專利名稱：病毒載體及其在治療過度增殖性疾病(特別是再狹窄)上的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于通過基因療法治療與過度增殖性疾病有關(guān)的病理狀態(tài)的新的特別有效的方法。更具體地說，按照本發(fā)明的方法包括通過gax基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)移特異性地阻止血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的增殖。本發(fā)明的方法尤其適于通過在血管壁中g(shù)ax基因的過度表達(dá)治療血管成形術(shù)后的再狹窄。按照本發(fā)明，gax基因可以通過病毒載體轉(zhuǎn)移。這些載體優(yōu)選地是腺病毒載體。
已分離了與阻止細(xì)胞分裂相聯(lián)系的各種基因。這樣，gas(阻止生長特異性的gas1-6)和gadd(阻止生長和DNA可誘導(dǎo)損壞gadd34、gadd45和gadd153)基因在靜止細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)，其中靜止細(xì)胞是在細(xì)胞周期的G0期被阻止的細(xì)胞(Schneider等，細(xì)胞，1988，54787-793，Del Sal等，細(xì)胞，1992，123514-3521；Cowled等，細(xì)胞研究快報，1998，211197-202；Brancolini和Schneider，細(xì)胞生物學(xué)雜志，1994，124743-756；Zhan等，分子細(xì)胞生物學(xué)，1993，134242-4250；Jackman等，癌癥研究，545656-5662，1994)。和這些基因表達(dá)的研究結(jié)果一致，gas-I蛋白質(zhì)的微注射阻止DNA的合成(Del Sal等，細(xì)胞，1992，70595-607)。相反地，生長因子(如PDGF(血小板衍生生長因子))或小牛血清的添加在體外模型中減少這些基因的表達(dá)(Coccia等，分子細(xì)胞生物學(xué)，1992，123514-3521)。這種與細(xì)胞增殖狀態(tài)有關(guān)的表達(dá)特異性在體內(nèi)也似乎有其對應(yīng)性。這樣，在卵巢切除術(shù)之后gas-1基因在大鼠子宮中強(qiáng)烈表達(dá)(Ferrero和Cairo，Cell.Biol.Int.，1993，17，857-862)。在相同的動物模型中，用雌激素治療導(dǎo)致細(xì)胞增殖，這一點(diǎn)在子宮內(nèi)原癌基因C-myc的表達(dá)增加中反映出來或者由gas-1基因表達(dá)的減少2所反映。同樣地，在增殖/再生的肝模型中，在部分的heptatectomy(即在從G0期向G1期過渡期間)四小時之后，gas-6的基因表達(dá)嚴(yán)重地減少。這種表達(dá)可能在肝細(xì)胞的一次分裂啟動后恢復(fù)正常(Ferrero等，細(xì)胞生理學(xué)雜志，1994，158263-269)。
申請人對新的基因，即gax(阻止生長特異性同源框)基因感興趣，而且現(xiàn)在證明這種基因具有用于治療過度增殖性疾病(特別是再狹窄)的基因治療中的特別有利的性質(zhì)。gax基因最初從大鼠主動脈中制備的cDNA文庫中鑒別。它編碼303個氨基酸的蛋白質(zhì)。已經(jīng)對其序列進(jìn)行了特征分析，而且克隆了其cDNA(Gorski等，分子細(xì)胞生物學(xué)，1993，6，3722-3733)。gax基因具有某些和gas與gadd基因的性質(zhì)類似的性質(zhì)，因?yàn)榭磥硭部梢哉{(diào)節(jié)細(xì)胞周期中的G0至G1過渡。按相同的方式，在與PDGF接觸兩小時之后，在大鼠VSMCs中通過因子10降低gax mRNA的水平(Gorski等，分子細(xì)胞生物學(xué)，1993，6，3722-3733)。因此gax基因的表達(dá)在VSMC致有絲分裂的反應(yīng)期間被抑制。
按照本發(fā)明的方法的一個優(yōu)點(diǎn)主要是gax基因的特異性表達(dá)。這樣，在成年大鼠中，gax基因主要在心血管(主動脈和心臟)系統(tǒng)中表達(dá)。另一方面，Northern印跡不能證明gax mRNA在肝、人腦、胃或骨骼肌中的存在。血管成形術(shù)后的再狹窄是局部的過度增殖性疾病，這種疾病在動脈硬化癥血小板區(qū)域中的非手術(shù)治療之后出現(xiàn)。這樣，通過血管成形術(shù)治療動脈硬化癥損傷在對動脈壁機(jī)械傷害之后經(jīng)常導(dǎo)致(在某些研究中可多達(dá)50％的病例)再狹窄。在這種機(jī)制中的關(guān)鍵事件是膜血管中層的平滑肌細(xì)胞(VSMC)向膜內(nèi)膜的增殖和遷移，具體來說是無由于通過膜內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞操作的保護(hù)和/或反饋。在VSMC細(xì)胞中有選擇地表達(dá)按照本發(fā)明的抗增殖基因的能力代表了非常實(shí)質(zhì)性的優(yōu)點(diǎn)。
按照本發(fā)明的方法的另一個優(yōu)點(diǎn)也在于這樣的事實(shí)gax基因?qū)儆谘夯蚣易濉＿@些基因編碼包含共有序列(或血液結(jié)構(gòu)域(homeodomains))的轉(zhuǎn)錄因子，該共有序列識別DNA的特異性區(qū)域(或同源框)(綜述Gehringal等，細(xì)胞，78211-223，1994)。大鼠gax蛋白質(zhì)的同源結(jié)構(gòu)域包含在氨基酸185和245之間。另人感興趣的是，目前為止鑒別的血液基因參與胚胎發(fā)生期間細(xì)胞分化/生長的控制，這樣就增強(qiáng)了按照本發(fā)明的方法的治療潛力(綜述Lawrence和Morata，細(xì)胞，78181-189，1994；Krumlauf，細(xì)胞78191-201，1994)。
本發(fā)明首先涉及缺陷重組病毒，該病毒包含至少一種編碼全部或部分GAX蛋白質(zhì)或者這種蛋白質(zhì)的變體的插入基因。本發(fā)明也涉及這樣的病毒用于治療過度增殖疾病的用途。
