM基因和EGPF作為報(bào)道基因的插入載體pBN40進(jìn)行感染。由于轉(zhuǎn)染載體中含有報(bào)道基因EGFP，因此最遲在第3天即可在被重組病毒感染的細(xì)胞中檢測(cè)到所合成的蛋白質(zhì)。獲得的重組病毒用噬斑純化法進(jìn)行純化。
用移液管管尖分離被感染細(xì)胞(發(fā)熒光或染色)，在200μL PBS或培養(yǎng)基中重懸浮和抽吸，以進(jìn)行噬斑純化。然后，包含約10E6個(gè)細(xì)胞的新培養(yǎng)皿用100μl重懸浮噬斑進(jìn)行感染。48小時(shí)后，細(xì)胞懸浮于300μl PBS中。從懸浮液中抽提DNA，用PCR分析進(jìn)行篩選。選擇出顯示預(yù)期條帶的克隆，并用該病毒以不同量感染新鮮6孔平板。用1％瓊脂糖覆蓋住孔以防止病毒的撒布。48小時(shí)后即可分離包含重組病毒克隆的被感染細(xì)胞。
重復(fù)該過(guò)程，直到用PCR不能檢測(cè)到野生型MVA-BN為止。
經(jīng)過(guò)4輪噬斑純化后，用能夠選擇性擴(kuò)增預(yù)期插入(如上所述的oBN210和OBN478)的引物對(duì)進(jìn)行PCR分析，以鑒定重組病毒即MVA-PrM4，其中對(duì)照引物對(duì)能特異識(shí)別插入位點(diǎn)缺失E(oBN453GTTGAAGGATTCACTTCCGTGGA，SEQ ID NO.9和oBN454GCATTCACAGATTCTATTGTGAGTC，SEQ ID NO.10)。
將PrM2插入到MVA-PrM4按上面描述的方法用MVA-PrM4感染細(xì)胞，并進(jìn)一步用包含登革病毒血清2的PrM基因和NPT II(新霉素抗性基因)作為選擇基因的插入載體pBN39進(jìn)行感染。為了純化表達(dá)抗生素抗性基因的重組MVA，推薦最好是病毒在選擇條件下擴(kuò)增3輪再進(jìn)行噬斑純化步驟。因此加入G418到培養(yǎng)基中，以選擇新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶。G418是新霉素的衍生物，通過(guò)干擾核糖體的功能而抑制蛋白質(zhì)的合成。NPT基因的活性可通過(guò)磷酸化而使G418失活。
在新霉素選擇存在下，進(jìn)行16輪噬斑純化后，用能夠選擇性擴(kuò)增預(yù)期插入(如上所述的oBN93和oBN477)的引物進(jìn)行PCR分析，以鑒定重組病毒即MVA-PrM4/PrM2，其中對(duì)照引物對(duì)特異性識(shí)別插入位點(diǎn)缺失A(如上的oBN477)和oBN452GTTTCATCAGAAATGACTCCATGAAA，SEQ IDNO.11)。此外，PrM4在缺失E的插入用下述引物對(duì)進(jìn)行驗(yàn)證oBN210-oBN478和oBN453-oBN454。
將PrM1插入MVA在第一輪中，按上述程序用MVA-BN感染細(xì)胞，再用含有登革病毒血清型1的PrM基因和hbfp作為報(bào)道基因(人源化藍(lán)色熒光蛋白基因)的插入載體pBN49進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在用重組病毒感染細(xì)胞的第3天即可檢測(cè)到合成的hbfp蛋白。獲得的重組病毒用噬斑純化法進(jìn)行純化。
經(jīng)過(guò)10輪噬斑純化后，用能夠選擇性擴(kuò)增預(yù)期插入(如上所述的oBN194和OBN476)的引物對(duì)進(jìn)行PCR分析，以鑒定重組病毒即MVA-PrM4，其中對(duì)照引物對(duì)能特異識(shí)別插入位點(diǎn)缺失2(oBN54CGGGGTACCCGACGAACAAGGAACTGTAGCAGAGGCATC.SEQ ID NO.12和oBN56AACTGCAGTTGTTCGTATGTCATAAATTCTTTAATTAT，SEQID NO.13)。
將PrM3插入MVA在第一輪中，按上述程序用MVA-BN感染細(xì)胞，再用含有登革病毒血清型3的PrM基因和Ecogpt基因(Ecogpt或簡(jiǎn)寫(xiě)成gpt，代表磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因)作為報(bào)道基因的插入載體pBN50進(jìn)行感染。獲得的重組病毒通過(guò)3輪噬斑純化，選擇條件上添加霉酚酸、葉黃素和次黃嘌呤以對(duì)磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶代謝進(jìn)行選擇。霉酚酸抑制次黃苷單磷酸脫氫酶，導(dǎo)致嘌呤合成受阻，因而在大部分細(xì)胞系中抑制病毒復(fù)制?？梢酝ㄟ^(guò)組成性啟動(dòng)子的Ecogpt的表達(dá)以及提供葉黃素和次黃嘌呤作為底物可克服這種受阻。
