一種鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因，其是在土生隱球酵母BSLL1-1菌株中克隆的，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，編碼如SEQIDNO：2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；將該蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，并進(jìn)一步將該基因在釀酒酵母中成功表達(dá)，該基因使釀酒酵母耐鋁能力增加，基因工程菌可以吸附（或者吸收）培養(yǎng)介質(zhì)中的活性鋁，該釀酒酵母基因工程菌具有降低酸性土壤中活性鋁含量的應(yīng)用潛力。
【專利說明】一種鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及土生隱球酵母編碼鈣調(diào)磷酸酶催化亞基 的耐鋁基因，核苷酸序列和氨基酸序列，以及耐鋁蛋白的異源表達(dá)，涉及含有該基因的重組 質(zhì)粒和表達(dá)該耐鋁基因的工程菌株，它們的制備和表達(dá)方法，以及它們在吸附環(huán)境中活性 鋁的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 酸性土壤在世界上廣泛存在，其中可耕種面積為1. 79億hm2。我國酸性土壤的分 布遍及14個省區(qū)，約占全國耕地面積的21% (熊毅和李慶逵，1987)。氮肥的過量施用是導(dǎo) 致農(nóng)田土壤酸化的最主要原因。此外，工業(yè)化發(fā)展導(dǎo)致的酸雨、人類不良的耕作方式和陽離 子在土壤中的淋失，使酸性土壤的面積不斷擴大，酸化程度不斷加劇。
[0003] 鋁（aluminum，A1)在地殼中分布廣泛，約占地殼總質(zhì)量的7%。在土壤中，鋁的主 要存在形態(tài)是不溶于水的氧化物或鋁硅酸鹽，這些形態(tài)是對植物和環(huán)境沒有傷害的。但是 隨著土壤酸化程度的增加，土壤中的鋁從不溶于水的形態(tài)中溶解出來，轉(zhuǎn)化為可溶于水的 無機離子態(tài)，如Al 3+、（A10H)2+、（A10H)2+，這些形態(tài)對植物根系的毒害作用最大，又稱為活性 A1。因此，在酸性土壤上鋁毒害是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的主要限制因素之一。通常，解決鋁毒害 的方法是大量施用石灰來提高土壤的pH值，使游離鋁沉淀。但是這種方法難以徹底解決土 壤酸度和鋁毒害問題，同時還存在著潛在的環(huán)境問題。
[0004] 土壤微生物是土壤生態(tài)體系的重要組成部分，在植物和土壤的相互作用過程中扮 演著重要的角色。土壤微生物參與土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、物質(zhì)代謝、有機物分解、礦化以及污染物 降解等多種生化反應(yīng)。特別是，土壤微生物在土壤中污染物或者是重金屬清除中發(fā)揮了重 要作用，也即微生物修復(fù)技術(shù)。微生物修復(fù)技術(shù)是利用微生物(土著菌、外來菌、基因工程 菌)對污染物的代謝作用而轉(zhuǎn)化、降解污染物。微生物修復(fù)技術(shù)已成功應(yīng)用于煤氣廠址PAHs 污染修復(fù)，石油烴污染土壤修復(fù)，農(nóng)藥污染土壤修復(fù)等。此外，重金屬污染土壤的微生物修 復(fù)主要是利用土壤中天然的微生物資源，削減、凈化土壤中重金屬或降低重金屬毒性，從而 使污染物的濃度降低到可以接受的水平，或?qū)⒂卸居泻Φ奈廴疚镛D(zhuǎn)化為無害的物質(zhì)，也包 括將其穩(wěn)定化以減少其向周邊環(huán)境擴散。在重金屬污染土壤的生態(tài)修復(fù)中微生物主要通過 以下幾種方式起作用：（1)通過微生物的吸附、代謝達(dá)到對重金屬消減、凈化作用和固定作 用；（2)通過微生物改變重金屬的化學(xué)形態(tài)，使重金屬固定或生物可利用性降低，減少重金 屬的危害；（3) 土壤微生物通過氧化還原作用改變根際重金屬形態(tài)或產(chǎn)生的有機酸可增加 金屬的溶解性，提高重金屬的有效性，以利于植物吸收；（4)通過促進(jìn)植物生長，提高植物 抗病性、抗逆能力等方式間接影響修復(fù)效率。因為微生物種類多，代謝類型豐富，生長在酸 性環(huán)境中的微生物在長期的進(jìn)化過程中，為了保護細(xì)胞免受鋁的毒害，產(chǎn)生了一系列的抗 鋁毒機制：如有機酸及其代謝產(chǎn)物對鋁的螯合作用；抗氧化脅迫作用；抗細(xì)胞程序性死亡 等。因此，篩選或者改良土壤微生物使其增加對鋁的耐受性或者提高其對土壤中鋁的清除 能力，是解決酸性土壤上鋁毒害的直接而有效的措施。
