一種用于抑制目的基因表達(dá)的RNAi中間載體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于抑制目的基因表達(dá)的RNAi中間載體及其制備方法，該RNAi中間載體以表達(dá)載體PBI121為骨架，在骨架上克隆入擬南芥肌動(dòng)蛋白10用來形成干擾載體頸環(huán)結(jié)構(gòu)中的環(huán)狀部分；同時(shí)，在擬南芥肌動(dòng)蛋白10一端分別引入了XhoI、NcoI、PstI酶切位點(diǎn)，另一端引入SacI、ClaI酶切位點(diǎn)。本發(fā)明以表達(dá)載體PBI121為骨架，通過引入擬南芥肌動(dòng)蛋白10和五個(gè)酶切位點(diǎn)構(gòu)建成具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)的新載體，該載體為構(gòu)建RNAi載體的中間載體，可用于基因沉默。同時(shí)，對(duì)中間載體進(jìn)行了PCR鑒定，為此載體在RNAi干擾載體構(gòu)建中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，該制備方法，能夠簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率，降低實(shí)驗(yàn)成本。
【專利說明】—種用于抑制目的基因表達(dá)的RNAi中間載體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于抑制目的基因表達(dá)的RNAi中間載體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]RNAiCRNA干擾)技術(shù)屬于基因沉默領(lǐng)域，能夠使目的基因表達(dá)效率降低甚至消除。實(shí)驗(yàn)過程中，如果驗(yàn)證某一基因功能，需要對(duì)目的基因進(jìn)行沉默，以期觀察生物的表型性狀是否有變化，進(jìn)一步確定基因功能。傳統(tǒng)RNAi干擾載體構(gòu)建過程繁瑣、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，因此還不能滿足使用需求。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]發(fā)明目的:針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種用于抑制目的基因表達(dá)的RNAi中間載體，可用于基因沉默。本發(fā)明的另一目中上述用于抑制目的基因表達(dá)的RNAi中間載體的制備方法，可以加快構(gòu)建的速度、提高效率，省時(shí)、省力。
[0004]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種用于抑制目的基因表達(dá)的RNAi中間載體，以表達(dá)載體PBI121為骨架，在骨架上克隆入擬南芥肌動(dòng)蛋白10用來形成干擾載體頸環(huán)結(jié)構(gòu)中的環(huán)狀部分；同時(shí)，在擬南芥肌動(dòng)蛋白10 一端分別引入了 Xho1、NcoI ,PstI酶切位點(diǎn)，另一端引入Sac1、ClaI酶切位點(diǎn)。
[0005]所述的中間載體含有CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子和卡納霉素抗性基因。
[0006]所述的中間載體含有⑶S報(bào)告基因,且⑶S報(bào)告基因與目的干擾序列共融合表達(dá)。
[0007]在擬南芥肌動(dòng)蛋白10左端依次引入了 Xho1、Nco1、PstI酶切位點(diǎn)，右端依次引入Sac1、ClaI酶切位點(diǎn)。
[0008]所述的用于抑制目的基因表達(dá)的RNAi中間載體的構(gòu)建方法，其特征在于:先在表達(dá)載體 PBI121 為骨架上添加 HindII1、BamH1、Sail、Spe1、Pst1、Nco1、XhoI 酶切位點(diǎn)，然后在骨架上克隆入擬南芥肌動(dòng)蛋白10。
[0009]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明以表達(dá)載體PBI121為骨架，通過引入擬南芥肌動(dòng)蛋白10和五個(gè)酶切位點(diǎn)構(gòu)建成具有獨(dú)立結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)的新載體，該載體為構(gòu)建RNAi載體的中間載體，可用于基因沉默。同時(shí)，對(duì)中間載體進(jìn)行了 PCR鑒定，為此載體在RNAi干擾載體構(gòu)建中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，該制備方法，能夠簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提聞實(shí)驗(yàn)效率，降低實(shí)驗(yàn)成本。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1是RNAi中間載體的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2是PBI121載體酶切位點(diǎn)的添加鑒定結(jié)果圖；
圖3是中間過渡表達(dá)載體的構(gòu)建PCR鑒定結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0012]實(shí)施例1 RNAi中間載體
用于抑制目的基因表達(dá)的RNAi中間載體，如圖1所示，以表達(dá)載體PBI121 (市售)為骨架，在骨架上克隆入擬南芥肌動(dòng)蛋白10(Genebank登陸號(hào)為AT5G52360.1，NM_124615)用來形成干擾載體頸環(huán)結(jié)構(gòu)中的環(huán)狀部分；同時(shí)，在擬南芥肌動(dòng)蛋白10左端依次引入了 Xhol、Nco1、PstI酶切位點(diǎn)，右端依次引入Sac1、ClaI酶切位點(diǎn)。中間載體含有CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子和卡納霉素抗性基因。中間載體含有GUS報(bào)告基因，且GUS報(bào)告基因與目的干擾序列共融合表達(dá)。
實(shí)施例2 PBI121載體酶切位點(diǎn)的添加。
[0013](I)設(shè)計(jì)PBI121的35S啟動(dòng)子引物。
[0014]上游引物:5'-GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTC-3' (HindIII)；