在本發(fā)明的病毒中，插入基因可以是互補(bǔ)DNA(cDNA)或基因組DNA(gDNA)的片段，或者是由，例如，插入了一種或多種內(nèi)含子的cDNA組成的雜交構(gòu)建體?；蛞部梢杂珊铣苫虬牒铣傻男蛄薪M成。如上所述，基因可以是編碼全部或部分GAX蛋白質(zhì)或者其變體的基因。在本發(fā)明的含義之內(nèi)，術(shù)語變體指任何突變體、片段或肽，它們具有GAX的至少一種生物學(xué)性質(zhì)以及從其它物種獲得的任何GAX同系物。這些片段與變體可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)獲得，具體來說是通過遺傳和/或化學(xué)和/或酶修飾、或另外通過雜交、或表達(dá)克隆使變體能按照其生物活性選擇。遺傳修飾包括抑制、缺失、突變等。
在本發(fā)明的含義之內(nèi)，插入基因優(yōu)選地是編碼大鼠全部或部分GAX蛋白質(zhì)或其人類同系物的基因。更優(yōu)選地是cDNA或gDNA。
通常，插入基因也包含能夠使其在被感染細(xì)胞中表達(dá)的序列。這些序列可以是天然的在表達(dá)所說的基因中起作用的序列(如果該序列可在受感染的細(xì)胞中起作用)。該序列也可以是不同來源的序列(在表達(dá)不同的蛋白質(zhì)或甚至是合成蛋白質(zhì)中起作用)。具體地說，該序列可以是真核或病毒基因的衍生的序列，這些序列以特異性或非特異性方式和可誘導(dǎo)性或非誘導(dǎo)性方式刺激或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。作為例子，它們可以是衍生自需要感染的細(xì)胞的基因組或病毒的基因組，特別是腺病毒E1A和MLP基因的啟動子、CMV或LTR-RSV啟動子等。可以提及的真核啟動子是遍在啟動子(HPRT、波形蛋白、肌動蛋白、微管蛋白等)、中間纖維啟動子(結(jié)蛋白、神經(jīng)微絲、角蛋白、GFAP等)、治療基因啟動子(MDR型、CFTR、因子VIII等)、組織特異性啟動子(在平滑肌細(xì)胞中的肌動蛋白啟動子)、在細(xì)胞分裂中優(yōu)先活化的啟動子或?qū)Υ碳し磻?yīng)的其它啟動子(甾類激素受體、視黃酸受體等)。另外，這些表達(dá)序列可通過添加活化序列、調(diào)節(jié)序列等修飾。另外，當(dāng)插入基因不包含任何表達(dá)序列時，可以將其插入這種序列下游的缺陷病毒基因組中。
而且，插入序列通常在編碼序列上游包含指導(dǎo)合成多肽進(jìn)入靶細(xì)胞的分泌途徑的信號序列。當(dāng)該信號序列是天然的GAX信號序列時，它也可以是任何功能性的信號序列(胸苷激酶基因的信號序列)或人工信號序列。
按照本發(fā)明的病毒是缺陷，它在靶細(xì)胞中不能自我復(fù)制。通常，在本發(fā)明的范圍之內(nèi)使用的缺陷病毒的基因組因而至少缺乏對所說的病毒在被感染細(xì)胞中的復(fù)制必需的序列。這些區(qū)域可被除去(全部或部分)、或被變得無功能、或被其它序列(特別是插入基因)取代。但是，缺陷病毒優(yōu)選地保留了其對于衣殼化病毒顆粒必需的基因組序列。
按照本發(fā)明的病毒可以從腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)或逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生。按照一個優(yōu)選的實(shí)施方案，所述病毒是腺病毒。
腺病毒存在不同的血清型，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)隨某些血清型不同而不同，在這些血清型中，在本發(fā)明的范圍之內(nèi)優(yōu)選地是使用2型或5型人腺病毒(Ad2或Ad5)或動物來源的腺病毒(參見申請W094/26914)。這些可在本發(fā)明的范圍之內(nèi)使用并可被提及的動物來源的腺病毒是犬、牛、鼠(例如Mavl，Beard等，病毒學(xué)，75(1990)，81)、羊、豬、禽類或其它猿(例如SAV)來源的腺病毒。優(yōu)選地，動物來源的腺病毒是犬腺病毒，更優(yōu)選地是CAV2腺病毒[例如Manhattan或A26/61菌株(ATCC)800)]。優(yōu)選地，在本發(fā)明的范圍之內(nèi)使用人、犬或混合來源的腺病毒。
優(yōu)選地，本發(fā)明的缺陷腺病毒包括ITRs、衣殼化序列和興趣核酸。更優(yōu)選地，在本發(fā)明的腺病毒的基因組中，至少E1區(qū)是無功能的?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)使所說的病毒基因無功能，具體來說是通過全部除去、取代、部分缺失或向所說的基因添加一種或幾種堿基。這樣的修飾可在體外(在分離的DNA上)或原位完成，例如，使用遺傳操作技術(shù)或通過用誘變劑處理。其它區(qū)域也可以修飾，所述區(qū)特別是E3區(qū)(W095/02697)、E2區(qū)(WO94/28998)、E4區(qū)(WO94/28152、WO94/12649和WO95/02697)和L5區(qū)(WO95/02697)。按照優(yōu)選的實(shí)施方案，按照本發(fā)明的腺病毒在E1和E4區(qū)包含缺失。按照另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明包含E1區(qū)中的缺失，在該區(qū)中插入進(jìn)E4區(qū)和編碼GAX的序列(參見FR9413355)。在本發(fā)明的病毒中，E1區(qū)的缺失優(yōu)選地從Ad5腺病毒序列的核苷酸455延伸至3329。
按照本發(fā)明的缺陷重組腺病毒可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)制備(Leurero等，基因，101(1991)195，EP 185 573；Graham，EMBO雜志，3(1984)2917)。具體來說，它們可以通過腺病毒和質(zhì)粒之間的同源重組制備，在質(zhì)粒中還攜帶興趣的DNA序列。同源性重組在所說的腺病毒和質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)適當(dāng)?shù)募?xì)胞系之后完成。所使用的細(xì)胞系優(yōu)選地(i)可通過所說的元件轉(zhuǎn)化，(ii)包含能補(bǔ)充缺陷腺病毒的基因組一部分的序列，為了避免重組的風(fēng)險，優(yōu)選地是整合形式?？梢蕴峒暗募?xì)胞系的例子是人胚胎腎細(xì)胞系293(Graham等，遺傳病毒學(xué)雜志，36(1977)59)(該細(xì)胞系具體地說包含整合進(jìn)其基因組的Ad5腺病毒基因組的左邊部分(12％))或能補(bǔ)充如上所述的E1和E4功能的細(xì)胞系(特別是申請WO94/26914和WO95/02697所描述的)。
