專利名稱：人類免疫缺陷病毒活性抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及HIV(人類免疫缺陷病毒)活性的抑制劑，更特殊地涉及對HIV感染性疾病治療有效而幾乎不引起不良反應(yīng)的HIV活性抑制劑。
據(jù)報導(dǎo)，1950年在非洲發(fā)現(xiàn)世界上首例死于HIV感染的患者，HIV感染者迅即擴播到世界各地。最近報導(dǎo)，大量的人感染了HIV并已死亡。
HIV感染者的治療劑包括2′，3′二脫氧核苷胸腺嘧啶疊氮鈉(AZT)、2′3′二脫氧核苷次黃嘌呤(ddI)、2′3′二脫氧核苷胞嘧啶(ddC)、白細胞介素-2、GL0223、DHCA、γ-β-ser干擾素、α干擾素、γ干擾素等。
但是，這些治療劑存在不良反應(yīng)嚴重或療效差的問題，至今尚未發(fā)現(xiàn)有特異療效的HIV活性的抑制劑(即HIV活性抑制劑)。
因此，本發(fā)明者進行了認真的研究以尋求一種HIV活性抑制劑，它抑制HIV病毒活性，能消滅所述病毒，而且沒有不良反應(yīng)之慮。結(jié)果，本研究者發(fā)現(xiàn)用特殊方法制備的一種菌絲體提取物抑制HIV活性并限制所述病毒的增殖，從而完成了本發(fā)明。
日本專利公布No.23826/1985描述了制備一種保健飲料的方法，包括以下步驟將香菇(Lentinusedodes)真菌接種在包括蔗渣的固體培養(yǎng)基上，然后將含增殖的菌絲體的固體培養(yǎng)基分開(分割開)，使分割開的12吋篩孔的培養(yǎng)基不多于30%(重量)，在將固體培養(yǎng)基保持于30-50℃的條件下，向分割開的固體培養(yǎng)基中加入水和選自纖維素酶、蛋白酶和糖甙酶組成的一組中的至少一種酶，在酶的存在下將固體培養(yǎng)基磨碎和研碎，以便使12吋篩孔的蔗渣纖維量至少為70%(重量)，然后加熱至不高于95℃的溫度使酶失活并滅菌，將得到的懸浮液過濾。
而日本專利申請No.5355/1984和No.5356/1984(即分別為日本專利公布No.35149/1992和No.6171/1992)描述了用紫芝(Fomesjaponicus)真菌制備保健飲料的方法。
但是，在這些出版物中既未描述也未提示所獲得的保健飲料作為HIV活性抑制劑是有效的。
關(guān)于從香菇(日本食用蘑菇、香菇)中得到的生理活性物質(zhì)，有一些文獻報導(dǎo)。
“BIOTHERAPY”Vol.2，No.3，pp.509-521(June，1088)，TetsuoTaguchietal.闡述了從香菇中得到的香菇糖與HIV活療劑AZT合用抑制HIV的增殖。上述論文的合作者KureoChihara在“PharmaceuticalMagazine”Vol.108，No.3，pp.171-186(1988)報告了從香菇中得到的多糖類的主要物質(zhì)是β-1，6β-1，3-D-葡聚糖。
此外，“BIOCHEMICALANDBIOPHYSICALRESEARCHCOMMUNICATIONS”Vol.160，No.1，pp.367-373(1988)，HarumiSuzukietal.報道香菇菌絲體(LEM)的提取物具有抗HIV效應(yīng)，“Agri.Biol.Chem.”Vol.54，No.2，pp.479-487(1990)描述了所述提取物的主要物質(zhì)是LEM中含有的水溶性木素。
另外，本發(fā)明的HIV活性抑制劑在體外試驗中即使在不純的狀態(tài)下，125μg/ml的濃度就對HIV活性顯示足夠的抑制效應(yīng)，且不同于上述已報道的物質(zhì)。