下游引物:5 ' -CCCGGATCCGTCGACACTAGTCTGCAGCCATGGCTCGAGGTCCCCCGTGTTCTC-3 '(酶切位點(diǎn)為 BamH1、Sail、Spe1、Pst1、Nco1、Xhol)。
[0015](2)以PBI121質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0016]PCR體系為:1 μ L質(zhì)粒DNA，上下游引物各I μ L，Taq酶0.2 μ L (5 U/μ L)，1xTaq 酶 buffer 2 μ L, 10 mM dNTP 2 μ L, ddH20 12.5 μ L，總體系為 20 μ L。
[0017]PCR 程序?yàn)?94 °C, 3 min ；94 °C，30 s ；55 °C,45 s ；72 °C, 50 s ;30 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 10 min。
[0018](3)上述(2)中的PCR產(chǎn)物和PBI121質(zhì)粒分別經(jīng)過酶切(酶切體系為=HindIII Iμ L, XhoI I μ L, I μ L 1xK Buffer, 17 μ L 質(zhì)粒，總體系為 20 μ L ；37°C 孵育 3h)后進(jìn)行連接反應(yīng)(連接體系:10xT4 DNA Ligase Buffer 2.5 yL，PCR 產(chǎn)物 0.3 pmol，pBI121 載體 0.03 pmol, T4 DNA Ligase I μ L，補(bǔ)水至 25 μ L ; 16°C過夜反應(yīng))。
[0019](4)改造后的PBI121載體酶切鑒定:用Pstl/EcoRI雙酶切(酶切體系為=HindIIII μ L, XhoI I μ L, I μ L 1xK Buffer, 17 μ L 質(zhì)粒，總體系為 20 μ L ；37°C 孵育 3h)改造后的質(zhì)粒，I號(hào)和3號(hào)泳道出現(xiàn)了預(yù)計(jì)的2200bp左右的目的條帶，初步說明成功引入了酶切位點(diǎn)，如圖2所示。
[0020](5)測(cè)序鑒定:經(jīng)酶切初步鑒定為陽(yáng)性的單菌落送上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步表明所添加的酶切位點(diǎn)與測(cè)序結(jié)果一致。
[0021]實(shí)施例3中間過渡表達(dá)載體的構(gòu)建。
[0022](I)擴(kuò)增擬南芥肌動(dòng)蛋白10的引物:
上游引物:5' -GGGCTGCAG ATGGCGAACG CGGCGTCGGG-3' (Pst I)；
下游引物:5' ~GGGGGATCCCCTAGAGAGCTCGACTTTTGATGAT~3/ (BamHI )。
[0023](2)以上述(I)為引物，擬南芥基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR。
[0024]PCR體系為:1 UL擬南芥DNA，上下游引物各I μ L，Taq酶0.2 μ L (5 U/μ L)，1xTaq 酶 buffer 2 μ L，10 mM dNTP 2 μ L, ddH20 12.5 μ L，總體系為 20 μ L。
[0025]PCR 程序?yàn)?94 °C，3 min ；94 °C，30 s ；58 °C，45 s ；72 °C，50 s ;30 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 10 min。
[0026](3)引入內(nèi)含子后可用酶切位點(diǎn)為:XhoI—NcoI — PstI — intron — SacI—Clal。
[0027](4) PCR鑒定:出現(xiàn)了 1300bp左右的目的帶，如圖3所示。
[0028]PCR體系為:1 μ L重組質(zhì)粒，上下游引物各I μ L，Taq酶0.2 μ L (5 U/μ L)，1xTaq 酶 buffer 2 μ L，10 mM dNTP 2 μ L, ddH20 12.5 μ L，總體系為 20 μ L。
[0029]PCR 程序?yàn)?94 °C，3 min ；94 °C，30 s ；57 °C，45 s ；72 °C，50 s ;30 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 10 min。
[0030](5)測(cè)序鑒定:酶切鑒定為陽(yáng)性的單菌落送上海生工測(cè)序，結(jié)果進(jìn)一步表明添加的酶切位點(diǎn)及引入的擬南芥肌動(dòng)蛋白序列與測(cè)序結(jié)果一致，說明中間載體構(gòu)建已成功構(gòu)建。
【權(quán)利要求】
1.一種用于抑制目的基因表達(dá)的RNAi中間載體,其特征在于:以表達(dá)載體PBI121為骨架，在骨架上克隆入擬南芥肌動(dòng)蛋白10用來形成干擾載體頸環(huán)結(jié)構(gòu)中的環(huán)狀部分；同時(shí)，在擬南芥肌動(dòng)蛋白10 —端分別引入了 Xhol、Nco1、PstI酶切位點(diǎn)，另一端引入Sac1、ClaI酶切位點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抑制目的基因表達(dá)的RNAi中間載體，其特征在于:所述的中間載體含有CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子和卡納霉素抗性基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抑制目的基因表達(dá)的RNAi中間載體，其特征在于:所述的中間載體含有GUS報(bào)告基因,且GUS報(bào)告基因與目的干擾序列共融合表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抑制目的基因表達(dá)的RNAi中間載體，其特征在于:在擬南芥肌動(dòng)蛋白10左端依次引入了 Xho1、Nco1、PstI酶切位點(diǎn)，右端依次引入Sac1、ClaI酶切位點(diǎn)。
5.權(quán)利要求1所述的用于抑制目的基因表達(dá)的RNAi中間載體的構(gòu)建方法，其特征在于:先在表達(dá)載體 PBI121 為骨架上添加 HindII1、BamH1、Sail、Spe1、Pst1、Nco1、XhoI 酶切位點(diǎn)，然后在骨架上克隆入擬南芥肌動(dòng)蛋白10。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK104263750SQ201410505644
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】胡德龍, 顏志明, 楊寶林, 董慧, 許建民, 雷武生 申請(qǐng)人:江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院