隨后，回收繁殖的腺病毒并使用如實(shí)施例中說明的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)純化。
腺伴隨病毒(AAV)是相對較小的DNA病毒，它以穩(wěn)定和位點(diǎn)特異性方式整合進(jìn)它們所感染的細(xì)胞的基因組。它們可感染許多細(xì)胞而不誘導(dǎo)對細(xì)胞生長、形態(tài)或分化的任何作用。而且，看來它們不涉及人病理狀態(tài)。克隆、測序AAV基因組并確定了其特征。它包含大約4700個堿基并在每個末端包含大約145個堿基的逆末端重復(fù)區(qū)(ITR)，作為病毒的復(fù)制起點(diǎn)?；蚪M的其余部分被劃分成兩個攜帶衣殼化功能的必須區(qū)域基因組的左邊部分(包含參與病毒復(fù)制和病毒基因表達(dá)的rep基因)和基因組的右邊部分(包含編碼病毒衣殼蛋白質(zhì)的帽子基因)。
源自AAVs的供在體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)移基因的載體在文獻(xiàn)中已有描述(參見，特別是WO91/18088；WO93/09239；US4,797,368，US5,139,941，EP488 528)。這些申請描述了各種源自AAV的構(gòu)建體(其中rep和/或cap基因缺失并被興趣基因取代)以及這些構(gòu)建體在體外(轉(zhuǎn)移進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞)或體內(nèi)(直接轉(zhuǎn)移進(jìn)有機(jī)體)轉(zhuǎn)移所說的興趣基因的用途。按照本發(fā)明的缺陷重組AAVs可通過把包含在兩個AAV逆端重復(fù)區(qū)(ITR)的側(cè)面的核酸序列的質(zhì)粒以及攜帶AAV衣殼化基因(rep和cap基因)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)移進(jìn)受人輔助病毒(例如腺病毒)感染的細(xì)胞系中來制備。然后通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化產(chǎn)生的AVV重組體。因此，本發(fā)明也涉及源自AAV的重組病毒，其基因組包括編碼在AAV ITRs側(cè)翼的GAX的序列。本發(fā)明也涉及包含編碼在AAV的兩個ITRs側(cè)翼的GAX序列的質(zhì)粒?？梢允褂眠@樣的質(zhì)粒，因?yàn)槠淇梢栽诤线m時用該質(zhì)粒把GPX序列摻入微脂粒載體(假病毒)中。
重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建在文獻(xiàn)中描述很多參見，特別是EP453242，EP178220，Bernstein等，遺傳工程，7(1985)235；McCormick，生物技術(shù)，3(1985)689等。具體地說，逆轉(zhuǎn)錄病毒是整合的病毒，它感染分裂的細(xì)胞。逆轉(zhuǎn)錄基因組主要包括兩個LTRs、一個衣殼化序列和三個編碼區(qū)(gag，pol和env)。在源自逆轉(zhuǎn)錄病毒的重組載體中，gag、pol和env基因通常是全部或部分缺失的，并以興趣基因的同源核酸序列取代。這些載體可以從不同類型的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建。所述病毒特別是說如，MoMuLV(“鼠莫洛尼氏白血病病毒”；也稱為MoMLV)、MSV(“鼠莫洛尼氏肉瘤病毒”)、HaSV(“Harvey肉瘤病毒”)；SNV(“脾壞死病毒”)；RSV(“勞氏肉瘤病毒”)或其它Friend病毒。
通常，為了構(gòu)建包含編碼按照本發(fā)明的GAX序列的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，特別地構(gòu)建了包含LTRs、衣殼化序列和所說的編碼序列的質(zhì)粒，然后用于轉(zhuǎn)染稱為衣殼化細(xì)胞系的細(xì)胞系，該細(xì)胞系可反過來(in trahs)提供在質(zhì)粒中缺乏的逆轉(zhuǎn)錄病毒功能。通常，衣殼化細(xì)胞系可表達(dá)gag、pol和env基因。這樣的衣殼化細(xì)胞系在現(xiàn)有技術(shù)中有描述，特別是細(xì)胞系PA317(US4,861,719)；psiCRIP細(xì)胞系(WO90/02806)和Gp+envAm-12細(xì)胞系(WO89/07150)。另外，重組體逆轉(zhuǎn)錄病毒可包含LTRs之內(nèi)的抑制轉(zhuǎn)錄活性的修飾以及包括gag基因的一部分的延伸的衣殼化序列(Bender等，病毒學(xué)雜志，61(1987)1639)。然后通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。
使用缺陷重組腺病毒治療再狹窄是特別有利的。這樣，腺病毒具有感染增殖的血管平滑肌細(xì)胞的高容量。這使得可以使用相對低量的活性因子(重組腺病毒)并導(dǎo)致對所要處理的位點(diǎn)的有效的和十分快速的作用。本發(fā)明的腺病毒也能以高水平表達(dá)導(dǎo)入的gax基因，因而給予其非常有效的治療作用。進(jìn)而，因?yàn)槠溆坞x基因性質(zhì)，本發(fā)明的腺病毒僅在增殖細(xì)胞中保持有限的時間，因此，它的作用時間很短，比較適于所需的治療作用。
本發(fā)明也涉及藥物組合物，該藥物組合物包含一種或多種如上所述的缺陷重組病毒。該組合物可以制成以局部、口服、腸胃、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、眼內(nèi)等路線施用為目的的制劑。
按照本發(fā)明的組合物優(yōu)選地包括藥物注射，特別是注射進(jìn)血管壁的制劑中的可接受的賦形劑。這些賦形劑具體來說可以是無菌的、等張鹽溶液(磷酸鈉或雙鈉，氯化鈉、鉀、鈣或鎂等，或這樣的鹽的混合物)的或干燥的(特別是凍干的)組合物，該組合物通過實(shí)際上添加無菌水或生理鹽水使可注射的溶液組成。賦形劑也可以是制備自任何生物協(xié)調(diào)的或非細(xì)胞毒性的(同源或異源)的聚合物的水凝膠。這樣的聚合物已有描述，例如在申請WO93/08845中有描述。其中某些(例如，特別是得自乙烯和/或丙烯氧化物的聚合物)是商業(yè)上可得到的。
