內(nèi)包核酸的高分子微囊復(fù)合體及其制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及內(nèi)包核酸(DNA)的高分子微囊復(fù)合體。更詳細(xì)而言，涉及內(nèi)包較長(zhǎng)鏈的 DNA但充分小的高分子微囊復(fù)合體。
[0002] 本申請(qǐng)基于2013年8月6日在日本申請(qǐng)的日本特愿2013 -163106號(hào)主張優(yōu)先權(quán)，并 將其內(nèi)容援引于此。
【背景技術(shù)】
[0003 ]作為次世代的治療法，通過(guò)控制基因表達(dá)來(lái)治療疾病的基因治療被寄予極大的期 待?；蛑委熤械淖畲笳n題在于將基因?qū)氚袠?biāo)細(xì)胞或組織時(shí)的導(dǎo)入效率不充分這一點(diǎn)。 尤其，為了實(shí)現(xiàn)基于全身施予的基因治療，需要使基因在血中穩(wěn)定地循環(huán)而集聚到靶標(biāo)組 織、并在侵入靶標(biāo)細(xì)胞后有效地進(jìn)行基因表達(dá)。因此，為了解決這些問(wèn)題，盛行的是開發(fā)向 靶標(biāo)細(xì)胞等的導(dǎo)入效率、在靶標(biāo)細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)效率更優(yōu)選的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體(基因載體）。
[0004] 例如，已知一次結(jié)構(gòu)得到精密控制的高分子會(huì)自發(fā)產(chǎn)生組織化，可以形成微囊、泡 囊等高次結(jié)構(gòu)體，以往在以藥物送達(dá)系統(tǒng)、材料科學(xué)為首的各種領(lǐng)域中研究了此種高分子 的自組織化的結(jié)構(gòu)體的利用。例如專利文獻(xiàn)1中公開了一種靜電耦合型高分子微囊藥劑載 體，其包含具有非電荷性鏈段(非電荷性高分子鏈嵌段)和電荷性鏈段（電荷性高分子鏈嵌 段)的嵌段共聚物、且在芯部分可以內(nèi)包具有與該電荷性鏈段相反的電荷的藥劑。通過(guò)使用 陽(yáng)離子性鏈段作為上述電荷性鏈段，從而可以將DNA內(nèi)包于芯部分。
[0005] 另外，還報(bào)告了各種實(shí)現(xiàn)更高分子微囊的穩(wěn)定化的做法。例如，在專利文獻(xiàn)2中公 開了一種靜電耦合型高分子微囊藥劑載體，其通過(guò)借助交聯(lián)劑使嵌段共聚物彼此交聯(lián)來(lái)使 其穩(wěn)定化。進(jìn)而，在專利文獻(xiàn)3中還公開了含有非電荷性親水性高分子鏈嵌段和在側(cè)鏈的一 部分導(dǎo)入了疏水性基的陽(yáng)離子性聚氨基酸鏈嵌段的嵌段共聚物。該嵌段共聚物通過(guò)在側(cè)鏈 導(dǎo)入疏水性基，從而使表面能增大，因此微囊內(nèi)的凝聚力增強(qiáng)，芯變小，結(jié)果實(shí)現(xiàn)了高分子 微囊的穩(wěn)定化。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007] 專利文獻(xiàn)
[0008] 專利文獻(xiàn)1:日本特開平8 -188541號(hào)公報(bào) [0009] 專利文獻(xiàn)2:國(guó)際公開第2004/105799號(hào) [0010] 專利文獻(xiàn)3:國(guó)際公開第2009/113645號(hào)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 發(fā)明要解決的課題
[0012] 在全身施予基因載體的情況下，為了在靶標(biāo)細(xì)胞中導(dǎo)入基因，需要使基因載體的 血中滯留性較高。
[0013] 另外，若基因載體的大小過(guò)大，則存在難以攝入細(xì)胞的問(wèn)題。尤其對(duì)于像胰臟癌那 樣血管密度低的癌癥，血管的透過(guò)性成為障壁，通過(guò)全身施予而使尺寸IOOnm的基因載體送 達(dá)癌組織深部是非常困難的。
[0014] 在靜電耦合型高分子微囊藥劑載體的芯收容了基因的高分子微囊復(fù)合體非常有 望成為基因載體，但是在大小、血中滯留性的方面還尚有改善的余地。
