專利名稱：基因表達(dá)的抑制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抑制基因表達(dá)、具體是抑制植物中基因表達(dá)的方法。本發(fā)明也涉及一種用于該方法的核苷酸序列。此外，本發(fā)明涉及一種可用于表達(dá)該核苷酸序列的啟動(dòng)子。
在植物、尤其是高等植物中，淀粉是主要的貯存糖類之一。淀粉的結(jié)構(gòu)包括直鏈淀粉和支鏈淀粉。直鏈淀粉基本上是由α-1-4-連接的糖殘基的直鏈組成的。支鏈淀粉包括具有一些α-1-6分支的α-1-4-連接的糖殘基的鏈。支鏈淀粉分支的性質(zhì)是通過其中一種通常稱作淀粉分支酶(“SBE”)的酶的作用來實(shí)現(xiàn)的。通過在α-1，6-糖苷分支鍵中加入α-1，4葡聚糖，SBE催化支鏈淀粉分子中分支點(diǎn)的形成。在

圖1中示意性地顯示出直鏈淀粉和支鏈淀粉的生物合成，而在圖2中顯示出α-1-4-鍵和α-1-6鍵。
已知淀粉是一種重要的原材料。淀粉廣泛用于食品、造紙以及化學(xué)工業(yè)。但是為了得到具有某種所需功能特性的淀粉，用于這些工業(yè)應(yīng)用中的大部分淀粉均是通過化學(xué)、物理或者酶的方法采后修飾的。
在過去的幾年里，制成能夠生產(chǎn)出與采后修飾(modified)淀粉相同的修飾淀粉的遺傳修飾植物正是人們所需要的。也已知通過表達(dá)反義核苷酸的編碼序列可能可以制備出上述經(jīng)遺傳修飾的植物。在這一方面，JuneBourque提供了一個(gè)在植物中進(jìn)行遺傳操作的反義方案的詳細(xì)摘要(Bourque 1995植物科學(xué)105 pp 125-149)。
雖然已知酶的活性受到具體的核苷酸序列的表達(dá)影響(例如參閱Finnegan和McElroy《生物技術(shù)》12 883-888以及Matzke和MatzkeTIG 11 1-3的教導(dǎo))，仍需要一種可以更可靠和/或更有效和/或更具體地影響酶活性的方法。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種在植物(或其細(xì)胞，組織或者器官)中影響酶的活性的方法，該方法包括在植物(或其細(xì)胞，組織或者器官)中表達(dá)核苷酸序列，其中所說的核苷酸序列部分或者完整地編碼(是)以有義取向的內(nèi)含子；并且其中所說的核苷酸序列不含有通常與該內(nèi)含子有關(guān)的有義外顯子序列這樣的序列。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了一種在生產(chǎn)淀粉的生物體(或其細(xì)胞，組織或者器官)中影響酶活性的方法，該方法包括在生產(chǎn)淀粉的生物體(或其細(xì)胞，組織或者器官)中表達(dá)核苷酸序列，其中所示的核苷酸序列部分或者完整地編碼(是)以有義取向的內(nèi)含子；其中所說的核苷酸序列不含有通常與該內(nèi)含子有關(guān)的外顯子序列的有義序列；并且其中淀粉分支酶的活性受到影響和/或支鏈淀粉的含量受到影響和/或改變了淀粉的組成。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了一種包括如SEQ.I.D.No.1至SEQ.I.D.No.13之任一所示的核苷酸序列的序列或其變體、衍生物或者同系物。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供了一種包括如SEQ.I.D.No.14所示序列的啟動(dòng)子或其變體、衍生物或者同系物。
根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提供了一種能夠包括或者表達(dá)本發(fā)明的構(gòu)建體。
根據(jù)本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提供了一種包括或者表達(dá)本發(fā)明的載體。
根據(jù)本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明提供了一種包括或者表達(dá)本發(fā)明的細(xì)胞、組織或者器官。
根據(jù)本發(fā)明的第八方面，本發(fā)明提供了一種包括或者表達(dá)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因的生產(chǎn)淀粉的生物體。根據(jù)本發(fā)明的第九方面，本發(fā)明提供了一種從本發(fā)明得到的淀粉。
根據(jù)本發(fā)明的第十方面，本發(fā)明提供了pBEA11(NCIMB 40754)。根據(jù)本發(fā)明的第十一方面，本發(fā)明提供了一種可以從λ-SBE 3.2(NCIMB40751)或λ-SBE 3.4(NCIMB 40752)得到的有義核苷酸序列或其變體、衍生物或者同系物。
本發(fā)明主要的優(yōu)點(diǎn)在于它提供了一種用于制備修飾淀粉的方法，而該方法不需要進(jìn)行淀粉的采后修飾。因此本發(fā)明的方法避免了對通常用于淀粉采后修飾的危險(xiǎn)化學(xué)物質(zhì)使用的需要。
此外，本發(fā)明還提供了經(jīng)遺傳修飾的植物，該植物可以生產(chǎn)出其特性將滿足不同的工業(yè)需要的修飾的和/或新的和/或改進(jìn)的淀粉。
因此，本發(fā)明提供了一種在植物中制備特制(tailor-made)淀粉的方法，其中該淀粉可以代替采后修飾的淀粉。
本發(fā)明也提供了一種可以通過與已知的采后修飾方法相比對環(huán)境的影響更為有益的方法來制備修飾淀粉的方法，其中的采后修飾方法要求使用危險(xiǎn)的化學(xué)物質(zhì)以及大量的能量。
本發(fā)明另一個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)在于與已知的影響酶活性的方法相比，它提供了一種可能更可靠和/或更有效和/或更特異地影響酶活性的方法。關(guān)于本發(fā)明的這一優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)當(dāng)指出在SBEs的編碼區(qū)之間存在一定程度的同源性。但與SBEs的內(nèi)含子序列存在極少的或者不存在同源性。因此，有義內(nèi)含子的表達(dá)提供了選擇性地影響具體的SBE表達(dá)的機(jī)制。這一有利方面例如可以用來減少或者除去一種具體的SBE酶以及用另一種酶來代替該酶，其中的另一種酶可以是另一種分支酶或者甚至為受到影響的酶的重組形式或者甚至為一種比如可以包括來自一個(gè)來源的SBE酶的一部分以及至少來自另一來源的另一SBE酶的至少一部分的雜種酶。以下更詳細(xì)地討論本發(fā)明組合的幾個(gè)方面將包括本發(fā)明的這一具體特征。
因此本發(fā)明提供了一種選擇性地影響SBE活性的機(jī)制，這與現(xiàn)有技術(shù)中取決于使用例如反義外顯子表達(dá)的方法形成對比，通過現(xiàn)有技術(shù)的方法是不可能引入新的SBE的活性而又不影響原有活性的。
優(yōu)選關(guān)于本發(fā)明的第一方面，淀粉分支酶的活性受到影響和/或其中支鏈淀粉的含量受到影響和/或改變了淀粉的組成。
優(yōu)選關(guān)于本發(fā)明的第一或第二方面，所說的核苷酸序列不含有外顯子序列的有義序列。
優(yōu)選關(guān)于本發(fā)明的第四方面，所說的啟動(dòng)子與一個(gè)感興趣的基因(“GOI”)組合。
優(yōu)選地，降低或者去除了所說的酶的活性。
優(yōu)選地，所說的核苷酸序列至少基本上編碼以有義取向的至少一個(gè)內(nèi)含子的全部。
優(yōu)選地，所說的核苷酸序列部分或者完整地編碼2個(gè)或者多個(gè)內(nèi)含子并且其中的每個(gè)內(nèi)含子均以有義取向。
優(yōu)選地，所說的核苷酸序列包括至少350個(gè)核苷酸(例如350 bp)，更優(yōu)選包括至少500個(gè)核苷酸(例如500 bp)。
優(yōu)選地，所說的核苷酸序列包括如SEQ.I.D.No.1至SEQ.I.D.No.13之任一所示的序列或其變體、衍生物或者同系物，其中也包括其組合。
優(yōu)選地，所說的核苷酸序列是通過具有如SEQ.I.D.No.14所示序列的啟動(dòng)子或其變體、衍生物或者同系物表達(dá)的。
優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因的生產(chǎn)淀粉的生物體為植物。
因此，本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方面涉及一種在植物(或其細(xì)胞，組織或者器官)中影響酶的活性的方法，該方法包括在植物(或其細(xì)胞，組織或者器官)中表達(dá)核苷酸序列，其中所說的核苷酸序列部分或者完整地編碼以有義取向的內(nèi)含子；其中所說的核苷酸序列不含有通常與該內(nèi)含子有關(guān)的外顯子序列的有義序列；并且其中淀粉分支酶的活性受到影響和/或其中支鏈淀粉的含量受到影響和/或改變了淀粉的組成。
因此，本發(fā)明一個(gè)更優(yōu)選的方面涉及一種在植物(或其細(xì)胞，組織或者器官)中影響酶的活性的方法，該方法包括在植物(或其細(xì)胞，組織或者器官)中表達(dá)核苷酸序列，其中所說的核苷酸序列部分或者完整地編碼以有義取向的內(nèi)含子；其中所說的核苷酸序列不含有通常與該內(nèi)含子有關(guān)的外顯子序列的有義序列；其中淀粉分支酶的活性受到影響和/或其中支鏈淀粉的含量受到影響和/或改變了淀粉的組成；并且其中所說的核苷酸序列包括如SEQ.I.D.No.1至SEQ.I.D.No.13之任一所示的序列或其變體、衍生物或者同系物，其中也包括其組合。
與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語“核苷酸”包括DNA和RNA。優(yōu)選地，該術(shù)語是指DNA，更優(yōu)選地是指通過使用重組DNA技術(shù)制備的DNA。
在常規(guī)意義上，使用術(shù)語“內(nèi)含子”來表示核苷酸的一個(gè)區(qū)段，它通常為DNA，并且它不編碼部分或者全部所表達(dá)的蛋白質(zhì)或酶。
在常規(guī)意義上，使用術(shù)語“外顯子”來表示核苷酸的一個(gè)區(qū)段，它通常為DNA，并且它編碼部分或者全部所表達(dá)的蛋白質(zhì)或酶。
因此，術(shù)語“內(nèi)含子”是指被轉(zhuǎn)錄成RNA分子但在把該RNA翻譯成蛋白質(zhì)之前從RNA中剪接掉的基因區(qū)。相反地，術(shù)語“外顯子”是指被轉(zhuǎn)錄成RNA，隨后又翻譯成蛋白質(zhì)的基因區(qū)。
