OsGSL5蛋白在控制植物育性中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了OsGSL5蛋白在控制植物育性中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了抑制OsGSL5編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在調(diào)控植物育性中的應(yīng)用；所述OsGSL5蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明利用反義核酸沉默水稻體內(nèi)OsGSL5基因表達(dá)，得到不育水稻，從而證明OsGSL5基因可以調(diào)控水稻育性，該基因在花粉發(fā)育形成過(guò)程中所起的作用，特別是具有創(chuàng)造人工可控制雄性不育、創(chuàng)制雜交水稻以及創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因生物安全的受體材料上具有重要的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】0sGSL5蛋白在控制植物育性中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及0SGSL5蛋白在控制植物育性中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是世界上最重要的糧食作物之一，它養(yǎng)活著全球一半的人口，如何提高水稻 的產(chǎn)量是關(guān)系到國(guó)計(jì)民生的重要問(wèn)題。目前，我國(guó)絕大部分的稻米由雜交水稻產(chǎn)生，通過(guò)控 制花粉育性培育不育系是雜交水稻生產(chǎn)的關(guān)鍵。雜交水稻的生產(chǎn)使用的一些核基因或細(xì)胞 質(zhì)雄性的不育系，在水稻雜交育種和增產(chǎn)中起了重要作用。
[0003] 水稻花粉發(fā)育是一個(gè)很復(fù)雜的細(xì)胞進(jìn)程，涉及了花粉發(fā)育的所有環(huán)節(jié)，如減數(shù)分 裂、有絲分裂、絨氈層細(xì)胞的發(fā)育、花藥壁的形成等（Liu et al. 2005)。任何一個(gè)進(jìn)程或 環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常都可能造成植株育性降低，嚴(yán)重時(shí)甚至可能完全不育。我國(guó)的雄性不育研究 和利用在國(guó)際上處于領(lǐng)先地位。近年來(lái)應(yīng)用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué) 手段對(duì)模式植物水稻和擬南芥的雄性不育過(guò)程做了深入的研究，取得了一些新的研究結(jié) 果，如：擬南芥中的 EMSl (Zhao et al. 2002)、CERl (Aarts et al. 1995)、AtGSL2 (Dong et al. 2005)基因和水稻 UDTl (Jung et al. 2005)、MSP1 (Onomura et al. 2003)、GAMYB (Kaneko et al. 2004)、UDPG(Chen et al. 2007)、WDA1 (Jung et al. 2006)基因等，上述基因的突變直 接導(dǎo)致了植株的育性降低，有的完全不育。Emsl編碼一個(gè)受體激酶基因，該基因主要參與花 粉母細(xì)胞、絨氈層的發(fā)育。UDTl基因是小孢子發(fā)育的關(guān)鍵基因，該基因主要作用于減數(shù)分裂 時(shí)期，它對(duì)于絨氈層細(xì)胞的發(fā)育、小孢子母細(xì)胞的減數(shù)分裂以及中層的降解起作用。GAMYB 對(duì)于小孢子母細(xì)胞緊貼絨氈層細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)進(jìn)而進(jìn)行正常的減數(shù)分裂是必需的。WDAl對(duì)于 水稻花粉壁蠟質(zhì)層形成是必需的。對(duì)它們的研究加深了對(duì)植物雄性不育機(jī)理的理解。