[0015] 本發(fā)明的主要目的在于提供內(nèi)包較長(zhǎng)鏈的DNA、大小充分小、還可以作為基因載體 發(fā)揮功能的高分子微囊復(fù)合體以及其制造方法。
[0016] 用于解決課題的手段
[0017] 本發(fā)明人等對(duì)在包含生物適合性中性高分子即聚乙二醇(PEG)和陽(yáng)離子性高分子 (以下，有時(shí)簡(jiǎn)寫成"陽(yáng)離子性高分子鏈嵌段"。）的嵌段共聚物中內(nèi)包有作為環(huán)狀雙鏈DNA的 質(zhì)粒DNA(以下，有時(shí)簡(jiǎn)寫成"pDNA"。）的高分子微囊復(fù)合體調(diào)查了陽(yáng)離子性高分子鏈嵌段的 長(zhǎng)度(聚合度)與高分子微囊復(fù)合體的粒徑的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn):在陽(yáng)離子性高分子鏈嵌段的 長(zhǎng)度較短的情況下，高分子微囊復(fù)合體是長(zhǎng)軸為IOOnm以上的棒狀，但是陽(yáng)離子性高分子鏈 嵌段的長(zhǎng)度越長(zhǎng)，則長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度越短，在陽(yáng)離子性高分子鏈嵌段的長(zhǎng)度充分長(zhǎng)時(shí)，存在減小 至接近球體狀的形狀的傾向。另外，對(duì)PEG密度與血中滯留時(shí)間的關(guān)系進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果發(fā) 現(xiàn):越是PEG密度高的高分子微囊復(fù)合體，存在血中滯留時(shí)間越長(zhǎng)的傾向。在此，若陽(yáng)離子性 高分子鏈嵌段的長(zhǎng)度變長(zhǎng)，則與1分子的PDNA結(jié)合的嵌段共聚物數(shù)變少，結(jié)果導(dǎo)致PEG密度 降低。即，可知:在內(nèi)包pDNA的高分子微囊復(fù)合體的情況下，若為了減小粒徑而使PEG密度降 低，則血中滯留性降低。
[0018] 本發(fā)明人等進(jìn)行了進(jìn)一步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)在使PDNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)解離的狀態(tài) 下與嵌段共聚物混合而形成復(fù)合體，從而可以在不降低構(gòu)成殼部分的非電荷性親水性高分 子鏈嵌段的密度的情況下形成遠(yuǎn)比棒狀更小的球體狀的高分子微囊復(fù)合體，以至完成本發(fā) 明。
[0019] 即，本發(fā)明的內(nèi)包核酸的高分子微囊復(fù)合體及其制造方法為下述[1]~[15]。
[0020] [1]-種內(nèi)包核酸的高分子微囊復(fù)合體，其特征在于，其由含有非電荷性親水性高 分子鏈嵌段及陽(yáng)離子性高分子鏈嵌段的嵌段共聚物、與包含1000個(gè)堿基長(zhǎng)度以上的彼此互 補(bǔ)的堿基序列的2條單鏈DNA、至少雙螺旋結(jié)構(gòu)的一部分解離為單鏈結(jié)構(gòu)的1000個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng) 度以上的雙鏈DNA、或1000個(gè)堿基長(zhǎng)度以上的1條單鏈DNA形成。
[0021] [2]根據(jù)上述[1]的內(nèi)包核酸的高分子微囊復(fù)合體，其由含有非電荷性親水性高分 子鏈嵌段及陽(yáng)離子性高分子鏈嵌段的嵌段共聚物、與包含1000個(gè)堿基長(zhǎng)度以上的彼此互補(bǔ) 的堿基序列的2條單鏈DNA、或至少雙螺旋結(jié)構(gòu)的一部分解離為單鏈結(jié)構(gòu)的1000個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng) 度以上的雙鏈DNA形成。
[0022] [3]根據(jù)上述[1]或[2]的內(nèi)包核酸的高分子微囊復(fù)合體，其中，上述單鏈DNA為 2000個(gè)堿基長(zhǎng)度以上，上述雙鏈DNA為2000個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度以上。