與本發(fā)明的核苷酸序列有關(guān)的術(shù)語“變體”或“同系物”或“片段”包括各個(gè)核苷酸序列的一個(gè)(或多個(gè))核酸的任意的取代、變化、修飾、置換、缺失或者添加，只要所得到的核苷酸序列可以影響植物或其細(xì)胞或者組織中的酶的活性即可，優(yōu)選其中所得到的核苷酸序列至少與如SEQ.I.D.No.s 1-13所示的有義序列的任意一個(gè)序列具有相同的效果。更具體地講，術(shù)語“同系物”包括與結(jié)構(gòu)相似性和/或功能相似性有關(guān)的同源性，只要所得到的核苷酸序列具有影響本發(fā)明的酶活性的能力即可。就序列同源性(即相似性)而言，優(yōu)選存在大于80％的同源性，更優(yōu)選至少有85％的同源性，更優(yōu)選至少有90％的同源性，甚至于更優(yōu)選至少有95％的同源性，更優(yōu)選至少有98％的同源性。以上的術(shù)語與序列的等位變異也是同義的。
類似地，與本發(fā)明的啟動(dòng)子有關(guān)的術(shù)語“變體”或“同系物”或“片段”包括各個(gè)啟動(dòng)子序列的一個(gè)(或多個(gè))核酸的任意的取代、變化、修飾、置換、缺失或者添加，只要所得到的啟動(dòng)子序列允許GOI的表達(dá)即可，優(yōu)選其中所得到的啟動(dòng)子序列至少與SEQ.I.D.No.14具有相同的效果。更具體地講，術(shù)語“同系物”包括與結(jié)構(gòu)相似性和/或功能相似性有關(guān)的同源性，只要所得到的啟動(dòng)子序列具有允許諸如本發(fā)明的一個(gè)核苷酸序列GOI表達(dá)的能力即可。就序列同源性(即相似性)而言，優(yōu)選存在大于80％的同源性，更優(yōu)選至少有85％的同源性，更優(yōu)選至少有90％的同源性，甚至于更優(yōu)選至少有95％的同源性，更優(yōu)選至少有98％的同源性。以上的術(shù)語與序列的等位變異也是同義的。
本發(fā)明的內(nèi)含子序列可以是任意一個(gè)或者全部的本發(fā)明的內(nèi)含子序列，其中也包括了其部分序列，只要使用了部分的有義序列(即并非或者不包括如SEQ.I.D.No.1-13所示的任意一個(gè)或多個(gè)的完整的序列)，該部分序列就會(huì)影響酶的活性。部分序列的合適的例子包括短于如SEQ.I.D.No.s 1至13所示的任意一個(gè)完整的有義序列的序列，但該序列包括鄰接的外顯子或多個(gè)外顯子的核苷酸。
對于本發(fā)明的第二方面而言(即特異性地影響SBE活性)，本發(fā)明的核苷酸序列可以包括SBE基因的一個(gè)或者多個(gè)有義或反義外顯子序列(但不包括天生就與所說的內(nèi)含子序列有關(guān)的有義外顯子序列)，其中也包括其完整的或者部分的序列，而只要該核苷酸序列可以影向SBE活性即可，優(yōu)選其中所說的核苷酸序列降低或者去除了SBE活性。優(yōu)選地，本發(fā)明第二方面的核苷酸序列不包括有義外顯子序列。
術(shù)語“載體”包括表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化載體。術(shù)語“表達(dá)載體”是指能夠在體內(nèi)或體外進(jìn)行表達(dá)的構(gòu)建體。術(shù)語“轉(zhuǎn)化載體”是指能夠從一個(gè)物種轉(zhuǎn)移至另一物種的構(gòu)建體-諸如從大腸桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至真菌或者植物細(xì)胞中，或者從農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞中。
與本發(fā)明的有義核苷酸序列方面有關(guān)的術(shù)語“構(gòu)建體”包括直接或間接地附著到一個(gè)啟動(dòng)子上的本發(fā)明的核苷酸序列，該術(shù)語與諸如“偶聯(lián)物”、“序列盒”和“雜種分子”之類的術(shù)語是同義的。間接附著的實(shí)例為提供了一種諸如內(nèi)含子序列(諸如Sh1-內(nèi)含子或ADH內(nèi)含子)的合適的間隔序列來間隔本發(fā)明的啟動(dòng)子及核苷酸序列。對于與本發(fā)明有關(guān)的包括直接或間接附著的術(shù)語“融合的”而言，情況同樣屬實(shí)。該術(shù)語不包括在自然環(huán)境下與野生型SBE基因啟動(dòng)子有關(guān)的野生型SBE基因的自然組合。
所說的構(gòu)建體甚至可以包括或表達(dá)一種可用于選擇轉(zhuǎn)移了遺傳構(gòu)建體的植物細(xì)胞的標(biāo)記物，其中的標(biāo)記物已被轉(zhuǎn)化至該植物細(xì)胞中。存在多種可用于例如植物的標(biāo)記物-諸如甘露糖。其它標(biāo)記物的實(shí)例包括那些提供了抗生素抗性的標(biāo)記物-例如對G418、潮霉素、博來霉素、卡那霉素及慶大霉素的抗性。
本發(fā)明的構(gòu)建體優(yōu)選包括一個(gè)啟動(dòng)子。術(shù)語“啟動(dòng)子”按照本領(lǐng)域的通常意義來使用，例如在基因表達(dá)的Jacob-Monod理論中RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)。合適的啟動(dòng)子的例子為那些可以指導(dǎo)本發(fā)明的核苷酸序列有效表達(dá)和/或在特異細(xì)胞類型中指導(dǎo)有效表達(dá)的啟動(dòng)子。在WO 92/11375中公開了對組織具有特異性的啟動(dòng)子的一些實(shí)例。
該啟動(dòng)子還可以包括如Pribnow盒或TATA盒之類的保守區(qū)。該啟動(dòng)子甚至可以包含影響(諸如維持、提高、降低)本發(fā)明的核苷酸序列表達(dá)水平的其它序列。上述序列的合適的例子包括Sh1-內(nèi)含子或ADH內(nèi)含子。其它序列包括可誘導(dǎo)元件-諸如溫度，化學(xué)藥劑，光或者應(yīng)激可誘導(dǎo)元件。而且可以存在適于提高轉(zhuǎn)錄或翻譯的元件。一個(gè)在后元件的實(shí)例為TMV 5’前導(dǎo)序列。(參見Sleat Gene 217217-225；以及Dawson植物分子生物學(xué)2397)。
正如所述，本發(fā)明的構(gòu)建體和/或載體可以包括能夠提供受調(diào)控的或者組成型表達(dá)的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。任意合適的用于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的啟動(dòng)子為patatin啟動(dòng)子或E35S啟動(dòng)子。另一方面，優(yōu)選啟動(dòng)子為SBE啟動(dòng)子。
例如，如果生物體為植物的話，那么啟動(dòng)子可以是一種影響在種子、塊莖、莖、新芽、根及葉片組織的任意一種或多種中的核苷酸序列表達(dá)的啟動(dòng)子，其中優(yōu)選塊莖。舉例來說，用于本發(fā)明核苷酸序列的啟動(dòng)子可以為如我們在1994年10月21日提交的共同未決的英國專利申請No.9421292.5中所述的α-Amy 1啟動(dòng)子(此處稱作Amy 1啟動(dòng)子，Amy637啟動(dòng)子或α-Amy 637啟動(dòng)子)。另外，用于本發(fā)明核苷酸序列的啟動(dòng)子可以為如我們在1994年10月21日提交的共同未決的英國專利申請No.9421286.7中所述的α-Amy 3啟動(dòng)子(此外稱作Amy 3啟動(dòng)子，Amy351啟動(dòng)子或α-Amy 351啟動(dòng)子)。
本發(fā)明也包括使用啟動(dòng)子以表達(dá)本發(fā)明的核苷酸序列，其中使該啟動(dòng)子的一部分失活但其中該啟動(dòng)子仍能起到一個(gè)啟動(dòng)子的作用。在某些情況下，一個(gè)啟動(dòng)子的部分失活是有利的。尤其對以前提到的Amy 351啟動(dòng)子而言，使該啟動(dòng)子的一部分失活從而該部分失活的啟動(dòng)子以更為特異的方式，諸如僅以一種特異的組織類型或器官，來表達(dá)本發(fā)明的核苷酸序列是可能的。術(shù)語“失活的”是指在改進(jìn)了啟動(dòng)子的表達(dá)模式但其中部分失活的啟動(dòng)子仍起到一個(gè)啟動(dòng)子作用的意義上而言的部分失活。但是如上所述，經(jīng)修飾的啟動(dòng)子能夠在原始啟動(dòng)子的至少一種(但并非全部)特異的組織中表達(dá)編碼本發(fā)明的酶的基因。部分失活的實(shí)例包括改變啟動(dòng)子序列的折疊模式或者改變與部分核苷酸序列的結(jié)合種類，以便于該核苷酸序列的一部分不為例如RNA聚合酶所識(shí)別。另外并且優(yōu)選地，使啟動(dòng)子部分失活的方式是截短啟動(dòng)子以形成其片段。另一種方式為使該序列的至少一部分突變，以便于RNA聚合酶無法結(jié)合到該部分或另一部分上。另一種修飾為突變調(diào)節(jié)蛋白(例如從絲狀真菌中已知的CreA蛋白)的結(jié)合位點(diǎn)以產(chǎn)生碳的分解代謝物的阻遏并從而消除天然啟動(dòng)子的分解代謝物的阻遏。
本發(fā)明的構(gòu)建體和/或載體可以包括轉(zhuǎn)錄的終止區(qū)。
本發(fā)明的核苷酸可以與額外的構(gòu)建體組合(但不必同時(shí))加以表達(dá)。因此本發(fā)明也提供了構(gòu)建體的一種組合，該組合包括含有可操作地連接到第一啟動(dòng)子上的本發(fā)明的核苷酸序列的第一構(gòu)建體；以及含有可操作地連接到第二啟動(dòng)子上(該啟動(dòng)子不必與第一啟動(dòng)子相同)的GOI的第二構(gòu)建體。就本發(fā)明的這一方面而言，構(gòu)建體的這種組合可以存在于同一載體、質(zhì)粒、細(xì)胞、組織、器官或生物體中。本發(fā)明的這一方面也包括表達(dá)上述物質(zhì)的方法，其中優(yōu)選在生物體的特異的細(xì)胞或組織中表達(dá)，諸如僅在生物體的一種特異的細(xì)胞或組織中表達(dá)，而生物體一般為植物。就本發(fā)明的這一方面而言，當(dāng)通常與野生型基因的啟動(dòng)子有關(guān)的編碼酶的基因與該野生型基因的啟動(dòng)子均處于其自然狀態(tài)時(shí)，所說的第二構(gòu)建體不包括這種天然組合。
