脂肪酶的微生物發(fā)酵及提取分離方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種脂肪酶的微生物發(fā)酵及提取分離方法，涉及生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)產(chǎn)酶量少、產(chǎn)酶活性低、酶壽命短等缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了脂肪酶的高效發(fā)酵生產(chǎn)和提取分離，本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、成本低廉、易于放大，酶產(chǎn)量高、活性高、純度高、穩(wěn)定性好、壽命長(zhǎng)。本發(fā)明具有重要的應(yīng)用價(jià)值，可以用于油脂奶酪加工、面包烘焙、醫(yī)藥催化合成、飼料加工、合成生物柴油、污水處理、紡織脫脂等領(lǐng)域。
【專利說(shuō)明】脂肪酶的微生物發(fā)酵及提取分離方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種脂肪酶的微生物發(fā)酵及提取分離方法。

【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶(EC3.1.1.3，Lipase)，又稱甘油酯水解酶，是指分解或合成高級(jí)脂肪酸和丙三醇形成的甘油三酸酯酯鍵的酶。脂肪酶是一類特殊的酯鍵水解酶，只作用于異相系統(tǒng)，即只在油水界面上作用，而且只有當(dāng)?shù)孜镆晕⒘?、小聚合分散狀態(tài)或呈乳化顆粒時(shí)，月旨肪酶對(duì)底物水解才有顯著的催化作用。脂肪酶廣泛存在動(dòng)物、植物和微生物中而微生物脂肪酶種類最多，廣泛存在于細(xì)菌、酵母和霉菌中，最易獲得和大規(guī)模生產(chǎn)，且具有比動(dòng)植物脂肪酶更廣的pH、溫度適應(yīng)性，因此是工業(yè)用脂肪酶的重要來(lái)源。
[0003]脂肪酶的生產(chǎn)和使用成本是制約其工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。由于野生菌產(chǎn)脂肪酶的能力低，酶系復(fù)雜，較難分離純化，一般無(wú)法直接用于大規(guī)模生產(chǎn)。通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建合適的表達(dá)系統(tǒng)不僅能夠提高脂肪酶的表達(dá)量，而且可以簡(jiǎn)化后續(xù)蛋白質(zhì)的分離純化工藝，從而降低生產(chǎn)成本。另外，制備純化的立體選擇性酶對(duì)于立體選擇性反應(yīng)是非常重要的，能夠避免其他非立體選擇性酶的影響。巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)是近幾年發(fā)展起來(lái)的較為完善的、被廣泛用來(lái)表達(dá)外源蛋白的甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)。主要優(yōu)點(diǎn)有:(1)具有強(qiáng)有力的醇氧化酶(Alochol Oxidase,A0X1)基因啟動(dòng)子，可嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)；(2)作為真核表達(dá)系統(tǒng)，可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的加工與修飾，從而使表達(dá)出的蛋白具有生物活性；(3)營(yíng)養(yǎng)要求低、生長(zhǎng)快、培養(yǎng)基廉價(jià)，便于工業(yè)化生產(chǎn)；(4)可高密度發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵罐中細(xì)胞干重甚至可達(dá)120g/L以上；(5)表達(dá)量高，許多蛋白可達(dá)到g/L以上水平；(6)表達(dá)的蛋白既可存在于細(xì)胞內(nèi)，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于純化；(7)糖基化程度低，所分泌的糖蛋白的免疫原性較低，更利于臨床應(yīng)用。