[0004] 在被子植物花藥發(fā)育過(guò)程中，胼胝質(zhì)（callose)是廣泛存在于植物細(xì)胞的多糖分 子，構(gòu)成植物細(xì)胞壁的重要成分。胼胝質(zhì)層介于細(xì)胞壁和質(zhì)膜之間，對(duì)胼胝質(zhì)的報(bào)道主要 是胼胝質(zhì)參與花粉發(fā)育過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化（Waterkeyn et al. 1962 ;Steiglitz. 1977)。小 孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的前期開始合成胼胝質(zhì)，合成的胼胝質(zhì)將小孢子母細(xì)胞包圍。由于胼 胝質(zhì)可以降低細(xì)胞壁的滲透性，從而創(chuàng)造了一種與周圍組織隔開的相對(duì)獨(dú)立的環(huán)境。小孢 子母細(xì)胞減數(shù)分裂第一次分裂中期，小孢子的胼胝質(zhì)壁開始消失，以增加細(xì)胞通透性，進(jìn)行 營(yíng)養(yǎng)輸送，四分體初期胼胝質(zhì)壁達(dá)最厚。在小孢子母細(xì)胞完成減數(shù)分裂后，絨氈層適時(shí)分泌 胼胝質(zhì)酶以分解包裹四分體的胼胝質(zhì)，使小孢子釋放出來(lái)。胼胝質(zhì)主要起著起屏障或分子 過(guò)濾器作用。胼胝體酶合成和分泌時(shí)間對(duì)于花粉的正常發(fā)育具有決定作用（Stanley and Linskens. 1974 ;Waterkeyn and Beinfait. 1970 ;Zhang et al. 2002) aFei 等（1999)對(duì)擬南 芥雄性不育突變體ms32超微結(jié)構(gòu)觀察表明，絨氈層細(xì)胞過(guò)早形成了合成和分泌胼胝酶的 粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，導(dǎo)致了包裹花粉母細(xì)胞和四分體的胼胝壁提前降解，致使花粉敗育。Worrall 等（1992)等將經(jīng)過(guò)修飾的胼胝體基因與擬南芥減數(shù)分裂時(shí)期特異的啟動(dòng)子融合轉(zhuǎn)入煙草 中。研究結(jié)果表明，在減數(shù)分裂期表達(dá)了胼胝體酶的轉(zhuǎn)基因植株，出現(xiàn)了部分或者是完全不 育的表型。缺少胼胝體壁的花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂表面上看似正常，但花粉壁的形成不是 高度有序的沉積，孢粉素在花粉壁表面隨機(jī)的分布。由此可以推斷，胼胝體壁的提前或者是 延遲降解都將會(huì)使小孢子的發(fā)育過(guò)程受到干擾，并導(dǎo)致外壁沉積的異常造成植株不育。但 是關(guān)于花粉發(fā)育過(guò)程中胼胝質(zhì)降解的分子調(diào)控機(jī)理報(bào)道很少。此外，胼胝的正常合成和降 解與植物抗病，抗逆，生長(zhǎng)和發(fā)育，生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)以及育性密切相關(guān)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供抑制0sGSL5編碼基因表達(dá)的物質(zhì)的用途。
[0006] 本發(fā)明提供的抑制0SGSL5編碼基因表達(dá)的物質(zhì)的用途在調(diào)控植物育性中的應(yīng) 用；
[0007] 所述0SGSL5蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。
[0008] 上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物育性為降低植物育性。
[0009] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供抑制0sGSL5編碼基因表達(dá)的物質(zhì)的另外新用途。
[0010] 本發(fā)明提供的抑制0SGSL5編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在培養(yǎng)不育水稻中的應(yīng)用。
[0011] 所述〇sGSL5蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。
[0012] 上述應(yīng)用中，所述抑制0sGSL5編碼基因表達(dá)的物質(zhì)為DNA分子A，所述DNA分子A 的序列為序列表中序列1自5'末端第5171-5713位核苷酸的反向互補(bǔ)序列或含有所述DNA 分子A的重組載體。
[0013] 上述應(yīng)用中，所述重組載體為將所述DNA分子A插入表達(dá)載體pCambial390_Ubi 中得到的重組載體，在本發(fā)明的實(shí)施例中，重組載體0sGSL5i-pCambial390-UBI為將DNA分 子A插入表達(dá)載體pCambial390-Ubi中的SpeI和BamHI位點(diǎn)間得到的重組載體，其中DNA 分子A的序列為序列表中序列1自5'末端第5171-5713位核苷酸的反向互補(bǔ)序列。