本發(fā)明旨在解決與如上所述現(xiàn)有技術(shù)有關(guān)的這些問題。本發(fā)明的目的是提供一種HIV活性的抑制劑，它抑制HIV的病毒活性，能限制所述病毒的增殖，由于極少不良反應(yīng)之慮，因而安全性極好。
按本發(fā)明所述的HIV活性抑制劑包括用以下步驟獲得的香菇菌絲體提取物將香菇真菌接種在包括蔗渣的固體培養(yǎng)基上，然后將含增殖的菌絲體的固體培養(yǎng)基分割開，在將固體培養(yǎng)基保持于30-50℃的條件下，向分割開的固體培養(yǎng)基中加入水和選自纖維素酶、蛋白酶和糖甙酶組成的一組中的至少一種酶，在酶的存在下將固體培養(yǎng)基磨碎和研碎，得到香菇菌絲體提取物，然后將提取物加熱到不高于95℃的溫度使酶失活，并將提取物滅菌。
包含用上述方法得到的香菇菌絲體提取物的HIV活性抑制劑能抑制HIV的病毒活性，所述病毒的增殖，并且因極少不良反應(yīng)之慮而安全性極好。


圖1是本發(fā)明的HIV活性抑制劑抑制作用的圖示。
按本發(fā)明的HIV活性抑制劑將在下文進行詳述。
HIV活性抑制劑的制備按本發(fā)明所述的HIV活性抑制劑至少含一種香菇菌絲體的提取物。
為了制備香菇菌絲體提取物，將由蔗渣組成的固體培養(yǎng)基與水(最好是純水)適當混合，然后將香菇真菌接種到固體培養(yǎng)基中。如果需要，此蔗渣培養(yǎng)基可用稻糠、無機物(如磷、鐵、鍺)、花生殼和未碾過的米加以補充。
接著，將接種了香菇真菌的培養(yǎng)基放在調(diào)節(jié)好溫度、濕度和照明度的培養(yǎng)室中以繁殖菌絲體。
菌絲體在固體培養(yǎng)基上廣泛播散生長，形成蘑菇體。在蘑菇體體正要形成前或剛形成后，要求將蔗渣基質(zhì)分割開，以使12吋篩孔的蔗渣量不多于30%(重量)，即通過12號篩的分割后的蔗渣基質(zhì)不多于30%(重量)。如上所述，蔗渣基質(zhì)培養(yǎng)基的分割在蘑菇體正要形成前或剛形成后進行為好，但也可在蘑菇體長得相當程度后進行。
給這樣分割開的固體培養(yǎng)基補充水和選自由纖維素酶、蛋白酶和糖甙酶組成的一組中的至少一種酶，并將固體培養(yǎng)基保持在30-50℃下。在這些酶中，加纖維素酶更好。加入的酶量為每kg固體培養(yǎng)基在0.5-5g的范圍內(nèi)，較佳為1-3g。加入的水以不含離子(如金屬離子)的純水為較好。加入的純水量為每kg分割開的培養(yǎng)基1-10kg，最好為2-6kg，以得到含蔗渣的混合物。
然后，從含蔗渣的混合物中取得香菇菌絲體提取物。為了取出香菇菌絲體提取物，要求使固體培養(yǎng)基受到碾磨，采用例如變速齒輪泵循環(huán)含培養(yǎng)基的混合物時，使12吋篩孔的蔗渣纖維的量不少于70%(重量)(通過12號篩的碾碎和磨碎的固體培養(yǎng)基不少于70%(重量)。
含蔗渣混合物的碾磨可在保持所述混合物的溫度于30-50℃的情況下進行，也可將所述混合物的溫度緩慢地升至上述溫度以上而進行。碾磨在緩慢升溫下進行較好。當水溫變?yōu)椴坏陀?0℃(較好為不低于70℃)時，如果將室溫下的空氣引入含蔗渣的混合物，則氣泡突然受熱并破裂以致對蔗渣纖維產(chǎn)生碰撞，由此可高效率地進行有效成分的提取。
然后，將如此處理的含蔗渣混合物進一步加熱到不高于95℃的溫度，較好為約75-90℃，并在此同樣的溫度下保持幾十分鐘，使混合物中的酶失活并將所述混合物滅菌，從而獲得香菇菌絲體提取物。
如果需要，可將這樣獲得的香菇菌絲體提取物通過50-120吋篩孔(較好為60-100吋篩孔)的濾布進行過濾。
如上得到的香菇菌絲體提取物可以其濃縮物的形式使用，也可以冷凍干燥提取物所得粉劑的形式使用。
