與大豆抗銹病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記GmSSR18-24及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個(gè)與大豆抗銹病基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記GmSSR18-24及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定大豆抗銹病的方法，包括如下步驟：分別以待鑒定大豆和SX6907的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1和序列表中序列2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，按照標(biāo)準(zhǔn)確定所述待鑒定大豆的抗病性，本發(fā)明利用高抗銹病大豆SX6907材料與2個(gè)非抗銹病大豆材料雜交，構(gòu)建遺傳群體，定位抗銹病基因，開發(fā)緊密連鎖的分子標(biāo)記，并進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，可提高選擇效率，加快育種進(jìn)程。
【專利說明】與大豆抗銹病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記GmSSRI 8-24及應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于大豆分子生物學(xué)及遺傳育種【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體涉及一個(gè)與大豆抗銹病 基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記GmSSR18-24及其應(yīng)用，同時(shí)還涉及該分子標(biāo)記在大豆抗銹 病育種中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 大豆是是世界上重要的油料作物和糧食作物，也是畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、醫(yī)藥、輕工、化 工等行業(yè)的原料來源。大豆原產(chǎn)于我國，18世紀(jì)傳至西方。第二次世界大戰(zhàn)后，世界大豆 生產(chǎn)迅速發(fā)展，同時(shí)帶到加工和利用的迅速發(fā)展。在古老的東方食品加工基礎(chǔ)上，發(fā)展出油 月旨、蛋白和功能性成分的深加工及其多種多樣的終端食品、保健食品、醫(yī)藥材料以及各類飼 料產(chǎn)品，甚至用于制造紡織和材料工業(yè)的原料，使得大豆一躍而成全世界關(guān)注的重要經(jīng)濟(jì) 作物之一。2013年中國大豆種植面積685萬公頃，總產(chǎn)量1220萬噸，而進(jìn)口大豆達(dá)創(chuàng)記錄 的6340萬噸，占據(jù)我國六分之五的大豆市場(chǎng)。造成我國大豆生產(chǎn)滯后、供給嚴(yán)重不足、國內(nèi) 大豆產(chǎn)業(yè)遭受進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆嚴(yán)重沖擊的原因是多方面的，但主要原因之一是綜合抗病蟲 害和抗逆能力差，單產(chǎn)低，種植效益低下，國際競(jìng)爭(zhēng)力弱。
[0003] 大豆銹病是一種氣傳病害、一種多循環(huán)病害，是大豆上最具破壞性的病害之一。大 豆銹病是由豆薯層銹菌引起的真菌性病害，具有破壞性強(qiáng)、循環(huán)式侵染、專性寄生等特點(diǎn)。 它的寄主主要是豆類作物，還有野葛、栽培葛等，在南方主要的越冬寄主是野葛，野葛冬天 不落葉，一年四季都能被銹菌侵染，冬季最嚴(yán)重，銹菌可寄生在上面成為第2年的初侵染來 源。高溫高濕氣候條件將加快致病真菌的繁殖速度，導(dǎo)致銹病蔓延，如不進(jìn)行有效控制，可 造成大豆40%的減產(chǎn)損失。2004年，大豆銹菌正式登陸美國大陸，并迅速傳至北部，由 于目前還沒有有效的抗病品種和防治方法，每年造成的損失高達(dá)70億至100億美元。隨 著全球氣候的逐漸變暖，大豆銹病開始向高緯度地區(qū)蔓延，銹病對(duì)大豆生產(chǎn)的危害已經(jīng)引 起全球大豆生產(chǎn)者的高度重視。
[0004] 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)油料作物研究所大豆研究室采用離體葉片接種方法對(duì)1000余份大 豆種質(zhì)資源進(jìn)行抗性篩選，獲得1份高抗銹病材料SX6907 (單志慧等，一個(gè)大豆銹病新抗源 的篩選與鑒定，中國油料作物學(xué)報(bào)，2012, 34 :188-192)，該材料在接種銹菌后20天不產(chǎn)生 侵染病斑，在接種高濃度銹菌時(shí)，產(chǎn)生少數(shù)紅褐色病斑，但無孢子堆破裂現(xiàn)象，無孢子產(chǎn)生。 組織學(xué)觀察表明，SX6907在接種部位造成細(xì)胞壞死，侵染點(diǎn)無孢子形成，其抗性表現(xiàn)為抗銹 菌擴(kuò)展。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供鑒定或輔助鑒定大豆抗銹病的方法。本發(fā)明所提供的 鑒定或輔助鑒定大豆抗銹病的方法，包括如下步驟：分別以待鑒定大豆和SX6907的基因組 DNA為模板，用由序列表中序列1和序列表中序列2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，按照如下方法確定所述待鑒定大豆的抗病性：