[0014] 表達(dá)載體pCambial390_Ubi為將序列表中序列4所示的Ubiquitin啟動(dòng)子插入植 物雙元表達(dá)載體pCambial390的HindIII和PstI位點(diǎn)間，構(gòu)成中間載體pCambial390_Ubi。
[0015] 上述應(yīng)用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為水稻。
[0016] 本發(fā)明第三個(gè)目的是提供一種培育育性降低或者培育不育植物的方法。
[0017] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：將抑制0SGSL5編碼基因表達(dá)的物質(zhì)導(dǎo)入目的 植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的育性低于所述目的植物；
[0018] 所述抑制0sGSL5編碼基因表達(dá)的物質(zhì)為DNA分子A，所述DNA分子A的序列為序 列表中序列1自5'末端第5171-5713位核苷酸的反向互補(bǔ)序列。
[0019] 上述方法中，所述DNA分子A通過(guò)上述重組載體中導(dǎo)入目的植物中。
[0020] 上述方法中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為水稻。
[0021] 本發(fā)明第四個(gè)目的是提供一種DNA分子。
[0022] 本發(fā)明提供的DNA分子，為如下1)或2):
[0023] 1)序列為序列表中序列1自5'末端第5171-5713位核苷酸的反向互補(bǔ)序列的DNA 分子；
[0024] 2)在嚴(yán)格條件下與1)雜交且編碼相同蛋白的DNA分子。
[0025] 上述嚴(yán)格條件可為用0. IX SSPE (或0. I XSSC)，0. 1 % SDS的溶液，在DNA或者RNA 雜交實(shí)驗(yàn)中65°C下雜交并洗膜。
[0026] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明利用反義核酸沉默水稻體內(nèi)0sGSL5基因表達(dá)，得到不 育水稻，從而證明0sGSL5基因可以調(diào)控水稻育性，該基因在花粉發(fā)育形成過(guò)程中所起的作 用，特別是具有創(chuàng)造人工可控制雄性不育、創(chuàng)制雜交水稻以及創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因生物安全的受體 材料上具有重要的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1為水稻不育突變體gsl5_l的突變表型
[0028] 圖IA :成熟期水稻野生型植株與不育植株形態(tài)比較：左為野生型，右為不育突變 體；圖IB :植株成熟后的稻穗，左為野生型，右為不育系；圖IC :抽穗時(shí)野生型花藥與突變 體花藥形態(tài)比較，左邊為野生型花藥，右邊為突變體花藥。圖ID :野生型植株（WT)的花粉 在經(jīng)淀粉-碘化鉀染色后觀察；圖IE :突變體花粉在經(jīng)淀粉一碘化鉀染色后觀察；
[0029] 圖2為突變體gsl5_l中0sGSL5基因分析
[0030] A為0sGSL5基因的結(jié)構(gòu)和Tosl7插入位點(diǎn)分析，起始密碼（ATG)和終止密碼（TGA) 已經(jīng)標(biāo)出，方框表示0sGSL5基因的單外顯子，橫線表上基因的內(nèi)含子；兩個(gè)到三角形分別 表示gsl5-l中Tosl7插入的位置。Pl，P2,表示跨T-DNA的兩條基因組引物，P3表示位于 gsl5-l突變體中T-DNA上的邊界引物；
[0031] B為T-DNA插入雜合植株后代的基因型檢測(cè)。植株基因型的確定當(dāng)Pl和P3配對(duì) 時(shí)才可以擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物，由于T-DNA插入片段太大，Pl與P2配對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物無(wú)法得到； 野生型植株由于沒有T-DNA的插入，所以Pl和P3配對(duì)擴(kuò)增沒有產(chǎn)物，但可以利用引物Pl 與P2配對(duì)擴(kuò)增得到目標(biāo)產(chǎn)物；而0sGSL5雜合T-DNA插入轉(zhuǎn)基因植株則Pl和P2配對(duì)以及 Pl和P3配對(duì)時(shí)都可以擴(kuò)增得到產(chǎn)物。植株表型：20個(gè)Tl代單株中第2、5、9、13株為突變 表型，突變植株的基因型均為0sGSL5純合T-DNA插入，而正常植株的基因型為野生（以W 表示）或雜合型（以He表示），這一結(jié)果表明突變表型與0sGSL5基因內(nèi)的T-DNA插入共分 離；