[0004]長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)的脂肪酶市場(chǎng)都被國(guó)外公司所壟斷，且價(jià)格昂貴，因此開(kāi)發(fā)我國(guó)自主創(chuàng)新的脂肪酶及其制劑對(duì)于推動(dòng)我國(guó)科技進(jìn)步和實(shí)現(xiàn)國(guó)家繁榮富強(qiáng)具有重要的進(jìn)步意義。國(guó)內(nèi)關(guān)于脂肪酶的微生物發(fā)酵和提取技術(shù)尚不成熟，脂肪酶制劑在我國(guó)現(xiàn)有的酶制劑生產(chǎn)企業(yè)中還沒(méi)有一家成規(guī)模的生產(chǎn)企業(yè)，其產(chǎn)品還存在著催化活性低、穩(wěn)定性差、使用壽命短等問(wèn)題。因此，積極研究開(kāi)發(fā)脂肪酶及其制劑，有利于打破國(guó)外技術(shù)壟斷，實(shí)現(xiàn)脂肪酶向產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)變和帶動(dòng)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)我國(guó)的繁榮富強(qiáng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)我國(guó)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，本發(fā)明提供了一種脂肪酶的微生物發(fā)酵及提取分離方法，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種脂肪酶的微生物發(fā)酵及提取分離方法，其方法如下:
(I)發(fā)酵菌種以基因工程菌畢赤酵母GS115 /pPIC9K-proRCL作為發(fā)酵生產(chǎn)菌種；
(2)培養(yǎng)液
a、搖瓶培養(yǎng)液
酵母提取物 10 g/L，蛋白胨 20 g/L, K2HPO4 3g/L, H2PO4 IL 8g/L，加水 890mL/L，121°C滅菌20 min，然后待溫度降至60°C以下在超凈臺(tái)上加入10XYNB 100mL/L(13.4 g/L)，500 X 生物素 lmL/L(4Xl(T4 g/L)，甘油 10mL/L ；
b、發(fā)酵培養(yǎng)液
85% H3PO4 26.7mL/L, CaSO4.2H20 0.93g /L, K2S04 18.2g /L, MgSO4.2H20 14.9g/L,KOH 4.13 g/L，甘油40g/L, PTM1 4.0mL/L (其中甘油、PTM1待實(shí)消結(jié)束后再加入)；
c、PTM1
CuSO4.5H20 6.0g/L, KI 0.088g/L, MnSO4.H2O 3.0g/L, Na2MoO4.2H20 0.2g/L, H3BO30.02g/L, CoCl2.6H20 0.5g/L, ZnCl2 20.0g/L, FeSO4.7H20 65.0g/L，生物素 0.2 g/L，濃H2SO4 5 mL/L ；
d、補(bǔ)料培養(yǎng)液
50% 甘油(W/V，含 12mL/L PTM1)補(bǔ)料液；
e、BMMY培養(yǎng)液
酵母提取物 10 g/L，蛋白胨 20 g/L,K2HPO4 3g/L,KH2PO4 IL 8g/L，加水 895mL/L，121°C滅菌20 min，然后待溫度降至60°C以下在超凈臺(tái)上加入100XYNB 100mL/L(13.4 g/L)，500 X 生物素 lmL/L (4X10-4 g/L)，甲醇 5m/L ；
f、甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)液
100% 甲醇(含 12mL/L PTM1)；
(3)菌種發(fā)酵生產(chǎn)
a、挑選一單菌落，置于裝有25ml搖瓶培養(yǎng)液的250ml搖瓶中，于28_30°C/250-300 rpm培養(yǎng) 16-18 h ；
b、配制發(fā)酵培養(yǎng)液(甘油、PTM1暫不加入)并加入發(fā)酵罐內(nèi)，標(biāo)定pH電極與DO電極并插入罐體，密封發(fā)酵罐，接通蒸汽，對(duì)發(fā)酵罐的空氣系統(tǒng)及罐體實(shí)施滅菌，待罐壓升至
0.12MPa，溫度121°C時(shí)，保壓、保溫滅菌20min，待實(shí)消結(jié)束，接通冷凍循環(huán)水將溫度冷卻至28-30 0C ；
C、在接種口周圍放一圈酒精棉球，點(diǎn)燃，在無(wú)菌條件下打開(kāi)接種口，將搖瓶培養(yǎng)液按5-10%接種量迅速接種于發(fā)酵罐內(nèi)，并補(bǔ)加已經(jīng)過(guò)濾除菌的甘油AOgA^PTM1 4.0mL/L，設(shè)定好溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量等參數(shù)，進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵20 h左右，發(fā)酵培養(yǎng)液中的甘油被消耗殆盡，此時(shí)DO迅速上升到100%，開(kāi)始流加補(bǔ)料培養(yǎng)液，補(bǔ)料培養(yǎng)液的流加時(shí)間為6-24 h，在發(fā)酵過(guò)程中，保持罐內(nèi)溫度28-30°C，罐內(nèi)溶氧D0>20%，罐內(nèi)pH值5_7，通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)控制溶氧的高低，自動(dòng)流加質(zhì)量濃度25%的無(wú)菌氨水來(lái)控制發(fā)酵培養(yǎng)液的pH值大小;
