專利名稱：大豆GmSGT基因和其5"UTR的克隆及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因及其編碼蛋白和基因的5’ UTR，特別是涉及一個(gè)來(lái)源于大豆的具有氨基轉(zhuǎn)移酶功能的抗病基因及其編碼蛋白與其在培育抗病性提高的植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)菌及真菌是危害農(nóng)作物的主要病原菌。雖然目前對(duì)某些病害已找到有效的防治方法，但對(duì)大多數(shù)嚴(yán)重危害農(nóng)作物生長(zhǎng)的病害尚無(wú)切實(shí)有效的防治措施。培育抗病品種是防治植物病害的根本措施。但由于病原菌變異迅速，可供利用的抗原匱乏，常規(guī)育種的作用受到很大程度的限制。隨著分子生物學(xué)、植物病理學(xué)及基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，運(yùn)用基因工程手段提高植物的抗病性為抗病育種開(kāi)辟了一條嶄新途徑。Taler等對(duì)印度野生、高抗霜霉病甜瓜品種Pl進(jìn)行遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，P45蛋白與抗病性緊密連鎖(PlanteR Genes That Encode Photorespiratory Enzymes Confer Resistance against Disease The Plant Cell，Vol. 16，172-184，January 2004)。根據(jù) P45蛋白部分氨基酸測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用RT-PCR的方法克隆得到兩個(gè)編碼P45蛋白的eR基因，分別命名為Atl和At2。Atl和At2核苷酸序列的同源性為88%，氨基酸序列同源性為93%。研究發(fā)現(xiàn)Atl和At2不屬于任何一類已知的eR基因，其編碼蛋白與絲氨酸乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Ser glyoxylate aminotransferase, SGT)、丙氨酸乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Ala glyoxylate aminotransferase, AGT)氨基酸序列同源性均大于80%。酶學(xué)活性分析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，植物抗、感病性與SGT、AGT的酶活有直接相關(guān)性，高抗品種中SGT、AGT酶活最高，接近100%，中抗品種中酶活大約70%，感病品種中酶活則低于25%。Taler等將Atl或At2基因轉(zhuǎn)入感病品種，感病品種即獲得抗病性，同時(shí)，SGT、 AGT和乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase, GO)的酶活性均顯著提高(Plant eR Genes That Encode Photorespiratory Enzymes ConferResistance against Disease The Plant Cell，Vol. 16，172-184，January 2004)。推測(cè) SGT 和 AGT 可能具有提高 GO 活性的功能。經(jīng)檢測(cè)，抗病植株中GO的活性是感病植株中GO活性的10-20倍。SGT、AGT和GO 是植物光呼吸中的關(guān)鍵酶，它們都在植物的過(guò)氧化物體中起作用。在過(guò)氧化物體中，GO 催化乙醇酸向乙醛酸轉(zhuǎn)化并產(chǎn)生H2O2，而SGT、AGT分別以絲氨酸和丙氨酸作為氨基供體， 催化乙醛酸向苷氨酸轉(zhuǎn)化。SGT、AGT、GO協(xié)同作用導(dǎo)致植物體內(nèi)H2O2的產(chǎn)生和積累。已知H2O2在植物抗病過(guò)程中起很重要的作用，H2O2不僅能夠直接殺死病原菌(Peng & Kuc， Phytopathol. 82 =696-699,1992)，還可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白的氧化交聯(lián)阻止病菌的侵 Λ (Bradley et al., Cell70 :21-30,1992 ；Brisson et al.，Plant Cell 6:1703—1712， 1994)及通過(guò)激活水楊酸合成以誘導(dǎo)防衛(wèi)基因的表達(dá)，使植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性(Leon et al. , PlantPhysiol. 108 :1673-1678,1995 ；Chen et al. , Science 162 :1883-1886, 1993)。懸浮細(xì)胞試驗(yàn)證明H2O2能激活植保素的合成(Apostol et al. ,Plant Physiol. 90 109-116，1989 ；Davis et al.，Phytochem. 32 :607-611,1993 ； Degousee et al.，Plant Physiol. 104 :945-952,1994)。