[0032] C為是RT-PCR分析0sGSL5在野生型（WT)和突變體gsl5-l中的表達(dá)，結(jié)果表明 0sGSL5在突變體中的表達(dá)被完全敲除。以Actin做為內(nèi)標(biāo)。
[0033] 圖3為野生型和突變體花藥石蠟切片的比較。
[0034] 圖3a_h為野生型花藥在小孢子時(shí)期、液泡化花粉時(shí)期、有絲分裂時(shí)期和成熟花粉 期的花藥橫切片。圖3i-p為表示突變體花藥在小孢子時(shí)期、液泡化花粉時(shí)期、有絲分裂時(shí) 期和成熟花粉期的花藥橫切片。Bars = 25 iim。
[0035] 圖4為利用反義核酸抑制野生型水稻內(nèi)源0sGSL5的表達(dá)可以降低水稻育性
[0036] 圖5為3株RNA干涉系的基因表達(dá)分析圖
[0037] 圖 6 為 0sGSL5i-pCambial390-UBI 載體結(jié)構(gòu)圖

【具體實(shí)施方式】
[0038] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0039] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0040] 實(shí)施例1、0sGSL5基因突變體gsl5-l獲得及表型
[0041] 一、gsl5_l突變體的獲得
[0042] l、gsl5_l突變體的獲得
[0043] 所用的水稻T-DNA插入突變體庫(kù)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)陸軍生物技術(shù)研究所利用載 體PFX-E24. 2-15R構(gòu)建而成（突變體庫(kù)的創(chuàng)建方法已經(jīng)公開發(fā)表論文，見等見Wan等， Activation tagging, an efficient tool for functional analysis of the rice genome。 Plant Mol Biol. 2009Jan ；69 (1-2):69-80)〇
[0044] 挑選出10000份水稻轉(zhuǎn)基因品種"日本晴（為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所保持的 粳稻測(cè)序品種）"的種子，經(jīng)浸種、催芽后播于秧田，35天后移栽至大田。每份材料種兩行， 每行10株，為一個(gè)家系，種植地點(diǎn)為河北廊坊萬(wàn)莊中國(guó)農(nóng)科院高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園內(nèi)的試驗(yàn) 田，按常規(guī)的水稻種植方法進(jìn)行田間管理。經(jīng)過(guò)大田篩選共獲到300個(gè)不育或育性低的突 變家系。其中，一個(gè)原始編號(hào)為S78的突變體表型為育性極低（如圖1A-E)，將突變體命名 為 gsl5-l。
[0045] 2、分離gsl5_l突變體T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列
[0046] 利用 PCR Walking 方法（Siebert 等，An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA. Nucleic Acids Res, 1995, 23:1087-1088),分離了這個(gè)突變體的側(cè) 翼序列。根據(jù)側(cè)翼序列與水稻基因組的匹配位置確定插入位點(diǎn)，結(jié)果顯示該側(cè)翼序列位于 水稻的第6染色體上，插入位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于水稻基因組注釋網(wǎng)站（http://rice. plantbiology. msu. edu/)上的一個(gè)基因（登錄號(hào)：L0C_0s06g08380)，命名為0sGSL5,其核苷酸序列為序列 表中序列1，編碼的蛋白命名為0sGSL5,該蛋白的氣基酸序列為序列2。Tosl7插入到該基 因的第六外顯子中（見圖2A)。
[0047] PCR Walking方法分離得到的gsl5_l突變體T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列為序列 3〇