合適的組合的實(shí)例為包括本發(fā)明的核苷酸序列和啟動(dòng)子，諸如本發(fā)明的啟動(dòng)子，的第一構(gòu)建體以及包括啟動(dòng)子，諸如本發(fā)明的啟動(dòng)子，和GOI的第二構(gòu)建體，其中GOI以有義或者反義取向來編碼另一種淀粉分支酶。
以上有關(guān)于針對本發(fā)明的有義核苷酸的術(shù)語“構(gòu)建體”的注釋同樣可用于針對本發(fā)明啟動(dòng)子的術(shù)語“構(gòu)建體”。在這一方面，該術(shù)語包括直接或間接附著到GOI上的本發(fā)明的啟動(dòng)子。
就本發(fā)明的啟動(dòng)子方面或本發(fā)明的組合方面而言的術(shù)語“GOI”是指任何感興趣的基因，如下所述，該基因不必編碼蛋白質(zhì)或酶。GOI可以是討論中的生物體，例如植物，外源或者天然的任意核苷酸序列。
GOI的典型實(shí)例包括編碼改進(jìn)了代謝及分解代謝途徑的其它蛋白質(zhì)或者酶的基因。GOI可以編碼用于引入或者提高病原體抗性的試劑。
GOI甚至可以為用于改進(jìn)存在于相關(guān)組織中的天然轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的反義構(gòu)建體。上述GOI的實(shí)例為本發(fā)明的核苷酸序列。
GOI甚至可以編碼宿主生物體，例如植物，的非天然蛋白質(zhì)。GOI可以編碼有利于動(dòng)物或者人類的化合物。例如，GOI能編碼具有藥物活性的蛋白質(zhì)或酶，諸如治療化合物胰島素、干擾素、人血清白蛋白、人生長因子以及凝血因子中的任意一種。GOI甚至可以編碼給食品或飼料或作物提供額外的營養(yǎng)價(jià)值的蛋白質(zhì)。典型的實(shí)例包括可以抑制抗-營養(yǎng)因子形成的植物蛋白以及具有更為人所需的氨基酸的組成，例如比非轉(zhuǎn)基因植物具有更高的賴氨酸含量，的植物蛋白。GOI甚至可以編碼可用于食品加工中的酶，諸如木聚糖酶和α-半乳糖苷酶，GOI可以為編碼任意一種害蟲毒素的基因，可以為一種諸如針對α-淀粉酶、蛋白酶或葡聚糖酶的反義轉(zhuǎn)錄物。此外，GOI可以為本發(fā)明的核苷酸序列。
GOI可以是編碼阿拉伯呋喃糖苷酶的核苷酸序列，而這是我們共同未決的英國專利申請9505479.7的主題。GOI可以是編碼葡聚糖酶的核苷酸序列，而這是我們共同未決的英國專利申請9505475.5的主題。GOI可以是編碼α-淀粉酶的核苷酸序列，而這是我們共同未決的英國專利申請9413439.2的主題。GOI可以是編碼α-淀粉酶的核苷酸序列，而這是我們共同未決的英國專利申請9421290.9的主題。GOI可以是編碼α-glucanlyase的任意一種核苷酸序列，而這在我們共同未決的PCT專利申請PCT/EP94/03397中已有描述。
一方面，GOI甚至可以是可操作地連接到一個(gè)不同的啟動(dòng)子的本發(fā)明的核苷酸序列。
GOI可以包括編碼木聚糖酶、arabinase、乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶(rhamnogalacturonase)、葡聚糖酶、果膠酶、分支酶或另一種糖類修飾酶或蛋白酶的一種或多種酶的序列。此外，GOI可以是任意一種上述序列的反義序列。
如上所述，本發(fā)明提供了一種選擇性地影響特有的酶活性的機(jī)制。
就本發(fā)明一個(gè)重要的應(yīng)用而言，目前可能通過表達(dá)特有的基因組的蛋白質(zhì)或酶的有義內(nèi)含子構(gòu)建體以及(例如同時(shí))表達(dá)該酶或蛋白質(zhì)的重組形式，換言之即GOI為編碼該基因組的酶或蛋白質(zhì)的重組核苷酸序列，來減少或消除編碼該基因組的蛋白質(zhì)或酶的基因組核苷酸序列的表達(dá)。這一應(yīng)用使得可以在缺乏各自的基因組酶及蛋白質(zhì)(或者該酶及蛋白質(zhì)的含量降低)的條件下表達(dá)所需的重組酶或蛋白質(zhì)。因此，所需的重組酶及蛋白質(zhì)可以容易地從宿主生物體中分離和純化。本發(fā)明這一特有的方面明顯優(yōu)越于現(xiàn)有技術(shù)的方法，例如現(xiàn)有技術(shù)的方法取決于使用了反義外顯子的表達(dá)，而該方法也影響重組酶的表達(dá)。
因此，本發(fā)明另一方面涉及在一個(gè)宿主生物體中表達(dá)重組蛋白或酶的方法，該方法包括表達(dá)編碼該重組蛋白或酶的核苷酸序列；以及表達(dá)另一個(gè)核苷酸序列，其中所說的另一個(gè)核苷酸序列部分或者完整地以有義取向編碼內(nèi)含子；其中所說的內(nèi)含子為通常與編碼相應(yīng)于重組蛋白或酶的蛋白或酶的基因組基因有關(guān)的內(nèi)含子；并且其中所說的另一個(gè)核苷酸序列不含有通常與該內(nèi)含子有關(guān)的外顯子序列的有義序列。另一方面包括上述核苷酸序列的組合，其中包括所說序列在構(gòu)建體、載體、細(xì)胞、組織、及轉(zhuǎn)基因生物體中的插入。
因此，本發(fā)明也涉及核苷酸序列的組合，該組合包括編碼重組酶的第一核苷酸序列；以及對應(yīng)于以有義取向的內(nèi)含子的第二核苷酸序列；其中所說的內(nèi)含子為與編碼對應(yīng)于重組酶的酶的基因組基因有關(guān)的內(nèi)含子；并且其中所說的第二核苷酸序列不含有通常與該內(nèi)含子有關(guān)的外顯子序列的有義序列。
GOI甚至可以編碼一個(gè)或多個(gè)但以反義取向的內(nèi)含子，諸如在所附序列表中提供的任意一個(gè)或多個(gè)反義內(nèi)含子序列。例如，本發(fā)明也包括與如一個(gè)反義內(nèi)含子組合的一個(gè)有義內(nèi)含子(例如SEQ.I.D.No.1)的表達(dá)，其中優(yōu)選該反義內(nèi)含子不互補(bǔ)于所說的有義內(nèi)含子序列(如SEQ.I.D.No.16)。
術(shù)語“細(xì)胞”、“組織”和“器官”包括其自身及存在于生物體內(nèi)的細(xì)胞、組織和器官。
與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語“生物體”包括可以含有本發(fā)明的核苷酸序列和/或其中當(dāng)本發(fā)明的核苷酸序列存在于該生物體中時(shí)可以表達(dá)所說序列的任意的生物體。所說的生物體優(yōu)選為生產(chǎn)淀粉的生物體，諸如任意一種植物、藻類、真菌、酵母、細(xì)菌及其細(xì)胞系。所說的生物體優(yōu)選為植物。
術(shù)語“生產(chǎn)淀粉的生物體”包括能夠生物合成淀粉的任意的生物體。優(yōu)選地，該生產(chǎn)淀粉的生物體為植物。
如本文所使用的術(shù)語“植物”包括任何適宜的被子植物，裸子植物，單子葉植物及雙子葉植物。合適的植物的典型實(shí)例包括如馬鈴薯等的蔬菜；如小麥、玉米及大麥等的谷物；水果；樹木；花卉；以及其它的植物作物。該術(shù)語優(yōu)選是指“馬鈴薯”。
與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因生物體”包括含有本發(fā)明的核苷酸序列和/或從中得到產(chǎn)物的任意的生物體，和/或在其中可以表達(dá)本發(fā)明的核苷酸序列生物體。優(yōu)選在該生物體的基因組中插入本發(fā)明的核苷酸序列。該轉(zhuǎn)基因生物體優(yōu)選為植物，更優(yōu)選為馬鈴薯。
為了制備宿主生物體，人們可以使用原核或真核生物體。適宜的原核宿主的實(shí)例包括大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。關(guān)于轉(zhuǎn)化原核宿主的教導(dǎo)在現(xiàn)有技術(shù)中已進(jìn)行了詳盡地報(bào)道，例如可參閱Sambrook等人(Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》，第2版，1989，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)。
盡管在EP-B-0470145與CA-A-2006454中沒有公開本發(fā)明的酶和編碼該酶的核苷酸序列，但這兩篇文獻(xiàn)均就可用于制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)類型方面提供了一些有用的背景技術(shù)的解釋。目前，在以下的解釋中包括了上述背景技術(shù)的一些教導(dǎo)。
在構(gòu)建遺傳修飾的植物中的基本原則為在植物基因組中插入遺傳信息以便于達(dá)到穩(wěn)定地維持被插入的遺傳材料。
存在多種用于插入遺傳信息的技術(shù)，其中兩個(gè)主要的原則為直接地引入該遺傳信息以及通過使用載體系統(tǒng)來引入遺傳信息。在Potrykus(植物生理植物分子生物學(xué)年度回顧42205-225)與Christou(農(nóng)業(yè)-食品-工業(yè)高技術(shù)進(jìn)步/1994年4月17-27)的文章中可以找到上述常規(guī)技術(shù)的綜述。
因此一方面，本發(fā)明涉及一種攜帶本發(fā)明的核苷酸序列或構(gòu)建體并且能夠向生物體(諸如植物)的基因組中引入該核苷酸序列或構(gòu)建體的載體系統(tǒng)。
所說的載體系統(tǒng)可以包括一個(gè)載體，但該系統(tǒng)也可以包括兩個(gè)載體。在兩個(gè)載體的情況中，該載體系統(tǒng)通常稱作二元載體系統(tǒng)。Gynheung An等人(1980)在《植物分子生物學(xué)手冊A3》第1-19頁的“二元載體”中進(jìn)一步詳細(xì)地描述了二元載體系統(tǒng)。
一種用于以給定的啟動(dòng)子或核苷酸序列或構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞而廣泛使用的系統(tǒng)基于使用來自根瘤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)?；騺碜悦r(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒(An等人(1986)植物生理81,301-305以及Butcher D.N.等人(1980)，適于植物病理學(xué)家的組織培養(yǎng)方法，版本D.S.Ingrams與J.P.Helgeson，203-208)。已經(jīng)構(gòu)建了適于構(gòu)建上述植物或植物細(xì)胞構(gòu)建體的幾種不同的Ti與Ri質(zhì)粒。上述Ti質(zhì)粒的一個(gè)非限制性的實(shí)例為pGV3850。