用能夠選擇性擴(kuò)增預(yù)期插入(如上所述的oBN255和oBN479)的引物進(jìn)行PCR分析，以鑒定獲得的重組病毒即MVA-PrM3，其中對(duì)照引物對(duì)能特異識(shí)別插入位點(diǎn)I4L(oBN499CAACTCTCTTCTTGATTACC，SEQ ID NO.14和oBN500CGATCAAAGTCAATCTA TG，SEQ ID NO.15)。
MVA-PrM1和MVA-PrM3的共感染用等量的按上述方法獲得的MVA-PrM1和MVA-PrM3感染細(xì)胞。在用磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶代謝選擇重組病毒的藍(lán)色熒光克隆，如此進(jìn)行3輪噬斑純化，對(duì)純化的重組病毒用引物對(duì)(如上述的oBN255和oBN479、oBN499和oBN500、oBN194和oBN476、oBN54和oBN56)進(jìn)行PCR分析。獲得的重組病毒稱為MVA-PrM1/PrM3。
MVA-PrM1/PrM3和MVA-PrM2/PrM4的共感染用等量的按上述方法獲得的MVA-PrM1/PrM3和MVA-PrM2/PrM4感染細(xì)胞。在用磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶代謝和新霉素選擇以進(jìn)行噬斑純化。分離出能產(chǎn)生綠色和藍(lán)色熒光的重組病毒，并用引物對(duì)(如上述的oBN255和oBN479、oBN499和oBN500、oBN194和oBN476、oBN54和oBN56、oBN93和oBN477、oBN477和oBN452、oBN210和oBN478、oBN453和oBN454)進(jìn)行PCR分析。
如圖11所示，對(duì)重組病毒(Clone 20)的PCR分析表明，包含所有4個(gè)PrM基因。凝膠的上半部顯示了對(duì)重組病毒進(jìn)行不同PCR的結(jié)果，下半部分顯示對(duì)照質(zhì)粒進(jìn)行的相同PCR反應(yīng)的結(jié)果(如所標(biāo)出的)。第1、10和11道為1kb和100bp分子量標(biāo)記。
引物組合oBN210/oBN478特異于缺失E和插入其中的PrM4。對(duì)重組病毒和質(zhì)粒pBN40進(jìn)行PCR的擴(kuò)增片段預(yù)期為607bp(示于第2道)。
引物組合oBN453/oBN454特異于缺失E。對(duì)重組病毒進(jìn)行PCR的擴(kuò)增片段預(yù)期為2.7kp，對(duì)于野生型病毒為2.3kb(示于第3道)。在凝膠上半部也顯示有野生型病毒的特異性條帶。這表明制備的重組病毒還沒(méi)有完全去除野生型病毒。有必要進(jìn)一步進(jìn)行噬斑純化。
引物組合oBN93/oBN477特異于缺失A和插入其中的PrM2。對(duì)重組病毒和質(zhì)粒pBN39進(jìn)行PCR的擴(kuò)增片段預(yù)期為636bp(示于第4道)。
引物組合oBN477/oBN452特異于缺失A。對(duì)重組病毒進(jìn)行PCR的擴(kuò)增片段預(yù)期為4.1kb，對(duì)于野生型病毒為2.7kb(示于第5道)。凝膠上部分可以鑒定特異于野生型病毒的條帶。
引物組合oBN255/oBN479特異于間隔區(qū)I4L和插入其中的PrM3。對(duì)重組病毒和質(zhì)粒pBN50進(jìn)行PCR的擴(kuò)增片段預(yù)期為825bp(示于第6道)。
引物組合oBN499/oBN500特異于間隔區(qū)I4L。對(duì)重組病毒進(jìn)行PCR的擴(kuò)增片段預(yù)期為1.0kb，對(duì)于野生型病毒為0.3kb(示于第7道)。
引物組合oBN194/oBN476特異于缺失2和插入其中的PrM1。對(duì)重組病毒和質(zhì)粒pBN49進(jìn)行PCR的擴(kuò)增片段預(yù)期為678bp(示于第8道)。
引物組合oBN54/oBN56特異于缺失2。對(duì)重組病毒進(jìn)行PCR的擴(kuò)增片段預(yù)期為1.6kp，對(duì)于野生型病毒為0.9kb(示于第9道)。在凝膠上半部也顯示鑒定的野生型病毒的特異性條帶。
任選地，可以產(chǎn)生4個(gè)不同病毒，用這4個(gè)病毒共感染的細(xì)胞，再篩選出重組體。
也可對(duì)重組載體進(jìn)行改善，而包含另外的選擇或抗性標(biāo)記。