這樣的HIV活性抑制劑可以諸如顆粒劑、液體劑、片劑和膠囊等不同劑型口服給藥。也可開發(fā)所述抑制劑的注射液，它作用于HIV感染者。含上述菌絲體提取物的HIV活性抑制劑可不經(jīng)稀釋地施用于HIV感染者，但也可用諸如純水或乙醇適當稀釋后給藥。
如上所述，當將含香菇菌絲體提取物的本發(fā)明的HIV活性抑制劑施用于HIV感染者時，HIV活性顯著減弱，所述病毒的增殖可被抑制。此外，因HIV感染而被削弱的細胞可復(fù)活并可長期生存。
將含香菇菌絲體提取物的本發(fā)明的HIV活性抑制劑給HIV感染者投藥可削弱HIV活性，抑制所述病毒的增殖并液活受HIV感染的人體細胞(如上所述)的原因設(shè)想如下根據(jù)本發(fā)明者的研究，認為含香菇菌絲體提取物的HIV活性抑制劑含有從香菇菌絲體和從長有香菇菌絲體的固體培養(yǎng)基中提取的以混合形式存在的大量有效成分，這些有效成分(未鑒定)具有抗HIV活性。
從這一事實可以設(shè)想，單從香菇菌絲體中提取的有效成分對HIV幾乎不顯示抑制活性，單從固體培養(yǎng)基(蔗渣)中提取的有效成分也對HIV幾乎不顯示抑制活性。
按照本發(fā)明，提供了一種HIV活性抑制劑，它能抑制HIV的病毒活性或所述病毒的增殖，能促進受HIV感染的人體細胞的激活，并因極少有不良反應(yīng)之慮而安全性極佳。
下面用實施例對本發(fā)明作更詳細的描述，但應(yīng)當認為，本發(fā)明決不受這些實施例的限制。
制備例1包含香菇菌絲體提取物的HIV活性抑制劑的制備將純水適量加入由90重量份蔗渣和10重量份稻糠組成的固體培養(yǎng)基中。然后，將香菇真菌接種到固體培養(yǎng)基中。這樣處理過的固體培養(yǎng)基放在已調(diào)節(jié)好溫度和濕度的培養(yǎng)室中，以繁殖香菇菌絲體。在菌絲體增殖并播散生長在固體培養(yǎng)基中后，將蔗渣基質(zhì)的纖維素分割開，以使12吋篩孔的蔗渣纖維量為24%(重量)。向這樣分割開的1.0kg培養(yǎng)基中加入3.51純水和2.0g純化過的纖維素酶，固體培養(yǎng)基保持在40℃，得到含蔗渣的混合物。
接著，在借助變速齒輪泵使含混合物的培養(yǎng)基循環(huán)的同時，在泵的齒輪部分碾碎和磨碎混合物，共約200分鐘時間，使12吋篩孔的蔗渣纖維量為80%(重量)。含蔗渣的混合物的碾碎和磨碎在使混合物緩慢升溫下進行。
此后，將含蔗渣的混合物進一步加熱到90℃，使其在該溫度下靜置30分鐘。
通過加熱到90℃，完成了酶的失活和混合物的滅菌。
將這樣得到的含培養(yǎng)基的混合物通過60吋篩孔的濾布過濾，得到含精細懸浮物質(zhì)的香菇菌絲體提取物。
實驗例1-10對于如上所述制備例1中所得到的含香菇菌絲體提取物的HIV活性抑制劑，按“AntiviralResearch”Vol.20，pp.317-331，(1993)所描述的方法測定其抗HIV效應(yīng)。
詳細情況如下用人T細胞白血病病毒修飾人輔助T細胞，將得到的人T4淋巴細胞MT-4用作靶細胞。
在37℃下，用HIV(HIV-1型RF種族，2×103TCD50/ml)將MT-4細胞(105/ml)感染1小時。
然后，用新鮮的培養(yǎng)基洗滌經(jīng)HIV這樣感染的MT-4細胞(感染倍數(shù)(infection multiplicity)0.02)以除去未吸附的病毒。此后，將細胞數(shù)調(diào)整節(jié)到5×104細胞/ml，分別以100μl/的量分配到96孔微量板的每個孔中。