[0005] 鈣離子（Ca2+)作為動植物及微生物細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，參與了胞內(nèi)很多生理 反應(yīng)。Ca 2+作為離子信號分子，需要下游受體才能將信號傳遞下去，并調(diào)節(jié)多種細(xì)胞反應(yīng)和 生物進(jìn)程。鈣調(diào)素（Calmodulin，CaM)是真核細(xì)胞內(nèi)高度保守的、廣泛存在的一種非常重要 的鈣離子受體蛋白。CaM自身不具有酶的活性，但其能與靶蛋白相互作用，從而對靶蛋白的 活性進(jìn)行調(diào)節(jié)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的Ca 2+濃度升高時，Ca2+會與CaM的EF-hand結(jié)構(gòu)域結(jié)合，直接導(dǎo) 致隹丐調(diào)素結(jié)合蛋白（calmodulin binding protein, CaMBP)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞，CaM結(jié) 合結(jié)構(gòu)域被釋放出來，結(jié)合了四個Ca2+的CaM再通過CaM結(jié)合結(jié)構(gòu)域與CaMBP相結(jié)合，從而 將信號傳導(dǎo)下去。鈣調(diào)磷酸酶（Calcineurin，CaN)是鈣調(diào)素下游結(jié)合靶蛋白的一種，是特 異性的鈣/鈣調(diào)蛋白依賴的蘇氨酸/絲氨酸蛋白磷酸酶。鈣調(diào)磷酸酶是一個異源二聚體蛋 白，由一個71KDa的催化亞基A (CNA)和一個19KDa的調(diào)節(jié)亞基B (CNB)組成。CNA含有四 個功能區(qū)：分別是催化結(jié)構(gòu)域；CNB結(jié)合結(jié)構(gòu)域；鈣調(diào)素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD);自抑制域(AID)。 鈣調(diào)磷酸酶的調(diào)節(jié)亞基CNB是一個具有EF-hand結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，能與Ca 2+結(jié)合。Ca2+存 在時，B亞基與A亞基結(jié)合后，會使調(diào)節(jié)片段中的自抑制結(jié)構(gòu)域（AID)從催化活性中心上 脫落，從而降低了自抑制結(jié)構(gòu)域?qū)γ富钚缘淖砸种谱饔谩?br> [0006] 鈣調(diào)磷酸酶在很多細(xì)胞和發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，其主要作用是通過轉(zhuǎn)錄因子 Crzl調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而使脅迫條件下細(xì)胞存活。在白色念珠菌中，鈣調(diào)磷酸酶的主要 作用是響應(yīng)各種刺激或脅迫（Zelteret al·，F(xiàn)ungal GenetBiol, 2004，41: 827-841; Stie and Fox, Eukaryot Cell, 2008，7: 177-186)。在高溫、高pH 以及I丐鹽離子脅 迫的情況下，鈣調(diào)磷酸酶對于釀酒酵母的生長是必需的（Bonilla et al.，ΕΜΒ0，2002， 21:2343-2353)。在釀酒酵母中乙醇脅迫可以激活鈣離子介導(dǎo)的鈣調(diào)磷酸酶/Crzl途徑 (Araki et al·，J Biosci Bioeng, 2009，107(1):1_6)。通過研究|丐調(diào)磷酸酶對人類主要 病原菌念珠菌毒力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)編碼鈣調(diào)磷酸酶催化亞基（CMP1/CNA)的白色念珠菌 突變體和編碼鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)亞基（CNB1)的白色念珠菌突變體，對于鹽脅迫、堿脅迫和滲 透脅迫是敏感的（Bader et al·，Infect Immun, 2003，71:5344-5354; Blankenship et al.，Eukaryot Cell, 2003，2:422-430)。這些結(jié)果表明，鈣調(diào)素信號途徑可能是生物體 耐受逆境脅迫的一種普遍機制，過表達(dá)該途徑上的基因會提高對逆境脅迫的耐受能力。因 此，克隆這些基因?qū)ρ芯克鼈冊诳逛X毒中的作用具有非常重要的意義。同時，對克隆到的基 因進(jìn)行改造或者構(gòu)建基因工程菌株，還可以為治理酸性土壤上的鋁毒害問題提供理論和應(yīng) 用基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明旨在提供一種鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所 示，編碼如SEQ ID N0 :2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；其由土生隱球酵母（C A腫icoA/s) BSLL1-1菌株產(chǎn)生，基因序列全長1917bp，與黑白輪枝菌絲氨 酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶（PP2B)基因同源性達(dá)到81%，編碼鈣調(diào)磷酸酶催化亞基（CNA)蛋白 由638個氨基酸組成，分子量約為77KDa。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因的重組表達(dá)載體 PYES3/CT- CNA。
[0009] 本發(fā)明另一目的是提供一種含有鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因或上述重組表達(dá)載體 的釀酒酵母工程菌株。