實(shí)施例2插入載體間隔區(qū)136-137(IGR136-137)的重組載體為了將外源序列插入到MVA基因組中的相應(yīng)于基因組位置129940處的稱為間隔區(qū)(IGR)136-137，構(gòu)建了包含該插入位點(diǎn)附近約600bp的側(cè)翼序列的質(zhì)粒載體。設(shè)計(jì)合適的PCR引物以便分離MVA-BN基因組DNA中的側(cè)翼序列。這種引物含有限制性酶位點(diǎn)的突出端(extension)，用于將側(cè)翼序列克隆到載體質(zhì)粒上。在側(cè)翼序列之間，引入選擇基因表達(dá)盒，如受痘病毒啟動(dòng)子(P)轉(zhuǎn)錄調(diào)控下的NPT II基因(新霉素抗性基因)。此外，具有克隆位點(diǎn)以便插入另外的欲插入到IGR 136-137(PacI)的基因或外源序列。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)如此載體構(gòu)建體如圖12所示(pBNX67)。
間隔區(qū)07-08(IGR07-08)的重組載體為了將外源序列插入到MVA基因組中的相應(yīng)于基因組位置12800處的稱為間隔區(qū)(IGR)07-08，構(gòu)建了包含該插入位點(diǎn)附近約600bp的側(cè)翼序列的質(zhì)粒載體。設(shè)計(jì)合適的PCR引物以便分離MVA-BN基因組DNA中的側(cè)翼序列。這種引物有限制性酶位點(diǎn)的突出，用于將側(cè)翼序列克隆到載體質(zhì)粒上。在側(cè)翼序列之間，引入選擇基因表達(dá)盒，如受痘病毒啟動(dòng)子(P)轉(zhuǎn)錄調(diào)控下的Ecogpt基因(鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因)。此外，具有克隆位點(diǎn)(PacI)以便插入另外的欲插入到IGR 07-08的基因或外源序列。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)如此載體構(gòu)建體如圖13所示(pBNX88)。
間隔區(qū)44-45(IGR 44-45)的重組載體為了將外源序列插入到MVA基因組中的相應(yīng)于基因組位置37330處的稱為間隔區(qū)(IGR)44-45，構(gòu)建了包含該插入位點(diǎn)附近約600bp的側(cè)翼序列的質(zhì)粒載體。設(shè)計(jì)合適的PCR引物以便分離MVA-BN基因組DNA中的側(cè)翼序列。這種引物有限制性酶位點(diǎn)的突出，用于將側(cè)翼序列克隆到載體質(zhì)粒上。在側(cè)翼序列之間，引入選擇基因表達(dá)盒，如受痘病毒啟動(dòng)子(P)轉(zhuǎn)錄調(diào)控下的NPT II基因(新霉素抗性基因)。此外，具有克隆位點(diǎn)(PacI)以便插入另外的欲插入到IGR 44-45的基因或外源序列。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)如此載體構(gòu)建體如圖14所示(pBNX87)。
構(gòu)建在基因組中包含整合了數(shù)個(gè)同源基因的重組痘病毒插入載體為了將分別來(lái)自登革病毒3個(gè)血清型即血清型2、3和4的3個(gè)PrM基因插入到MVA基因組中，使用了3個(gè)獨(dú)立的重組載體。
如上面的詳細(xì)描述，這些載體包含與MVA基因組同源的序列，以便通過(guò)同源重組而靶向插入。此外，每一個(gè)載體包含選擇或報(bào)道基因表達(dá)盒。
登革病毒的3個(gè)血清型的PrM序列按實(shí)施例1中描述的方法合成。
結(jié)果，IGR136-137的插入載體構(gòu)建體包含登革病毒血清型4的PrM基因(圖15-pBN27)。IGR 07-08的插入載體構(gòu)建體包含登革病毒血清型2的PrM基因(圖16-pBN34)。IGR 44-45的插入載體構(gòu)建體包含登革病毒血清型3的PrM基因(圖17-pBN47)。
經(jīng)同源重組產(chǎn)生重組MVA通過(guò)同源重組制備重組MVA的方法按實(shí)施例1的方法進(jìn)行。圖18中表明了PrM4、PrM3和PrM2在MVA基因組中的插入位點(diǎn)。
將PrM4插入到MVA在第一輪中，按上述程序用MVA-BN感染細(xì)胞，再用含有登革病毒血清型4的PrM基因和EGFP作為報(bào)道基因的插入載體pBN27進(jìn)行轉(zhuǎn)染。由于被轉(zhuǎn)染的載體包含報(bào)道基因即EGFP，因而最遲在第3天即可在被重組病毒感染的細(xì)胞中檢測(cè)到其合成的蛋白質(zhì)。獲得的重組病毒需要按實(shí)施例1描述的噬斑純化法進(jìn)行純化。經(jīng)過(guò)4輪噬斑純化后，用能夠選擇性擴(kuò)增插入位點(diǎn)IGR136-137的引物對(duì)對(duì)重組病毒MVA-PrM4進(jìn)行PCR鑒定(oBN1008GATACCGATCACGTTCTA.SEQ ID NO.16和oBN1009ggatatgattatgtagag.SEQ ID NO.17)。