d、待補(bǔ)料培養(yǎng)液流加結(jié)束，停止補(bǔ)料，維持細(xì)胞饑餓0.5-1 h，然后流加BMMY培養(yǎng)液
0.5-1 h讓酵母菌適應(yīng)甲醇環(huán)境，當(dāng)DO再次上升到100%時(shí)開(kāi)始流加甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)液，控制體系中甲醇的質(zhì)量濃度在O-1h內(nèi)為1.0-2.0%,在2-4h內(nèi)為3.0-5.0%,在4_8h內(nèi)為
2.0-3.0%，在8h后為0.5-1.0%，在誘導(dǎo)期間，溫度控制在20-28°C，pH值控制在5.5-6.5，溶氧 D0>20% ；
e、甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)36-72h后，開(kāi)始放罐，將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至冷凍離心機(jī)中于4°C /1500_3000g離心5-10min,收集離心上清液；
(4)脂肪酶提取分離
a、硫酸銨沉淀
將硫酸銨粉末邊攪拌邊加入到離心上清液中，使硫酸銨終濃度為2%，放于4°C冰箱靜置0.5-1 h，然后于4°C /3000-5000g離心5-10min，收集離心上清液，以同樣的方式再次將硫酸銨粉末加入到離心上清液中，使硫酸銨終濃度為60%，放于4°C冰箱靜置0.5-1 h，然后于4°C /3000-5000g離心5-10min，收集離心沉淀，將離心沉淀用中性磷酸鹽緩沖液溶解，得到粗酶液；
b、凝膠過(guò)濾層析
用分離分子量在16-200KD范圍附近的凝膠顆粒填充層析柱，以中性磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，將得到的粗酶液上樣到層析柱上，以中性磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，收集活性峰所對(duì)應(yīng)的洗脫液，將所得的洗脫液進(jìn)行超濾濃縮，得到凝膠過(guò)濾粗酶液；
C、離子交換層析
用陰離子交換樹(shù)脂填充離子交換柱，以中性磷酸鹽緩沖液平衡離子交換柱，將凝膠過(guò)濾粗酶液上樣到離子交換柱上，以去離子水沖洗離子交換柱，再以中性磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，收集活性峰所對(duì)應(yīng)的洗脫液，將所得的洗脫液進(jìn)行超濾濃縮，得到離子交換粗酶液；
d、親和層析
用Sephar0Se4B填充親和層析柱，將脂肪酶抑制劑作為配體通過(guò)共價(jià)鍵偶聯(lián)到Sepharose4B上，以中性磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，將離子交換粗酶液上樣到層析柱上，以去離子水沖洗層析柱，再以0.1M PH3-5檸檬酸緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，將所得的洗脫液立即用弱堿性磷酸鹽緩沖液中和至中性，進(jìn)行超濾濃縮并除鹽，得到純酶液；
e、聚乙二醇沉淀
在得到的純酶液中加入聚乙二醇，使脂肪酶沉淀下來(lái)，然后于4°C /3000-5000g離心5-10min，收集離心沉淀，將離心沉淀放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥，得到脂肪酶凍干粉。
[0006]本發(fā)明的有益效果:
1、本發(fā)明克服了傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)產(chǎn)酶量少、產(chǎn)酶活性低、酶壽命短等缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了脂肪酶的高效發(fā)酵生產(chǎn)和提取分離，本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、成本低廉、易于放大，酶產(chǎn)量高、活性高、純度高、穩(wěn)定性好、壽命長(zhǎng)。
[0007]2、本發(fā)明具有重要的應(yīng)用價(jià)值，可以用于油脂奶酪加工、面包烘焙、醫(yī)藥催化合成、飼料加工、合成生物柴油、污水處理、紡織脫脂等領(lǐng)域。

【具體實(shí)施方式】
[0008]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，凡是其他在不脫離本發(fā)明核心的情況下做出的簡(jiǎn)單的變形或修改均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0009]實(shí)施例:
(O發(fā)酵菌種