[0023] [4]根據(jù)上述[1]~[3]中任一項(xiàng)的內(nèi)包核酸的高分子微囊復(fù)合體，其在水性介質(zhì) 中的采用動(dòng)態(tài)光散射法的平均粒徑為IOOnm以下。
[0024] [5]根據(jù)上述[1]~[4]中任一項(xiàng)的內(nèi)包核酸的高分子微囊復(fù)合體，其中，DNA和利 用靜電相互作用與DNA結(jié)合的陽(yáng)離子性高分子鏈嵌段形成芯部分，非電荷性親水性高分子 鏈嵌段形成殼部分。
[0025] [6]根據(jù)上述[5]的內(nèi)包核酸的高分子微囊復(fù)合體，其中，上述芯部分的平均粒徑 為50nm以下。
[0026] [7]根據(jù)上述[1]~[6]中任一項(xiàng)的內(nèi)包核酸的高分子微囊復(fù)合體，其為球體狀。
[0027] [8]根據(jù)上述[1]~[7]中任一項(xiàng)的內(nèi)包核酸的高分子微囊復(fù)合體，其中，上述單鏈 DNA或上述雙鏈DNA為線狀。
[0028] [9]根據(jù)上述[1]~[8]中任一項(xiàng)的內(nèi)包核酸的高分子微囊復(fù)合體，其中，上述嵌段 共聚物的至少一部分彼此交聯(lián)。
[0029] [10]根據(jù)上述[1]~[9]中任一項(xiàng)的內(nèi)包核酸的高分子微囊復(fù)合體，其中，在上述 陽(yáng)離子性高分子鏈嵌段的主鏈或側(cè)鏈以共價(jià)鍵結(jié)合有疏水性基。
[0030] [11]根據(jù)上述[1]~[10]中任一項(xiàng)的內(nèi)包核酸的高分子微囊復(fù)合體，其中，在上述 陽(yáng)離子性高分子鏈嵌段的側(cè)鏈具有乙胺結(jié)構(gòu)或丙胺結(jié)構(gòu)。
[0031 ] [ 12] -種內(nèi)包核酸的高分子微囊復(fù)合體的制造方法，其特征在于，其是制造收容 有DNA的內(nèi)包核酸的高分子微囊復(fù)合體的方法，
[0032] 該方法具有如下工序:將含有非電荷性親水性高分子鏈嵌段及陽(yáng)離子性高分子鏈 嵌段的嵌段共聚物、與使雙螺旋結(jié)構(gòu)的至少一部分解離的狀態(tài)的1000個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度以上的 雙鏈DNA在水性介質(zhì)中混合。
[0033] [ 13]根據(jù)[12]的內(nèi)包核酸的高分子微囊復(fù)合體的制造方法，其中，上述雙鏈DNA為 2000個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度以上。
[0034] [14]根據(jù)上述[12]或[13]的內(nèi)包核酸的高分子微囊復(fù)合體的制造方法，其中，上 述雙鏈DNA為線狀。
[0035] [15]根據(jù)[12]~[14]中任一項(xiàng)的內(nèi)包核酸的高分子微囊復(fù)合體的制造方法，其 中，上述雙鏈DNA為在60°C以上變性后的雙鏈DNA。
[0036]發(fā)明效果
[0037]根據(jù)本發(fā)明，即使使用在將1000個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度以上、優(yōu)選2000個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度以上 的長(zhǎng)鏈的DNA收容于內(nèi)部時(shí)以往主要形成棒狀或環(huán)狀的內(nèi)包核酸的高分子微囊復(fù)合體的嵌 段共聚物的情況下，也能夠提供球體狀的高分子微囊復(fù)合體。球體狀的高分子微囊復(fù)合體 的粒徑比棒狀的內(nèi)包核酸的高分子微囊復(fù)合體更小，且構(gòu)成該嵌段共聚物的非電荷性親水 性高分子鏈嵌段的密度也較大，因此向細(xì)胞中的攝入效率和血中滯留性這兩者均優(yōu)異。
【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖1為表示在參考例1中各高分子微囊復(fù)合體的TEM圖像和由該圖像算出的高分子 微囊復(fù)合體(棒狀粒子)的長(zhǎng)軸長(zhǎng)的分布的圖。