在其治療與過度增殖性疾病有關(guān)的病理狀態(tài)的用途中，按照本發(fā)明的缺陷重組腺病毒可以不同的方法施用。特別是通過注射施用。在治療再狹窄時，本發(fā)明的腺腺病毒優(yōu)選地通過用以腺病毒飽和的親水膜(例如水凝膠)包被的血管成形術(shù)囊或通過包含用于腺病毒溶液的注入室的任何其它導(dǎo)管(這樣可以以精確的方式施用到治療的位點(diǎn)并使得腺病毒在治療的細(xì)胞的水平上局部和有效地釋放)直接施用于血管壁。這種施用的方法有利地使感染高百分比(達(dá)9.6％)的膜血管中層細(xì)胞成為可能，其中膜血管中層優(yōu)選地構(gòu)成治療再狹窄的靶，而標(biāo)準(zhǔn)的施用方法(例如靜脈內(nèi)注射)不能使這些細(xì)胞感染至任何非常明顯的程度。
本發(fā)明的治療方法有利地包括把包含以重組腺病毒飽和的水凝膠的組合物導(dǎo)入治療位點(diǎn)。水凝膠可以直接沉積在治療的組織的表面，例如在手術(shù)治療期間(特別是血管成型術(shù)期間)。水凝膠有利地通過導(dǎo)管(例如囊導(dǎo)管)導(dǎo)入治療位點(diǎn)。飽和的水凝膠以尤其有利的方式通過囊導(dǎo)管導(dǎo)入治療位點(diǎn)。
用于注射的病毒的劑量可按照不同的參數(shù)調(diào)整，具體地說是按照所使用的施用方式和治療所需的時期調(diào)整，通常，將按照本發(fā)明的重組病毒制成制劑并以104和1014pfu/ml之間的劑量施用。在AAVs和腺病毒的情況下，可以使用106至1010pfu/ml之間的劑量。術(shù)語pfu(“噬斑形成單位”)相應(yīng)于病毒懸浮液的感染力，通過感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)物并測定(通常在48小時之后)受感染的細(xì)胞的噬斑數(shù)測定。測定病毒溶液的pfu滴度技術(shù)在文獻(xiàn)中記載很多。
本發(fā)明提供了治療和預(yù)防與過度增殖性疾病(如再狹窄)有關(guān)的病理狀態(tài)的新的與十分有效的方法。
而且，這種治療方法可以如用于人一樣用于任何動物，如羊、牛、家養(yǎng)動物(狗、貓等)、馬、魚等。
使用下列實(shí)施例可以更充分地描述本發(fā)明，這些實(shí)施例應(yīng)被認(rèn)為是說明性的而非限制性的。
圖例

圖1質(zhì)粒pC01的描述。
圖2質(zhì)粒pXL-CMV-GaxHA的描述。
圖3在以pXL-CMV-GaxHA轉(zhuǎn)染的載體VSMCs中GAX-HA蛋白質(zhì)的核定位。
圖3A以載體pCGN轉(zhuǎn)染的VSMCs(無GAX插入)圖3B以載體pXL-CMV-GaxHA轉(zhuǎn)染的VSMCs。
圖4在以Ad-CMV-Gax處理的VSMCs中GAX-HA的核定位。
圖5Ad-CMV-Gax對VSMCs增殖的作用(t＝24小時)-VSMCs在以Ad-CMV-Gax(1000pfu/細(xì)胞)或以對照腺病毒(Ad-RSV-βGal，1000pfu/細(xì)胞)處理之后計數(shù)24小時。細(xì)胞生長被阻止(0.5％FCS)或刺激(FCS 20％)。
圖6Ad-CMV-Gax對VSMCs增殖的作用(t＝48小時)-VSMCs在以Ad-CMV-Gax(1000pfu/細(xì)胞)或以對照腺病毒(Ad-RSV-βGal，1000pfu/細(xì)胞)處理之后計數(shù)48小時。細(xì)胞生長被阻止(0.5％FCS)或刺激(FCS 20％)。
圖7Ad-CMV-Gax對在小牛血清(FCS 20％)存在下溫育的VSMCs的生存能力的作用。
-實(shí)驗(yàn)條件，參考圖6圖7A不以腺病毒處理的細(xì)胞圖7B以Ad-RSV-βGal處理的細(xì)胞圖7C以Ad-CMV-Gax處理的細(xì)胞圖8在以囊導(dǎo)管傷害后Ad-CMV-Gax和Ad-RSV-βGal對大鼠頸動脈的作用。
圖8A內(nèi)膜表面面積的測定圖8B內(nèi)膜和血管中層比的測定圖8C腔狹窄的測定圖9對照和處理的血管的橫切面圖9AAd-RSV-βGa處理的對照血管圖9BAd-CKV-Gax處理的血管。
常用的分子生物學(xué)技術(shù)在分子生物學(xué)中使用的標(biāo)準(zhǔn)方法，如質(zhì)粒DNA的制備抽取、質(zhì)粒DNA在氯化銫梯度中離心、在瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠上電泳、DNA片段通過電洗脫純化、蛋白質(zhì)用酚或酚/三氯甲烷抽取、DNA使用乙醇或異丙醇在鹽介質(zhì)中沉淀、轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌等對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的，并在文獻(xiàn)有充分描述[Maniatis T.等，“分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊”，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，N.Y.，1982；Ausubel F.M.等(eds)，“分子生物學(xué)通用方案”，John Wiley&Sons，紐約，1987]。
pBR322和pUC型質(zhì)粒和K13系列噬菌體從商業(yè)途徑購買Bethesda研究實(shí)驗(yàn)室)。
用于連接的DNA片段可按照其大小通過在瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠中電泳分離、用酚或酚/三氯甲烷抽取、用乙醇沉淀，然后按照制造廠商的建議在T4 DNA連接酶(Biolabs)的存在下溫育。
5突出端可使用大腸桿菌DNA聚合酶I(Biolabs)的克列諾片段按照制造廠商的說明填充。3端在T4 DNA聚合酶(Biolabs)(按照制造廠商的建議使用)的存在下破壞。5突出端通過小心地以S1核酸酶處理破壞。
可使用Amersham生產(chǎn)的試劑盒按照Taylof等開發(fā)的方法進(jìn)行使用合成寡核苷酸的體外定點(diǎn)誘變[核酸研究，13(1985)8749-8764)。