以基因工程菌畢赤酵母GS115 /pPIC9K-proRCL作為發(fā)酵生產(chǎn)菌種； (2)培養(yǎng)液
a、搖瓶培養(yǎng)液
酵母提取物 10 g/L，蛋白胨 20 g/L, K2HPO4 3g/L，H2PO4 IL 8g/L，加水 890mL/L，121°C滅菌20 min，然后待溫度降至60°C以下在超凈臺(tái)上加入10XYNB 100mL/L(13.4 g/L)，500 X 生物素 lmL/L(4Xl(T4 g/L)，甘油 10mL/L ；
b、發(fā)酵培養(yǎng)液
85% H3PO4 26.7mL/L, CaSO4.2H20 0.93g /L, K2S04 18.2g /L, MgSO4.2H20 14.9g/L,KOH 4.13 g/L，甘油40g/L, PTM1 4.0mL/L (其中甘油、PTM1待實(shí)消結(jié)束后再加入)；
c、PTM1
CuSO4.5H20 6.0g/L, KI 0.088g/L, MnSO4.H2O 3.0g/L, Na2MoO4.2H20 0.2g/L, H3BO30.02g/L, CoCl2.6H20 0.5g/L, ZnCl2 20.0g/L, FeSO4.7H20 65.0g/L，生物素 0.2 g/L，濃H2SO4 5 mL/L ；
d、補(bǔ)料培養(yǎng)液
50% 甘油(W/V，含 12mL/L PTM1)補(bǔ)料液；
e、BMMY培養(yǎng)液
酵母提取物 10 g/L，蛋白胨 20 g/L,K2HPO4 3g/L,KH2PO4 IL 8g/L，加水 895mL/L，121°C滅菌20 min，然后待溫度降至60°C以下在超凈臺(tái)上加入100XYNB 100mL/L(13.4 g/L)，500 X 生物素 lmL/L (4X10-4 g/L)，甲醇 5m/L ；
f、甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)液
100% 甲醇(含 12mL/L PTM1)；
(3)菌種發(fā)酵生產(chǎn)
a、挑選一單菌落，置于裝有25ml搖瓶培養(yǎng)液的250ml搖瓶中，于28°C/280rpm培養(yǎng)18
h ；
b、配制發(fā)酵培養(yǎng)液(甘油、PTM1暫不加入)并加入發(fā)酵罐內(nèi)，標(biāo)定pH電極與DO電極并插入罐體，密封發(fā)酵罐，接通蒸汽，對(duì)發(fā)酵罐的空氣系統(tǒng)及罐體實(shí)施滅菌，待罐壓升至
0.12MPa，溫度121°C時(shí)，保壓、保溫滅菌20min，待實(shí)消結(jié)束，接通冷凍循環(huán)水將溫度冷卻至30 0C ；
C、在接種口周圍放一圈酒精棉球，點(diǎn)燃，在無(wú)菌條件下打開(kāi)接種口，將搖瓶培養(yǎng)液按10%接種量迅速接種于發(fā)酵罐內(nèi)，并補(bǔ)加已經(jīng)過(guò)濾除菌的甘油AOgA^PTM1 4.0mL/L，設(shè)定好溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量等參數(shù)，進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵20 h左右，發(fā)酵培養(yǎng)液中的甘油被消耗殆盡，此時(shí)DO迅速上升到100%，開(kāi)始流加補(bǔ)料培養(yǎng)液，補(bǔ)料培養(yǎng)液的流加時(shí)間為12 h，在發(fā)酵過(guò)程中，保持罐內(nèi)溫度28°C，罐內(nèi)溶氧D0>20%，罐內(nèi)pH值5，通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)控制溶氧的高低，自動(dòng)流加質(zhì)量濃度25%的無(wú)菌氨水來(lái)控制發(fā)酵培養(yǎng)液的pH值大??；
d、待補(bǔ)料培養(yǎng)液流加結(jié)束，停止補(bǔ)料，維持細(xì)胞饑餓0.5h，然后流加BMMY培養(yǎng)液0.5h讓酵母菌適應(yīng)甲醇環(huán)境，當(dāng)DO再次上升到100%時(shí)開(kāi)始流加甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)液，控制體系中甲醇的質(zhì)量濃度在O-1h內(nèi)為1.0%,在2-4h內(nèi)為4.0%,在4_8h內(nèi)為2.5%,在8h后為0.6%,在誘導(dǎo)期間，溫度控制在25°C，pH值控制在6，溶氧D0>20% ；
e、甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)60h后，開(kāi)始放罐，將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至冷凍離心機(jī)中于4°C/3000g離心5min,收集離心上清液； (4)脂肪酶提取分離
a、硫酸銨沉淀