應(yīng)當(dāng)優(yōu)選把本發(fā)明的核苷酸序列或構(gòu)建體在介于T-DNA的末端序列之間或靠近T-DNA序列處插入Ti-質(zhì)粒中，從而避免緊鄰T-DNA邊界序列破裂，這是因?yàn)閷τ谙蛑参锏幕蚪M中插入修飾的T-DNA而言，上述區(qū)域中至少有一個(gè)區(qū)域似乎是必不可少的。
這正如從上面的解釋中理解的那樣，如果所說的生物體為植物的話，本發(fā)明的載體系統(tǒng)優(yōu)選為一個(gè)含有為感染植物所必需的序列(例如Vir區(qū))以及T-DNA序列的至少一個(gè)邊界部分的系統(tǒng)，所說的邊界部分與遺傳構(gòu)建體位于同一載體上。
另外，所說的載體系統(tǒng)優(yōu)選為根瘤農(nóng)桿菌Ti-質(zhì)粒或者毛根農(nóng)桿菌Ri-質(zhì)?；蚱溲苌?。由于這些質(zhì)粒是人們熟知的并且廣泛用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物，所以存在許多基于上述質(zhì)粒或其衍生物的載體系統(tǒng)。
在轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建中，可以先在微生物中構(gòu)建本發(fā)明的核苷酸序列或構(gòu)建體，其中載體可以在該微生物中復(fù)制并且在插入植物之前該微生物是易于操作的。一種有用的微生物的實(shí)例為大腸桿菌，但也可以使用具有以上特性的其它微生物。當(dāng)在大腸桿菌中已經(jīng)構(gòu)建了如上定義的載體系統(tǒng)的載體時(shí)，如有需要的話把該載體轉(zhuǎn)化到一種合適的農(nóng)桿菌菌株中(例如根瘤農(nóng)桿菌)。因而，優(yōu)選把包含本發(fā)明的核苷酸序列或構(gòu)建體的Ti-質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至一種合適的農(nóng)桿菌菌株中(例如根瘤農(nóng)桿菌)，以便于獲得含有本發(fā)明的啟動(dòng)子或核苷酸序列或構(gòu)建體的農(nóng)桿菌細(xì)胞，隨后把該DNA轉(zhuǎn)化至待修飾的植物細(xì)胞中。
例如如果為了轉(zhuǎn)化而使用了所說植物細(xì)胞的Ti-或Ri-質(zhì)粒的話，那么至少可以把Ti-與Ri-質(zhì)粒T-DNA的右邊界、但通常是其右邊界和左邊界，作為引入基因的側(cè)翼區(qū)，連接起來。在EP-A-120516中、Hoekema在《二元植物載體系統(tǒng)》Offset-drukkerij Kanters B.B.，Alblasserdam，1985，第五章中、Fraley等人在Crit.Rev.Plant Sci.，41-46中以及An等人在EMBO J.(1985)4277-284中已經(jīng)深入地研究并描述了用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞而使用的T-DNA。
由農(nóng)桿菌直接侵染植物組織是一種現(xiàn)已廣泛使用并在Butcher D.N.等人(1980)《適于植物病理學(xué)家的組織培養(yǎng)方法》版本D.S.Ingrams與J.P.Helgeson，203-208中有所描述的簡單的技術(shù)。就這一主題的進(jìn)一步的教導(dǎo)可參閱Potrykus(植物生理植物分子生物學(xué)年度回顧42205-225)和Christou(農(nóng)業(yè)-食品-工業(yè)高技術(shù)進(jìn)步/1994年4月17-27)。就該技術(shù)而言，可以在植物的某一部分或組織之中或之上(即在葉、根、莖的一部分上或在該植物的另一部分上)進(jìn)行植物的侵染。
一般說來，由攜帶GOI(諸如本發(fā)明的核苷酸序列)以及選擇性地?cái)y帶啟動(dòng)子的農(nóng)桿菌直接侵染植物組織，例如通過以剃刀刀片切割植物或用針刺植物或用研磨料摩擦植物來使待侵染的植物受傷。然后用所說的農(nóng)桿菌接種該傷口。隨后在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)接種的植物或植物的部分并使其發(fā)育為成熟的植株。
當(dāng)構(gòu)建植物細(xì)胞時(shí)，可以根據(jù)熟知的組織培養(yǎng)方法來培養(yǎng)和維持上述細(xì)胞，諸如通過在提供了如氨基酸、植物激素、維生素等必須的生長因子的合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)細(xì)胞。
采用用于從細(xì)胞或組織培養(yǎng)物中再生植物的已知方法可以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生為遺傳修飾的植物，例如通過采用抗生素來選擇轉(zhuǎn)化的幼苗并且通過在含有合適的營養(yǎng)物、植物激素等的培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)上述幼苗。
在EP-A-0449375中可以找到有關(guān)植物轉(zhuǎn)化的進(jìn)一步的教導(dǎo)。
正如在CA-A-2006454中所報(bào)道的，可以得到大量含有大腸桿菌中的復(fù)制系統(tǒng)并且能夠選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的標(biāo)記物的克隆載體。所說的載體例如包括pBR 322，pUC系列，M13mp系列，pACYC184等。通過這種方式，可以把本發(fā)明的核苷酸或構(gòu)建體引入位于載體中的合適的限制性位點(diǎn)上。然后使用這種被包含的質(zhì)粒在大腸桿菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述大腸桿菌細(xì)胞，然后獲得細(xì)胞并裂解。隨后回收上述質(zhì)粒。作為分析方法，有常用的序列分析、限制酶切分析、電泳以及進(jìn)一步的生物化學(xué)-分子生物學(xué)方法。在每種操作之后，所使用的DNA序列可以進(jìn)行限制性消化并與接下來的DNA序列連接起來。每種序列均可以在同樣的或不同的質(zhì)粒中克隆。
在植物中引入本發(fā)明的核苷酸序列或構(gòu)建體后，進(jìn)一步的DNA序列的操作和/或插入可能是必須的-諸如為了建立如上提及的組合系統(tǒng)(例如包含構(gòu)建體的組合的生物體)。
以上用于以本發(fā)明的核苷酸序列轉(zhuǎn)化原核生物和植物的解釋同樣可用于以本發(fā)明的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化上述生物體。
總而言之，本發(fā)明涉及通過表達(dá)有義內(nèi)含子序列來影向酶的活性。
而且，本發(fā)明也涉及對上述有義內(nèi)含子序列的表達(dá)有用的啟動(dòng)子。
下面的樣品已按照布達(dá)佩斯條約于1995年7月13日保藏在位于英國蘇格蘭Aberdeen AB2 1RY 23 St Machar Drive的國立工業(yè)及海洋細(xì)菌有限保藏公司(NCIMB)這一公認(rèn)的保藏機(jī)構(gòu)中NCIMB 40754(是指如本文所述的pBEA 11)；NCIMB 40751(是指如本文所述的λ-SBE3.2)，以及NCIMB 40752(是指如本文所述的λ-SBE3.4)。
因此，本發(fā)明的一個(gè)高度優(yōu)選的實(shí)例涉及一種影響植物(或其細(xì)胞，組織或者器官)中酶的活性的方法，該方法包括在植物(或其細(xì)胞，組織或者器官)中表達(dá)核苷酸序列，其中所說的核苷酸序列部分或者完整地以有義取向編碼內(nèi)含子；其中所說的核苷酸序列不含有通常與該內(nèi)含子有關(guān)的外顯子序列的有義序列；其中淀粉分支酶的活性受到影響和/或支鏈淀粉的含量受到影響和/或改變了淀粉的組成；并且其中所說的內(nèi)含子的核苷酸序列可以從NCIMB 40751、NCIMB 40752或NCIMB 40754或其變體、衍生物或同系物得到。
因此，本發(fā)明的一個(gè)更為高度優(yōu)選的方面涉及一種影響植物(或其細(xì)胞，組織或者器官)中酶的活性的方法，該方法包括在植物(或其細(xì)胞，組織或者器官)中表達(dá)核苷酸序列，其中所說的核苷酸序列部分或者完整地以有義取向編碼內(nèi)含子；其中所說的核苷酸序列不含有通常與該內(nèi)含子有關(guān)的外顯子序列的有義序列；其中淀粉分支酶的活性受到影響和/或支鏈淀粉的含量受到影響和/或改變了淀粉的組成；其中所說的核苷酸序列包括如SEQ.I.D.No.1至SEQ.I.D.No.13之任一所示的序列或其變體、衍生物或者同系物，其中也包括其組合；并且其中所說的內(nèi)含子的核苷酸序列可以從NCIMB 40751、NCIMB 40752或NCIMB 40754或其變體、衍生物或同系物得到。
現(xiàn)在，僅通過實(shí)施例的方式來描述本發(fā)明，其中參考了以下所附的附圖圖1為直鏈淀粉及支鏈淀粉生物合成的示意表示；圖2為支鏈淀粉α-1-4-鍵及α-1-6-鍵的圖解表示；圖3為基因組SBE克隆的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的圖解表示；圖4為pPATA1的質(zhì)粒圖，其大小為3936bp；圖5為pABE7的質(zhì)粒圖，其大小為5106bp；圖6為pVictorIV Man的質(zhì)粒圖，其大小為7080bp；圖7為pBEA11的質(zhì)粒圖，其大小為9.54kb；圖8顯示出包括啟動(dòng)子、外顯子及內(nèi)含子的完整的SBE基因組的核苷酸序列；圖9為pVictor5a的質(zhì)粒圖，其大小為9.12kb；以及圖10為pBEP2的質(zhì)粒圖，其大小為10.32kb。
圖1和圖2可以參閱以上關(guān)于淀粉的一般介紹性的描述。正如所提及的，圖3為基因組SBE克隆的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的圖解表示，圖8中所顯示的為其序列。這一具有大約11.5k堿基對的克隆包括14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子。從5’末端至3’末端以升序的方式來編號(hào)上述內(nèi)含子并且這些內(nèi)含子分別對應(yīng)于SEQ.I.D.No.s 1-13。它們各自的反義內(nèi)含子序列如SEQ.I.D.No.s 15-27所示。