[0010] 本發(fā)明另一目的是將鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因應(yīng)用在吸附環(huán)境中活性鋁中。
[0011] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案： 1、 本發(fā)明提取從云南省保山市龍陵縣周邊茶園茶樹根際酸性土壤中分離的土生隱球 酵母BSLL1-1菌株基因組DNA，送上海人類基因組研究中心進(jìn)行基因組測序，得到CNA基因 組序列。根據(jù)該序列設(shè)計引物，用土生隱球酵母的cDNA為模板，用設(shè)計好的引物擴增CNA 基因片段。將擴增片段連接到PMD-18T載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，然后涂布含氨芐青霉 素的平板，挑取陽性菌落測序，鑒定出編碼CNA蛋白的基因，其序列如SEQ ID N0 :1所示，該 蛋白由638個氨基酸編碼，氨基酸序列如SEQ ID N0 :2所示； 2、 以土生隱球酵母cDNA為模板，用特異引物擴增CNA片段，然后與經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶 切的pET-32a載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)菌株，獲得重組質(zhì)粒pET-32a-CNA和含 重組表達(dá)質(zhì)粒的重組大腸桿菌菌株BL21 (DE3)_ pET-32a-CAN ; 3、 從測序正確的pMD18-T-CNA質(zhì)粒上酶切回收目的片段，連接到經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切 的酵母表達(dá)載體PYES3/CT質(zhì)粒上，得到重組質(zhì)粒pYES3/CT-CNA，將重組質(zhì)粒用電擊法轉(zhuǎn)化 釀酒酵母（INVScl)感受態(tài)細(xì)胞，用Western blotting法在轉(zhuǎn)基因酵母中檢測到了目的條 帶的存在，從而成功得到含PYES3/CT-CNA表達(dá)載體的重組酵母工程菌株INVScl-pYES3/ CT-CNA。
[0012] 本發(fā)明的優(yōu)點和技術(shù)效果如下： 本發(fā)明的鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因可以增加酵母的耐鋁能力，鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基 因工程菌株可以通過吸附作用降低環(huán)境中活性鋁的含量，這種利用微生物修復(fù)環(huán)境中活性 鋁的技術(shù)費用低，操作簡便，對環(huán)境影響小，不會造成二次污染。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1為本發(fā)明中驗證CNA和CaM之間相互作用的GST-pull down檢測圖；圖中： GST為純化的GST蛋白；GST-CAM為純化的GST-CaM融合蛋白； 圖2為本發(fā)明原核表達(dá)載體pET-32a-CNA質(zhì)粒及其漢3?HWa/7dIII雙酶切鑒定電泳檢 測圖，其中A圖中對照為對照質(zhì)粒；1，2,3為pET-32a-CNA質(zhì)粒；B圖中marker為DNA分子 量標(biāo)準(zhǔn)；2為2號質(zhì)粒雙酶切； 圖3為本發(fā)明CNA重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)電泳檢測圖，其中Marker為蛋白分子 量標(biāo)準(zhǔn)；0h，2h，4h，6h，8h為誘導(dǎo)時間；對照為轉(zhuǎn)空載體的菌株；上清為誘導(dǎo)菌體上清 液；沉淀為誘導(dǎo)菌體沉淀； 圖4為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因酵母的構(gòu)建及檢測圖，其中圖A為pYES3/CT-CNA質(zhì)粒的酶切 檢測圖，Μ為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，2，3，4為質(zhì)粒你/7dIII酶切；圖B為Western blotting檢測轉(zhuǎn)基因酵母中CNA蛋白的表達(dá)； 圖5為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因酵母耐鋁能力檢測圖； 圖6為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因酵母吸附(或吸收）鋁能力的檢測圖；其中：圖A為0. 2mM鋁時轉(zhuǎn) 基因酵母和對照酵母培養(yǎng)基中剩余鋁含量；圖B為2mM鋁時轉(zhuǎn)基因酵母和對照酵母培養(yǎng)基 中剩余鋁含量。

【具體實施方式】
[0014] 下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此，本 實施例中方法如無特殊說明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無特殊說明的采用常規(guī)試劑 或按常規(guī)方法配置的試劑。