將硫酸銨粉末邊攪拌邊加入到離心上清液中，使硫酸銨終濃度為2%，放于4°C冰箱靜置I h，然后于4°C /5000g離心5min，收集離心上清液，以同樣的方式再次將硫酸銨粉末加入到離心上清液中，使硫酸銨終濃度為60%，放于4°C冰箱靜置I h，然后于4°C /5000g離心5min,收集離心沉淀，將離心沉淀用中性磷酸鹽緩沖液溶解，得到粗酶液；
b、凝膠過(guò)濾層析
用分離分子量在16-200KD范圍附近的凝膠顆粒填充層析柱，以中性磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，將得到的粗酶液上樣到層析柱上，以中性磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，收集活性峰所對(duì)應(yīng)的洗脫液，將所得的洗脫液進(jìn)行超濾濃縮，得到凝膠過(guò)濾粗酶液；
C、離子交換層析
用陰離子交換樹(shù)脂填充離子交換柱，以中性磷酸鹽緩沖液平衡離子交換柱，將凝膠過(guò)濾粗酶液上樣到離子交換柱上，以去離子水沖洗離子交換柱，再以中性磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，收集活性峰所對(duì)應(yīng)的洗脫液，將所得的洗脫液進(jìn)行超濾濃縮，得到離子交換粗酶液；
d、親和層析
用Sephar0Se4B填充親和層析柱，將脂肪酶抑制劑作為配體通過(guò)共價(jià)鍵偶聯(lián)到Sepharose4B上，以中性磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，將離子交換粗酶液上樣到層析柱上，以去離子水沖洗層析柱，再以0.1M pH4.5檸檬酸緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，將所得的洗脫液立即用弱堿性磷酸鹽緩沖液中和至中性，進(jìn)行超濾濃縮并除鹽，得到純酶液；
e、聚乙二醇沉淀
在得到的純酶液中加入聚乙二醇，使脂肪酶沉淀下來(lái)，然后于4°C/5000g離心5min，收集離心沉淀，將離心沉淀放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥，得到脂肪酶凍干粉。
【權(quán)利要求】
1.一種脂肪酶的微生物發(fā)酵及提取分離方法，其特征在于，其方法如下: .(O發(fā)酵菌種 以基因工程菌畢赤酵母GS115 /pPIC9K-proRCL作為發(fā)酵生產(chǎn)菌種； .(2)培養(yǎng)液 a、搖瓶培養(yǎng)液 酵母提取物 10 g/L，蛋白胨 20 g/L, K2HPO4 3g/L, H2PO4 IL 8g/L，加水 890mL/L，121°C滅菌20 min，然后待溫度降至60°C以下在超凈臺(tái)上加入10XYNB 100mL/L(13.4 g/L)，500 X 生物素 lmL/L(4Xl(T4 g/L)，甘油 10mL/L ； b、發(fā)酵培養(yǎng)液85% H3PO4 26.7mL/L, CaSO4.2H20 0.93g /L, K2S04 18.2g /L, MgSO4.2H20 14.9g/L,KOH 4.13 g/L，甘油40g/L, PTM1 4.0mL/L (其中甘油、PTM1待實(shí)消結(jié)束后再加入)；
c、PTM1
CuSO4.5H20 6.0g/L, KI 0.088g/L, MnSO4.H2O 3.0g/L, Na2MoO4.2H20 0.2g/L, H3BO30.02g/L, CoCl2.6H20 0.5g/L, ZnCl2 20.0g/L, FeSO4.7H20 65.0g/L，生物素 0.2 g/L，濃H2SO4 5 mL/L ； d、補(bǔ)料培養(yǎng)液50% 甘油(W/V，含 12mL/L PTM1)補(bǔ)料液； e、BMMY培養(yǎng)液 酵母提取物 10 g/L，蛋白胨 20 g/L,K2HPO4 3g/L,KH2PO4 IL 8g/L，加水 895mL/L，121°C滅菌20 min，然后待溫度降至60°C以下在超凈臺(tái)上加入100XYNB 100mL/L(13.4 g/L)，500 X 生物素 lmL/L (4X10-4 g/L)，甲醇 5m/L ； f、甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)液100% 甲醇(含 12mL/L PTM1)； .