一種用于鑒定才女蟲復(fù)合體種類的引物及方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于鑒定才女蟲復(fù)合體種類的引物，所述引物為引物1或引物2，其中引物1由引物F1和引物R1組成，引物F1的序列如SEQ ID No.1所示，引物R1的序列如SEQ ID No.2所示，引物2由引物F2和引物R2組成，引物F2的序列如SEQ ID No.3所示，引物R2的序列如SEQ ID No.4所示，還公開了一種利用上述引物鑒定才女蟲復(fù)合體種類的方法以及上述引物在鑒定才女蟲復(fù)合體種類方面的應(yīng)用。
【專利說明】一種用于鑒定才女蟲復(fù)合體種類的引物及方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于寄生蟲分子鑒定領(lǐng)域，具體涉及一種用于鑒定才女蟲復(fù)合體種類的引 物及方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 才女蟲隸屬于環(huán)節(jié)動物門、多毛綱、海稚蟲科，是指海稚蟲科中第五剛節(jié)發(fā)生變形 的所有種類的合稱。目前，才女蟲的分類主要依靠形態(tài)特征，如粗足刺、觸手、腦后脊等的形 態(tài)變化等來區(qū)分不同種類。有時還需要蟲體的活體形態(tài)特征，如體色、觸手顏色等。由于部 分才女蟲能鉆入貝類堅硬的貝殼內(nèi)形成洞穴，要從洞穴內(nèi)完整地挑出才女蟲難度很大。即 使獲得了完整蟲體，由于才女蟲的活體特征變化大，且其分類的性狀特征相似性高，故亦不 易區(qū)分。因此，才女蟲的這種分類方法不但分類鑒定的難度大，而且很容易造成對種類的錯 誤鑒定。
[0003] 與才女蟲的形態(tài)學(xué)分類方法相比較，基于基因標(biāo)記的分子分類方法具有更穩(wěn)定的 特征，且不需要完整的才女蟲樣品。結(jié)合才女蟲的形態(tài)學(xué)特征，通過比較才女蟲種間或種內(nèi) 的標(biāo)記基因序列的相似度、遺傳距離等，能夠輕而易舉地進(jìn)行才女蟲的分類鑒定。
[0004] 才女蟲的分子分類方法的關(guān)鍵是分子標(biāo)記的篩選。一個理想的分子標(biāo)記必須具備 以下三點(diǎn)：（1)序列變異水平適宜，可以將不同物種彼此區(qū)分開來，同時種內(nèi)變異較?。唬?) 分子標(biāo)記兩端序列高度保守，能夠設(shè)計通用引物，且易于PCR擴(kuò)增；(3)擴(kuò)增片段長度適中， 最好700bp左右。但目前還沒有篩選出良好的用于才女蟲分子分類方法的分子標(biāo)記。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個目的在于提供一種用于鑒定才女蟲復(fù)合體種類的引物，該引物通 過才女蟲線粒體基因中的細(xì)胞色素 C氧化酶亞基I基因（COI)設(shè)計獲得，其能特異地擴(kuò)增 才女蟲線粒體COI序列。
[0006] 本發(fā)明的目的還在于提供一種利用上述引物鑒定才女蟲復(fù)合體種類的方法，該方 法可通過獲取才女蟲的COI序列數(shù)據(jù)，快速、準(zhǔn)確地判斷出才女蟲的種類。
[0007] 本發(fā)明的最后一個目的在于提供上述用于鑒定才女蟲復(fù)合體種類的引物在鑒定 才女蟲復(fù)合體種類方面的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的第一個目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種用于鑒定才女蟲復(fù)合體 種類的引物，所述引物為引物對1或引物對2,其中引物對1由引物Fl和引物Rl組成，引物 Fl的序列如SEQ ID No. 1所示，引物Rl的序列如SEQ ID No. 2所示，引物對2由引物F2和 引物R2組成，引物F2的序列如SEQ ID No. 3所示，引物R2的序列如SEQ ID No. 4所示。
[0009] 本發(fā)明 申請人:通過試驗發(fā)現(xiàn)，才女蟲線粒體基因中的細(xì)胞色素 C氧化酶亞基I基 因（COI)最適合作為才女蟲分子鑒定的分子標(biāo)記。才女蟲種間的COI序列遺傳距離是種內(nèi) 遺傳距離的10倍左右，分辨率極高，且能設(shè)計通用引物，易于擴(kuò)增，片段長度適中。因此， COI基因是快速、準(zhǔn)確地鑒定和區(qū)分才女蟲種類的理想分子標(biāo)記。
[0010] 本發(fā)明上述引物對1或引物對2的設(shè)計原理是以才女蟲的COI序列為引物設(shè)計模 板，然后根據(jù)環(huán)節(jié)動物種類的共同COI序列作為輔助模板，設(shè)計出上述才女蟲的簡并引物 對1或引物對2,上述引物對1或引物對2能特異地擴(kuò)增才女蟲線粒體COI序列。