可使用DNA熱循環(huán)儀(Perkin Elmer Cetus)按照制造廠商的說明完成通過稱為PCR[聚合酶催化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，Saiki R.K.等，科學(xué)，230(1985)1350-1354；Mullis K.B.和Faloona F.A.，醫(yī)療酶學(xué)，155(1987)335-350]的技術(shù)的DNA片段的酶擴(kuò)增。
核苷酸序列可通過Sanger等[美國科學(xué)院學(xué)報，74，(1977)5463-5467]開發(fā)的方法使用Amersham生產(chǎn)的試劑盒確定。
實(shí)施例1攜帶在CMV啟動子控制下的編碼大鼠gax蛋白質(zhì)的基因的載體pXL-CMV-GaxHA的構(gòu)建本實(shí)施例描述了使重組發(fā)生的包含編碼gax蛋白質(zhì)(物種大鼠)的cDNA和腺病毒序列的載體的構(gòu)建。包含18個氨基酸的流感病毒血細(xì)胞凝集素的表位(表位HA1)被添加到gax蛋白質(zhì)的N-端末端(Field等，分子細(xì)胞生物學(xué)，82159-2165，1988)。以這種方法添加表位可使gax隨后表達(dá)，特別是通過使用針對HA1表位的抗體的免疫熒光技術(shù)。除了其靈敏性之外，這種方法同時使其在體外和體內(nèi)消除相應(yīng)于內(nèi)源gax蛋白質(zhì)表達(dá)的背景噪音成為可能。
1.1質(zhì)粒pC01的構(gòu)建A-質(zhì)粒pCE的構(gòu)建首先，在載體pIC19H的ECoR和Xba位點(diǎn)之間克隆相應(yīng)于Ad5腺病毒基因組左邊的EcoR1/XbaI片段。由此產(chǎn)生質(zhì)粒pCA。然后用HinfI切割質(zhì)粒pCA，使用大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段填充其5突出端；然后以EcoRI切割。然后把這樣產(chǎn)生的質(zhì)粒pCA片段(包含Ad5腺病毒基因組的左端)在載體pIC20H的EcoRI和SmaI位點(diǎn)之間克隆(Marsh等，基因32(1984)481)。由此產(chǎn)生質(zhì)粒pCB。然后質(zhì)粒pCB以EcoRI切割，使用大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段填充其5突出端；然后以BamHI切割。然后把這樣產(chǎn)生的質(zhì)粒pCB片段(包含Ad5腺病毒基因組的左端)在載體pIC20H的NruI和BglII位點(diǎn)之間克隆。由此產(chǎn)生質(zhì)粒pCE，它的優(yōu)點(diǎn)是其在多克隆位點(diǎn)之后具有Ad5腺病毒的前382個堿基對。
B-質(zhì)粒pCD的構(gòu)建首先把得自Ad5腺病毒基因組的Sau3A(3346)/SstI(3645)和SstI(3645)/NarI(5519)片段連接在一起，并在載體pIC20H的ClaI和BamHI位點(diǎn)之間克隆。由此產(chǎn)生質(zhì)粒pPY53。然后在載體pIC20H的SalI和ClaI位點(diǎn)之間克隆得自質(zhì)粒pPY53的SalI/TaqI片段(從dam-背景制備)(在Sau3A(3346)和TaqI(5207)位點(diǎn)之間包含Ad5腺病毒基因組的一部分)，由此產(chǎn)生質(zhì)粒pCA。然后把從dam-背景制備的Ad5腺病毒基因組的TaqI(5207)/NarI(5519)片段以及得自質(zhì)粒pCA的Sall-TaqI片段連接在一起，在載體pIC20H的SalI和NarI位點(diǎn)之間克隆。由此產(chǎn)生質(zhì)粒pCC。然后把從dam-背景制備的Ad5腺病毒基因組的NarI(5519)/NruI(6316)片段以及質(zhì)粒pCC的SalI/NarI片段連接在一起并在載體pIC20R的SalI和NruI位點(diǎn)之間克隆。由此產(chǎn)生質(zhì)粒pCD。
C-質(zhì)粒pC01的構(gòu)建用XhoI部分消化質(zhì)粒pCD，然后以SalI完全消化產(chǎn)生包含Ad5腺病毒序列的從Sau3A(3446)位點(diǎn)至NruI(6316)位點(diǎn)的限制片段。把該片段克隆進(jìn)質(zhì)粒pCE的SalI位點(diǎn)。這樣產(chǎn)生質(zhì)粒pC01(圖1)。它包含至HinfI(382)位點(diǎn)的Ad5腺病毒的左邊部分、多克隆位點(diǎn)和Ad5腺病毒的Sau3A(3446)/Nrul(6316)片段。
1.2.載體pXL-CMV-GAXHA的構(gòu)建(參見圖2)在載體pCGN的XbaI和BamHI位點(diǎn)之間克隆Gax cDNA(Tanaka和Herr，細(xì)胞60375-386，1990)。形成的載體pGCN-Gax包含巨細(xì)胞病毒(CMV)的早期啟動子和增強(qiáng)子序列(-522，+72；Boshart，細(xì)胞，41521-530，1985)、單純性皰疹病毒胸腺嘧啶核甙激酶的前導(dǎo)序列(包括AUG起始密碼子以及前三個氨基酸(+55，+104；Rusconi和Yamamoto，EMBO雜志，61309-1315，1987)、編碼HA1表位的序列[Y P Y D V P D Y A S L G G P(SEQID NO1)]、大鼠gax cDNA以及兔的β-珠蛋白基因的聚腺苷酸化序列(Pabo，細(xì)胞，35445-451，1983)。
然后用XmnI和Sfil切割載體pCGN-GaX，把形成的片段(包含啟動子、cDNA和聚腺苷酸化序列)首先用克列諾片段處理之后，導(dǎo)入包含重組所需腺病毒序列的穿梭載體pC01的EcoRV位點(diǎn)。獲得的質(zhì)粒定名為pXL-CMV-GaxHA(參見圖2)。
實(shí)施例2增殖抑制質(zhì)粒pXL-CMV-GaxHA性質(zhì)的證明本實(shí)施例描述了可以用來體外同時證明有關(guān)同源重組載體(參見實(shí)施例1)表達(dá)(gax蛋白質(zhì)和HA表位的檢測)以及活性(對細(xì)胞增殖的作用)的質(zhì)量的操作步驟。