(3)菌種發(fā)酵生產(chǎn) a、挑選一單菌落，置于裝有25ml搖瓶培養(yǎng)液的250ml搖瓶中，于28_30°C/250-300 rpm培養(yǎng) 16-18 h ； b、配制發(fā)酵培養(yǎng)液(甘油、PTM1暫不加入)并加入發(fā)酵罐內(nèi)，標(biāo)定pH電極與DO電極并插入罐體，密封發(fā)酵罐，接通蒸汽，對(duì)發(fā)酵罐的空氣系統(tǒng)及罐體實(shí)施滅菌，待罐壓升至0.12MPa，溫度121°C時(shí)，保壓、保溫滅菌20min，待實(shí)消結(jié)束，接通冷凍循環(huán)水將溫度冷卻至28-30 0C ； C、在接種口周圍放一圈酒精棉球，點(diǎn)燃，在無(wú)菌條件下打開(kāi)接種口，將搖瓶培養(yǎng)液按5-10%接種量迅速接種于發(fā)酵罐內(nèi)，并補(bǔ)加已經(jīng)過(guò)濾除菌的甘油AOgA^PTM1 4.0mL/L，設(shè)定好溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量等參數(shù)，進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵20 h左右，發(fā)酵培養(yǎng)液中的甘油被消耗殆盡，此時(shí)DO迅速上升到100%，開(kāi)始流加補(bǔ)料培養(yǎng)液，補(bǔ)料培養(yǎng)液的流加時(shí)間為6-24 h，在發(fā)酵過(guò)程中，保持罐內(nèi)溫度28-30°C，罐內(nèi)溶氧D0>20%，罐內(nèi)pH值5_7，通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)控制溶氧的高低，自動(dòng)流加質(zhì)量濃度25%的無(wú)菌氨水來(lái)控制發(fā)酵培養(yǎng)液的pH值大小; d、待補(bǔ)料培養(yǎng)液流加結(jié)束，停止補(bǔ)料，維持細(xì)胞饑餓0.5-1 h，然后流加BMMY培養(yǎng)液0.5-1 h讓酵母菌適應(yīng)甲醇環(huán)境，當(dāng)DO再次上升到100%時(shí)開(kāi)始流加甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)液，控制體系中甲醇的質(zhì)量濃度在O-1h內(nèi)為1.0-2.0%,在2-4h內(nèi)為3.0-5.0%,在4_8h內(nèi)為2.0-3.0%，在8h后為0.5-1.0%，在誘導(dǎo)期間，溫度控制在20-28°C，pH值控制在5.5-6.5，溶氧 D0>20% ； e、甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)36-72h后，開(kāi)始放罐，將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至冷凍離心機(jī)中于4°C /1500-3000g離心5-10min,收集離心上清液； .(4)脂肪酶提取分離 a、硫酸銨沉淀 將硫酸銨粉末邊攪拌邊加入到離心上清液中，使硫酸銨終濃度為2%，放于4°C冰箱靜置0.5-1 h，然后于4°C /3000-5000g離心5-10min，收集離心上清液，以同樣的方式再次將硫酸銨粉末加入到離心上清液中，使硫酸銨終濃度為60%，放于4°C冰箱靜置0.5-1 h，然后于4°C /3000-5000g離心5-10min，收集離心沉淀，將離心沉淀用中性磷酸鹽緩沖液溶解，得到粗酶液； b、凝膠過(guò)濾層析 用分離分子量在16-200KD范圍附近的凝膠顆粒填充層析柱，以中性磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，將得到的粗酶液上樣到層析柱上，以中性磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，收集活性峰所對(duì)應(yīng)的洗脫液，將所得的洗脫液進(jìn)行超濾濃縮，得到凝膠過(guò)濾粗酶液； C、離子交換層析 用陰離子交換樹(shù)脂填充離子交換柱，以中性磷酸鹽緩沖液平衡離子交換柱，將凝膠過(guò)濾粗酶液上樣到離子交換柱上，以去離子水沖洗離子交換柱，再以中性磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，收集活性峰所對(duì)應(yīng)的洗脫液，將所得的洗脫液進(jìn)行超濾濃縮，得到離子交換粗酶液； d、親和層析 用Sephar0Se4B填充親和層析柱，將脂肪酶抑制劑作為配體通過(guò)共價(jià)鍵偶聯(lián)到Sepharose4B上，以中性磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，將離子交換粗酶液上樣到層析柱上，以去離子水沖洗層析柱，再以0.1M PH3-5檸檬酸緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，將所得的洗脫液立即用弱堿性磷酸鹽緩沖液中和至中性，進(jìn)行超濾濃縮并除鹽，得到純酶液； e、聚乙二醇沉淀 在得到的純酶液中加入聚乙二醇，使脂肪酶沉淀下來(lái)，然后于4°C /3000-5000g離心5-10min，收集離心沉淀，將離心沉淀放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥，得到脂肪酶凍干粉。
【文檔編號(hào)】C12R1/84GK104388404SQ201410644517
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】王幼鵬 申請(qǐng)人:安徽華億農(nóng)牧科技發(fā)展有限公司