[0011] 本發(fā)明的第二個目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種鑒定才女蟲復(fù)合體種類 的方法，包括以下步驟：
[0012] (1)引物設(shè)計：設(shè)計才女蟲COI序列，以才女蟲COI序列為設(shè)計模板，設(shè)計上述引 物對1或引物對2 ;
[0013] (2)DNA提?。禾崛〔煌排x樣品的DNA ;
[0014] (3)PCR擴(kuò)增：以步驟（2)中提取的才女蟲樣品的DNA作為模板DNA，先采用上述引 物對1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如擴(kuò)增無條帶，則采用上述引物對2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后， 進(jìn)行電泳檢測，如采用引物對1進(jìn)行擴(kuò)增時，電泳結(jié)果顯示在IOOObp附近具有單一條帶或 采用引物對2進(jìn)行擴(kuò)增時，電泳結(jié)果顯示在700bp附近具有單一條帶，則說明擴(kuò)增成功，如 無條帶、多帶或條帶長度不符時，則視為擴(kuò)增失敗；
[0015] (4)測序：取步驟⑶中擴(kuò)增成功的PCR反應(yīng)液，進(jìn)行測序，采用雙向測序，測序引 物為PCR擴(kuò)增時采用的引物，將測序所得序列進(jìn)行拼接和比對，獲得所有樣品的完整序列， 計算所有樣品序列間的遺傳距離，如兩兩序列的遺傳距離小于〇. 03,則被認(rèn)為是同種，如果 序列間遺傳距離大于〇. 15,則被認(rèn)為是不同種。
[0016] 步驟（3)中PCR反應(yīng)時50yL反應(yīng)體系優(yōu)選包括2yL模板DNA，5yL 10XPCR buffer，2U Taq 酶，5yL IOXTaq buffer，0.25mM dNTP mixture，引物 F1、引物 Rl 或引物 F2、引物 R2 各 40pM。
[0017] 步驟（3)中 PCR 反應(yīng)條件優(yōu)選首先 95 °C 5min，再 94 °C 30sec、50°C 30sec、 72°C Imin 共 30 個循環(huán)，再 72°C lOmin，10°C保存。
[0018] 本發(fā)明的最后一個目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：上述用于鑒定才女蟲復(fù)合 體種類的引物在鑒定才女蟲復(fù)合體種類方面的應(yīng)用。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0020] (1)核糖體RNA基因是目前才女蟲分子鑒定中最常用的分子標(biāo)記，但是，由于該基 因過度保守，才女蟲的種間種內(nèi)遺傳距離非常接近，因此不適合作為才女蟲分子標(biāo)記，線粒 體COI基因是中度保守基因，進(jìn)化速度比核糖體RNA快，COI基因非常適于才女蟲的分子 分類鑒定，才女蟲的種間種內(nèi)遺傳距離差距大，分辨率高，且能設(shè)計通用引物、易于擴(kuò)增、測 序；
[0021] (2)本發(fā)明利用COI基因作為分子標(biāo)記進(jìn)行才女蟲種類鑒定，在首次完成形態(tài)學(xué) 鑒定和獲取相應(yīng)的DNA數(shù)據(jù)后，或通過NCBI數(shù)據(jù)庫Blast搜索，即可通過獲取才女蟲的COI 序列數(shù)據(jù)，快速、準(zhǔn)確地判斷出才女蟲的種類，與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定相比，基于COI基因的 分子鑒定不需要才女蟲活體，也不需要完整的蟲體，亦不需要專業(yè)人員鑒定，即可準(zhǔn)確鑒定 才女蟲種類，減少因人為誤判或活體特征變化等因素造成的錯誤鑒定種類。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1才女蟲COI引物特異性檢驗圖，泳道1-6分別為石灰蟲、纓鰓蟲、單殖吸蟲、雜 色鮑、草魚、石斑魚樣品；泳道7-11分別為5種不同的才女蟲樣品；泳道12為陰性對照。

【具體實施方式】
[0023] 實施例1引物設(shè)計
[0024] 1、引物設(shè)計