將PrM2插入到MVA按上述程序用MVA-PrM4感染細(xì)胞，再用含有登革病毒血清型2的PrM基因和BFP基因作為報(bào)道基因的插入載體pBN34進(jìn)行轉(zhuǎn)染。由于被轉(zhuǎn)染的載體包含報(bào)道基因BFP，因而最遲在第3天即可在被重組病毒感染的細(xì)胞中檢測(cè)到其合成的蛋白質(zhì)。獲得的重組病毒需要按實(shí)施例1描述的噬斑純化法進(jìn)行純化。經(jīng)過(guò)6輪噬斑純化后，重組病毒MVA-PrM4+PrM2進(jìn)一步傳代、增殖，并制備粗原液。用能夠選擇性擴(kuò)增插入位點(diǎn)IGR07-08的引物對(duì)對(duì)該重組體進(jìn)行PCR鑒定(oBN 903CTGGATAAATACGAGGACGTG.SEQ ID NO.18和oBN904GACAATTATCCGACGCACCG；SEQ ID NO.19)。
將PrM3插入到MVA按上述程序用MVA-PrM2+4感染細(xì)胞，再用含有登革病毒血清型3的PrM基因和EGFP基因作為報(bào)道基因的插入載體pBN47進(jìn)行轉(zhuǎn)染。由于被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞包含報(bào)道基因EGFP，因而最遲在第3天即可在被重組病毒感染的細(xì)胞中檢測(cè)到其合成的蛋白質(zhì)。獲得的重組病毒需要按實(shí)施例1描述的噬斑純化法進(jìn)行純化。經(jīng)過(guò)3輪噬斑純化后，用能夠選擇性擴(kuò)增插入位點(diǎn)IGR44-45的引物對(duì)(oBN904CGTTAGACAACACACCGACGATGG.SEQ IDNO.20和oBN905 CGGATGAAAAATTT TTGGAAG.SEQ ID NO.21)對(duì)重組病毒MVA-PrM4+3+2進(jìn)行PCR鑒定。
對(duì)包含3個(gè)登革病毒PrM基因重組病毒進(jìn)行PCR分析，其結(jié)果如圖19所示。PCR實(shí)驗(yàn)按實(shí)施例1描述的方式進(jìn)行。引物組合oBN1008和oBN1009特異于IGR136-137，其包含PrM4的插入(圖19下面的凝膠圖)。對(duì)重組病毒進(jìn)行PCR，預(yù)期擴(kuò)增片段為1kb(示于第4、5和6道)，用質(zhì)粒作陽(yáng)性對(duì)照(泳道8)。對(duì)于不含Prm4的空載體對(duì)照，預(yù)期擴(kuò)增片段為190bp(泳道2)。M泳道為分子量標(biāo)記，而泳道1、3和7為空。引物組合oBN902和oBN903特異于IGR07-08，其包含PrM2插入(圖19上部的凝膠圖)。對(duì)重組病毒進(jìn)行PCR，預(yù)期片段為960bp(示于泳道4-6)，質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照(泳道8)。對(duì)于不含Prm2的空載體對(duì)照，預(yù)期擴(kuò)增片段為190bp(泳道2)。引物組合oBN904和oBN905特異于IGR44-45，其包含Prm3插入(圖19中間的凝膠圖)。重組病毒預(yù)期的PCR片段的大小為932bp(示于泳道4-6)，質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照(泳道8)。對(duì)于不含Prm2的空載體對(duì)照，預(yù)期片段為185bp(泳道2)。
關(guān)于微生物保藏的說(shuō)明(細(xì)則13之二)
由受理局填寫(xiě) 由國(guó)際局填寫(xiě)
PCT/RO/134表(1992年7月)
附錄3第14頁(yè)布達(dá)佩斯條約關(guān)于用于專利程序的國(guó)際認(rèn)可的微生物保藏國(guó)際局表格收件人BAVARIAN NORDIC RESEARCHINSTITUTE GMBHFRAUNHOFERSTRASSE 18BD-82152 MARTINSRIED德國(guó)保藏人的姓名和地址 當(dāng)適用于細(xì)則6.4(d)時(shí)，所述的日期為國(guó)際保藏單位的資格被認(rèn)定的日期。
表格bp/4(只此一頁(yè))
附錄3第24頁(yè)布達(dá)佩斯條約關(guān)于用于專利程序的國(guó)際認(rèn)可的微生物保藏國(guó)際局表格收件人 存活證明BAVARIAN NORDIC RESEAR由下一頁(yè)所指明的國(guó)際保INSTITUTE GMBH藏單位根據(jù)細(xì)則10.2出具FRAUNHOFERSTRASSE 18BD-82152 MARTINSRIED德國(guó)保藏人的姓名和地址