接著，在含HIV感染的MT-4細胞的微量板的每一個孔中加入100μl培養(yǎng)基，其中，濃度為終濃度兩倍的HIV活性抑制劑被溶入，于37℃下培養(yǎng)5-6天。
在培養(yǎng)的最后一天，向微量板的每個孔中加入MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物]，再繼續(xù)培養(yǎng)4小時。然后，通過測量595nm的吸光度對產(chǎn)生的甲 染料的密度進行比色測定。
結(jié)果列于表1。
在表1中，還列出了除將制備例1中得到的HIV活性抑制劑加到不用HIV感染的MT-4靶細胞中之外，以上述同樣方法產(chǎn)生的甲 染料的密度(吸光度)。
表1中所示的活性(存活力)指標(%)是按如下方法測定的。在100μl含靶細胞MT-4的培養(yǎng)基中加入100μl不含HIV活性抑制劑的培養(yǎng)基(HIV活性抑制劑的濃度＝0)，培養(yǎng)靶細胞MT-4。在靶細胞MT-4培養(yǎng)后，通過595nm處的比色測定顏色密度，在此情況下的吸光度定為100(實驗號1)。再用各種濃度的HIV活性抑制劑按上述同樣方法測量吸光度。這樣得到的每一吸光度與上述吸光度的比用百分數(shù)(%)表示，此值作為細胞活性(細胞存活力)的指標。例如，實驗例2中的吸光度為1.122，實驗例1中的吸光度為1.056，因此，實驗例2的細胞存活力(%)＝1.122/1.056≌106.3%。
圖1以圖示法表示表1中所列的結(jié)果。
從表1或圖1所列結(jié)果可以看出，當HIV活性抑制劑的濃度超過125μg/ml時，由于來自HIV活性抑制劑的影響，即使不用HIV感染細胞，MT-4細胞的存活力也降低。然而，由于HIV活性抑制劑的抗AIDS病毒效應(yīng)，在不高于上述濃度的濃度范圍內(nèi)，隨著HIV活性抑制劑濃度的增加，感染HIV的MT-4細胞的存活力提高。特別是，當HIV活性抑制劑的濃度為125μg/ml時，感染HIV的MT-4細胞的存活力是71.5%。
權(quán)利要求
1.一種HIV活性抑制劑，其特征在于包含用以下步驟獲得的香菇菌絲體提取物將香菇真菌接種在包括蔗渣的固體培養(yǎng)基上，然后將含增殖的菌絲體的固體培養(yǎng)基分割開，在將固體培養(yǎng)基保持于30-50℃的條件下，向分割開的固體培養(yǎng)基中加入水和選自纖維素酶、蛋白酶和糖甙酶組成的一組中的至少一種酶，在酶的存在下將固體培養(yǎng)基磨碎和研碎，得到香菇菌絲體提取物，然后將提取物加熱到不高于95℃的溫度使酶失活，并將提取物滅菌。
2.如權(quán)利要求1所述的HIV活性抑制劑，其中酶是纖維素酶。
3.如權(quán)利要求1所述的HIV活性抑制劑，其中固體培養(yǎng)基包含蔗渣和稻糠。
全文摘要
一種HIV活性抑制劑，包含用以下步驟獲得的香菇菌絲體提取物將香菇真菌接種在包括蔗渣的固體培養(yǎng)基上，然后將含增殖的菌絲體的固體培養(yǎng)基分割開，在將固體培養(yǎng)基保持于30—50℃的條件下，向分割開的固體培養(yǎng)基中加入水和選自纖維素酶、蛋白酶和糖甙酶組成的一組中的至少一種酶，在酶的存在下將固體培養(yǎng)基磨碎和研碎，得到香菇菌絲體提取物，然后將提取物加熱到不高于95℃的溫度使酶失活，并將提取物滅菌。該抑制劑抑制HIV活性，限制病毒增殖，極少不良反應(yīng)，安全性極好。
文檔編號C12P1/02GK1106695SQ9410301
公開日1995年8月16日 申請日期1994年3月15日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月17日
發(fā)明者長岡均 申請人:長岡均