[0039] 圖2為表示在參考例1中全身施予各高分子微囊復(fù)合體后的小鼠的耳靜脈的熒光 強(qiáng)度經(jīng)時(shí)變化的測(cè)定結(jié)果的圖。
[0040] 圖3為實(shí)施例1中使用熒光標(biāo)記PEG-PAsp(DET) - Chole所形成的高分子微囊復(fù)合 體(左:PM - 1、右:MCPM - 1)的 TEM圖像。
[0041] 圖4為表示實(shí)施例1中由TEM圖像算出的高分子微囊復(fù)合體的長(zhǎng)軸長(zhǎng)的分布的圖 (左:PM-1、右:MCPM-1)。
[0042] 圖5為實(shí)施例2中全身施予高分子微囊復(fù)合體MCPM-2 - GFP的小鼠的胰臟癌組織 的熒光圖像。
[0043]圖6為實(shí)施例2中全身施予高分子微囊復(fù)合體PM- 2-GFP的小鼠的胰臟癌組織的 熒光圖像。
[0044]圖7為實(shí)施例2中全身施予高分子微囊復(fù)合體MCPM- 1的小鼠的胰臟癌組織的熒光 圖像。
[0045]圖8為表示實(shí)施例2中對(duì)施予收容GFP基因的高分子微囊復(fù)合體中的PM- 2-GFP的 胰臟癌模型小鼠和施予了其中的MCPM-2-GFP的胰臟癌模型小鼠的胰臟癌組織深部的GFP 表達(dá)的相對(duì)熒光強(qiáng)度的測(cè)定結(jié)果的圖。
[0046]圖9為表示在實(shí)施例3中相對(duì)于全身施予于小鼠的高分子微囊復(fù)合體的總量的、全 身施予后經(jīng)過(guò)30分鐘后在血中滯留的高分子微囊復(fù)合體量的比例（％ )的測(cè)定結(jié)果的圖。 [0047]圖10為實(shí)施例4中全身施予了高分子微囊復(fù)合體(MCPM-4 -Venus -CL)的小鼠的 胰臟癌組織的熒光圖像。
[0048]圖11為表示實(shí)施例5中各高分子微囊復(fù)合體的TEM圖像的圖。
[0049] 圖12為表示實(shí)施例6中各高分子微囊復(fù)合體的TEM圖像的圖。
[0050] 圖13為表示實(shí)施例6中由各高分子微囊復(fù)合體的TEM圖像算出的高分子微囊復(fù)合 體的長(zhǎng)軸長(zhǎng)的分布的圖。
[0051 ]圖14為表示實(shí)施例7中以各溫度進(jìn)行變性處理后的高分子微囊復(fù)合體的長(zhǎng)軸長(zhǎng)及 縱橫比的分布的圖。
[0052]圖15為表示在實(shí)施例8中轉(zhuǎn)染了收容熒光素酶基因的PEG - PLys、或PEG - PLys - PDP的細(xì)胞株的熒光素酶表達(dá)的相對(duì)熒光強(qiáng)度的測(cè)定結(jié)果的圖。
[0053] 圖16為表示實(shí)施例9中對(duì)全身施予各高分子微囊復(fù)合體的小鼠測(cè)定胰臟癌的大小 的結(jié)果的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0054] 本發(fā)明的內(nèi)包核酸的高分子微囊復(fù)合體由含有非電荷性親水性高分子鏈嵌段及 陽(yáng)離子性高分子鏈嵌段的嵌段共聚物和核酸(DNA)形成，結(jié)合有上述陽(yáng)離子性高分子鏈嵌 段的核酸形成芯部分，上述非電荷性親水性高分子鏈嵌段形成殼部分。以下進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。 [0055] <非電荷性親水性高分子鏈嵌段>
[0056] 本發(fā)明中所使用的嵌段共聚物含有非電荷性親水性高分子鏈嵌段和陽(yáng)離子性高 分子鏈嵌段。作為非電荷性親水性高分子鏈嵌段，例如可例示來(lái)自PEG、聚丙二醇等聚亞烷 基二醇;聚（2 -甲基一 2 -噁唑啉）、聚(2 -乙基一 2 -噁唑啉）、聚（2-異丙基一 2-噁唑啉） 等聚噁唑啉;多糖、葡聚糖(dextran)、聚乙稀醇、聚乙烯基吡略燒酮、聚丙稀酰胺、聚甲基丙 烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯及它們的衍生物的各種嵌段等。其中，從作為生物適 合性高的中性的水溶性高分子的方面出發(fā)，優(yōu)選PEG、聚噁唑啉、葡聚糖、聚乙烯醇。
[0057] 非電荷性親水性高分子鏈嵌段的分子量只要能夠使嵌段共聚物形成內(nèi)部收容有 核酸的高分子微囊復(fù)合體的大小即可，并無(wú)特別限定。