使用Chamley等(細(xì)胞組織研究，177503-522 1977)改進(jìn)的方法通過酶促消化NZW兔主動脈培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)。簡言之，一旦取下兔主動詠，就在膠原酶(膠原酶II，Cooper Biomedical)存在下于37℃時溫育45分鐘。然后在膠原酶和彈性蛋白酶(Biosys)存在下進(jìn)行消化大約兩小時，由此產(chǎn)生細(xì)胞懸浮液。細(xì)胞在第十次繼代移植之前于20％小牛血清的存在下保持并用于所有的試驗(yàn)(見下)，平滑肌細(xì)胞的特征可通過抗αSM肌動蛋白抗體(F-3777，Sigma)免疫標(biāo)記。
為了檢驗(yàn)表達(dá)載體(參見實(shí)施例1)的質(zhì)量，通過免疫熒光檢測每個構(gòu)建體中g(shù)ax蛋白質(zhì)的存在和位置。為了進(jìn)行這個試驗(yàn)，用質(zhì)粒pXL-CMV-GaxHA和pCGNgax在DOSPA/DOPE混合物(Lipofectamine，Gibco BRL)存在下轉(zhuǎn)染平滑肌細(xì)胞或3T3細(xì)胞。在DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物存在下于無小牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞4至8小時(最優(yōu)時期SMCs為8小時)。在于小牛血清存在下培養(yǎng)24小時之后，為了進(jìn)行免疫熒光研究，將細(xì)胞在顯微鏡載玻片(Titertek)上再培養(yǎng)24小時。然后把細(xì)胞固定在4％多聚甲醛中，隨后通過添加0.1％Triton滲透。在于牛血清蛋白(BSA，Sigma)、抗HA抗體(12CA5，Boehringer Mannheim)存在下使細(xì)胞飽和之后，連續(xù)添加熒光素綴合的抗體。
同時在NIH3T3細(xì)胞和兔VSMCs的初始培養(yǎng)物上進(jìn)行的試驗(yàn)證明了質(zhì)粒pCGNgax和穿梭載體pXL-CMV-GaxHA確實(shí)編碼定位在核內(nèi)的蛋白質(zhì)(參見圖3A對照質(zhì)粒；3B質(zhì)粒pXL-CMV-GaxHA)。而且，在從以pXL-CMV-GaxHA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞提取核蛋白質(zhì)之后，我們可通過Western印跡證明用針對HA表位的抗體檢測到了蛋白質(zhì)。
然后確定了上述載體對細(xì)胞增殖的作用。為了確定此作用，使用了基于測定菌落形成的間接方法。簡言之，使用NIH3T3小鼠胚胎細(xì)胞進(jìn)行菌落形成試驗(yàn)，所用的方法從Schwelghoffer等(分子細(xì)胞生物學(xué)，1993，1339-43)改編。簡言之，用具有攜帶新霉素抗性基因的質(zhì)粒和具有過量的興趣載體(pCGNgax或pXL-CMV-GaxHA)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在G418中選擇一段時期后，菌落以酚品紅溶液染色(Diagnostica，Merck)。在表1中給出的代表性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明了在用pCGNgax轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的情況下菌落數(shù)目的減少。
表1
(§)pCGN對照載體無gax插入片段(*)p＜0.01
實(shí)施例3重組腺病毒Ad-CMVgax的構(gòu)建使在實(shí)施例1中制備的載體pXL-CMV-GaxHA隨后線性化并用缺陷腺病毒載體共轉(zhuǎn)染進(jìn)輔助細(xì)胞(細(xì)胞系293)(為了重組)，其反過來提供由腺病毒E1(E1A和E1B)區(qū)編碼的功能。
通過按照下列方案體內(nèi)同源重組腺病毒Ad.RSVβgal(StratfordPerricaud等，臨床研究雜志，90(1992)626)和載體pXL-CMV-GaxHA獲得腺病毒Ad-CMVgax為了使同源重組發(fā)生，用酶XmnI線形化的載體pXL-CMV-GaxHA和用ClaI線形化的腺病毒Ad.RSVβgal在磷酸鈣的存在下共轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞系293。通過噬斑純化選擇以這種方法產(chǎn)生的重組腺病毒。分離之后，在細(xì)胞系293上擴(kuò)增重組腺病毒，形成了包含具有大約1010pfu/ml滴度的非純化的重組缺陷腺病毒的培養(yǎng)物上清液。
通過按照已知的技術(shù)在氯化銫梯度上離心純化病毒顆粒(具體來說參見Graham等，病毒學(xué)，52(1973)456)。將腺病毒Ad-CMVgax在20％甘油中于-80℃保存。
實(shí)施例4增殖抑制質(zhì)粒pXL-CMV-GaxHA性質(zhì)的證明本實(shí)施例描述了可用來同時證明重組腺病毒在gax蛋白質(zhì)產(chǎn)生方面和生物活性方面(對細(xì)胞增殖的作用)的質(zhì)量的試驗(yàn)方法。
在腺病毒Ad-CMNgaxHA和在培養(yǎng)基(DMEM，0.5％FCS)上稀釋的對照腺病毒(Ad-RSVβGal在RSV啟動子控制下表達(dá)β-半乳糖苷酶的重組腺病毒)存在下溫育兔主動脈VSMCs。于37℃的潮濕大氣下大約1小時后，抽吸去包含腺病毒溶液的培養(yǎng)基并以培養(yǎng)基(DMEM，0.5％FCS)替代18至24小時。然后為了刺激細(xì)胞增殖添加富含F(xiàn)CS的培養(yǎng)基(FCS的最終濃度為20％)，細(xì)胞在24小時和48小時后計數(shù)。
另外，添加腺病毒溶液24小時之后，通過VSMCs表達(dá)的gax蛋白質(zhì)通過實(shí)施例2所述的技術(shù)(即通過免疫熒光核標(biāo)記(定位蛋白質(zhì)))或通過Western印跡監(jiān)測。通過識別HA表位的抗體以及和在pCGNgax或pXL-CMV-GaxHA轉(zhuǎn)染的VSMCs核中檢測到的gax蛋白質(zhì)具有相同的電泳遷移率可有效地檢測通過重組腺病毒產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。圖4說明了Gax蛋白質(zhì)在Ad-CMVgaxHa存在下的VSMCs中的位置。