[0006] 如果待鑒定大豆的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶有與SX6907帶型相同的條帶，則待鑒 定大豆為抗銹病大豆或候選為抗銹病大豆,如果待鑒定大豆的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶沒有 與SX6907帶型相同的條帶，則待鑒定大豆為非抗銹病大豆為或?yàn)楹蜻x非抗銹病大豆；所述 待鑒定大豆為中豆40和SX6907的雜交后代，上述方法中，所述待鑒定大豆具體選自中豆 40 X SX6907的雜種后代中的F2單株。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述待鑒定大豆具體選自 中豆40XSX6907的？ 2單株。
[0007] 上述方法中，所述電泳為聚丙烯酰胺凝膠電泳，在所述聚丙烯酰胺凝膠電泳中，所 述聚丙烯酰胺凝膠的濃度6%。
[0008] 上述方法中，所述PCR擴(kuò)增中先進(jìn)行10個(gè)第一個(gè)循環(huán)后再進(jìn)行25個(gè)第二個(gè)循環(huán)， 所述第一個(gè)循環(huán)的引物退火條件為55°C 30s，所述第二個(gè)循環(huán)的引物退火條件為53°C 30s。
[0009] 其中，所述第一個(gè)循環(huán)的溫度程序是：先94°C 30s，然后55°C 30s，最后72°C Imin ; 所述第二個(gè)循環(huán)的溫度程序是：先94°C 30s，然后53°C 30s，最后72°C lmin。
[0010] 上述方法中，所述抗銹?。≧)大豆是指接種后2周僅在接種部位有少量紅褐色病 斑，病斑周圍組織不發(fā)生黃化，無黃褐色病斑；若無孢子堆形成為高抗，若有孢子堆形成，并 有少量孢子釋放為中抗銹?。∕);非抗銹?。⊿)大豆是指接種后3-5天出現(xiàn)侵染病斑，為典 型黃褐色病斑，5-7天后侵染點(diǎn)周圍變黃，侵染點(diǎn)逐步變大，葉片上相鄰的黃色部分連成片， 10天后，侵染點(diǎn)病斑破裂，有大量孢子釋放。
[0011] 上述方法可用于大豆育種、大豆抗銹病的早期預(yù)測(cè)或篩選抗銹病大豆。
[0012] 在大豆育種中，可利用上述方法鑒定出抗銹病大豆進(jìn)行育種。
[0013] 本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供鑒定或輔助鑒定大豆抗銹病的引物對(duì)。
[0014] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定大豆抗銹病的引物對(duì)，名稱為GmSSR18-24,由序 列表中序列1和序列表中序列2所示的兩條單鏈DNA組成。
[0015] 其中，序列表中序列1由23個(gè)脫氧核苷酸組成，序列表中序列2由27個(gè)脫氧核苷 酸組成。
[0016] 含有上述引物對(duì)GmSSR18-24的鑒定或輔助鑒定大豆抗銹病的試劑或試劑盒也屬 于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0017] 上述引物對(duì)GmSSR18-24、含有上述引物對(duì)GmSSR18-24的試劑或試劑盒的下述a)、 b)或c)用途也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0018] a)在大豆育種中的應(yīng)用；
[0019] b)在大豆抗銹病的早期預(yù)測(cè)中的應(yīng)用；
[0020] c)在篩選抗銹病大豆中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明的引物對(duì)GmSSR18-24距抗銹病基因位點(diǎn)0. 4cM，是與抗銹病基因位點(diǎn)緊密 連鎖的分子標(biāo)記（P = 〇. 0004)，是基于PCR技術(shù)的共顯性SSR標(biāo)記，因而可靠且使用方便。
[0022] 實(shí)驗(yàn)證明，利用引物對(duì)GmSSR18_24對(duì)大豆育種材料輔助鑒定的結(jié)果與抗病鑒定 結(jié)果完全一致，這表明引物對(duì)GmSSR18-24用于大豆抗銹病育種的分子標(biāo)記輔助選擇是切 實(shí)有效的。