[0058]例如，在使用來(lái)自PEG的嵌段（聚氧乙烯鏈嵌段、以下，有時(shí)簡(jiǎn)稱為"PEG嵌段"。）作 為非電荷性親水性高分子鏈嵌段的情況下，PEG嵌段的分子量?jī)?yōu)選為約1.0~lOOkDa、更優(yōu) 選為2~80kDa、進(jìn)一步優(yōu)選為8~25kDa。另外，作為PEG嵌段中的氧乙稀的重復(fù)單元數(shù)，優(yōu)選 22~2300個(gè)、更優(yōu)選45~1850個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選180~600個(gè)。
[0059] <陽(yáng)離子性高分子鏈嵌段>
[0060] 作為本發(fā)明中所使用的陽(yáng)離子性高分子鏈嵌段，只要是包含能夠與DNA靜電結(jié)合 的陽(yáng)離子性的高分子鏈的嵌段即可，并無(wú)特別限定。具體而言，例如可列舉:在側(cè)鏈具有陽(yáng) 離子性基的聚氨基酸衍生物;聚乙撐亞胺(PEI);聚甲基丙烯酸衍生物、聚丙烯酸衍生物等 丙稀酸系樹脂等。
[0061] 作為本發(fā)明中所使用的陽(yáng)離子性高分子鏈嵌段，優(yōu)選使用來(lái)自陽(yáng)離子性氨基酸的 聚氨基酸或其衍生物的嵌段、來(lái)自在陰離子性氨基酸的陰離子性基(通常為羧基)上通過(guò)酯 鍵或酰胺鍵等結(jié)合有陽(yáng)離子性化合物的氨基酸衍生物的嵌段。作為陽(yáng)離子性氨基酸的聚氨 基酸，可列舉聚賴氨酸、聚鳥氨酸、聚精氨酸、聚高精氨酸及聚組氨酸等。另外，作為使陰離 子性氨基酸上結(jié)合有陽(yáng)離子性化合物的氨基酸衍生物，可列舉天冬氨酸或谷氨酸的1個(gè)羧 基與除了跟羧基結(jié)合的部位以外還具有氨基、亞氨基、季氨基等陽(yáng)離子性基的化合物結(jié)合 的衍生物。作為具有該陽(yáng)離子性基的化合物，例如可列舉各種二胺等。具有來(lái)自使天冬氨酸 或谷氨酸的1個(gè)羧基與二亞乙基三胺反應(yīng)而得的氨基酸衍生物的重復(fù)單元的嵌段在側(cè)鏈具 有乙胺結(jié)構(gòu)。此外，還優(yōu)選具有來(lái)自在側(cè)鏈導(dǎo)入了丙胺結(jié)構(gòu)的聚氨基酸衍生物的重復(fù)單元 的嵌段。
[0062] 本發(fā)明中，特別優(yōu)選使用將來(lái)自以賴氨酸和/或其衍生物作為重復(fù)單元的聚氨基 酸的嵌段（以下，有時(shí)稱作"PLys嵌段"。）、或來(lái)自以使天冬氨酸的1個(gè)羧基與二亞乙基三胺 結(jié)合而成的氨基酸衍生物和/或其衍生物作為重復(fù)單元的聚氨基酸的嵌段（以下，有時(shí)稱作 "PAsp(DET)嵌段"。）作為陽(yáng)離子性高分子鏈嵌段的嵌段共聚合。
[0063] 作為陽(yáng)離子性高分子鏈嵌段中的重復(fù)單元數(shù)，為了在嵌段共聚物形成內(nèi)部收容了 核酸的高分子微囊復(fù)合體時(shí)容易使形成殼的非電荷性親水性高分子鏈嵌段的密度充分提 高，優(yōu)選10~200個(gè)，更優(yōu)選20~100個(gè)。
[0064] 通過(guò)在陽(yáng)離子性高分子鏈嵌段的側(cè)鏈或其末端(與以共價(jià)鍵直接或間接鍵合于非 電荷性親水性高分子鏈嵌段的末端相反一側(cè)的末端）以共價(jià)鍵結(jié)合疏水性基，從而可以使 所得內(nèi)包核酸的高分子微囊復(fù)合體更穩(wěn)定化。當(dāng)在陽(yáng)離子性高分子鏈嵌段的側(cè)鏈具有疏水 性基的情況下，疏水性基可以以任意方式配置于陽(yáng)離子性高分子鏈嵌段中，例如可列舉無(wú) 規(guī)配置的情況、以嵌段的形式配置的情況（即，由非電荷性親水性高分子鏈嵌段、包含在側(cè) 鏈以共價(jià)鍵結(jié)合有疏水基的重復(fù)單元的陽(yáng)離子性高分子鏈嵌段、和包含不擔(dān)載疏水基的重 復(fù)單元的陽(yáng)離子性高分子鏈嵌段形成三嵌段的情況）。
[0065] 作為疏水性基，可列舉固醇衍生物的殘基或C4-24烴基。固醇是指以環(huán)戊酮?dú)浞骗h(huán) (C17H28)為基體的天然、半合成或合成的化合物，例如，作為天然的固醇，并不受限定，但是 可列舉膽固醇、膽