如圖4所示的有代表性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明細(xì)胞數(shù)目在添加Ad-CMVgaxHA病毒之后顯著減少。另一方面，在使用相同濃度(M.O.I.1000)的對照腺病毒的處理中沒有觀察到這種細(xì)胞數(shù)目的減少。我們通過免疫熒光平行地證實(shí)這種高的多重感染可使β-gal標(biāo)志基因(使用抗大腸桿菌抗體，Monosan)或gax蛋白質(zhì)(使用抗HA抗體，參見實(shí)施例2)在大于90％的兔VSMC群體中表達(dá)。
Ad-RSV-βgal病毒的添加與在小牛血清(20％)存在下培養(yǎng)24小時后微弱的抑制細(xì)胞效應(yīng)(-13％)有關(guān)。在同樣的試驗(yàn)條件下，用Ad-CMVgaxHA處理導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目減少57％(參見圖5)。Ad-CMVgaxHa病毒的生物學(xué)活性在培養(yǎng)48小時之后十分明顯地加強(qiáng)，這可能也與細(xì)胞死亡有關(guān)。
這樣，由Ad-CMVgaxHA引起的增殖的阻止和細(xì)胞數(shù)目的顯著減少有關(guān)，其中細(xì)胞數(shù)目可在培養(yǎng)24小時之后檢測(參見圖5)。令人感興趣的是，Ad-CMVgaxHA的這種作用在用高濃度的FCS(20％)刺激的細(xì)胞中觀察到，但在無FCS(0.5％)的細(xì)胞中沒有觀察到(參見圖6)。因此，本實(shí)施例證明了編碼gax蛋白質(zhì)的重組腺病毒可有效地阻止細(xì)胞分裂，而對在細(xì)胞周期的G0階段被阻止的細(xì)胞的生存能力沒有任何明顯的作用。
Ad-CMVgaxHA對培養(yǎng)中的VSMCs的生存能力的作用也由圖7說明。
Ad-CMVgaxHA對DNA合成的抑制性質(zhì)通過溴脫氧尿苷(BrdU)-摻入試驗(yàn)證實(shí)。簡言之，在添加腺病毒24小時后，在FCS(10至20％)和BrdU(10μM)(它在DNA合成階段代替胸腺嘧啶摻入細(xì)胞并可以特異性抗體檢測)存在下培養(yǎng)VSMCs?？赏ㄟ^流式細(xì)胞光度術(shù)定量測定BrdU摻入。
可以使用相同的流式細(xì)胞光度術(shù)使Ad-CMVgaxHA-處理的兔VSMCs在其細(xì)胞周期中造成的發(fā)育可視化。用Ad-CMVgaxHA處理伴隨著在G0/G1期的細(xì)胞周期阻止。
實(shí)施例5使用腺病毒體內(nèi)抑制內(nèi)膜增生本實(shí)施例顯示了在血管病理學(xué)模型中重組腺病毒的功效。
所使用的動脈損傷模型依賴大鼠頸動脈的破損(Clows等，實(shí)驗(yàn)室研究，49(1983)327-333)。在這個模型中，VSMCs分化、增殖并遷移以形成在傷害兩周之內(nèi)部分封閉動脈的新內(nèi)膜。
通過腹膜內(nèi)注射戊巴比妥(45mg/kg)麻醉Sprague-Dawley大鼠。在外部頸動脈動脈切開術(shù)之后，用囊導(dǎo)管剝露大鼠頸動脈并使其和1.109pfu的Ad-CMVgaxHA或Ad-RSVβ-Gal接觸。腺病毒在包含15％泊咯沙姆407的溶液中使用，這有利于腺病毒基因的轉(zhuǎn)移。在二十分鐘溫育后，除去病毒溶液并除去繃帶以恢復(fù)循環(huán)。兩周后殺死大鼠，對處理血管的橫切面進(jìn)行定量的形態(tài)測定分析。結(jié)果在圖8和圖9中顯示。
獲得的結(jié)果表明所有九個Ad-RSVβ-Gal轉(zhuǎn)染的頸動脈有強(qiáng)烈的VSMC增殖并有相當(dāng)?shù)男聝?nèi)膜增厚。新內(nèi)膜的面積是0.186+/-0.02mm2(SEM)，其范圍為0.10至0.28。腔開放相應(yīng)地變窄40+/-4％(21至63)，圖8C。內(nèi)膜血管中層比是1.51+/-0.1(0.87至2.17)。這些結(jié)果和先前在鹽水中處理的對照血管相似。相對而言，Ad-CMVgaxHA處理顯著地減少了對囊傷害的病理狀態(tài)反應(yīng)。對于Ad-CMVgaxHA處理的血管，新內(nèi)膜損傷的平均區(qū)域是0.076+/-0.02mm2(0至0.19)，腔變窄減少至17.5+/-5％。統(tǒng)計分析確證Ad-CMVgaxHA處理與Ad-RSVβ-Gal對照相比顯著地抑制了內(nèi)膜增厚的發(fā)展。用Ad-CMVGaxHA處理特異性地使內(nèi)膜血管中層比降低了64％，內(nèi)膜區(qū)域降低了59％，腔變窄降低了56％(圖8A和8B)。對內(nèi)膜增生的顯著作用由對照(圖9A)或處理(圖9B)動物的橫切面獲得的結(jié)果進(jìn)一步說明。
本實(shí)施例證明了Ad-CMVgaxHA構(gòu)建體十分有效的體內(nèi)生長阻止活性，該活性是十分特異性的，在對照動物中沒有觀察到。呈現(xiàn)的結(jié)果清楚地表明了Ad-CMVgaxHA血管形態(tài)的治療活性，特別是治療與血管成形術(shù)后再狹窄有關(guān)的增生的活性。病毒(如腺病毒)體內(nèi)轉(zhuǎn)移Gax基因的使用尤其有效。該方法也是有利的，因?yàn)樗诨蛉〈椒?。該方法是?dú)特的，其中它結(jié)合了施用效率和治療基因，該基因顯示出兩種治療性質(zhì)生長阻止和在血管系統(tǒng)中的組成型表達(dá)。按照本發(fā)明的Gax基因轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)在血管中過度增殖性疾病的特異性消退并由此使血管功能正常化。本發(fā)明的局部Gax基因轉(zhuǎn)移也是特別有利的，其中它不干涉動脈損傷后的重新內(nèi)皮細(xì)胞化(re-endothelization)過程。而且，除了對細(xì)胞增殖和血管形態(tài)的直接影響外，按照本發(fā)明的gax基因轉(zhuǎn)移也可對胞外基質(zhì)合成和改型發(fā)揮間接的作用。這些結(jié)果清楚地顯示按照本發(fā)明的Gax基因轉(zhuǎn)移是治療血管成形術(shù)后血管損傷的有效的新方法。
序列表(1)一般信息(i)申請人姓名CASE WESTERN RESERVE UNIVERRSITY街道城市Cleveland州俄亥俄國家美國郵區(qū)代碼44106(i)申請人姓名BRANELLEC，Didier街道1，Rue Saint-Benoit城市94210 La Varenne-Saint Hilaire州國家法國郵區(qū)代碼(i)申請人姓名WALSH，Kenneth街道207 Judy Farm路城市Carlisle州馬薩諸塞國家美國郵區(qū)代碼01741(i)申請人姓名ISNER，Jeffrey M.