[0023] 本發(fā)明通過對(duì)大豆抗銹病基因的定位，并開發(fā)與其緊密連鎖的分子標(biāo)記 GmSSR18-24,該標(biāo)記可用于分子標(biāo)記輔助選擇。在常規(guī)育種方法中，大豆的對(duì)銹病的抗性鑒 定比較繁瑣，對(duì)鑒定技術(shù)要求比較高，選擇效率低下。通過檢測(cè)抗銹病基因位點(diǎn)來預(yù)測(cè)大豆 對(duì)銹病的抗性，可以在苗期進(jìn)行淘汰，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高選擇效率，從而加快 育種進(jìn)程。本發(fā)明中抗銹病基因位點(diǎn)位置明確，基因位點(diǎn)的檢測(cè)方法方便快速，不受環(huán)境影 響。通過檢測(cè)與抗銹病基因位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記，即可確定大豆對(duì)銹病的抗性，進(jìn)而準(zhǔn) 確快速篩選高抗銹病的材料。
[0024] 本發(fā)明利用高抗銹病大豆SX6907材料與2個(gè)非抗銹病大豆材料雜交，構(gòu)建遺傳群 體，定位抗銹病基因，開發(fā)緊密連鎖的分子標(biāo)記，并進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，可提高選擇效 率，加快育種進(jìn)程。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為利用GmSSR18-24對(duì)1-28的F2代單株、母本和父本的基因組DNA進(jìn)行PCR 得到的PCR產(chǎn)物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖
[0026] 其中，1-28為材料編號(hào)，Pl和P2分別代表母本中豆40和父本SX6907
[0027] 圖2為標(biāo)記GmSSR18-24與抗銹病基因位點(diǎn)rpp. 18-1的連鎖分析
[0028] 其中，括號(hào)內(nèi)數(shù)據(jù)單位為cM

【具體實(shí)施方式】
[0029] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0030] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0031] 大豆中豆40(張誠,介紹6個(gè)國審大豆品種,農(nóng)家顧問，2012,4 :35-37)和大豆資 源材料SX6907 (單志慧等，一個(gè)大豆銹病新抗源的篩選與鑒定，中國油料作物學(xué)報(bào)，2012， 34 :188-192)公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所獲得，以重復(fù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)。
[0032] 在以下的實(shí)施方案中，除非特別說明，否則所有操作均按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》 (第三版）（黃培堂等譯，北京：科學(xué)出版社，2002)所提供的方法進(jìn)行。
[0033] 實(shí)施例1、利用引物對(duì)GmSSR18-24鑒定中豆40XSX6907的F2單株對(duì)銹病的抗性
[0034] 一、鑒定或輔助鑒定大豆抗銹病的PCR試劑
[0035] 本實(shí)施例的鑒定或輔助鑒定大豆抗銹病的PCR試劑由PCR引物對(duì)GmSSR18-24、 IOXTaq緩沖液，dNTP混合物，MgCl2溶液、Taq DNA聚合酶和CldH2O組成。
[0036] 其中，PCR引物對(duì)GmSSR18-24由正向引物和反向引物這兩條單鏈DNA組成，其序 列如下：
[0037] 正向引物：5 ' -GAAGAGGGTCTTCAAAATCAATC-3 '（序列 1)，
[0038] 反向引物：5 ' -TTGTTAATCAGGATCTATAAGACATTG-3 '（序列 2)。
[0039] 二、待鑒定大豆
[0040] 中豆40XSX6907的F2分離群體是按照如下方法獲得：中豆40和SX6907雜交，雜 交后代自交，即為F 2分離群體。
[0041] 三、田間實(shí)驗(yàn)和利用引物對(duì)GmSSR18-24鑒定待鑒定大豆對(duì)銹病的抗性
[0042] 中豆40X SX6907的雜種后代中的F2單株種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所 試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)。
[0043] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，待鑒定大豆具體選自中豆40XSX6907的F2單株。
[0044] 上述方法中，抗銹?。≧)大豆是指接種后2周僅在接種部位有少量紅褐色病斑， 病斑周圍組織不發(fā)生黃化，無黃褐色病斑；若無孢子堆形成為高抗，若有孢子堆形成，并有 少量孢子釋放為中抗銹?。∕);非抗銹病（S)大豆是指接種后3-5天出現(xiàn)侵染病斑，為典型 黃褐色病斑，5-7天后侵染點(diǎn)周圍變黃，侵染點(diǎn)逐步變大，葉片上相鄰的黃色部分連成片，10 天后，侵染點(diǎn)病斑破裂，有大量孢子釋放。
[0045] (二）利用引物對(duì)GmSSR18-24鑒定大豆的對(duì)銹病的抗性