在近來(lái)的研究中還發(fā)現(xiàn)在不親和的植物一病原互作中氧化激增產(chǎn)生的H2A不僅可作為區(qū)域信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而且還可作為擴(kuò)散信號(hào)誘導(dǎo)周?chē)辞秩炯?xì)胞中防衛(wèi)基因如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)(Levine et al. , Cell 79:583-593， 1994)。上述研究表明，eR基因?qū)Σ≡鷽](méi)有種屬?；?，是具有氨基轉(zhuǎn)移酶活性的酶學(xué)抗病基因。霜霉病是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要病害，霜霉菌寄生譜廣，能引起葫蘆科等多種作物的霜霉病，尤其是黃瓜，大豆等作物上損失慘重。霜霉菌主要引起葉片枯萎，在有利的環(huán)境條件下，菌絲的生長(zhǎng)和病害的傳播都很迅速。19世紀(jì)后期the oomycete Plasmopara viticola引起的葡萄霜霉病幾乎摧毀了法國(guó)的釀酒業(yè)，直到1885年波爾多液的發(fā)現(xiàn)才使得病害得以控制。最近由klerospora graminicola引起的霜霉病的流行導(dǎo)致了印度和西部非洲重要的原料作物一珍珠栗的嚴(yán)重?fù)p失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)來(lái)源于大豆的具有氨基轉(zhuǎn)移酶功能的酶學(xué)抗病基因及編碼蛋白和該基因的5’ UTR序列。本發(fā)明所提供的酶學(xué)抗病基因，名稱為GmSGT (Glycine max serine glyoxylate aminotransferase),來(lái)源于大豆屬大豆(Glycine max L. Merril)，是下述核苷酸序列之1)序列表中SEQ ID NO 1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO 2的DNA序列；3)序列表中SEQ ID NO 3的DNA序列4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO=I限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0. IX SSPE (或0. IX SSC)、0. SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。序列表中的SEQ ID NO 1由1260個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5，端第146位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO :2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
5)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO 3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0. IX SSPE (或0. IX SSC)、0. SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。本發(fā)明酶學(xué)抗病基因所編碼的蛋白(GmSGT)，具有下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的 SEQ ID NO 2 ；2)將序列表中SEQ ID NO 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、 缺失或添加且具有提高植物抗病性的蛋白質(zhì)。序列表中的SEQ ID NO 2由401個(gè)氨基酸殘基組成。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增GmSGT中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供提供一種提高植物抗病性的方法。
6)序列表中SEQ NO :4的DNA序列；7)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ NO 4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0. IX SSEP (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。8)序列表中SEQ NO 4由擬8個(gè)核苷酸組成，具有起始基因轉(zhuǎn)錄的功能，其中包括有有 3 個(gè) TATA-box (_17bp、-57bp 和 _196bp)，3 個(gè) CAAT-box (_23bp、_291bp、_341bp)和有 3 個(gè) G-box (_139bp、_214bp、_547bp)9)序列表中SEQ NO :4通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，包含有與生物抗病相關(guān)的順式作用元件 as-1 (激活序列1)順式調(diào)控元件。該元件位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游有+236bp和+272bp處， 它們的共有序列為T(mén)GACGTAC。