街道34 Brenton路城市Wescon
州馬薩諸塞國家美國郵區(qū)代碼02193(ii)發(fā)明名稱病毒載體及其在治療過度增殖性疾病(特別是再狹窄)上的用途(iii)序列數(shù)1(iv)通訊地址(A)地址Rhone-Poulenc Rorer公司(B)街道500 Areola路3C43(C)城市Collegeville(D)州PA(E)國家美國(F)郵區(qū)代碼19426(v)計算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentin Relesse#1.0，1.30版(vi)目前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朠CT(B)申請日(C)分類號(vii)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朏R 95-04234(B)申請日1995，3，31(viii)律師/代理人信息(A)姓名Savitzky，Martin F.
(B)登記號29，699(C)證書/檔案號ST95022-US(ix)電信信息
(A)電話(610)454-3816(B)傳真(610)454-3808(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度14個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部(xi)序列描述SEQ ID NO1Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Gly Cly Pro
權(quán)利要求書按照條約第19條的修改1.一種缺陷重組病毒，該病毒包含至少一種編碼全部或部分GAX蛋白質(zhì)或者這種蛋白質(zhì)的變體的插入基因。
2.按照權(quán)利要求1的病毒，其特征在于該病毒缺乏其在被感染細(xì)胞中復(fù)制所必需的基因組區(qū)。
3.按照權(quán)利要求1或2的病毒，其特征在于該病毒是腺病毒，優(yōu)選地是Ad5或Ad2型。
4.按照權(quán)利要求1或2的病毒，其特征在于該病毒是動物來源的，優(yōu)選地是犬來源的腺病毒。
5.按照權(quán)利要求1或2之一的病毒，其特征在于所述插入基因編碼大鼠全部或部分GAX蛋白質(zhì)或者這種蛋白質(zhì)的變體。
6.按照權(quán)利要求5的病毒，其特征在于所述插入基因編碼大鼠GAX蛋白質(zhì)或其人類同系物。
7.按照權(quán)利要求1或2之一的病毒，其特征在于所述插入基因是cDNA。
8.按照權(quán)利要求1或2之一的病毒，其特征在于所述插入基因是gDNA。
9.按照權(quán)利要求1或2之一的病毒，其特征在于所述插入基因包含能使其在被感染細(xì)胞中表達(dá)的序列。
10.按照權(quán)利要求1或2之一的病毒，其特征在于所述插入基因包含信號序列，這種信號序列指導(dǎo)合成多肽進(jìn)入靶細(xì)胞的分泌途徑。
11.按照權(quán)利要求3的腺病毒，其特征在于該腺病毒包含E1區(qū)的全部或部分缺失。
12.按照權(quán)利要求11的腺病毒，其特征在于該腺病毒還包含E4區(qū)的全部或部分缺失。
13.按照權(quán)利要求1或2的病毒，其特征在于該病毒是腺伴隨病毒(AAV)。
14.按照權(quán)利要求1或2的病毒，其特征在于該病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒。
15.按照權(quán)利要求1或2之一的病毒在制備藥物組合物上的用途，所述藥物組合物用于治療或預(yù)防與過度增殖性疾病有關(guān)的病理狀態(tài)。
16.按照權(quán)利要求15的用途，其是用于制備治療再狹窄的藥物組合物。
17.一種藥物組合物，該藥物組合物包含一種或多種按照權(quán)利要求1至2之一的缺陷重組病毒。
18.按照權(quán)利要求17的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物是可注射形式，并且其包含104至1014pfu腺病毒/ml。
19.按照權(quán)利要求18的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物包含在水凝膠中飽和的重組腺病毒。
權(quán)利要求
1.一種缺陷重組病毒，該病毒包含至少一種編碼全部或部分GAX蛋白質(zhì)或者這種蛋白質(zhì)的變體的插入基因。
2.按照權(quán)利要求1的病毒，其特征在于該病毒缺乏其在被感染細(xì)胞中復(fù)制所必需的基因組區(qū)。
3.按照權(quán)利要求1或2的病毒，其特征在于該病毒是腺病毒，優(yōu)選地是Ad5或Ad2型。
4.按照權(quán)利要求1或2的病毒，其特征在于該病毒是動物來源的，優(yōu)選地是犬來源的腺病毒。
5.按照權(quán)利要求1至4之一的病毒，其特征在于所述插入基因編碼大鼠全部或部分GAX蛋白質(zhì)或者這種蛋白質(zhì)的變體。
6.按照權(quán)利要求5的病毒，其特征在于所述插入基因編碼大鼠GAX蛋白質(zhì)或其人類同系物。
7.按照權(quán)利要求1至6之一的病毒，其特征在于所述插入基因是cDNA。
8.按照權(quán)利要求1至6之一的病毒，其特征在于所述插入基因是gDNA。
9.按照權(quán)利要求1至8之一的病毒，其特征在于所述插入基因包含能使其在被感染細(xì)胞中表達(dá)的序列。
10.按照權(quán)利要求1至9之一的病毒，其特征在于所述插入基因包含信號序列，這種信號序列指導(dǎo)合成多肽進(jìn)入靶細(xì)胞的分泌途徑。
11.按照權(quán)利要求3或4的腺病毒，其特征在于該腺病毒包含E1區(qū)的全部或部分缺失。
12.按照權(quán)利要求11的腺病毒，其特征在于該腺病毒還包含E4區(qū)的全部或部分缺失。
13.按照權(quán)利要求1或2的病毒，其特征在于該病毒是腺伴隨病毒(AAV)。
14.按照權(quán)利要求1或2的病毒，其特征在于該病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒。
15.按照權(quán)利要求1至14之一的病毒在制備藥物組合物上的用途，所述藥物組合物用于治療或預(yù)防與過度增殖性疾病有關(guān)的病理狀態(tài)。
16.按照權(quán)利要求15的用途，其是用于制備治療再狹窄的藥物組合物。
17.一種藥物組合物，該藥物組合物包含一種或多種按照權(quán)利要求1至14之一的缺陷重組病毒。
18.按照權(quán)利要求17的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物是可注射形式，并且其包含104至1014pfu腺病毒/ml。
19.按照權(quán)利要求18的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物包含在水凝膠中飽和的重組腺病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及缺陷重組病毒,該病毒包含至少一種編碼全部或部分GAX蛋白質(zhì)或者這種蛋白質(zhì)的變體的插入基因。本發(fā)明也涉及該重組病毒的用途,特別是在治療血管成型術(shù)后的再狹窄上的用途。
文檔編號C12N7/00GK1190402SQ96193929
公開日1998年8月12日 申請日期1996年3月28日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月31日
發(fā)明者D·布拉尼萊克, K·瓦爾施, J·M·伊斯納, P·狄耐夫爾 申請人:凱斯韋斯頓瑞瑟弗大學(xué)