[0025] 首先利用線粒體通用引物對16S arL和16S brH擴(kuò)增出才女蟲的16S序列并 測序，然后根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計引物進(jìn)行Long PCR擴(kuò)增線粒體剩余序列并測序，成功獲取 才女蟲線粒體的全長序列。在NCBI線粒體全長頁面（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/ genomes/OrganelleResource. cgi ? opt = organelle&taxid = 33208)上搜索并下載 環(huán)節(jié)動物線粒體全長序列，它們分別是Lumbricus terrestris (U24570)、Perinereis nuntia(JX644015)、Platynereis dumerilii(AF178678)等種類。根據(jù) NCBI 上對這些物種 的線粒體的注釋說明，獲取這些種類的COI區(qū)段序列。將這些COI序列與獲取的才女蟲全長 序列（其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示）進(jìn)行比對，得到COI序列共同區(qū)域的比對結(jié)果。 以才女蟲COI序列（其核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示）為設(shè)計模板，利用Primer5. 0軟 件進(jìn)行引物設(shè)計，選取引物得分高的引物對，結(jié)合COI比對結(jié)果進(jìn)行簡并引物設(shè)計。若引物 對的堿基與比對結(jié)果相應(yīng)位點(diǎn)的堿基相同，則該堿基不變，若引物對的堿基與比對結(jié)果相 應(yīng)位點(diǎn)不一致，則將這些不同的堿基根據(jù)簡并原則設(shè)計成相應(yīng)的簡并堿基。該引物對的設(shè) 計原理是以才女蟲的COI序列為引物設(shè)計模板，然后根據(jù)環(huán)節(jié)動物種類的共同COI序列作 為輔助模板，設(shè)計才女蟲的簡并引物對特異地擴(kuò)增才女蟲線粒體COI序列。設(shè)計出的引物 包括引物1或引物2,其中引物1由引物Fl和引物Rl組成，引物Fl的序列如SEQ ID No. 1 所示，引物Rl的序列如SEQ ID No. 2所示，引物2由引物F2和引物R2組成，引物F2的序 列如SEQ ID No. 3所示，引物R2的序列如SEQ ID No. 4所示。
[0026] 具體的，引物Fl和引物Rl的具體序列如下：
[0027] 引物 Fl :5，-CCTWGTDATACCTRTCWTAATT-3，
[0028] 引物 Rl:5，-CCTGTAAATARAGGGAATCA-3，
[0029] 引物F2和引物R2的具體序列如下：
[0030] 引物 F2 為：5' -CCWGATATRGCATTCCC-3 '
[0031] 引物 R2 為：5，-GCKARYCADCTAAATACTTTAA-3，。
[0032] 才女蟲的序列全長序列如下，全長17608bp，其中下劃線部分為線粒體COI序列。
[0033] CCTCTAATCACAAACGAATTGGCACTTTATACTTTATTCTTGGTCTATGATCGGGAACTTTAGGAACTT CCTTAAGGGTCCTTATTCGCCTCGAATTAATGCAGCCTGGGGGATCATTTTTAAAAGACCCTCAACTCTATAACTCC ATCGTAACAGCCCATGCATTTATTATAATTTTCTTCCTTGTTATACCTATCTTAATTGGTGGGTTTGGAAATTGACT CATTCCATTAATATTAGCAACACCTGATATAGCTTTCCCTCGAATAAACGCACTAAGATTTTGAATTCTCCCCCCCG CCCTTGCTATACTATTAAGTGGTATATGAGTCGAAGATGGAGCCGGTACAGGATGAACAATCTATCCACCCCTCTCT GGTAACGTAGCTCACGCAGGTCCTGCAGTAGATTTAACCATTTTATCCCTCCATTTAGCAGGTGTATCCTCTTTAAT AGGAGCAATTAACTTTACTACAACTATCGCAAATAGACGGCTCGAAGGTATACCAACAGAAAAAATACCTCTATTCA TTTGATCTGTTCTAATTACAGTCATTCTTTTAATTTTAGCGCTTCCAGTCCTAGCAGGAGCCCTTACTATACTAATT ATGGACCGAAACTGTAACACATCATTTTTTGAACCAACCGGAGGAGGAGATCCAATTCTCTTTCAACATCTATTCTG ATTCTTTGGTCACCCAGAAGTATATATTCTTATTCTTCCTGGGTTTGGTGCTATCTCTCATATCATTACTCATCACA GGAAAAAAAAGAAAACATTTGGAACATTAGGTATACAATATGCAATATGCGCAATTGGTCTCTTAGGTCTTATTGTC