本發(fā)明所提供的提高植物抗病性的方法，是將所述大豆酶學(xué)抗病基因?qū)胫参锝M織或細(xì)胞，得到抗病性提高的植物。所述大豆酶學(xué)抗病基因可通過(guò)含有所述大豆酶學(xué)抗病基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞。用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它的參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用GmSGT構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動(dòng)子、根部特異表達(dá)啟動(dòng)子等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。 翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。具體來(lái)講，用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為pBI121、pCAMBIA2301、 pCAMBIA1301、pCAMBIA1300 等，優(yōu)選為 pCAMBIA2301。以pCAMBIA2301為出發(fā)載體，構(gòu)建的植物表達(dá)載體為pGmSGT2301。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、 螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。攜帶有本發(fā)明GmSGT的植物表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、 直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是玉米、小麥、等單子葉植物， 也可以是煙草、擬南芥、菜豆等雙子葉植物。本發(fā)明從大豆品種“早豐5號(hào)”中克隆得到GmSGT，該基因與具有氨基轉(zhuǎn)移酶功能的甜瓜eR基因的核苷酸序列同源性為79. 52 %，氨基酸序列同源性為96. 76 %。將該基因轉(zhuǎn)入煙草，轉(zhuǎn)基因煙草高抗煙草青枯病和煙草黑脛病，表明GmSGT轉(zhuǎn)基因植物可高抗霜霉、 灰霉病等真菌病害。本發(fā)明將在植物病害的防治領(lǐng)域及抗病品種的繁育工作中發(fā)揮重要作用。 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。


圖1為GmSGT5’ Race PCR產(chǎn)物的1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果
圖2為質(zhì)粒pGsR的限制性內(nèi)切酶EcoRI和I^stI酶切鑒定結(jié)果
圖3為GmSGT全基因PCR產(chǎn)物的1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果
圖4為pGmSGTa的限制性內(nèi)切酶I^stI酶切鑒定結(jié)果
圖5為GmSGT植物表達(dá)載體pGmSGT2301的酶切鑒定結(jié)果
圖BGmSGT轉(zhuǎn)基因煙草抗青枯病檢測(cè)
圖7為構(gòu)建GmSGT基因啟動(dòng)子的克隆步移文庫(kù)的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果
圖8為GmSGT基因啟動(dòng)子序列分析圖
圖9為GmSGTP植物表達(dá)載體的酶切檢測(cè)圖
圖10為轉(zhuǎn)基因煙草的GUS染色結(jié)果
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。所用引物均由上海生工合成，測(cè)序工作均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大工程樓實(shí)驗(yàn)室協(xié)助完成。實(shí)施例1、GmSGT的克隆植物材料大豆品種“早豐5號(hào)”，苗齡4周時(shí)，整株噴2. OmM水楊酸，誘導(dǎo)48h。一、GmSGT5，Race 的引物設(shè)計(jì)根據(jù)gene bank (www. ncbi. nlm. nih. gov)中公布的甜瓜eR基因序列，網(wǎng)上進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)大豆受2. OmM水楊酸誘導(dǎo)48小時(shí)的EST序列中有1個(gè)46^ρ的DNA片段，與甜瓜 eR基因3’端序列同源性高達(dá)83%，推測(cè)該序列可能是大豆中同源基因的3’端基因序列， 將大豆中的該同源基因命名為GmSGT，據(jù)此設(shè)計(jì)用于GmSGT5’ Race的3’端PCR引物Pl和 P2，5，端引物 P3 和 P4 由 Invitrogen 公司的 GeneRacer 試劑盒(Cat. No. L1502-01)提供， 上述引物序列如下Pl :5，-CTGGTTGCTTTGCCTAAACGACTGTG-3，P2 :5’ -AAGAGCAGCTCTCAGACCATACAGC-3’P3 :5’ -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’P4 :5’ -GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3，二 GmSGT2全基因的克隆用下述方法進(jìn)行GmSGT全基因的克隆，具體過(guò)程包括以下步驟1、大豆RNA提取使用hvitrogen 公司的 TRIZOLk Reagent 試劑盒(Cat. No. 15596-026)并參照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取上述經(jīng)水楊酸誘導(dǎo)的大豆品種“早豐” 5號(hào)的葉片RNA，具體過(guò)程如下
