一種檢測口蹄疫a型病毒的試劑盒及制備和使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種用于檢測口蹄疫A型病毒的試劑盒，及試劑盒制備方法和這種試劑盒的非疾病診斷目的的使用方法。本發(fā)明的擴(kuò)增口蹄疫A型病毒的引物的基因序列有四條；本發(fā)明的檢測口蹄疫A型病毒的試劑盒內(nèi)包括有前述基因序列的四條引物。相關(guān)的實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的可特異性快速擴(kuò)增口蹄疫A型病毒的核酸，通過核酸電泳檢測到特異性條帶，同時具有特異性。相關(guān)的實(shí)驗(yàn)提示本發(fā)明的序列可在制備快速鑒別口蹄疫A型病毒的GeXP診斷試劑盒中的應(yīng)用，并在口蹄疫病毒流行病學(xué)研究中應(yīng)用。
【專利說明】-種檢測口蹄疫A型病毒的試劑盒及制備和使用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測口蹄疫A型病毒的試劑盒，及試劑盒制備方法和這種試 劑盒的非疾病診斷目的的使用方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)引起的動物急性、烈性傳染病，主要危害豬、牛、羊痘偶蹄動物，發(fā)病 率極高，造成了巨大的政治、經(jīng)濟(jì)損失，因此被世界衛(wèi)生組織（OIE)列為A類傳染病的首位。 FMDV可以分為7個血清型，即A型、0型、C型、Asia 1型、SAT 1型、SAT 2型和SAT 3型， 每個血清又有許多不同的亞型，且各血清型之間沒有交叉性免疫，同一血清型的各亞型之 間僅有部分交叉免疫。
[0003] 口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)引起的動物急性、烈性傳染病，主要危害豬、牛、羊痘偶蹄動物，發(fā)病 率極高，造成了巨大的政治、經(jīng)濟(jì)損失，因此被世界衛(wèi)生組織（OIE)列為A類傳染病的首位。 FMDV可以分為7個血清型，即A型、0型、C型、Asia 1型、SAT 1型、SAT 2型和SAT 3型， 每個血清又有許多不同的亞型，且各血清型之間沒有交叉性免疫，同一血清型的各亞型之 間僅有部分交叉免疫。
[0004] 口蹄疫病毒的分型鑒別診斷一直是研究的熱點(diǎn)。研究表明，口蹄疫病毒的A、0、 Asia 1三種血清型的RNA序列同源性約為70%左右，然而其編碼結(jié)構(gòu)蛋白的Pl區(qū)域的差異 比較好，該區(qū)域的核苷酸序列也常常被用來進(jìn)行口蹄疫病毒的分型及進(jìn)化分析。在病毒的 這些基因中，VPl蛋白參與病毒的吸附、入侵、免疫反應(yīng)，并且與病毒的血清型特異性有關(guān)。 因此VPl的基因序列通常被用來進(jìn)行FMDV不同毒株之間的親緣關(guān)系分析，從而研究口蹄 疫的分子流行病學(xué)規(guī)律。準(zhǔn)確鑒定分離株種屬和弄清其來源將有助于口蹄疫的流行病學(xué)分 析，具有重要意義。
[0005] 由于RT-PCR快速，靈敏和可靠性的優(yōu)點(diǎn)，該方法已被廣泛地用于口蹄疫診斷。近 年來各種RT-PCR檢測方法已用于早期上皮細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)分離和其組織中口蹄疫病毒RNA 的檢測（Meyer RF, et al.，1991)。Rodriguez等首次可通過RT-PCR對口蹄疫病毒0型、 A型和C型進(jìn)行分型檢測（Rodriguez A, et al. ,1992)。自此以后不同血清型特異性 引物RT-PCR方法已被用于口蹄疫病毒7個血清型份分型檢測（Callens, et al.，1997; Vangrysperre, et al.，1996)。這些檢測引物位于口蹄疫病毒基因組的不同位置，包括5' 非編碼區(qū)、開放閱讀框和3'端非編碼區(qū)。為了提高RT-PCR診斷靈敏度，多組引物結(jié)合的多 重檢測也被用于口蹄疫的檢測（Giridharan P，et al.，2005; Bao H，et al.，2008)，但是 這些RT-PCR方法的靈敏度依然有限，若前期再結(jié)合ELISA方法一起使用必然會使該過程更 加耗時費(fèi)力。