[0048] 3、Tosl7插入側(cè)翼序列與突變表型的共分離檢測(cè)
[0049] 為了證實(shí)花粉敗育的突變表型是由于0sGSL5基因內(nèi)的Tos 17插入引起，本發(fā)明對(duì) 19個(gè)1'1代轉(zhuǎn)基因植株（其中，第2、5、9、13株為突變單株）進(jìn)行了1' 〇817插入位點(diǎn)側(cè)翼序 列與突變表型的共分離檢測(cè)。共分離檢測(cè)的具體步驟為：（1)在0sGSL5基因Tosl7插入位 點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)基因組引物Pl (5' ATT TGG GAC CTC AGC GAA GC 3')和P2 (5' TGA CTC AAG GGC TCT GIT GC 3'），在 Tosl7 上設(shè)計(jì)一條載體引物 LBl (P3:5,-CGG TTA CAT CTT CTC AAA CTC AAT GTG G-3'），如圖2B。在Tl代植株中，0sGSL5純合T-DNA插入植株只有 當(dāng)Pl和P3配對(duì)時(shí)才可以擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物；而由于Tosl7插入使Pl與P2配對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物 達(dá)到17kb，在設(shè)定的PCR反應(yīng)程序無(wú)法得到相應(yīng)PCR產(chǎn)物（這樣鑒定植株基因型的方法是 領(lǐng)域內(nèi)的通用方法）。野生型植株由于沒有T-DNA的插入，所以Pl和P3配對(duì)擴(kuò)增沒有產(chǎn) 物，但可以利用引物Pl與P2配對(duì)擴(kuò)增得到目標(biāo)產(chǎn)物。而0sGSL5雜合T-DNA插入轉(zhuǎn)基因植 株則Pl和P2配對(duì)以及Pl和P3配對(duì)時(shí)都可以擴(kuò)增得到產(chǎn)物。
[0050] 應(yīng)用CTAB法從19株Tl代單株中分別抽提總DNA作為模板，用⑴中引物組合 P1+P3和P1+P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20iiL，具體包含：DNA模板liiL;10倍體積 的 Taq 酶反應(yīng)緩沖液 2 ii L ;2mM dNTPL 5 ii L ;25mM 鎂離子 L 2 ii L ; 10 ii M 引物 0? 2 ii L ;0? 3 單位Taq酶，加雙蒸水至20 ii L。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下：94°C 5min ;94°C 45sec，55°C 45sec， 72°C I. 5min，28cycles ;72°C 5min，25°C lmin。（3)將反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)凝 膠上的帶型判定各個(gè)單株的基因型。
[0051] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，19株Tl代單株中，4株突變體表型植株的基因型均為0sGSL5純合 T-DNA插入，而其他15株表型正常的植株基因型為野生或雜合型（如圖2B)。這表明gsl5-l 突變體的突變表型是由于0sGSL5基因內(nèi)的Tosl7插入造成，且該突變體表現(xiàn)為隱性純合突 變體。
[0052] 二、野生型和突變體不同時(shí)期花藥的石蠟切片觀察
[0053] RT-PCR分析0sGSL5在野生型（WT)和突變體gsl5-l中的表達(dá)，結(jié)果表明0sGSL5 在突變體中的表達(dá)被完全敲除（圖2C)。以Actin做為內(nèi)標(biāo)。
[0054] 取不同發(fā)育時(shí)期的來(lái)源于野生型和突變體的花藥在Carnoy固定液（無(wú)水乙醇： 冰醋酸：氯仿=6:1:3)固定24小時(shí)（花藥發(fā)育分為8個(gè)時(shí)期，詳情參考Feng，等.2001. Pollen development and its stages in rice (Oryza sativa L.). Chinese J. Rice Sci 15(1) :21-28.)。固定后的材料在系列酒精中脫水（70%酒精、90%酒精、95%酒精、無(wú)水酒 精總各順序放置30分鐘）。脫水后的材料浸蠟包埋，切片及展片，37°C烘箱烘干（4 一 7d) 后置二甲苯中溶蠟，染色，中性樹膠封片，干后鏡檢，自然風(fēng)干后置于顯微鏡觀察，拍照。