1)取50_100mg大豆葉片在液氮中磨成粉末，轉(zhuǎn)入1. 5mL離心管中。2)加入ImL TRIZOL Reagent充分混勻，室溫放置5min。3)加 200 μ L 氯仿，振蕩 15s，室溫放置 2-3min, 4°C、12000g 離心 IOmin04)取上清，加入500 μ L異丙醇，室溫放置lOmin，4°C、12000g離心5min，在離心管底部可見(jiàn)白色片狀的RNA沉淀。5)棄上清，小心加入ImL 70%乙醇，不要破壞RNA片狀沉淀，k后用加樣器將液體全部吸出。6)室溫放置5-lOmin，使乙醇揮發(fā)(不要讓其完全干，否則影響溶解性)，加入 20 μ L DEPC水溶解沉淀，得到經(jīng)水楊酸誘導(dǎo)后的大豆葉片RNA。2、RNA去磷酸化本實(shí)驗(yàn)中所用10 μ L CIP 緩沖液、RNaseOUTTM、CIP、DEPC 水、氯仿 / 苯酚、10mg/mL 貝糖原(musselglycogen)，3M 醋酸鈉(ρΗ5· 2)均由 Invitrogen 公司的 GeneRacer 試劑盒提供。對(duì)步驟1提取的大豆葉片RNA用hvitrogen公司的GeneRacer試劑盒并參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行去磷酸化處理，具體方法如下1)取提取的RNA 2yL(5-10g)置于1.5mL離心管中，放置冰上，再順次加入 10 X CIP 緩沖液 1 μ L、RNaseOUT 1 μ L、CIP 1 μ L 禾口 DEPC /K 5 μ L 至總體積為 10 μ L。2)輕柔混勻，4°C稍加離心，收集液體，50°C溫浴lh。3)4°C稍加離心，置于冰上，加90 μ L DEPC水和100 μ L氯仿/苯酚，振蕩30秒， 12000g室溫離心5min。4)取上層液相，置于1個(gè)新的1. 5mL離心管中，加入2ul 10mg/mL貝糖原(mussel glycogen), 10 μ L 3Μ醋酸鈉(ρΗ 5. 2)，混勻后，加入220 μ L95%乙醇，稍加混合。5) _70°C冰箱中放置lOmin，4°C、12000g離心20min，用移液器小心吸去上清，不要碰到RNA沉淀。6)加入500μ1 70%乙醇，顛倒混勻幾次，4°C、12000g離心anin。用移液器小心吸去上清，稍加離心，將乙醇吸出。7)室溫下風(fēng)干l-2min，立即加入7 μ L DEPC水將RNA沉淀溶解，得到經(jīng)去磷酸化處理的大豆RNA。3、去掉RNA 5’端帽狀結(jié)構(gòu)本實(shí)驗(yàn)中所用TAP緩沖液、RNaseOUT 、TAP、DEPC水、氯仿/苯酚、10mg/mL貝糖原 (musselglycogen)，3M 醋酸鈉(pH5. 2)均由 hvitrogen 公司的 GeneRacer 試劑盒提供。對(duì)步驟2經(jīng)去磷酸化處理的大豆葉片RNA用hvitrogen公司的GeneRacer試劑盒并參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行5’端脫帽處理，具體方法如下 1)取步驟2經(jīng)去磷酸化的RNA 7 μ L置冰上，再依次加入IyL TAP緩沖液、1 μ L RNaseOUT 和1 μ LTAP,至總體積為10 μ L，輕柔混勻，4°C短暫離心收集液體。2) 37°C溫浴lh，4°C短暫離心收集液體，置冰上。3)加入90 μ L DEPC水和100 μ L氯仿/苯酚，振蕩混勻30秒。4) 12000g室溫離心5min，取上層液相，放入1個(gè)新的1. 5mL離心管中。5)加入 2 μ L 10mg/mL 貝糖原(mussel glycogen) ,IOyL 3M 醋酸鈉(ρΗ5· 2)，混勻，加入220 μ L 95%乙醇，稍加混合。6) _70°C冰箱中放置lOmin，4°C、12000g離心20min。用移液器小心吸去上清，不要
碰到RNA沉淀。7)加入500 μ L 70%乙醇，顛倒混勻幾次，4°C、12000g離心anin。用移液器小心吸去上清，稍加離心，將乙醇盡可能吸出。室溫下風(fēng)干Ι-aiiin，立即加入7yL DEPC水將RNA