[0006] 最近，實(shí)時熒光定量RT-PCR方法已被用于口蹄疫病毒的檢測，該方法不需要PCR 后期處理(例如凝膠分析)且通過應(yīng)信號來直接監(jiān)視目標(biāo)cDNA的擴(kuò)增。TaqMan實(shí)驗(yàn)的檢測 效果同抗原結(jié)合ELISA的病毒分離實(shí)驗(yàn)一樣（Reid SM, etal. ,2003)。目前，兩種不同的 實(shí)時熒光定量RT-PCR TaqMan實(shí)驗(yàn)已普遍使用，一種針對5'非編碼區(qū)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位 點(diǎn)（IRES) (Reid SM, et al.，2002)和第二種針對3D (RNA聚合酶）的編碼序列。實(shí)時熒 光定量RT-PCR方法的速度和準(zhǔn)確性可以從樣品核酸提取到實(shí)驗(yàn)建立的計(jì)算機(jī)操作的偶聯(lián) 進(jìn)一步提高。這使得該檢測適合于主要指示病例診斷和在持續(xù)疫情中的檢測。實(shí)時/定量 RT-PCR試驗(yàn)?zāi)壳霸谠S多發(fā)達(dá)國家作為一種口蹄疫病毒診斷和定量的常規(guī)測試。但是，這些 實(shí)驗(yàn)不是專門設(shè)計(jì)用于的區(qū)分口蹄疫病毒血清型。已經(jīng)證明5'端非編碼區(qū)檢測在A血清 型病毒的檢測中更敏感，而在3D檢測試驗(yàn)對檢測SAT病毒具有更高的靈敏度（King DP, et al.，2006)。另外，由于探針靶向區(qū)域的核苷酸錯配，這些檢測方法不能檢測少量的FMDVs。 因此，任何一種單獨(dú)的檢測方法不能100%的檢測FMDV。最近，Tam等報(bào)道了用于口蹄疫病 毒檢測和病毒分型熒光多重rRT-PCR檢測方法，該方法具有更高的檢測靈敏度，但卻不能 區(qū)分某些血清型之間的交叉反應(yīng)性（Tam S，et al.，2009)。
[0007] rRT-PCR便攜式設(shè)備使得FMDV野外樣品的檢測成為可能，然而這種設(shè)備比較昂 貴、比較脆弱且精密度要求比較高。因此，其他的方法，如環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增的方法被用來進(jìn)行野 外樣品的檢測。LAMP在一個恒定的溫度擴(kuò)增特異性核苷酸序列，因此不需要熱循環(huán)儀。該 方法基于DNA序列通過一自動循環(huán)鏈置換反應(yīng)擴(kuò)增的原理，使用一組兩個特別設(shè)計(jì)的內(nèi)引 物和兩個外引物和具有鏈置換高活性的DNA聚合酶進(jìn)行該測定法（et al.，2000)。引物在 初始階段識別6個獨(dú)立的靶序列和在LAMP反應(yīng)的后期階段識別4個獨(dú)立的序列，使用標(biāo)準(zhǔn) 的水浴或加熱塊進(jìn)行該反應(yīng)少于一個小時，然后對結(jié)果用肉眼進(jìn)行可視化觀察。其優(yōu)點(diǎn)為 其簡單操作，反應(yīng)快速且結(jié)果直觀，這使得該方法已被許多疾病流行國家進(jìn)行野外樣品檢 測。已有口蹄疫病毒高通量的RT-LAMP的建立，然而該方法由于容易污染造成假陽性，就尚 未得廣范的認(rèn)可（Dukes JP, et al.，2006)。
[0008] ELISA和RT-PCR結(jié)合的口蹄疫檢測方法具有很高的可靠性和準(zhǔn)確性，但樣品從采 樣點(diǎn)到實(shí)驗(yàn)室的運(yùn)輸問題成為口蹄疫病毒早期診斷的最大障礙。因此，在疑似疫情點(diǎn)急需 一種可以用于疾病快速診斷和特異性檢測的方法。由Reid等人建立一種基于單克隆抗體 的口蹄疫層析試紙條技術(shù)（Reid SM, et al.，2001)。該試紙條檢測上皮懸浮液測試中的口 蹄疫病毒抗原靈敏性與常規(guī)抗原ELISA靈敏性一樣，且對口蹄疫病毒血清型0, A，C和Asia 1在細(xì)胞培養(yǎng)上清有著100%等效的敏感性，但是卻不能夠?qū)@些血清型進(jìn)行區(qū)分。因此， 急需一種靈敏度高的能夠特異性區(qū)分不同F(xiàn)MDV型別的高通量的檢測方法。
[0009] 研究表明，口蹄疫病毒的A、0、Asia 1三種血清型的RNA序列同源性約為70%左 右，然而其編碼結(jié)構(gòu)蛋白的Pl區(qū)域的差異比較好，該區(qū)域的核苷酸序列也常常被用來進(jìn)行 口蹄疫病毒的分型及進(jìn)化分析。在病毒的這些基因中，VPl蛋白參與病毒的吸附、入侵、免 疫反應(yīng)，并且與病毒的血清型特異性有關(guān)。因此VPl的基因序列通常被用來進(jìn)行FMDV不同 毒株之間的親緣關(guān)系分析，從而研究口蹄疫的分子流行病學(xué)規(guī)律。準(zhǔn)確鑒定分離株種屬和 弄清其來源將有助于口蹄疫的流行病學(xué)分析，具有重要意義。