[0055] 結(jié)果如圖3顯示，突變體和野生型花藥的前4個(gè)時(shí)期沒有明顯差異（注：前4個(gè)時(shí) 期的沒有差異），從花藥發(fā)育的第5個(gè)時(shí)期開始，野生型的花藥絨氈層開始降解，到最后完 全消失，產(chǎn)生正常的花粉。而突變體的花藥絨氈層在應(yīng)該降解的時(shí)候沒有正常降解，直至發(fā) 育的最后時(shí)期，最終導(dǎo)致花粉的敗育。
[0056] 實(shí)施例2、抑制0sGSL5的表達(dá)的物質(zhì)在培育水稻不育材料中的應(yīng)用
[0057] UDNA分子的制備
[0058] 根據(jù)0sGSL5基因的CDS序列（序列1)設(shè)計(jì)引物如下：5' -GCT TAT CTG AAA TCA TCT TGT CTC TC-3' 和 5' -CCA AGA TGC GGG AGA TCT G-3'。
[0059] 提取水稻日本晴幼苗總RNA，將RNA用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到分子 量約為540bp的條帶。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（TIANGEN)回收該片段。將該回收片段與 pMD19-TSimple(Takara)連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù) PMD19-T Simple載體上的羧卞青霉素抗性標(biāo)記篩選陽(yáng)性克隆，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒，以該 重組質(zhì)粒載體上的通用引物M13對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。
[0060] 經(jīng)過(guò)測(cè)序，該重組質(zhì)粒上的PCR產(chǎn)物為序列表中序列1自5 ^末端第5171-5713 位核苷酸。
[0061] 2、Ubiquitin啟動(dòng)子的獲得
[0062] 以玉米基因組DNA為模板，Pl和P2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到2Kbp的PCR產(chǎn)物 即為Ubiquitin啟動(dòng)子，核苷酸序列為序列表中序列4。
[0063] 擴(kuò)增 ubiquitin 啟動(dòng)子所用的引物：Pl: 5' -GCCCAAGCTTCTAGTGCAGTGCAGCGTGA C-3' 和 P2:5' -GCAACTGCAGGTACCTAGTGCAGAAGTAACACCA-3',
[0064] 3、抑制0sGSL5的表達(dá)的重組載體的獲得
[0065] 將上述2得到的序列表中序列4所示的Ubiquitin啟動(dòng)子插入植物雙元表達(dá)載體 pCambial390 (該載體可購(gòu)自 Cambia, Queensland. Australia)的 HindIII 和 PstI 位點(diǎn)間， 構(gòu)成中間載體pCambial390_Ubi ;
[0066] 再將上述1得到的序列表中序列1自5 '末端第5171-5713位核苷酸的反向互補(bǔ) 片段（0sGSL5i)替換中間載體pCambial390-Ubi的SpeI和BamHI位點(diǎn)間的片段，得到重組 載體，命名為0sGSL5i-pCambial390-UBI (圖6,其中，，HPT代表潮霉素篩選標(biāo)記。35S代表 花椰菜病毒的啟動(dòng)子。UBI代表玉米啟動(dòng)子UBI。HindIII、PstI、SpeI、BamHI代表各酶切 位點(diǎn)）。
[0067] 0sGSL5i-pCambial390_UBI為抑制0sGSL5的表達(dá)的重組載體，其中序列表中序列 1自5 ^末端第5171-5713位核苷酸的反向互補(bǔ)片段為抑制0sGSL5的表達(dá)的DNA分子A。
[0068] 經(jīng)過(guò)測(cè)序，重組載體0sGSL5i-pCambial390-UBI為將DNA分子A插入表達(dá)載體 pCambial390-Ubi中的SpeI和BamHI位點(diǎn)間得到的重組載體，其中DNA分子A的序列為序 列表中序列1自5'末端第5171-5713位核苷酸的反向互補(bǔ)序列。4、干擾0sGSL5表達(dá)的轉(zhuǎn) 基因水稻的獲得
[0069] 構(gòu)建好的重組載體電轉(zhuǎn)入（電轉(zhuǎn)化儀為eppendorf公司產(chǎn)品，本發(fā)明所用電壓為 1800V，具體操作參考該儀器的使用說(shuō)明書）農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)菌株 EHA105,轉(zhuǎn)化后的菌株命名為 0sGSL5i-pCambial390-UBI。