TGAGGACATCACATATATACCGTAGGATTAGACGTAGATTCCCGAGCATACTTTACAGGAGCAACAATAGTTATTGC 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CCCATGATCTACACCTACTCATTTCATTACAGCCTCAATATTAATTGTTGCAGCTATAACAAAAAGAGCCCAATTCC CATTTATTAGATGACTTCCCGCCGCTATGGCTGCCCCTACACCTGTTTCCGCCCTCGTTCACTCCTCTACCTTAGTT ACTGCAGGCATTTTTATCTTAATTCGATTTTTCCCGTCATTAAAAACAGTTTCAACTCTAGAATATATTCTTCTTTT CGCAGCCGCTATTACAGCCTGTGTAGCAGGTTTAGCTGCTATAGCTGAATGTGACATAAAAAAAGTTATTGCTTTAT CCACTCTAAGCCAACTAGGAACTATAGCTTACAGTTTAGCAATAAATATGCCACATCTTGCATTCTTTCATTTAATT ACCCACGCTTTATTTAAAGCACTCCTATTTATGGCAGCTGGTACTTTAATTCATTACCATGATCATAACCAAGACCT CCGTGCCATAGGGATACTCAACAATTCTATACCAGTTATTTCAACTATAATTGTTACATCTAGACTAGCACTATGTG GCGCCCCTTTTATAGCAGGCTTCTATTCTAAAGACTTAATTATTGAAGCCCAAATTAGAAACTCTTTTAACTATCTT TTAATCATAGTCTTCTTATTTGCGACAGGCCTTACATCAGCTTATAGAATACGATTTATAATTAACGTCGTTTGATC CCCTCGTCAAGCCCCGCCTGCAAGTATATTTCAGCCCTCACCTAACCTTCTTACAATAGGGCCAACTCTAGCCCTCG CAACAATAACTGTAATCGGGGGAGCATCCTTATTTTGAATTATAGTTCTTCCTGAAAGAGAGGCTATTCTACCTTTA TCACTAAAACTTCATGCCATTTTTGCAATAGCGATTGGCACATTCATAGGCTGAATTTTAAATTACAAATTATTTAA 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GCTGATGCAATAAAACTATTTACAAAAGAACAAGTTAAACCTAACATATCAAACTCTGTTCCATTcTACATTGCCCc TATATtAGCATTATTTTTAGCCCTTGCACTTAGAAACTTAATGCCAAGACCAAGCTCAATCACAGGCTCAGAGTTTT CCGCACCCTTATTTTCAGCTATTGCTAGATTAAATGTTTATGCATCTTTAATAGCAGGCTGAGCAAGAAATTCTAAA TATGCACTACTTGGCACAGTTCGAGCTATAGCCCAAACTATTTCATACGAAGTAGGTATATCCCTATGTATACTTAT AGCACTTGTTACAATAAGATCCCTAAGCCTAACTTCCTCCTTCACAGAACTCTCATGACCAGCTTTAGTTATTCCCC TTTTAATTCCTATCTGAATTGCTACAATTCTAGCAGAAACAAACCGGACTCCTTATGATCTTGTTGAGGGAGAATCA GAGCTAGTCTCTGGTTTCAATATTGAATACAGGGCAGGCCCATTCGCAATAATCTTTATAGCTGAATACACAAGAAT CATTGCTATAAGAATATTTACATCCGCACTATTTTCCTCAAGCTCCTCAAGTATTTTTTTTATACTAAAAACCCTTG TGATAACTACCTTATTCCTGTGAGTCCGAACAACACTTCCACGTATACGGTATGATAATCTTATATACCTAATATGG ATATCATTTCTTCCCGTGACCCTTGGCCTATCAATAATTTATTTTAGATTATTTTTTCTATTAAGGGATAGTTTATT AAAACACACACCTTGGAAGTGTGAGATCAGGGATTCCCTGTCTCTTATCCGGGATAGTATATTTATTACATTAGTCT TGTAAACTAAAAATGAAACCTTTTCTCTCGGATAGCTAGAAGTCCGGGACAAGCTAGAGCTTCTAACTCCAGCTAGG