沉淀溶解。4、將RNA Oligo與經(jīng)5’端脫帽處理的大豆RNA連接本實(shí)驗(yàn)中所用裝有0. 25 μ g GeneRacer RNA Oligo凍干粉的離心管、10X連接緩沖液、IOmM ATP,Rnase0ut ,T4 RNA 連接酶、DEPC 水、氯仿 / 苯酚、10mg/mL 貝糖原(mussel glycogen)，3M 醋酸鈉(pH 5. 2)均由 Invitrogen 公司 GeneRacer kit 提供。對(duì)上述經(jīng)去磷酸化、脫帽處理的大豆葉片RNA用hvitrogen公司的GeneRacer試劑盒并參照試劑盒說(shuō)明書(shū)將其與RNA Oligo進(jìn)行連接，具體方法如下1)取7yL上述經(jīng)去磷酸、脫帽處理的大豆RNA，加入裝有0. 25yg GeneRacer RNA Oligo凍干粉的離心管中，用移液器混勻，短暫離心。2) 65°C溫浴5min，去掉RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)(由于揮發(fā)作用，體積會(huì)減小到6 μ L)。冰上放置2min，短暫離心。3)加入 IyL IOx 連接緩沖液、1 μ L IOmM ATP、1 μ L RnaseOut , 1 μ L T4 RNA 連接酶，用移液器混勻，37°C溫浴lh，短暫離心，置于冰上。4)加入90 μ L DEPC水和100 μ L氯仿/苯酚，振蕩混勻30s。5) 12000g室溫離心5min，取上層液相，放入1個(gè)新的1. 5mL離心管中。加入2 μ L 10mg/mL 貝糖原(mussel glycogen)，10 μ L 3Μ 醋酸鈉(ρΗ5. 2)，混勻，加入 220 μ L 95% 乙醇，稍加混合，-70°C冰箱中放置lOmin。6)4°C、12000g離心20min，用移液器小心吸去上清。7)加入500yL 70 %乙醇，顛倒混勻，4°C、12000g離心anin。用移液器小心吸去上清。稍加離心，將乙醇盡可能吸出。室溫風(fēng)干Ι-aiiin。立即加入IOyL DEPC水溶解RNA沉淀。5、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA本實(shí)驗(yàn)中所用Gene Racer Oligo dT Primer, dNTP Mix，無(wú)菌蒸餾水、5X 第一鏈緩沖液，0. IM DTT, RNaseOut , SuperScript III RT 緩沖液和 RnaseH 均由 hvitrogen 公司的GeneRacer試劑盒提供。以步驟5獲得的大豆葉片RNA為模板，用hvitrogen公司的GeneRacer試劑盒并參照試劑盒說(shuō)明書(shū)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體方法如下1)取步驟5經(jīng)處理的大豆葉片RNA 10yL，加入IyL Gene Racer Oligo dT Primer, 1 μ L dNTP Mix, 1 μ L 無(wú)菌蒸餾水。2)65°C溫浴5min，去掉RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)，冰浴5min，短暫離心。3)依次加入 4yL 5X 第一鏈緩沖液，IyL 0. IM DTT, 1 μ L RNaseOut , 1 μ L superscript III RT緩沖液，至總體積20 μ L，用移液器混勻。4)離心，50°C溫浴 50min。5)70°C溫浴15min，停止反應(yīng)，冰上放置2min，離心。
6)加入 1 μ L RnaseH, 37°C溫浴 20min。7)短暫離心，反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA可立即用于PCR擴(kuò)增或置_20°C保存。6、目的基因的PCR擴(kuò)增以上述獲得的cDNA為模板，首先在引物Pl和P3的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件為先 95°C 5min ；再 94°C 30s, 67°C lmin，72°C 2min，共 30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C IOmin0再取1μ 1上述PCR產(chǎn)物，并以之為模板，在引物P2和P4的引導(dǎo)下，進(jìn)行第二次PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件為先 95°C 5min;再 94°C 30s，64°C lmin，72°C 2min，共 30 個(gè)循環(huán)；最后72°C IOmin0 PCR反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖 1所示，在944bp處有一明顯的擴(kuò)增條帶。7、凍融法回收PCR產(chǎn)物1)將上述擴(kuò)增的長(zhǎng)度約960bp的目的基因片段從瓊脂糖凝膠上切下，置于一新的
離心管中。2)加入TE緩沖液200 μ L，在振蕩器上振蕩5min，再放入液氮中冷凍5min。3)取出，在65°C下水浴5min。4)按步驟2-3所述方法重復(fù)冷凍、融化兩次。5)依次用苯酚、苯酚/氯仿、氯仿抽提，用無(wú)水乙醇沉淀DNA，然后加入4μ L無(wú)菌水溶解沉淀，沉淀即為回收的目的片段。8、PCR產(chǎn)物的克隆使用載體pMD18-T (TaKaRa，Cat. No. D504A)試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物的克隆。具體方法為取步驟7獲得PCR回收產(chǎn)物2 μ L，依次加入0. 5 μ L載體pMD18_T、2. 5 μ L Ligase Solution I，然后16°C連接8h。