1指的是初始保藏日，或者，當(dāng)進(jìn)行了新的保藏或保藏的轉(zhuǎn)換時(shí)，指的是最相關(guān)的日期(新保藏的日期或是轉(zhuǎn)保藏的日期)。
2對(duì)于那些法規(guī)10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情況，指的是最近的存活性檢驗(yàn)。
3用打叉表示選定。
表格BP/4(第1頁(yè))
附錄3第25頁(yè)
4如果要求該信息并且如果檢驗(yàn)結(jié)果為陰性，則填寫(xiě)此項(xiàng)。
分析試驗(yàn)的證書(shū)產(chǎn)物描述 MVA-575保藏號(hào)00120707
批準(zhǔn)人＿＿＿＿ECACC質(zhì)量主管日期＿＿＿
分析試驗(yàn)的證書(shū)產(chǎn)物描述 MVA-575保藏號(hào)00120707
批準(zhǔn)人＿＿＿＿ECACC質(zhì)量主管日期＿＿＿＿
關(guān)于微生物保藏的說(shuō)明(細(xì)則13之二)
由受理局填寫(xiě) 由國(guó)際局填寫(xiě)
PCT/RO/134表(1992年7月)
附錄3第14頁(yè)布達(dá)佩斯條約關(guān)于用于專利程序的國(guó)際認(rèn)可的微生物保藏國(guó)際局表格收件人PROF DR ANTON MAYRWEILHEIMER STR.1D-82319 STARNBERG德國(guó)保藏人的姓名和地址 當(dāng)適用于細(xì)則6.4(d)時(shí)，所述的日期為國(guó)際保藏單位的資格被認(rèn)定的日期。
Form BP/4(只此一頁(yè))
附錄3第24頁(yè)布達(dá)佩斯條約關(guān)于用于專利程序的國(guó)際認(rèn)可的微生物保藏國(guó)際局表格收件人存活證明PROF DR ANTON MAYR由下一頁(yè)所指明的國(guó)WEILHEIMER STR.1際保藏單位根據(jù)細(xì)則10.2出D-82319 STARNBERG德國(guó) 具保藏人的姓名和地址 1指的是初始保藏日，或者，當(dāng)進(jìn)行了新的保藏或保藏的轉(zhuǎn)換時(shí)，指的是最相關(guān)的日期(新保藏的日期或是轉(zhuǎn)保藏的日期)。
2對(duì)于那些法規(guī)10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情況，指的是最近的存活性檢驗(yàn)。
3用打叉表示選定。
BP/4表格(第一頁(yè))
附錄3第25頁(yè)
4如果要求該信息并且如果檢驗(yàn)結(jié)果為陰性，則填寫(xiě)此項(xiàng)。
BP/9表格(第二頁(yè)和最后一頁(yè))
關(guān)于微生物保藏的說(shuō)明(細(xì)則13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
附錄3第14頁(yè)布達(dá)佩斯條約關(guān)于用于專利程序的國(guó)際認(rèn)可的微生物保藏國(guó)際局表格收件人PROF.DR.DR，H.C.MULT.ANTONMAYRWELHEIMER STR.1D-82319 STARNBERG德國(guó)保藏人的姓名和地址 當(dāng)適用于細(xì)則6.4(d)時(shí)，所述的日期為國(guó)際保藏單位的資格被認(rèn)定的日期。
BP/4表格(只此一頁(yè))
附錄3第24頁(yè)布達(dá)佩斯條約關(guān)于用于專利程序的國(guó)際認(rèn)可的微生物保藏國(guó)際局表格收件人PROF.DR.DR，H.C.MULT.ANTON 存活證明MAYR由下一頁(yè)所指明的國(guó)WELHEIMER STR.1際保藏單位根據(jù)細(xì)則10.2出D-82319 STARNBERG具德國(guó)保藏人的姓名和地址 1指的是初始保藏日，或者，當(dāng)進(jìn)行了新的保藏或保藏的轉(zhuǎn)換時(shí)，指的是最相關(guān)的日期(新保藏的日期或是轉(zhuǎn)保藏的日期)。
2對(duì)于那些法規(guī)10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情況，指的是最近的存活性檢驗(yàn)。
3用打叉表示選定。
附錄3第25頁(yè)
4如果要求該信息并且如果檢驗(yàn)結(jié)果為陰性，則填寫(xiě)此項(xiàng)。
BP/9表格(第二頁(yè)和最后一頁(yè))
關(guān)于微生物保藏的說(shuō)明(細(xì)則13之二)
由受理局填寫(xiě)
PCT/RO/134表(1992年7月)
附錄3第25頁(yè)
4如果要求該信息并且如果檢驗(yàn)結(jié)果為陰性，則填寫(xiě)此項(xiàng)。