AGGTTCAACTCCTCCATCTATCTAAATGTTATTAATTCAATGATTATTTTTTTGATCTTTATTTTTATCTACCTTCG TAGCTATCTCCGCAAGAGTTCCATTATATACATGAGCAGCCTTAGAGATTAACACAATTGCCTTTATCCCTATAATA CTTGACCCTACAAAACCAGAAAGTGTACGTGCTGCAATAAAATATTTTTTCATTCAGGCCTACGCTTCTATAATCTT CTTAATTGGGCCCTTAGTAAACTACCTCCCGGAAATAACTGTATTTTTAGCAATAATAATAAAACTTGGAATATCGC CTTTCCATAACTGATACCCCTCTGTAATAACAAGCCTTAACTGATTATCCGCATTTTTTCTATCAACCTGACAAAAA ATTGCTCCTCTATGAATCTTAAGTGAAAACATTTATAATTTTAACCTAATCCTCCCAATTGCTTCTTTAAACGCCAT AATTGGAGGCTTAGGAGGACTGATACAAACCGAAATTCGACCCCTCCTAGCATTTTCGTCCATTGGTCATATAGGCT GATTATTGTTTAGCATTCCCCTCTCCAACTTTATTATAATTTTATACTTCTTTTCATACACTATTCACCTTATAATT TTAATATTTTTATTCTTCAAATCCAAAATTAACACCCCAAAAGATATATCCTCTTCCAACTCTTTATCTTCTCAGAC TAAAATAATTATTGCCCTCTCACTTTTATCCTTAGGAGGCCTACCTCCTCTTCTAGGCTTTATTCCTAAACTTCTAG TTCTTCTTGTTAGAGCTCCATTATTTATTCCTCCCTTCTTCTTAATAATTGGGAGCTATATTAACATTTATTATTAT ATATCAATCATATGAATTACTTTTATAACTAACCCCCAGCCTTTAAAATCTGTAACACCCTCAAAAATTTTCCTTTA CTTAACCACAATTATTATATCGTCCTTATTCCTAGTGCTAATCTGTGGATTGAATATACA
[0034] COI序列引物設(shè)計，其中下劃線位點(diǎn)為引物設(shè)計位點(diǎn)，依次為引物F1、引物F2、弓丨 物R2和引物R1。
[0035] CCTCTAATCACAAACGAATTGGCACTTTATACTTTATTCTTGGTCTATGATCGGGAACTTTAGGAACTT CCTTAAGGGTCCTTATTCGCCTCGAATTAATGCAGCCTGGGGGATCATTTTTAAAAGACCCTCAACTCTATAACTCC ATCGTAACAGCCCATGCATTTATTATAATTTTCTTCCTTGTTATACCTATCTTAATTGGTGGGTTTGGAAATTGACT CATTCCATTAATATTAGCAACACCTGATATAGCTTTCCCTCGAATAAACGCACTAAGATTTTGAATTCTCCCCCCCG CCCTTGCTATACTATTAAGTGGTATATGAGTCGAAGATGGAGCCGGTACAGGATGAACAATCTATCCACCCCTCTCT GGTAACGTAGCTCACGCAGGTCCTGCAGTAGATTTAACCATTTTATCCCTCCATTTAGCAGGTGTATCCTCTTTAAT AGGAGCAATTAACTTTACTACAACTATCGCAAATAGACGGCTCGAAGGTATACCAACAGAAAAAATACCTCTATTCA TTTGATCTGTTCTAATTACAGTCATTCTTTTAATTTTAGCGCTTCCAGTCCTAGCAGGAGCCCTTACTATACTAATT ATGGACCGAAACTGTAACACATCATTTTTTGAACCAACCGGAGGAGGAGATCCAATTCTCTTTCAACATCTATTCTG ATTCTTTGGTCACCCAGAAGTATATATTCTTATTCTTCCTGGGTTTGGTGCTATCTCTCATATCATTACTCATCACA GGAAAAAAAAGAAAACATTTGGAACATTAGGTATACAATATGCAATATGCGCAATTGGTCTCTTAGGTCTTATTGTC TGAGGACATCACATATATACCGTAGGATTAGACGTAGATTCCCGAGCATACTTTACAGGAGCAACAATAGTTATTGC TGTTCCTACAGGTATTAAAGTATTTAGATGAATAGCAACAGCAAGCGGGACACGTCTCAACCTTACTACCCCTATAA TGTGAGCCCTAGGATTCGTATTCCTATTCACAATAGGAGGTCTAACAGGAGTAGTACTAGCTAATGCCGCTCTTGAT ATTGCCCTACATGACACATACTATGTAACAGCCCACTTCCATTATGTCCTTAGTATAGGAGCCATTTTTGCCATCTT TGCAGGATTTATAAACTGATTCCCTCTATTTACAGGCTTAATATTCCACCAATTATGAAGTAAAATCCAATTTATCT GAATATTTACGGGAGTTAATCTTACATTCTTCCCCCAACACTTCTTAGGTGTAGCTGGGATACCTCGACGTATTCCT GACTACCCCCAATTATTCTTCCCATGAAATTTTGo