將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，經(jīng)篩選得到陽(yáng)性重組克隆，將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為pkR，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和I^stI進(jìn)行酶切鑒定，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，表明944bp的目的片段已正確連接入載體PMD18-T中，對(duì)pMeR做進(jìn)一步的測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果表明插入片段具有序列表中 SEQ ID NO 3的核苷酸序列。9、GmSGT全基因的克隆根據(jù)pGsR的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)引物P5和P6PCR擴(kuò)增GmSGT的全基因序列，引物序列如下P5 :5， -CTGCAGATGGATTATTTCAATGCACCAGGAAG-3，P6 :5， -CTGCAGGTCGACGAATGACTTGTGACTCAAATCCTGG-3，以大豆cDNA為模板，P5和P6為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94°C lmin,52°C lmin,72°C 1. 5min，共35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，回收約1.2bp的PCR產(chǎn)物，將其與載體pMD18-T Simple (TaKaRa, Cat. no. D506A)進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物用TSS法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，經(jīng)篩選得到陽(yáng)性重組克隆，將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為PSGT3，對(duì)其用限制性內(nèi)切酶I^stI進(jìn)行酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果表明約1.2bp的目的片段已正確連接入載體pMD18-TSimple中，測(cè)序結(jié)果表明插入片段具有序列表中SEQ ID NO 1的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID NO :1由 1260個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5，端第146位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO 2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。進(jìn)行核苷酸及氨基酸序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明該基因與甜瓜eR基因DNA序列的同源性為79. 52% ；其編碼的氨基酸序列與甜瓜eR基因所編碼的氨基酸序列同源性為88. 03%。實(shí)施例2、GmSGT植物表達(dá)載體pGmSGT2301的構(gòu)建一、中間載體pSGT3a構(gòu)建本實(shí)施例所構(gòu)建的基因GmSGT的表達(dá)盒中包括以下基因表達(dá)調(diào)控元件5’端的 35S啟動(dòng)子、基因GmSGT和3’端的NOS終止子。首先利用限制性內(nèi)切酶I^stI單切克隆載體 PSGT3，回收1. 2bp的目標(biāo)片段，連接入載體ρΤΩ4Α。酶切驗(yàn)證1. 2bp的目標(biāo)片段已連接入 ΡΤΩ4Α(如圖 4)。二、GmSGT植物表達(dá)載體pGmSGT2301的獲得GmSGT植物表達(dá)載體pGmSGT2301的具體方法為對(duì)質(zhì)粒載體pSGT3a用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI進(jìn)行酶切，回收約2100bp的含GmSGT目的表達(dá)盒，將其與經(jīng)相同酶酶切的植物表達(dá)載體PCAMBIA2301進(jìn)行連接，得到GmeR植物表達(dá)載體，命名為pGmSGT2301。 對(duì)其用限制性內(nèi)切酶I3StI進(jìn)行酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果如圖5所示，酶切產(chǎn)物片段大小為 2100bp，與預(yù)期結(jié)果相符。實(shí)施例3、GmSGT轉(zhuǎn)基因煙草的抗病性鑒定將實(shí)施例2構(gòu)建的植物表達(dá)載體pGmSGT2301用凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404。 再用葉盤(pán)法將整合有pGmSGT2301的根癌農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化煙草NC89，獲得GmSGT 轉(zhuǎn)基因煙草20株。采用整株葉片接種法，以非轉(zhuǎn)基因煙草為對(duì)照，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行青枯病的抗病性鑒定，具體方法如下測(cè)定煙草品種抗青枯病的程度，一般在病區(qū)的連作田塊自然發(fā)病，也可以經(jīng)過(guò)人工接種觀察對(duì)青枯病的抗性。