附錄3第24頁(yè)布達(dá)佩斯條約關(guān)于用于專利程序的國(guó)際認(rèn)可的微生物保藏國(guó)際局表格收件人BAVARIAN NORDIC RESEARCHINSTITUTE GMBH存活證明FRAUNHOFERSTRASSE 18B由下一頁(yè)所指明的國(guó)D-823152 MARTINSRIED德國(guó) 際保藏單位根據(jù)細(xì)則10.2出應(yīng)接到此存活證明的單位的名稱和地址 具 1指的是初始保藏日，或者，當(dāng)進(jìn)行了新的保藏或保藏的轉(zhuǎn)換時(shí)，指的是最相關(guān)的日期(新保藏的日期或是轉(zhuǎn)保藏的日期)。
2對(duì)于那些法規(guī)10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情況，指的是最近的存活性檢驗(yàn)。
3用打叉表示選定。
附錄3第14頁(yè)布達(dá)佩斯條約關(guān)于用于專利程序的國(guó)際認(rèn)可的微生物保藏收件人 國(guó)際局表格BAVARIAN NORDIC RESEARCHINSTITUTE GMBHFRAUNHOFERSTRASSE 18BD-82152 MARTINSRIED德國(guó)保藏人的姓名和地址 當(dāng)適用于細(xì)則6.4(d)時(shí)，所述的日期為國(guó)際保藏單位的資格被認(rèn)定的日期。
Bp/4表格(只此一頁(yè))
分析試驗(yàn)的證書(shū)產(chǎn)物描述 MVA-BN保藏號(hào)00083008
批準(zhǔn)人＿＿＿＿ECACC質(zhì)量主管日期＿＿＿＿
分析試驗(yàn)的證書(shū)產(chǎn)物描述 MVA-BN保藏號(hào)00083008
***證明完畢***批準(zhǔn)人＿＿＿＿ECACC質(zhì)量主管＿＿＿＿日期＿＿＿＿
序列表<110>巴法里安諾迪克有限公司(Bavarian Nordic A/S)<120>表達(dá)插入痘病毒基因組中的同源基因的重組痘病毒<130>BN 46 PCT<160>21<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>39<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>1cgcggatcca tgctgaacat cttgaacagg agacgcaga 39<210>2<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>2catgataaga gattgtatca g 21<210>3<211>80<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>3atgttgaaca taatgaacag gaggaaaaga tctgtgacca tgctcctcat gctgctgccc60acagccctgg cgttccatct80<210>4<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>4gattttgcta ttcagtggac tggatg 26<210>5<211>48<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>5ccttaatcga attctcatgt catggatggg gtaaccagca ttaatagt 48<210>6<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>6gctcccattc aattcacatt gg 22<210>7<211>80<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>7atcccattcc tgaatgtggt gttaaagcta ctgagcgctt ctctcgtctc cgttctccgc60tctgggtgca tgtcccatac80<210>8<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>8gtacatggat gatatagata tg 22<210>9<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>9gttgaaggat tcacttccgt gga23<210>10<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>10gcattcacag attctattgt gagtc 25<210>11<211>26