[0070] 將 0sGSL5i-pCambial390_UBI 轉(zhuǎn)入水稻粳稻品種日本晴（A Draft Sequence of the Rice Genome(Oryza sativa L. ssp. japonica)Stephen A. Goff, et al. Science 296, 92(2002)，以下也稱為野生型水稻）種子誘導(dǎo)的愈傷組織中，得到再生株系。具體如 下：
[0071] 1)種子愈傷組織誘導(dǎo)如下：選取飽滿、無(wú)霉變成熟水稻種子，用手工脫去谷殼（注 意保持胚完整），將脫谷殼米粒轉(zhuǎn)到50mL無(wú)菌三角瓶一加適量無(wú)菌水洗一次一棄水，倒入 75%酒精適量，搖動(dòng)攪拌，放置30秒（過(guò)程中適當(dāng)輕搖動(dòng)混勻）一棄酒精一加適量無(wú)菌水 洗一次一棄水一倒入適量2% NaCLO,不時(shí)搖動(dòng)攪拌，共處理30分鐘一棄NaCLO -用無(wú)菌水 洗3次，每次停留1分鐘一倒去無(wú)菌水，將種子從三角瓶轉(zhuǎn)到帶無(wú)菌濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿中吸 干。誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+2, 4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+3. 6g/L植物凝膠（pH5. 8)。
[0072] 2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化
[0073] (1)挑選繼代約7天的胚性愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體材料。
[0074] (2)收集上述農(nóng)桿菌重組菌體0sGSL5i-pCambial390-UBI，重懸于液體共培養(yǎng)培 養(yǎng)基（在YEP液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為100mg/L AS (乙酰丁香酮），調(diào)PH5. 2得到 的液體培養(yǎng)基）中，28°C，200rpm震蕩培養(yǎng)1-2小時(shí)；調(diào)整OD值至0. 2。
[0075] (3)將步驟⑵獲得的胚性愈傷組織浸泡步驟2)獲得的農(nóng)桿菌菌液，然后進(jìn)行菌 液浸泡，處理30min。
[0076] (4)將愈傷組織在無(wú)菌濾紙上吸干，轉(zhuǎn)移到鋪有一層滅菌濾紙的固體共培養(yǎng)培 養(yǎng)基（在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加5mg/L 2,4-D、0.4g/L CH(水解酐酪素）、0.1mg/ L 6-芐氨基腺嘌呤（6-BA)、10g/L葡萄糖、20mg/L As (乙酰丁香酮）和3. 6g/L植物凝膠 (phytagel)，調(diào)PH至5. 2滅菌得到的固體培養(yǎng)基）上，19°C暗培養(yǎng)2-3天。
[0077] (5)將步驟⑷培養(yǎng)得到的愈傷組織轉(zhuǎn)出，無(wú)菌水漂洗3-4次，再用含50mg/L Cef(頭胞噻吶霉素）的無(wú)菌水漂洗，然后將愈傷組織放到滅菌的濾紙上。
[0078] (6)將步驟（5)得到的用無(wú)菌濾紙吸干的愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基（在MS基 本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加5mg/L 2, 4-D、0. 4g/L CH (水解酐酪素）、250mg/L Cef (頭胞噻吶霉 素）、50mg/L HPT和3. 6g/L植物凝膠（phytagel)，調(diào)PH至5. 8滅菌得到的固體培養(yǎng)基） 上，25°C暗培養(yǎng)，每?jī)芍苻D(zhuǎn)至繼代培養(yǎng)基上繼代一次。