圖3和圖8更加詳細(xì)地提供了有關(guān)馬鈴薯SBE基因的11468個(gè)堿基對的信息。自第1至第2082個(gè)核苷酸的5’區(qū)含有SBE基因的啟動(dòng)子區(qū)。位于第2048至2051個(gè)核苷酸的TATA盒的候選物用方框表示。在馬鈴薯SBE cDNA克隆(Poulsen與Kreiberg(1993)植物生理1021053-1054)與外顯子DNAs之間的同源性起始于第2083bp并終止于第9666bp。在cDNA與外顯子DNA之間的同源性是通過以大寫字母表示的核苷酸來表示的，而翻譯成的氨基酸序列則以單字母密碼顯示在該外顯子DNA的下面。內(nèi)含子序列是以小寫字母表示的。
圖7為pBEA7的質(zhì)粒圖，其大小為9.54k堿基對。質(zhì)粒pBEA11包括馬鈴薯SBE基因的第一內(nèi)含子序列。這種具有1177個(gè)堿基對的第一內(nèi)含子序列示于圖3并且位于第一外顯子與第二外顯子之間。
現(xiàn)在將更加詳細(xì)地討論本發(fā)明的一些實(shí)驗(yàn)及方面。
實(shí)驗(yàn)方案分離，在質(zhì)粒中亞克隆以及基因組SBE克隆的測序使用放射性標(biāo)記的馬鈴薯SBE cDNA(Poulsen與Kreiberg(1993)植物生理1021053-1054)作探針從Desiree馬鈴薯基因組文庫(克隆技術(shù)實(shí)驗(yàn)室公司，Palo Alto CA，USA)中分離出含有馬鈴薯SBE基因的多種克隆。通過Southern分析來鑒別被分離的含有SBE DNA的λ-噬菌體的片段(λSBE 3.2-NCIMB 40751-與λSBE-3.4-NCIMB 40752)，然后將該片段亞克隆至pBluescript II載體中(克隆技術(shù)實(shí)驗(yàn)室公司，Palo AltoCA，USA)。λSBE 3.2含有15kb的馬鈴薯DNA插入片段，λSBE-3.4含有13kb的馬鈴薯DNA插入片段。所得到的質(zhì)粒稱作pGB3，pGB11，pGB15，pGB16和pGB25(參見以下的討論)。然后使用Pharmacia自動(dòng)讀數(shù)測序試劑盒(Pharmacia，Uppsala)和A.L.F.DNa測序儀(Pharmacia，Uppsala)對各個(gè)插入片段測序。
總計(jì)一共對SBE基因的一段11.5kb的序列進(jìn)行了測序。所說的序列可以從上述質(zhì)粒中推導(dǎo)出來，其中pGB25含有從1bp至836bp的序列，pGB15含有從735bp至2580bp的序列，pGB16含有從2580bp至5093bp的序列，pGB11含有從3348bp至7975bp的序列，并且pGB3含有從7533bp至11468bp的序列。
更詳細(xì)地講，通過把從λSBE 3.2分離出來的一段4kb的EcoRI片段插入pBluescript II SK(+)的EcoRI位點(diǎn)來構(gòu)建pGB3。通過把從λSBE 3.4分離出來的一段4.7kb的Xho I片段插入pBluescript II SK(+)的XhoI位點(diǎn)來構(gòu)建pGB11。通過把從λSBE 3.4分離出來的一段1.7kb的SpeI片段插入pBluescript II SK(+)的SpeI位點(diǎn)來構(gòu)建pGB15。通過把從λSBE 3.4分離出來的一段2.5kb的SpeI片段插入pBluescript II SK(+)的SpeI位點(diǎn)來構(gòu)建pGB16。為了構(gòu)建pGB25，采用引物5’GGA ATT CCA GTC GCA GTC TAC ATT AC 3’和5’CGG GAT CCA GAG GCA TTA AGA TTT CTG G 3’并以λSBE 3.4作模板來生產(chǎn)PCR片段。
用BamHI和EcoRI消化上述PCR片段并將該片段插入以同一限制酶消化的pBluescript II SK(+)中。
構(gòu)建質(zhì)粒pBEA11通過PCR使用寡核苷酸5’CGG GAT CCA AAG AAA TTC TCG AGG TTA CAT GG 3′和5’CGG GAT CCG GGG TAA TTT TTA CTA ATT TCA TG 3’
并以含有SBE基因的λSBE 3.4噬菌體作模板擴(kuò)增SBE內(nèi)含子1。
用BamHI消化上述PCR產(chǎn)物并將該產(chǎn)物以有義取向插入介于patatin啟動(dòng)子與35S終止子之間的質(zhì)粒pPATA1(在WO 94/24292中有所描述)的BamHI位點(diǎn)。以KpnI消化構(gòu)建體pABE7，分離出2.4kb的“patatin啟動(dòng)子-SBE內(nèi)含子1-35S終止子”的KpnI片段并將該片段插入植物轉(zhuǎn)化載體pVictorIV Man的KpnI位點(diǎn)，從而生成質(zhì)粒pBEA11。
轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的生產(chǎn)純性原種培養(yǎng)物于25℃及16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗下，將馬鈴薯’Bintje’和’Dianella’的幼苗培養(yǎng)物維持在根據(jù)Linsmaier，E.U.與Skoog，F(xiàn).(1965)在《植物生理學(xué)》18100-127中配制的培養(yǎng)基(LS)上，此外該培養(yǎng)基還含有2μM的硫代硫酸銀。
大約40天后，傳代培養(yǎng)上述培養(yǎng)物。然后從幼苗上切下葉子，并將其切成每段含有一個(gè)節(jié)的節(jié)切片(segment)(大約0.8厘米)。
接種馬鈴薯組織把來自培養(yǎng)了大約40天的幼苗培養(yǎng)物的幼苗(高度約為5-6厘米)切成內(nèi)部節(jié)的切片(大約0.8厘米)。將該切片放入含有轉(zhuǎn)化的根瘤農(nóng)桿菌的液體LS-培養(yǎng)基中，其中的根瘤農(nóng)桿菌含有感興趣的二元載體。在含有合適的抗生素(對應(yīng)于農(nóng)桿菌菌株的抗性基因)的YMB-培養(yǎng)基(三水合磷酸氫二鉀(0.66g/l)；七水合硫酸鎂(0.20g/l)；氯化鈉(0.10g/l)；甘露糖醇(10.0g/l)；和酵母提取物(0.40g/l))中培養(yǎng)上述農(nóng)桿菌過夜，直至在660nm下的光密度(OD-660)約為0.8，將上述農(nóng)桿菌離心并重新懸浮于LS-培養(yǎng)基至OD-660為0.5。
在農(nóng)桿菌的懸浮液中保留該切片30分鐘，然后通過在無菌濾紙上吸干該切片來除去過量的細(xì)菌。
共培養(yǎng)直接在含有瓊脂(8.0g/l)、2，4-二氯苯氧乙酸(2.0mg/l)和反式-玉米素(0.5mg/l)的LS-培養(yǎng)基上與細(xì)菌一起共培養(yǎng)幼苗的切片48小時(shí)。用無菌濾紙覆蓋上述培養(yǎng)基還有外植體，在25℃與16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗下放置培養(yǎng)皿。
“洗滌”步驟在共培養(yǎng)的培養(yǎng)基上經(jīng)48小時(shí)后，把上述切片轉(zhuǎn)移至含有液體LS-培養(yǎng)基的容器中，其中的培養(yǎng)基含有800mg/l的羧芐青霉素。輕輕地振蕩該容器，通過這一步驟，農(nóng)桿菌的主要部分或從切片中洗去和/或被殺死。
選擇在洗滌步驟之后，將上述切片轉(zhuǎn)移至平板，該平板含有LS-培養(yǎng)基、瓊脂(8g/l)、反式-玉米素(1-5mg/l)、赤霉素(0.1mg/l)、羧芐青霉素(800mg/l)和硫酸卡那霉素(50-100mg/l)或者取決于所使用的載體構(gòu)建的膦基麥黃酮(1-5mg/l)或甘露糖(5g/l)。每隔3-4周，將上述切片傳代培養(yǎng)至新鮮培養(yǎng)基上。在3至4周內(nèi)，從上述切片發(fā)育成幼苗，并且新的幼苗的形成將持續(xù)3-4個(gè)月。
再生幼苗的生根把再生的幼苗轉(zhuǎn)移至由LS-培養(yǎng)基、瓊脂(8g/l)和羧芐青霉素(800mg/l)組成的生根培養(yǎng)基中。
通過測試在含有硫酸卡那霉素(200mg/l)的上述培養(yǎng)基上的生根能力，通過進(jìn)行NPTII測定(Radke，S.E.等人，應(yīng)用遺傳學(xué)原理(1988)75685-694)或者根據(jù)Wang等人(1993，NAR 21 pp4153-4154)進(jìn)行PCR分析來驗(yàn)證再生幼苗的轉(zhuǎn)基因的基因型。把在上述任意一種測定中均不呈陽性的植物棄去或用作對照物。另一方面，通過進(jìn)行根據(jù)Hodal，L.等人(植物科學(xué)(1992)87115-122)有關(guān)共同引入的β-葡糖醛酸酶的基因的GUS測定也可以驗(yàn)證上述轉(zhuǎn)基因植物。
轉(zhuǎn)移至土壤把新生根的植物(高度約為2-3厘米)從生根培養(yǎng)基移植入土壤并放置在生長室中(21℃，16小時(shí)光照200-400uE/m2/sec)。當(dāng)植物很好地生長時(shí)，將這些植物移入溫室，在溫室中培養(yǎng)該植物直至塊莖已經(jīng)發(fā)育并且該植物的上部開始衰老。
收獲在大約3個(gè)月后收獲這些馬鈴薯，然后進(jìn)行分析。
分支酶的分析采用由Blennow與Johansson(植物化學(xué)(1991)30437-444)所送的SBE測定并且通過標(biāo)準(zhǔn)的Western方法采用定向的抗馬鈴薯SBE的抗體來測定轉(zhuǎn)基因馬鈴薯系中SBE的表達(dá)。
淀粉分析從馬鈴薯塊莖中分離出淀粉，該淀粉用于分析直鏈淀粉與支鏈淀粉之比(Hovenkamp-Hermelink等人(1988)馬鈴薯研究31241-246)。此外，通過在Dionex HPAEC上分析異淀粉酶消化的淀粉來測定支鏈淀粉的鏈長分布。通過N.Nelson(1944)在《生物化學(xué)雜志》153375-380中所述的方法來測定異淀粉酶消化的淀粉中還原端的數(shù)目。
上述結(jié)果表明SBE合成的水平和/或SBE活性的水平和/或轉(zhuǎn)基因植物中淀粉SBE的組成有所下降。
構(gòu)建SBE啟動(dòng)子構(gòu)建體使用引物5’CCA TCG ATA CTT TAA GTG ATT TGA TGG C 3’和5’CGG GAT CCT GTT CTG ATT CTT GAT TTC C 3’.