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>11gtttcatcag aaatgactcc atgaaa 26<210>12<211>39<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>12cggggtaccc gacgaacaag gaactgtagc agaggcatc 39<210>13<211>38<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>13aactgcagtt gttcgtatgt cataaattct ttaattat38<210>14<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>14caactctctt cttgattacc20<210>15<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>15cgatcaaagt caatctatg 19<210>16<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物
<400>16gataccgatc acgttcta 18<210>17<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>17ggatatgatt atgtagag 18<210>18<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>18ctggataaat acgaggacgt g 21<210>19<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>19gacaattatc cgacgcaccg20<210>20<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>20cgttagacaa cacaccgacg atgg 24<210>21<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>21cggatgaaaa atttttggaa g 2權(quán)利要求
1.一種重組痘病毒，至少包含兩個(gè)同源外源基因，其中每一個(gè)所述基因插入到病毒基因組的不同插入位點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組痘病毒，其中所述基因之間具有至少50％的同源性。
3.一種重組痘病毒，至少包含兩個(gè)同源外源基因，所述基因之間具有至少60％的同源性。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的重組痘病毒，其中所述基因之間具有65-75％的同源性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的重組痘病毒，其中所述基因來(lái)自于黃病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的重組痘病毒，其中所述黃病毒是登革病毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的重組痘病毒，其中所述基因是至少兩個(gè)衍生自至少兩個(gè)不同血清型病毒的同源基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7的重組痘病毒，其中所述基因是至少兩個(gè)PrM基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8的重組痘病毒，其中所述基因是4個(gè)PrM基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9的重組痘病毒，其中所述痘病毒是痘苗病毒(Vaccinia virus)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的重組痘病毒，其中所述痘苗病毒是修飾痘苗Ankara(MVA)病毒。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的重組痘病毒，其中MVA是MVA-BN，保藏于歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)，其保藏號(hào)為V00083008。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12的重組痘病毒，其中所述痘病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括人細(xì)胞中屬于復(fù)制缺陷型或不能復(fù)制。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13的重組痘病毒，其中所述基因插入在痘病毒基因組中的天然發(fā)生的缺失位點(diǎn)和/或間隔區(qū)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14的重組痘病毒作為藥物或疫苗。