根據(jù)口蹄疫病毒VPl基因組 序列構(gòu)建進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，A型有10個亞型（I - X);0型也有10個亞型，即歐洲-南美洲 型（Euro-SA)、中東-南非型（ME-SA)、東南亞型（SEA)、中國型（CHY)、西非型（WA)、東非1型 (EA-1)、東非 2 型（EA-2)、東非 3 型（EA-3)、印尼 1 型（ISA-I)和印尼 2 型（ISA-2);Asia 1 有6個亞型（I -VI)。此外，VPl基因也常被用來進(jìn)行A、0、Asia 1的分型檢測。因此，本 發(fā)明選擇口蹄疫病毒的A型VPl序列作為靶基因的區(qū)域，根據(jù)GeXP多重PCR檢測體系引物 的要求設(shè)計(jì)口蹄疫病毒A型的特異性引物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明提供一種可克服現(xiàn)有技術(shù)不足的、具有快速、高靈敏度、高通量的、可用于 檢測口蹄疫A型病毒的擴(kuò)增口蹄疫A型病毒的引物，由這種引物構(gòu)成的檢測試劑盒，這種試 劑盒的制備方法和非疾病檢測的這種試劑盒使用方法。
[0011] 本發(fā)明的擴(kuò)增口蹄疫A型病毒的引物的基因序列為SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、 SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4;本發(fā)明的檢測口蹄疫A型病毒的試劑盒內(nèi)包括有前述基因序 列為 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 的四條引物，其中引物 SEQ ID No. 3的5'端添加有Cy5熒光標(biāo)簽。
[0012] 本發(fā)明的試劑盒非疾病診斷目的的使用方法是：首先以A型病毒的RNA為模板，用 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 引物進(jìn)行擴(kuò)增，再對 PCR 產(chǎn)物的 進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，根據(jù)毛細(xì)管電泳信號分析圖上241bp處是否出現(xiàn)峰值，且信號大于 2000判定被檢樣品的陰陽性。
[0013] 相關(guān)的實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的序列SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2 (即FMDV-A-F和 FMDV-A-R)可特異性快速擴(kuò)增口蹄疫A型病毒的核酸，通過核酸電泳檢測到特異性條帶，但 同等條件下不能擴(kuò)增口蹄疫〇型病毒、口蹄疫病毒Asia 1病毒、水皰性口炎病毒和豬水泡 病病毒的核酸。
[0014] 相關(guān)的實(shí)驗(yàn)提示本發(fā)明的序列可在制備快速鑒別口蹄疫A型病毒的GeXP診斷試 劑盒中的應(yīng)用，并在口蹄疫病毒流行病學(xué)研究中應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1為口蹄疫A型病毒引物特異性驗(yàn)證的核酸電泳檢測結(jié)果。其中口蹄疫A型病 毒引物可以特異性地?cái)U(kuò)增出FMDV-A型的基因組片段，而口蹄疫Asia 1型病毒、口蹄疫0型 病毒、水皰性口炎病毒和豬水泡病病毒均無特異性條帶產(chǎn)生，說明口蹄疫A型病毒的GeXP 引物的特異性非常高。
[0016] 圖2為口蹄疫A型病毒引物PCR靈敏性驗(yàn)證的核酸電泳檢測結(jié)果。其中M為DL2000 Marker ;1為IO9個拷貝；2為IO8個拷貝；3為IO7個拷貝；4為IO 6個拷貝；5為IO5個拷貝； 6為IO4個拷貝；7為IO3個拷貝；8為IO 2個拷貝；9為10個拷貝。由圖可見109~104個拷 貝的模板均由特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，隨著模板量的減少，產(chǎn)物條帶變暗。從圖可以看出本發(fā)明所 設(shè)計(jì)的口蹄疫A型病毒GeXP引物在58°C條件下PCR反應(yīng)最少可以檢出IO 4個拷貝的模板。