[0046] 在步驟（一）編號(hào)為1-30的家系的F2單株、母本中豆40 (Pl)和父本SX6907 (P2) 的3葉期分別采集大豆葉片提取其基因組DNA，利用引物對(duì)GmSSR18-24進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)得 到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行60g/L變性聚丙烯酰胺凝膠（交聯(lián)度為5 % )電泳，檢測(cè)電泳條帶大 小。
[0047] 具體的實(shí)驗(yàn)方法如下：
[0048] 1、用 CTAB 法（Keim P. A rapid protocol for isolating soybean DNA. Soybean genet newslett, 1988, 15:147-148)提取葉片基因組 DNA
[0049] (I)取0.5g新鮮葉片放入1.5ml離心管中，用玻璃棒磨為勻漿，加入700μ I經(jīng) 65°C預(yù)熱30min的CTAB溶液和20 μ 1 β -巰基乙醇搖勻，放入65°C的水浴鍋中水浴30min。
[0050] (2)取出離心管，加入700μ 1氯仿-異戊醇（24 :l/v :v)輕搖幾次，靜置30min后 12000rpm，離心 10min。
[0051] (3)吸取上清液，加入2倍體積的冰凍無水乙醇，置于-20°C冰箱30min。12000rpm 離心10分鐘讓DNA沉淀，倒掉離心管中乙醇溶液。
[0052] (4)用75% (V/V)乙醇清洗2-3次，倒乙醇溶液，打開離心管蓋置于通風(fēng)櫥內(nèi)吹 干。
[0053] (5)加入200 μ 1雙蒸水溶解DNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度，并稀釋成 25ng/l·! 1，于-20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0054] 2、分別以步驟1提取的中豆40和SX6907的F2單株1-30及親本的基因組DNA為 模板，利用引物對(duì)GmSSR18-24進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如表1:
[0055] 表 1.
[0056]

【權(quán)利要求】
1. 鑒定或輔助鑒定大豆銹病抗性的方法，包括如下步驟：分別以待鑒定大豆、SX6907 的基因組DNA為|旲板，用由序列表中序列1和序列表中序列2所不的兩條單鏈DNA組成的 PCR引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，按照如下方法確定所述待鑒定大豆對(duì)銹 病的抗性： 如果待鑒定大豆的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶有與SX6907帶型相同的條帶，則待鑒定大 豆為抗銹病大豆或候選為抗銹病大豆，如果待鑒定大豆的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶沒有與 SX6907帶型相同的條帶，則待鑒定大豆為非抗銹病大豆或候選為非抗銹病大豆；所述待鑒 定大?為中? 40和SX6907的雜父后代。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述電泳為聚丙烯酰胺凝膠電泳。
3. 權(quán)利要求1或2所述方法的用途，所述用途為1)、2)或3): 1) 權(quán)利要求1或2所述方法在大豆育種中的應(yīng)用； 2) 權(quán)利要求1或2所述方法在大豆抗銹病早期預(yù)測(cè)中的應(yīng)用； 3) 權(quán)利要求1或2所述方法在篩選抗銹病大豆中的應(yīng)用。
4. 鑒定或輔助鑒定大豆抗銹病的引物對(duì)，由序列表中序列1和序列表中序列2所示的 兩條單鏈DNA組成。
5. 含有權(quán)利要求4所述的引物對(duì)的鑒定或輔助鑒定大豆抗銹病的試劑或試劑盒。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑，其特征在于：所述引物對(duì)中的各條引物在所述試劑中 的終濃度為2.5ng/l·! 1。
7. 權(quán)利要求4所述的引物對(duì)、權(quán)利要求5所述的試劑或試劑盒的用途，所述用途為a)、 b)或 c): a) 權(quán)利要求4所述的引物對(duì)、權(quán)利要求5所述的試劑或試劑盒在大豆育種中的應(yīng)用； b) 權(quán)利要求4所述的引物對(duì)、權(quán)利要求5所述的試劑或試劑盒在大豆抗銹病早期預(yù)測(cè) 中的應(yīng)用； c) 權(quán)利要求4所述的引物對(duì)、權(quán)利要求5所述的試劑或試劑盒在篩選抗銹病大豆中的 應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104293922SQ201410478960
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月18日
【發(fā)明者】陳海峰, 單志慧, 楊中路, 邱德珍, 趙勝, 陳李淼, 張嬋娟, 袁松麗, 張曉娟, 陳水蓮, 萬喬, 周新安 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所