16.一種疫苗，包含根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的重組痘病毒。
17.一種藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的重組痘病毒和藥物學(xué)可接受載體、稀釋劑、佐劑和/或添加劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-14的任何重組痘病毒、根據(jù)權(quán)利要求16的疫苗或權(quán)利要求17的組合物用于影響，優(yōu)選誘導(dǎo)活體動(dòng)物包括人的免疫反應(yīng)。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的重組痘病毒在制備藥物中的應(yīng)用。
20.一種影響，優(yōu)選為誘導(dǎo)活體動(dòng)物包括人的免疫反應(yīng)的方法，包括對(duì)需要治療的動(dòng)物或人給予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-14的重組痘病毒、根據(jù)權(quán)利要求16的疫苗或權(quán)利要求17的組合物。
21.包含有根據(jù)權(quán)利要求1-14的重組痘病毒的細(xì)胞。
22.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1-14的重組痘病毒的方法，包括如下步驟-用痘病毒感染細(xì)胞；-用第一載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)染上述被感染細(xì)胞，其中第一載體構(gòu)建體包含與痘病毒基因組異源的基因和能夠指導(dǎo)異源基因整合到痘病毒基因組中的插入位點(diǎn)的痘病毒基因組序列。-鑒定、分離所產(chǎn)生的重組痘病毒，可選地，對(duì)其進(jìn)行純化；-用先前感染細(xì)胞的步驟所獲得的重組痘病毒和包含有另外的與痘病毒基因組異源而與第一載體構(gòu)建體中的基因同源的基因的另一載體重復(fù)上述步驟。
23.一種試劑盒，包括-兩個(gè)或更多個(gè)載體構(gòu)建體，每一個(gè)構(gòu)建體包含受痘病毒表達(dá)調(diào)控元件轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因，其中包含在不同載體中的基因是同源基因，所述每一個(gè)基因側(cè)接能夠指導(dǎo)將所述基因整合到痘病毒基因組中的痘病毒DNA序列；和-鑒定和/或選擇所述同源基因已整合到其基因組中的重組痘病毒的方法。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的試劑盒，其中每一個(gè)同源基因的側(cè)接為能夠指導(dǎo)將每一個(gè)載體構(gòu)建體中的所述同源基因整合到痘病毒基因組中不同插入位點(diǎn)的痘病毒DNA序列。
25.來(lái)自于或同源于權(quán)利要求1-14的重組痘病毒的重組痘病毒基因組的DNA序列，其中所述DNA序列包括至少兩個(gè)同源基因和至少部分痘病毒基因組序列。
26.一種檢測(cè)被權(quán)利要求1-14的重組痘病毒感染的細(xì)胞的方法，其中包括將權(quán)利要求25的DNA序列給藥于所述細(xì)胞。
27.一種鑒定權(quán)利要求1-14的重組痘病毒的方法，其中包括將權(quán)利要求25的DNA序列給藥于所述病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠表達(dá)兩個(gè)或多個(gè)同源外源序列的重組痘病毒載體，其中外源序列來(lái)源于微生物的不同變種，之間具有50％或更高的同源性。本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備這種重組痘病毒的方法以及這種重組痘病毒作為藥物或疫苗的應(yīng)用。此外，本發(fā)明還提供一種影響優(yōu)選為誘導(dǎo)活體動(dòng)物包括人的免疫反應(yīng)的方法。
文檔編號(hào)C12N15/863GK1653183SQ03811106
公開(kāi)日2005年8月10日 申請(qǐng)日期2003年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月16日
發(fā)明者保羅·豪利, 桑加·萊勒 申請(qǐng)人:巴法里安諾迪克有限公司