青枯病菌接種體的制備將20°C下保存于無(wú)菌水中的青枯菌，在PAD培養(yǎng)基平板上劃線，培養(yǎng)于觀-30 V下，24h后挑取典型單菌落移置于PAD培養(yǎng)基斜面，在觀°C下再培養(yǎng) 24h后用無(wú)菌水稀釋，稀釋成所需要的接菌濃度(3 X IO8個(gè)細(xì)菌/mL)。將苗齡40天的轉(zhuǎn)基因煙苗，移栽至營(yíng)養(yǎng)缽中，待煙苗成活后，用根灌菌液的方法， 每株灌20mL的細(xì)菌懸浮液，接種后置于恒溫室中，并將營(yíng)養(yǎng)缽中放在盛水的瓷盤(pán)中保濕，觀察發(fā)病情況，并于接種后第7、10、15、21、30天進(jìn)行調(diào)查，計(jì)算發(fā)病率和病情指
數(shù)，病情指數(shù)的計(jì)算方法為
權(quán)利要求
1.大豆酶學(xué)抗病基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID NO 1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID NO 2的DNA序列；3)高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQID NO 1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆酶學(xué)抗病基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID NO 1 的 DNA 序列。
3.權(quán)利要求1所述的大豆酶學(xué)抗病基因的編碼蛋白，其特征在于所述蛋白是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQID NO 2 ；2)將序列表中SEQID NO 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有提高植物抗病性的的蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求3所述的大豆酶學(xué)抗病基因的編碼蛋白，其特征在于所述蛋白具有序列表中SEQ ID NO 2的氨基酸殘基序列。
5.含有權(quán)利要求1或2所述基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。
6.一種提高植物抗病性的方法，是將權(quán)利要求1或2所述的大豆酶學(xué)抗病基因?qū)胫参锝M織或細(xì)胞，得到抗病性提高的植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述大豆酶學(xué)抗病基因通過(guò)含有所述大豆酶學(xué)抗病基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體為 pBI121、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301 或 pCAMBIA1300。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體為 pCAMBIA2301。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述植物表達(dá)載體為pGmeR121。
10.大豆GmSGT基因5，UTR序列1)一種與抗病性相關(guān)基因GmSGT的啟動(dòng)子序列，其DNA序列如SEQ ID NO 4所示。2)包含SEQID NO 4所述DNA的重組載體。3)根據(jù)權(quán)利要求含SEQID NO :4的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)大豆酶學(xué)抗病基因，其編碼蛋白及其5’UTR序列。其目的是提供一個(gè)大豆酶學(xué)抗病基因及其編碼蛋白在培育高抗病性植物中的應(yīng)用。該基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)序列表中SEQ ID NO4的DNA序列；5)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。其編碼蛋白是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO2；2)將序列表中SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有提高植物抗病性的的蛋白質(zhì)。本發(fā)明將在植物病害的防治領(lǐng)域及抗病品種的繁育工作中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102242134SQ20101016780
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2010年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月11日
發(fā)明者劉昱輝, 孫文麗, 李梅, 賈士榮 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所