從λ-SBE 3.4中擴(kuò)增一段SBE啟動(dòng)子片段。用ClaI與BamHI消化該P(yáng)CR產(chǎn)物。然后將得到的1.2kb的片段插入用ClaI和BglII線性化的pVictor 5a中(參見圖9)，從而生成pBEP2(參見圖10)。
馬鈴薯塊莖的淀粉分支酶的測量把來自用pBEA11轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植株的馬鈴薯切成小塊并使用Ultra-Turax勻漿器在提取緩沖液(50 mM Tris-HCl pH 7.5，連二亞硫酸鈉(0.1g/l)和2mM DTT)中進(jìn)行勻漿；向每10克的塊莖中加入1克Dowex xl。將粗的勻漿物通過Miracloth過濾器進(jìn)行過濾并在4℃、24,700g下離心10分鐘。上清液用于淀粉分支酶的測定。
淀粉分支酶的測定是在25℃下、體積為400μl的容器中進(jìn)行的，上述溶液是由0.1M檸檬酸鈉緩沖液pH 7.0、0.75mg/ml直鏈淀粉、5mg/ml牛血清白蛋白和馬鈴薯提取物組成的。在0、15、30和60分鐘時(shí)，從上述反應(yīng)中取走50μl的等分試樣至20μl的3N HCl中。加入1ml碘溶液并用ELISA分光光度計(jì)測量620nm處吸光度的下降。
從以質(zhì)粒pBEA11轉(zhuǎn)化的24株轉(zhuǎn)基因Dianella馬鈴薯植株中測量塊莖提取物中的淀粉分支酶(SBE)的含量。
上述結(jié)果表明pBEA11的轉(zhuǎn)基因系生產(chǎn)出SBE含量僅為在未轉(zhuǎn)化的Dianella植株中SBE含量的10％至15％的塊莖。
小結(jié)上述實(shí)施例涉及馬鈴薯SBE的基因的分離和測序。這些實(shí)施例進(jìn)一步闡明可能可以制備出SBE的內(nèi)含子的構(gòu)建體?？梢园堰@些SBE的內(nèi)含子的構(gòu)建體引入諸如馬鈴薯之類的植物中。在引入后，可以實(shí)現(xiàn)SBE合成水平和/或SBE活性的水平和/或植物中淀粉組成的降低。
人們認(rèn)為本發(fā)明所表達(dá)的有義內(nèi)含子的核苷酸序列通過共同抑制和/或反式激活來影響酶的活性，而這并不希望與理論相結(jié)合。有關(guān)這些機(jī)理的綜述已由Finnegan和McElroy(1994生物技術(shù)12 pp883-887)以及Matzke和Matzke(1995 TIG 11 No.1 pp1-3)公開。通過上述機(jī)理，人們認(rèn)為本發(fā)明的有義內(nèi)含子降低了植物的酶活性(更具體地講是SBE活性)的水平，反過來人們認(rèn)為SBE活性又影響了直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例并從而影響支鏈淀粉的分支模式。
因此，本發(fā)明提供了一種可能通過使用有義內(nèi)含子序列降低SBE活性水平來控制植物或其組織或者細(xì)胞(諸如馬鈴薯塊莖)中的淀粉組成的方法。
因此總而言之，本發(fā)明涉及以影響植物中酶的活性的方法來令人吃驚地使用有義內(nèi)含子序列。
在不偏離本發(fā)明的范圍的情況下，本發(fā)明的其它改進(jìn)對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。例如，可能可以使用反義啟動(dòng)子序列來影響酶的活性，比如反義SBE啟動(dòng)子-諸如包括如SEQ.I.D.No.28所示的核苷酸序列或其變體、衍生物或者同系物的核苷酸序列。
下面幾頁提供了已從SEQ.I.D.No.1至SEQ.I.D.No.29順序排號(hào)的許多序列表。簡而言之，SEQ.I.D.No.1至SEQ.I.D.No.13表示有義內(nèi)含子序列(基因組DNA)；SEQ.I.D.No.14表示SBE啟動(dòng)子序列(基因組序列)；SEQ.I.D.No.15至SEQ.I.D.No.27表示反義內(nèi)含子序列；并且SEQ.I.D.No.28表示互補(bǔ)于SBE啟動(dòng)子序列的序列-即以反義取向的SBE啟動(dòng)子序列。包括啟動(dòng)子、外顯子和內(nèi)含子的SBE的完整的基因組核苷酸序列如SEQ.I.D.No.29所示(參見突出了具體的基因特征的圖3和圖8)。序列信息SEQ.I.D.No.1內(nèi)含子1的序列(1167bp).GTAATTTTTACTAATTTCATGTTAATTTCAATTATTTTTAGCCTTTGCATTTCATTTTCCAATATATCTGGATCATCTCCTTAGTTTTTTATTTTATTTTTTATAATATCAAATATGGAAGAAAAATGACACTTGTAGAGCCATATGTAAGTATCATGTGACAAATTTGCAAGGTGGTTGAGTGTATAAAATTCAAAAATTGAGAGATGGAGGGGGGGTGGGGGBARAGACAATATTTAGAAAGAGTGTTCTAGGAGGTTATGGAGGACACGGATGAGGGGTAGAAGGTTAGTTAGGTATTTGAGTGTTGTCTGGCTTATCCTTTCATACTAGTAGTCGTGGAATTATTTGGGTAGTTTCTTGTTTTGTTATTTGATCTTTGTTATTCTATTTTCTGTTTCTTGTACTTCGATTATTGTATTATATATCTTGTCGTAGTTATTGTTCCTCGGTAAGAATGCTCTAGCATGCTTCCTTTAGTGTTTTATCATGCCTTCTTTATATTCGCGTTGCTTTGAAATGCTTTTACTTTAGCCGAGGGTCTATTAGAAACAATCTCTCTATCTCGTAAGGTAGGGGTAAAGTCCTCACCACACTCCACTTGTGGGATTACATTGTGTTTGTTGTTGTAAATCAATTATGTATACATAATAAGTGGATTTTTTACAACACAAATACATGGTCAAGGGCAAAGTTCTGAACACATAAAGGGTTCATTATATGTCCAGGGATATGATAAAAATTGTTTCTTTGTGAAAGTTATATAAGATTTGTTATGGCTTTTGCTGGAAACATAATAAGTTATAATGCTGAGATAGCTACTGAAGTTTGTTTTTTCTAGCCTTTTAAATGTACCAATAATAGATTCCGTATCGAACGAGTATGTTTTGATTACCTGGTCATGATGTTTCTATTTTTTACATTTTTTTGGTGTTGAACTGCAATTGAAAATGTTGTATCCTATGAGACGGATAGTTGAGAATGTGTTCTTTGTATGGACCTTGAGAAGCTCAAACGCTACTCCAATAATTTCTATGAATTCAAATTCAGTTTATGGCTACCAGTCAGTCCAGAAATTAGGATATGCTGCATATACTTGTTCAATTATACTGTAAAATTTCTTAAGTTCTCAAGATATCCATGTAACCTCGAGAATTTCTTTGACAGSEQ.I.D.No.2內(nèi)含子2的序列(321bp)GTATGTTTGATAATTTATATGGTTGCATGGATAGTATATAAATAGTTGGAAAACTTCTGGACTGGTGCTCATGGCATATTTGATCTGTGCACCGTGTGGAGATGTCAAACATGTGTTACTTCGTTCCGCCAATTTATAATACCTTAACTTGGGAAAGACAGCTCTTTACTCCTGTGGGCATTTGTTATTTGAATTACAATCTTTATGAGCATGGTGTTTTCACATTATCAACTTCTTTCATGTGGTATATAACAGTTTTTAGCTCCGTTAATACCTTTCTTCTTTTTGATATAAACTAACTGTGGTGCATTGCTTGCBKKKSEQ.I.D.No.3內(nèi)含子3的序列(504bp)GTAACAGCCAAAAGTTGTGCTTTAGGCAGTTTGACCTTATTTTGGAAGATGAATTGTTTATACCTACTTTGACTTTGCTAGAGAATTTTGCATACCGGGGAGTAAGTAGTGGCTCCATTTAGGTGGCACCTGGCCATTTTTTTGATCTTTTAAAAAGCTGTTTGATTGGGTCTTCAAAAAAGTAGACAAGGTTTTTGGAGAAGTGACACACCCCCGGAGTGTCAGTGGCAAAGCAAAGATTTTCACTAAGGAGATTCAAAATATAAAAAAAGTATAGACATAAAGAAGCTGAGGGGATTCAACATGTACTATACAAGCATCAAATATAGTCTTAAAGCAATTTTGTAGAAATAAAGAAAGTCTTCCTTCTGTTGCTTCACAATTTCCTTCTATTATCATGAGTTACTCTTTCTGTTCGAAATAGCTTCCTTAATATTAAATTCATGATACTTTTGTTGAGATTTAGCAGTTTTTTCTTGTGTAAACTGCTCTCTTTTTTTGCAGSEQ.I.D.No.4內(nèi)含子4的序列(146bp).GTAGGTCCTCGTCTACTACAAAATAGTAGTTTCCATCATCATAACAGATTTTCCTATTAAAGCATGATGTTGCAGCATCATTGGCTTTCTTACATGTTCTAATTGCTATTAAGGTTATGCTTCTAATTAACTCATCCACAATGCAGSEQ.I.D.No.5內(nèi)含子5的序列(218bp).GTTTTGTTATTCATACCTTGAAGCTGAATTTTGAACACCATCATCACAGGCATTTCGATTCATGTTCTTACTAGTCTTGTTATGTAAGACATTTTGAAATGCAAAAGTTAAAATAATTGTGTCTTTACTAATTTGGACTTGATCCCATACTCTTTCCCTTAACAAAATGAGTCAATTCTATAAGTGCTTGAGAACTTACTACTTCAGCAATTAAACAGSEQ.I.D.No.6內(nèi)含子6的序列(198bp).GTATTTTAAATTTATTTCTACAACTAAATAATTCTCAGAACAATTGTTAGATAGAATCCAAATATATACGTCCTGAAAGTATAAAAGTACTTATTTTCGCCATGGGCCTTCAGAATATTGGTAGCCGCTGAATATCATGATAAGTTATTTATCCAGTGACATTTTTATGTTCACTCCTATTATGTCTGCTGGATACAGSEQ.I.D.No.7內(nèi)含子7的序列(208bp)GTTTGTCTGTTTCTATTGCATTTTAAGGTTCATATAGGTTAGCCACGGAAAATCTCACTCTTTGTGAGGTAACCAGGGTTCTGATGGATTATTCAATTTTCTCGTTTATCATTTGTTTATTCTTTTCATGCATTGTGTTTCTTTTTCAATATCCCTCTTATTTGGAGGTAATTTTTCTCATCTATTCACTTTTAGCTTCTAACCACAGSEQ.I.D.No.8內(nèi)含子8的序列(293bp).GTATGTCTTACATCTTTAGATATTTTGTGATAATTACAATTAGTTTGGCTTACTTGAACAAGATTCATTCCTCAAAATGACCTGAACTGTTGAACATCAAAGGGGTTGAAACATAGAGGAAAACAACATGATGAATGTTTCCATTGTCTAGGGATTTCTATTATGTTGCTGAGAACAAATGTCATCTTAAAAAAAACATTGTTTACTTTTTTGTAGTATAGAAGATTACTGTATAGAGTTTGCAAGTGTGTCTGTTTTGGAGTAATTGTGAAATGTTTGATGAACTTGTACAGSEQ.I.D.No.9內(nèi)含子9的序列(376bp).GTTCAAGTATTTTGAATCGCAGCTTGTTAAATAATCTAGTAATTTTTAGATTGCTTACTTGGAAGTCTACTTGGTTCTGGGGATGATAGCTCATTTCATCTTGTTCTACTTATTTTCCAACCGAATTTCTGATTTTTGTTTCGAGATCCAAGTATTAGATTCATTTACACTTATTACCGCCTCATTTCTACCACTAAGGCCTTGATGAGCAGCTTAAGTTGATTCTTTGAAGCTATAGTTTCAGGCTACCAATCCACAGCCTGCTATATTTGTTGGATACTTACCTTTTCTTTACAATGAAGTGATACTAATTGAAATGGTCTAAATCTGATATCTATATTTCTCCGTCTTTCCTCCCCCTCATGATGAAATGCAGSEQ.I.D.No.10內(nèi)含子10的序列(172bp).GTAAAATCATCTAAAGTTGAAAGTGTTGGGTTTATGAAGTGCTTTAATTCTATCCAAGGACAAGTAGAAACCTTTTTACCTTCCATTTCTTGATGATGGATTTCATATTATTTAATCCAATAGCTGGTCAAATTCGGTAATAGCTGTACTGATTAGTTACTTCACTTTGCAGSEQ.I.D.No.11內(nèi)含子11的序列(145bp).GTATATATGTTTTACTTATCCATGAAATTATTGCTCTGCTTGTTTTTAATGTACTGAACAAGTTTTATGGAGAAGTAACTGAAACAAATCATTTTCACATTGTCTAATTTAACTCTTTTTTCTGATCCTCGCATGACGAAAACAGSEQ.I.D.No.12內(nèi)含子12的序列(242bp).GTAAGGATTTGCTTGAATAACTTTTGATAATAAGATAACAGATGTAGGGTACAGTTCTCTCACCAAAAAGAACTGTAATTGTCTCATCCATCTTTAGTTGTATAAGATATCCGACTGTCTGAGTTCGGAAGTGTTTGAGCCTCCTGCCCTCCCCCTGCGTTGTTTAGCTAATTCAAAAAGGAGAAAACTGTTTATTGATGATCTTTGTCTTCATGCTGACATACAATCTGTTCTCATGACAGSEQ.I.D.No.13內(nèi)含子13的序列(797bp).GTACAGTTCTTGCCGTGTGACCTCCCTTTTTATTGTGGTTTTGTTCATAGTTATTTGAATGCGATAGAAGTTAACTATTGATTACCGCCACAATCGCCAGTTAAGTCCTCTGAACTACTAATTTGAAAGGTAGGAATAGCCGTAATAAGGTCTACTTTTGGCATCTTACTGTTACAAAACAAAAGGATGCCAAAAAAATTCTTCTCTATCCTCTTTTTCCCTAAACCAGTGCATGTAGCTTGCACCTGCATAAACTTAGGTAAATGATCAAAAATGAAGTTGATGGGAACTTAAAACCGCCCTGAAGTAAAGCTAGGAATAGTCATATAATGTCCACCTTTGGTGTCTGCGCTAACATCAACAACAACATACCTCGTGTAGTCCCACAAAGTGGTTTCAGGGGGAGGGTAGAGTGTATGCAAAACTTACTCCTATCTCAGAGGTAGAGAGGATTTTTTCAATAGACCCTTGGCTCAAGAAAAAAAGTCCAAAAAGAAGTAACAGAAGTGAAAGCAACATGTGTAGCTAAAGCGACCCAACTTGTTTGGGACTGAAGTAGTTGTTGTTGTTGAAACAGTGCATGTAGATGAACACATGTCAGAAAATGGACAACACAGTTATTTTGTGCAAGTCAAAAAAATGTACTACTATTTCTTTGTGCAGCTTTATGTATAGAAAAGTTAAATAACTAATGAATTTTGCTAGCAGAAAAATAGCTTGGAGAGAAATTTTTTATATTGAACTAAGCTAACTATATTCATCTTTCTTTTTGCTTCTTCTTCTCCTTGTTTGTGAAGSEQ.I.D.No.14SBE基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA序列ATCATGGCCAATTACTGGTTCAAATGCATTACTTCCTTTCAGATTCTTTCGAGTTCTCAT 60GACCGGTCCTACTACAGACGATACTAACCCGTGGAACTGTTGCATCTGCTTCTTAGAACT 120CTATGGCTATTTTCGTTAGCTTGGCGTCGGTTTGAACATAGTTTTTGTTTTCAAACTCTT 180CATTTACAGTCAAAATGTTGTATGGTTTTTGTTTTCCTCAATGATGTTTACAGTGTTGTG 240TTGTCATCTGTACTTTTGCCTATTACTTGTTTTGAGTTACATGTTAAAAAAGTGTTTATT 300TTGCCATATTTTGTTCTCTTATTATTATTATCATACATACATTATTACAAGGAAAAGACA 360AGTACACAGATCTTAACGTTTATGTTCAATCAACTTTTGGAGGCATTGACAGGTACCACA 420AATTTTGAGTTTATGATTAAGTTCAATCTTAGAATATGAATTTAACATCTATTATAGATG 480CATAAAAATAGCTAATGATAGAACATTGACATTTGGCAGAGCTTAGGGTATGGTATATCC 540AACGTTAATTTAGTAATTTTTGTTACGTACGTATATGAAATATTGAATTAATCACATGAA 600CGGTGGATATTATATTATGAGTTGGCATCAGCAAAATCATTGGTGTAGTTGACTGTAGTT 660GCAGATTTAATAATAAAATGGTAATTAACGGTCGATATTAAAATAACTCTCATTTCAAGT 720GGGATTAGAACTAGTTATTAAAAAAATGTATACTTTAAGTGATTTGATGGCATATAATTT 780AAAGTTTTTCATTTCATGCTAAAATTGTTAATTATTGTAATGTAGACTGCGACTGGAATT 840ATTATAGTGTAAATTTATGCATTCAGTGTAAAATTAAAGTATTGAACTTGTCTGTTTTAG 900AAAATACTTTATACTTTAATATAGGATTTTGTCATGCGAATTTAAATTAATCGATATTGA 960ACACGGAATACCAAAATTAAAAAGGATACACATGGCCTTCATATGAACCGTGAACCTTTG1020ATAACGTGGAAGTTCAAAGAAGGTAAAGTTTAAGAATAAACTGACAAATTAATTTCTTTT1080ATTTGGCCCACTACTAAATTTGCTTTACTTTCTAACATGTCAAGTTGTGCCCTCTTAGTT1140GAATGATATTCATTTTTCATCCCATAAGTTCAATTTGATTGTCATACCACCCATGATGTT1200CTGAAAAATGCTTGGCCATTCACAAAGTTTATCTTAGTTCCTATGAACTTTATAAGAAGC1260TTTAATTTGACATGTTATTTATATTAGATGATATAATCCATGACCCAATAGACAAGTGTA1320TTAATATTGTAACTTTGTAATTGAGTGTGTCTACATCTTATTCAATCATTTAAGGTCATT1380AAAATAAATTATTTTTTGACATTCTAAAACTTTAAGCAGAATAAATAGTTTATCAATTAT1440TAAAAACAAAAAACGACTTATTTATAAATCAACAAACAATTTTAGATTGCTCCAACATAT1500TTTTCCAAATTAAATGCAGAAAATGCATAATTTTATACTTGATCTTTATAGCTTATTTTT1560TTTTAGCCTAACCAACGAATATTTGTAAACTCACAACTTGATTAAAAGGATTTACAACAA1620GATATATATAAGTAGTGACAAATCTTGATTTTAAATATTTTAATTTGGAGGTCAAAATTT1680TACCATAATCATTTGTATTTATAATTAAATTTTAAATATCTTATTTATACATATCTAGTA1740AACTTTTAAATATACGTATATACAAAATATAAAATTATTGGCGTTCATATTAGGTCAATA1800AATCCTTAACTATATCTGCCTTACCACTAGGAGAAAGTAAAAAACTCTTTACCAAAAATA1860CATGTATTATGTATACAAAAAGTCGATTAGATTACCTAAATAGAAATTGTATAACGAGTA1920AGTAAGTAGAAATATAAAAAAACTACAATACTAAAAAAAATATGTTTTACTTCAATTTCG1980AAACTAATGGGGTCTGAGTGAAATATTCAGAAAGGGGAGGACTAACAAAAGGGTCATAAT2040GTTTTTTTATAAAAAGCCACTAAAATGAGGAAATCAAGAATCAGAACATACAAGAAGGCA2100GCAGCTGAAGCAAAGTACCATAATTTAATCAATGGAAATTAATTTCAAAGTTTTATCAAA2160ACCCATTCGSEQ.I.D.No.15內(nèi)含子1的反義序列 (1167bp).CTGTCAAAGAAATTCTCGAGGTTACATGGATATCTTGAGAACTTAAGAAATTTTACAGTATAATTGAACAAGTATATGCAGCATATCCTAATTTCTGGACTGACTGGTAGCCATAAACTGAATTTGAATTCATAGAAATTATTGGAGTAGCGTTTGAGCTTCTCAAGGTCCATACAAAGAACACATTCTCAACTATCCGTCTCATAGGATACAACATTTTCAATTGCAGTTCAACACCAAAAAAATGTAAAAAATAGAAACATCATGACCAGGTAATCAAAACATACTCGTTCGATACGGAATCTATTATTGGTACATTTAAAAGGCTAGAAAAAACAAACTTCAGTAGCTATCTCAGCATTATAACTTATTATGTTTCCAGCAAAAGCCATAACAAATCTTATATAACTTTCACAAAGAAACAATTTTTATCATATCCCTGGACATATAATGAACCCTTTATGTGTTCAGAACTTTGCCCTTGACCATGTATTTGTGTTGTAAAAAATCCACTTATTATGTATACATAATTGATTTACAACAACAAACACAATGTAATCCCACAAGTGGAGTGTGGTGAGGACTTTACCCCTACCTTACGAGATAGAGAGATTGTTTCTAATAGACCCTCGGCTAAAGTAAAAGCATTTCAAAGCAACGCGAATATAAAGAAGGCATGATAAAACACTAAAGGAAGCATGCTAGAGCATTCTTACCGAGGAACAATAACTACGACAAGATATATAATACAATAATCGAAGTACAAGAAACAGAAAATAGAATAACAAAGATCAAATAACAAAACAAGAAACTACCCAAATAATTCCACGACTACTAGTATGAAAGGATAAGCCAGACAACACTCAAATACCTAACTAACCTTCTACCCCTCATCCGTGTCCTCCATAACCTCCTAGAACACTCTTTCTAAATATTGTCTYTVCCCCCACCCCCCCTCCATCTCTCAATTTTTGAATTTTATACACTCAACCACCTTGCAAATTTGTCACATGATACTTACATATGGCTCTACAAGTGTCATTTTTCTTCCATATTTGATATTATAAAAAATAAAATAAAAAACTAAGGAGATGATCCAGATATATTGGAAAATGAAATGCAAAGGCTAAAAATAATTGAAATTAACATGAAATTAGTAAAAATTACSEQ.I.D.No.16內(nèi)含子2的反義序列 (321bp).MMMVGCAAGCAATGCACCACAGTTAGTTTATATCAAAAAGAAGAAAGGTATTAACGGAGCTAAAAACTGTTATATACCACATGAAAGAAGTTGATAATGTGAAAACACCATGCTCATAAAGATTGTAATTCAAATAACAAATGCCCACAGGAGTAAAGAGCTGTCTTTCCCAAGTTAAGGTATTATAAATTGGCGGAACGAAGTAACACATGTTTGACATCTCCACACGGTGCACAGATCAAATATGCCATGAGCACCAGTCCAGAAGTTTTCCAACTATTTATATACTATCCATGCAACCATATAAATTATCAAACATACSEQ.I.D.No.17內(nèi)含子3的反義序列 (504bp).CTGCAAAAAAAGAGAGCAGTTTACACAAGAAAAAACTGCTAAATCTCAACAAAAGTATCATGAATTTAATATTAAGGAAGCTATTTCGAACAGAAAGAGTAACTCATGATAATAGAAGGAAATTGTGAAGCAACAGAAGGAAGACTTTCTTTATTTCTACAAAATTGCTTTAAGACTATATTTGATGCTTGTATAGTACATGTTGAATCCCCTCAGCTTCTTTATGTCTATACTTTTTTTATATTTTGAATCTCCTTAGTGAAAATCTTTGCTTTGCCACTGACACTCCGGGGGTGTGTCACTTCTCCAAAAACCTTGTCTACTTTTTTGAAGACCCAATCAAACAGCTTTTTAAAAGATCAAAAAAATGGCCAGGTGCCACCTAAATGGAGCCACTACTTACTCCCCGGTATGCAAAATTCTCTAGCAAAGTCAAAGTAGGTATAAACAATTCATCTTCCAAAATAAGGTCAAACTGCCTAAAGCACAACTTTTGGCTGTTACSEQ.I.D.No.18內(nèi)含子4的反義序列 (146bp).CTGCATTGTGGATGAGTTAATTAGAAGCATAACCTTAATAGCAATTAGAACATGTAAGAAAGCCAATGATGCTGCAACATCATGCTTTAATAGGAAAATCTGTTATGATGATGGAAACTACTATTTTGTAGTAGACGAGGACCTACSEQ.I.D.No.19內(nèi)含子5的反義序列 (218bp).CTGTTTAATTGCTGAAGTAGTAAGTTCTCAAGCACTTATAGAATTGACTCATTTTGTTAAGGGAAAGAGTATGGGATCAAGTCCAAATTAGTAAAGACACAATTATTTTAACTTTTGCATTTCAAAATGTCTTACATAACAAGACTAGTAAGAACATGAATCGAAATGCCTGTGATGATGGTGTTCAAAATTCAGCTTCAAGGTATGAATAACAAAACSEQ.I.D.No.20內(nèi)含子6的反義序列 (198bp).CTGTATCCAGCAGACATAATAGGAGTGAACATAAAAATGTCACTGGATAAATAACTTATCATGATATTCAGCGGCTACCAATATTCTGAAGGCCCATGGCGAAAATAAGTACTTTTATACTTTCAGGACGTATATATTTGGATTCTATCTAACAATTGTTCTGAGAATTATTTAGTTGTAGAAATAAATTTAAAATACSEQ.I.D.No.21內(nèi)含子7的反義序列 (208bp)CTGTGGTTAGAAGCTAAAAGTGAATAGATGAGAAAAATTACCTCCAAATAAGAGGGATATTGAAAAAGAAACACAATGCATGAAAAGAATAAACAAATGATAAACGAGAAAATTGAATAATCCATCAGAACCCTGGTTACCTCACAAAGAGTGAGATTTTCCGTGGCTAACCTATATGAACCTTAAAATGCAATAGAAACAGACAAACSEQ.I.D.No.22內(nèi)含子8的反義序列 (293bp).CTGTACAAGTTCATCAAACATTTCACAATTACTCCAAAACAGACACACTTGCAAACTCTATACAGTAATCTTCTATACTACAAAAAAGTAAACAATGTTTTTTTTAAGATGACATTTGTTCTCAGCAACATAATAGAAATCCCTAGACAATGGAAACATTCATCATGTTGTTTTCCTCTATGTTTCAACCCCTTTGATGTTCAACAGTTCAGGTCATTTTGAGGAATGAATCTTGTTCAAGTAAGCCAAACTAATTGTAATTATCACAAAATATCTAAAGATGTAAGACATACSEQ.I.D.No.23內(nèi)含子9的反義序列 (376bp).CTGCATTTCATCATGAGGGGGAGGAAAGACGGAGAAATATAGATATCAGATTTAGACCATTTCAATTAGTATCACTTCATTGTAAAGAAAAGGTAAGTATCCAACAAATATAGCAGGCTGTGGATTGGTAGCCTGAAACTATAGCTTCAAAGAATCAACTTAAGCTGCTCATCAAGGCCTTAGTGGTAGAAATGAGGCGGTAATAAGTGTAAATGAATCTAATACTTGGATCTCGAAACAAAAATCAGAAATTCGGTTGGAAAATAAGTAGAACAAGATGAAATGAGCTATCATCCCCAGAACCAAGTAGACTTCCAAGTAAGCAATCTAAAAATTACTGATTATTTAACAAGCTGCGATTCAAAATACTTGAACSEQ.I.D.No.24內(nèi)含子10的反義序列 (172bp).CTGCAAAGTGAAGTAACTAATCAGTACAGCTATTACCGAATTTGACCAGCTATTGGATTAAATAATATGAAATCCATCATCAAGAAATGGAAGGTAAAAAGGTTTCTACTTGTCCTTGGATAGAATTAAAGCACTTCATAAACCCAACACTTTCAACTTTAGATGATTTTACSEQ.I.D.No.25內(nèi)含子11的反義序列 (145bp).CTGTTTTCGTCATGCGAGGATCAGAAAAAAGAGTTAAATTAGACAATGTGAAAATGATTTGTTTCAGTTACTTCTCCATAAAACTTGTTCAGTACATTAAAAACAAGCAGAGCAATAATTTCATGGATAAGTAAAACATATATACSEQ.I.D.No.26內(nèi)含子12的反義序列 (242bp).CTGTCATGAGAACAGATTGTATGTCAGCATGAAGACAAAGATCATCAATAAACAGTTTTCTCCTTTTTGAATTAGCTAAACAACGCAGGGGGAGGGCAGGAGGCTCAAACACTTCCGAACTCAGACAGTCGGATATCTTATACAACTAAAGATGCATGAGACAATTACAGTTCTTTTTGGTGAGAGAACTGTACCCTACATCTGTTATCTTATTATCAAAAGTTATTCAAGCAAATCCTTACSEQ.I.D.No.27內(nèi)含子13的反義序列 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TCTTCTCCTT GTTTGTGAAG9240GCTTATTACA GAGTTGATGA ACGCATGTCA GAAACTGAAG ATTACCAGAC AGACATTTGT9300AGTGAGCTAC TACCAACAGC CAATATCGAG GAGAGTGACG AGAAACTTAA AGATTCGTTA9360TCTACAAATA TCAGTAACAT TGACGAACGC ATGTCAGAAA CTGAAGTTTA CCAGACAGAC9420ATTTCTAGTG AGCTACTACC AACAGCCAAT ATTGAGGAGA GTGACGAGAA ACTTAAAGAT9480TCGTTATCTA CAAATATCAG TAACATTGAT CAGACTGTTG TAGTTTCTGT TGAGGAGAGA9540GACAAGGAAC TTAAAGATTC ACCGTCTGTA AGCATCATTA GTGATGTTGT TCCAGCTGAA9600TGGGATGATT CAGATGCAAA CGTCTGGGGT GAGGACTAGT CAGATGATTG ATCGACCCTT9660CTACCGATTG GTGATCGCTA TCCTTGCTCT CTGAGAAATA GGTGAGGCGA AACAAAAAAT9720AATTTGCATG ATAAAAAGTC TGATTTTATG ATCGCTATCC TCGCTTTCTG AGAAAGAAGC9780GAAACAAAGG CGACTCCTGG ACTCGAATCT ATAAGATAAC AAAGGCGACT CCTGGGACTC9840GAATCTATAA GATAACAAAG GCAATTCCAA GACTTGAATC TATAAAAAAT TTAGTTAAGA9900ATGATTAACG TCCGATCCTA ATTCGAATCG AGGCATCTTA CCACTCCATT GATAATTATA9960TAAGTCAATA AGTCATATAA WAGTATTAAA AACTAAATTG ACTTGATCGG TCTATCAAAA 10020ATMAGATMAA ATTGTGTTCA TATGTAACAT TTTTGTTGTC ACAATTAGCT TAATTACATC 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權(quán)利要求
1.一種影響植物(或其細(xì)胞，組織或者器官)中酶的活性的方法，該方法包括在所說的植物(或其細(xì)胞，組織或者器官)中表達(dá)核苷酸序列，其中所說的核苷酸序列部分或者完整地以有義取向編碼內(nèi)含子；并且其中所說的核苷酸序列不含有通常與所說的內(nèi)含子有關(guān)的外顯子序列的有義序列。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中淀粉分支酶的活性受到了影響和/或其中支鏈淀粉的含量受到了影響和/或改變了淀粉的組成。
3.一種影響生產(chǎn)淀粉的生物體(或其細(xì)胞，組織或者器官)中酶活性的方法，該方法包括在所說的生產(chǎn)淀粉的生物體(或其細(xì)胞，組織或者器官)中表達(dá)核苷酸序列，其中所說的核苷酸序列部分或者完整地編碼以有義取向的內(nèi)含子；其中所說的核苷酸序列不含有通常與所說的內(nèi)含子有關(guān)的外顯子序列的有義序列；并且其中淀粉分支酶的活性受到了影響和/或其中支鏈淀粉的含量受到了影響和/或改變了淀粉的組成。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1至3至任一的方法，其中所說的核苷酸序列不含有外顯子序列的有義序列。
5.一種根據(jù)前述權(quán)利要求之任一的方法，其中降低或去除了所說的酶活性。
6.一種根據(jù)前述權(quán)利要求之任一的方法，其中所說的核苷酸序列至少基本上以有義取向編碼至少一種內(nèi)含子的全部。
7.一種根據(jù)前述權(quán)利要求之任一的方法，其中所說的核苷酸序列以有義取向編碼至少一種內(nèi)含子的全部。
8.一種根據(jù)前述權(quán)利要求之任一的方法，其中所說的核苷酸序列包括如SEQ.I.D.No.1至SEQ.I.D.No.13之任一所示的序列或其變體、衍生物或者同系物，也包括其組合。
9.一種根據(jù)前述權(quán)利要求之任一的方法，其中所說的核苷酸序列由具有如SEQ.I.D.No.14所示序列的啟動(dòng)子或其變體、衍生物或者同系物來表達(dá)。
10.一種包括如在權(quán)利要求8中定義的核苷酸序列的有義序列或其變體、衍生物或者同系物。
11.一種具有如SEQ.I.D.No.14所示序列的啟動(dòng)子或其變體、衍生物或者同系物。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求11的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子結(jié)合了一種感興趣的基因(“GOI”)。
13.一種能夠包括或者表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求10至12之任一權(quán)利要求的本發(fā)明的構(gòu)建體。
14.一種包括或者表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求10至13之任一權(quán)利要求的本發(fā)明的載體。
15.一種核苷酸序列的組合，該組合包括編碼重組酶的第一核苷酸序列；以及以有義取向?qū)?yīng)于內(nèi)含子的第二核苷酸序列；其中所說的內(nèi)含子為一種與編碼對應(yīng)于所說重組酶的酶的基因組基因有關(guān)的內(nèi)含子；并且其中所說的第二核苷酸序列不含有通常與所說的內(nèi)含子有關(guān)的外顯子序列的有義序列。
16.一種包括或者表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求10至15之任一權(quán)利要求的本發(fā)明的細(xì)胞、組織或器官。
17.一種包括或者表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求10至16之任一權(quán)利要求的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)淀粉的生物體。
18.一種根據(jù)權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)淀粉的生物體，其中所說的生物體為植物。
19.一種從根據(jù)前述權(quán)利要求之任一權(quán)利要求的本發(fā)明中獲得的淀粉。
20. pBEA11(NCIMB 40754)。
21.一種內(nèi)含子的核苷酸序列，該核苷酸序列可以從λ-SBE 3.2(NCIMB 40751)或λ-SBE 3.4(NCIMB 40752)或其變體、衍生物或同系物得到。
22.一種在宿主生物體中表達(dá)重組蛋白或酶的方法，該方法包括表達(dá)編碼所說的重組蛋白或酶的核苷酸序列；以及表達(dá)另一個(gè)核苷酸序列；其中所說的另一個(gè)核苷酸序列部分或者完整地以有義取向編碼內(nèi)含子；其中所說的內(nèi)含子為一種通常與編碼對應(yīng)于所說的重組蛋白或酶的蛋白或酶的基因組基因有關(guān)的內(nèi)含子；并且其中所說的另一個(gè)核苷酸序列不含有通常與所說的內(nèi)含子有關(guān)的外顯子序列的有義序列。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種抑制基因表達(dá)的方法。這種影響植物中酶的活性的方法包括在植物(或其細(xì)胞,組織或者器官)中表達(dá)核苷酸序列,其中該核苷酸序列部分或者完整地以有義取向編碼內(nèi)含子;并且其中該核苷酸序列不含有通常與該內(nèi)含子有關(guān)的外顯子序列的有義序列。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1196092SQ96196982
公開日1998年10月14日 申請日期1996年7月12日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月14日
發(fā)明者P·拋爾森 申請人:丹尼斯科有限公司