[0079] (7)經(jīng)步驟（6)所述3次繼代培養(yǎng)后，將生長(zhǎng)旺盛的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng) 基（在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加lmg/L 6-芐氨基腺嘌呤（6-BA)、0. lg/L CH(水解酐酪 素）、250mg/L Cef(頭胞噻吶霉素）、50mg/L HPT 和 3. 6g/L 植物凝膠（phytagel)，調(diào) PH 至 5. 8滅菌得到的固體培養(yǎng)基）上，25°C、16h、2000Lx光照培養(yǎng)，兩周左右新鮮的愈傷組織上 開始有綠色芽點(diǎn)出現(xiàn)，每15天繼代一次，兩次繼代后，長(zhǎng)出小苗，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（在MS 基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加3g/L植物凝膠（phytagel)，調(diào)PH至5. 8滅菌得到的固體培養(yǎng)基） 進(jìn)行生根培養(yǎng)。
[0080] (8)待生根培養(yǎng)長(zhǎng)出完整小苗，將小苗轉(zhuǎn)入到壯苗培養(yǎng)基（1/2MS基本培養(yǎng)基的添 加3g/L植物凝膠（phytagel)，調(diào)PH至5. 8滅菌得到的固體培養(yǎng)基）上培養(yǎng)獲得到幼苗。
[0081] (9)將步驟（8)壯苗培養(yǎng)基上的幼苗，煉苗一周，在清水中將培養(yǎng)基漂洗干凈，先 移栽到溫室，再移栽到大田中得到轉(zhuǎn)0sGSL5i-pCambial390-UBI TO代植株。共得到60株 獨(dú)立轉(zhuǎn)化苗。
[0082] 表1為所用培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基添加不同成分，具體如下：

【權(quán)利要求】
1. 抑制OsGSL5編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在調(diào)控植物育性中的應(yīng)用； 所述OsGSL5蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述調(diào)控植物育性為降低植物育性。
3. 抑制OsGSL5編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在培養(yǎng)不育水稻中的應(yīng)用。 所述OsGSL5蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述抑制0sGSL5編碼基因表達(dá)的物質(zhì)為DNA分子A，所述DNA分子A的序列為序列表 中序列1自5'末端第5171-5713位核苷酸的反向互補(bǔ)序列或含有所述DNA分子A的重組 載體或含有所述DNA分子A的重組菌。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述重組載體為將所述DNA分子A插入表達(dá)載體pCambial390-Ubi中得到的重組載 體； 所述重組菌為將所述重組載體導(dǎo)入目的菌中得到的重組菌。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為水稻。
7. -種培育育性降低或者培育不育植物的方法，包括如下步驟：將抑制0sGSL5編碼基 因表達(dá)的物質(zhì)導(dǎo)入目的植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的育性低于所述目的植 物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述抑制OsGSL5編碼基因表達(dá)的物質(zhì)為 DNA分子A，所述DNA分子A的序列為序列表中序列1自5'末端第5171-5713位核苷酸的 反向互補(bǔ)序列； 所述DNA分子A具體通過(guò)權(quán)利要求5中的所述重組載體中導(dǎo)入目的植物中。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7-8中任一所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為水稻。
10. -種DNA分子A，為如下1)或2): 1) 序列為序列表中序列1自5'末端第5171-5713位核苷酸的反向互補(bǔ)序列的DNA分 子； 2) 在嚴(yán)格條件下與1)雜交且編碼相同蛋白的DNA分子。
【文檔編號(hào)】C12N15/29GK104292319SQ201410478783
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月18日
【發(fā)明者】吳金霞, 張治國(guó), 孫學(xué)輝, 路鐵剛 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所