[0036] 實施例2引物特異性檢測試驗
[0037] (1)分別提取石灰蟲（環(huán)節(jié)動物門）、纓鰓蟲（環(huán)節(jié)動物門）、單殖吸蟲（扁形動 物門）、雜色鮑（軟體動物門）、草魚（脊椎動物門）、石斑魚（脊椎動物門）、5種才女蟲 的總DNA，然后各取IyL樣品底物進(jìn)行PCR反應(yīng)。在25 μ L的反應(yīng)體系中包含以下試劑： IuL底物模板，2.5yL 10XPCR buffer，lU Taq 酶，2.5yL IOXTaq buffer，0.25mM dNTP mixture,引物組Fl和Rl各40pM。PCR反應(yīng)設(shè)一個陰性對照樣品。其中，引物組序列分別 為：
[0038] Fl=Si -CCTffGTDATACCTRTCff TAATT-3;
[0039] Rl=Si -CCTGTAAATARAGGGAATCA-3;
[0040] PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為首先 95°C 5min，再 94°C 30sec、50°C 30sec、72°C Imin 共 30 個循環(huán)，再72°C lOmin，KTC保存；
[0041] (2)將PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析（條件：6V/cm，20min)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該 引物組既不能擴(kuò)增出同為環(huán)節(jié)動物的石灰蟲和纓鰓蟲的線粒體COI片段，也不能擴(kuò)增出其 它動物門的基因片段（圖1)。但是，這對引物卻能成功擴(kuò)增樣品中全部才女蟲的COI序列， 并保持單一的目的條帶（圖1)。這說明該引物組對擴(kuò)增才女蟲線粒體COI序列具有高度的 特異性。
[0042] 實施例3鑒定才女蟲復(fù)合體種類的方法
[0043] (1)提取13個才女蟲樣品的DNA，然后各取2 μ L底物模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體 系為50 μ L，反應(yīng)體系包含以下試劑：2 μ L模板DNA，5 μ L 10XPCR buffer，2U Taq酶，5 μ L IOXTaq buffer，0.25mM dNTP mixture，引物 FI、Rl 各 40ρΜ。引物組序列為：
[0044] Fl=Si -CCTffGTDATACCTRTCff TAATT-3;
[0045] Rl=Si -CCTGTAAATARAGGGAATCA-3;
[0046] PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為首先 95°C 5min，再 94°C 30sec、50°C 30sec、72°C Imin 共 30 個循環(huán)，再72°C lOmin，KTC保存；
[0047] (2)取PCR反應(yīng)液進(jìn)行凝膠電泳檢測，電泳結(jié)果中若有單一的、長度在IOOObp左右 的條帶即說明樣品成功擴(kuò)增，即可將PCR反應(yīng)液送測序公司測序。若無條帶或條帶弱或不 單一等情況出現(xiàn)，則嘗試用引物組F2和R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系與擴(kuò)增條件不變。引物 組F2和R2的序列為
[0048] 引物 F2 為：5' -CCWGATATRGCATTCCC-3 '
[0049] 引物 R2 為：5，-GCKARYCADCTAAATACTTTAA-3，
[0050] (3)取30?40 μ LPCR反應(yīng)液送測序公司測序，所有擴(kuò)增產(chǎn)物的測序都采用雙向測 序，并用擴(kuò)增引物作為測序引物進(jìn)行測序，然后用DNAstar軟件中的SeqMan進(jìn)行對樣品的 序列進(jìn)行拼接，保存每個樣品的完整序列。Bioedit軟件對所有樣品的完整序列進(jìn)行比對， 比對時保持所有樣品序列長度一致，比對結(jié)果保存為fasta格式的文件。