[0017] 圖3為口蹄疫A型病毒GeXP引物的GeXP-PCR特異性檢測結(jié)果。從圖可以看出口 蹄疫病毒A型241bp處出現(xiàn)峰值，且信號大于2000時認(rèn)為是陽性結(jié)果。同時用口蹄疫A型 病毒的引物對口蹄疫〇型病毒、口蹄疫Asia 1型病毒、水皰性口炎病毒和豬水泡病病毒基 因組進(jìn)行GeXP反應(yīng)時沒有任何信號峰出現(xiàn)，這說明口蹄疫A型病毒的GeXP引物具有非常 好的特異性。
[0018] 圖4至圖7分別為不同拷貝的模板口蹄疫A型病毒用本發(fā)明的GeXP引物的擴(kuò)增 后用GeXP-PCR檢測的靈敏性檢測結(jié)果。其中圖4為10 4C〇pieS，圖5為103C〇pieS，圖6為 102copies，圖7為lOcopies。結(jié)果顯不104copies/ML?IO 2 copies/ML的模板均可以檢測到 特異性的峰值，隨著模板量的檢測，峰值的信號強(qiáng)度也不斷的減弱，在10 copies/ML時特異 性的信號峰值不足2000。從圖中可以看出本發(fā)明中所設(shè)計(jì)的口蹄疫A型病毒GeXP引物在 本發(fā)明檢測體系中可以檢測出l〇 2copies/ML的模板。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)解說. 1.序列的制備 根據(jù)GeXP引物設(shè)計(jì)要求和NCBI公布的FMDV-A型的基因組，選擇保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性 引物，并通過添加通用引物形成特異性嵌合引物，而通用引物序列屬于非生物源性的核苷 酸序列，此外合成通用引物序列，并在上游通用引物的5 '端添加Cy5熒光標(biāo)簽。本發(fā)明的 可特異性擴(kuò)增口蹄疫A型病毒核酸的引物：AGGTGACACTATAGAATAGGGTGATCTAGGGTCTCTCGC， 在本發(fā)明中被命名為 FMDV-A-F ;GTACGACTCACTATAGGGACAGGAGCTGCITTGCAGGTGCAAT，在本 發(fā)明中被命名為FMDV-A-R。用于本發(fā)明的通用引物：Cy5 AGGTGACACTATAGAATA，在本發(fā)明 中被命名為UWD-F ;GTACGACTCACTATAGGGA，本發(fā)明中被命名為UEV-R。
[0020] 2.病毒基因組提取 單層細(xì)胞長至80%以上融合后，接種病毒，37°C孵育30min后棄去毒液。加入細(xì)胞維持 液，37°C 5% CO2培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞病變（CPE)，待90%以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE后收毒。將病毒 反復(fù)凍融3次，置-20°C冰箱保存?zhèn)溆?。使用TaKaRa公司DNA提取試劑盒提取細(xì)胞毒株中 的 RNA。
[0021] 3. FMDV-A引物特異性驗(yàn)證 以提取純化的病毒RNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)體系如下：

【權(quán)利要求】
1. 用于檢測口蹄疫A型病毒的引物，其特征在于引物基因序列為SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4。
2. -種檢測口蹄疫A型病毒的試劑盒，其特征在于試劑盒內(nèi)包括有基因序列為SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 的四條引物，其中引物 SEQ ID No. 3 的 5' 端添加有Cy5熒光標(biāo)簽。
3. 權(quán)利要求2所述試劑盒非疾病診斷目的的使用方法，其特征在于：首先以A型病毒 的 RNA 為模板，用 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 引物進(jìn)行擴(kuò)增， 再對PCR產(chǎn)物的進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，根據(jù)毛細(xì)管電泳信號分析圖上241bp處是否出現(xiàn)峰 值，且信號大于2000判定被檢樣品的陰陽性。
【文檔編號】C12Q1/70GK104212916SQ201410465735
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】張強(qiáng), 盧昌, 趙志荀, 吳國華, 顏新敏, 李應(yīng)國, 岳華, 周曉黎, 李健, 朱海霞, 代雪玲, 田波, 蘆曉立, 高順平, 王曼 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所