[0051] (4)用Mega3. 1軟件打開fasta格式的比對結(jié)果，將結(jié)果轉(zhuǎn)換為Mega格式并保存， 然后通過Mega菜單欄中選擇Distances子菜單，在Distances中選擇Compute Pairwise 選項，選擇默認(rèn)設(shè)置，然后按Compute按鈕即可得到序列間的遺傳距離矩陣，結(jié)果如表1所 示。結(jié)果顯示，Sl與S2的遺傳距離為0. 01，S3與S4、S5、S6的遺傳距離為0. 00, S7與S8 的遺傳距離為〇. 〇〇 ;S10與Sll、S13的遺傳距離為0. 00 ;上述的遺傳距離都非常小，我們 判斷認(rèn)定它們各自屬于同一種；其他樣品序列間的遺傳距離都大于等于〇. 19,我們判斷它 們各屬于不同種。由以上實驗結(jié)果我們推斷，當(dāng)才女蟲的兩個COI序列間的遺傳距離小于 〇. 03時，我們認(rèn)為它們屬于同一種；而兩條序列間的遺傳距離大于0. 15時，我們認(rèn)為它們 屬于不同種。
[0052] 表113個未鑒定才女蟲樣品的遺傳距離比較結(jié)果，S1-S13表示樣品1-13。
[0053]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于鑒定才女蟲復(fù)合體種類的引物，其特征是：所述引物為引物對1或引物對 2,其中引物對1由引物F1和引物R1組成，引物F1的序列如SEQ ID No. 1所示，引物R1 的序列如SEQ ID No. 2所示，引物對2由引物F2和引物R2組成，引物F2的序列如SEQ ID No. 3所示，引物R2的序列如SEQ ID No. 4所示。
2. -種鑒定才女蟲復(fù)合體種類的方法，其特征是包括以下步驟： ⑴引物設(shè)計：以才女蟲C0I序列為設(shè)計模板，設(shè)計權(quán)利要求1中的引物對1或引物對 2 ； (2) DNA提?。禾崛〔煌排x樣品的DNA ; (3) PCR擴(kuò)增：以步驟⑵中提取的才女蟲樣品的DNA作為模板DNA，先采用權(quán)利要求1 中的引物對1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如擴(kuò)增無條帶，則采用權(quán)利要求1中的引物對2進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行電泳檢測，如采用引物對1進(jìn)行擴(kuò)增時，電泳結(jié)果顯示在lOOObp附近 具有單一條帶或采用引物對2進(jìn)行擴(kuò)增時，電泳結(jié)果顯示在700bp附近具有單一條帶，則說 明擴(kuò)增成功，如無條帶、多帶或條帶長度不符時，則視為擴(kuò)增失?。? ⑷測序：取步驟⑶中擴(kuò)增成功的PCR反應(yīng)液，進(jìn)行測序，采用雙向測序，測序引物為 PCR擴(kuò)增時采用的引物，將測序所得序列進(jìn)行拼接和比對，獲得所有樣品的完整序列，計算 所有樣品序列間的遺傳距離，如兩兩序列的遺傳距離小于〇. 03,則被認(rèn)為是同種，如果序列 間遺傳距離大于〇. 15,則被認(rèn)為是不同種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒定才女蟲復(fù)合體種類的方法，其特征是：步驟（3)中PCR反 應(yīng)時 50yL 反應(yīng)體系包括 2yL模板 DNA，5yL 10XPCR buffer，2U Taq 酶，5yL lOXTaq buffer，0.25mM dNTP mixture，引物 FI、引物 R1 或引物 F2、引物 R2 各 40pM。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒定才女蟲復(fù)合體種類的方法，其特征是：步驟（3)中 PCR 反應(yīng)條件為：首先 95°C 5min，再 94°C 30sec、50°C 30sec、72°C lmin 共 30 個循環(huán)，再 72°C 10min，10°C 保存。
5. 權(quán)利要求1所述的用于鑒定才女蟲復(fù)合體種類的引物在鑒定才女蟲復(fù)合體種類方 面的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104263819SQ201410442975
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月2日
【發(fā)明者】葉靈通, 唐彬, 曹超, 王江勇 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所