[0015] 實施例1: 土生隱球酵母（C Awsico^A^BSLLl-l菌株CNA基因的克隆和鑒定 提取土生隱球酵母菌基因組DNA (奧斯伯等，精編分子生物學(xué)實驗指南(第 五版)，北京：科學(xué)出版社，2008)，送上海人類基因組研究中心進(jìn)行基因組測序，得 到CNA基因組序列，根據(jù)該序列設(shè)計引物，引物序列如下：正向引物CNA-F :5' -GGATCCATGACCTCTCCGGCGACCCAGC-3 ' （下劃線為 酶切位點），反向引物 CNA-R : 5 ' - AAGCTTTTAGGCAATAGAGTTCTCGG-3' (下劃線為你 fldlll酶切位點）。用土生隱球酵母的cDNA 為模板，用設(shè)計好的引物擴增CNA基因 片段。PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性3min，然后按照 94°C變性30s，65 °C退火30s，72 °C延伸2min的程序進(jìn)行30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 °C反應(yīng) lOmin。CNA基因的PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體上，獲得TA克隆載體命名為pMD18-T-CNA， 然后對獲得的TA克隆載體進(jìn)行酶切驗證，對酶切檢測正確的pMD18-T-CNA質(zhì)粒送北京六合 華大基因科技股份有限公司測序，CAN核苷酸序列如序列表SEQ ID N0 :1所示。
[0016] 實施例2 :驗證CNA和CaM的互作 合成CNA的多肽611-627 :RLAEVISSPTKGGQGER，免疫雄兔，制備CNA抗體； 1)免疫：選取3. 0kg左右的新西蘭大白兔，免疫之前，耳靜脈取陰性血清，取1000 μ g鈣 調(diào)磷酸酶催化亞基的多肽，用生理鹽水稀釋到ΙΟΟΟμ 1，再加入等體積弗氏佐劑(初次免疫 用弗氏完全佐劑，加強免疫用弗氏不完全佐劑)。用研缽將溶液和佐劑研磨混勻，使溶液形 成油包水的狀態(tài)。將混勻好的免疫原進(jìn)行皮下注射，一般免疫三次，前兩次免疫間隔兩周， 最后一次免疫間隔一周。第一次免疫在腳掌部注射打2-3個點，后兩次在背部免疫打4-5 個點。
[0017] 2)心臟采血：將兔仰面，四肢縛于動物固定架上（或由助手抓住四肢）。用乙醚麻 醉，剪去左胸部毛發(fā)，消毒皮膚。剪開皮膚，將心臟剝離，用50ml注射器（連接16號針頭） 傾斜進(jìn)針，對準(zhǔn)心搏最強處刺入心臟抽血。將抽取的血液立即注入無菌50ml離心管中，待 凝固后分離血清。
[0018] 3)分離血清：于10000rpm，4°C，離心15 min，取上清，分裝后置-20°C冰箱中保存 備用。
[0019] 4)多抗效果檢測：用Western blotting方法檢測得到的多克隆抗體，用陰性血清 作為負(fù)對照。檢測得到的抗體效果很好，可以用于做后面的實驗。
[0020] 驗證 CNA 和 CaM 之間的相互作用。Glutathione S-transferase(GST)和 GST-CaM 在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，并且分別用GST親和層析柱純化獲得純度較高的目的蛋白。分別 取50 Pg純化的GST和GST-CaM融合蛋白與20 mM A1處理12 h的土生隱球酵母總蛋白500 吒在結(jié)合緩沖液（50 mM Tris-Cl，pH 7.5,100 mM NaCl，0.25% TritonX-100，lmM EDTA， ImM DTT)中共同震蕩孵育2 h;加入30 μ? GST瓊脂糖結(jié)合樹脂在4°C搖床（40 rpm)孵育 過夜；4°C，3500g離心5min收集沉淀物，收集的沉淀蛋白混合物用結(jié)合緩沖液洗滌三次；沉 降下來的蛋白質(zhì)混合物加入10 μ? SDS凝膠加樣緩沖液（Tris-HCl 50 mM，pH 6. 8;SDS 2 % ;DTT 100 mM ;溴酚藍(lán)0· 1 % ;甘油10 %)，用沸水浴煮；在12%的SDS-PAGE膠分離所沉淀 的蛋白質(zhì)；分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后分別用anti-CNA特異性抗體孵育膜，隨后 在Chemidoc XRS⑵/0-7?仍中進(jìn)行成像觀察。結(jié)果表明，CNA可以被GST-CaM蛋白沉淀；然 而負(fù)對照GST蛋白沒有沉淀到CNA (圖1)。因此，CaM和CNA在體外是可以相互作用的。
[0021] 實施例3 :CNA蛋白的異源表達(dá) 以土生隱球酵母的cDNA作為模板，用特異引物CNA-F和CNA-R擴增CNA片段，然后與經(jīng) 限制性內(nèi)切酶你 fldlll酶切的pET-32a載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)菌株， 獲得重組質(zhì)粒pET-32a-CNA。提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，檢測到與目的條帶 和載體片段同樣大小的兩條帶，如圖2所示，說明原核表達(dá)載體pET-32a-CNA構(gòu)建成功。將 重組質(zhì)粒pET-32a-CNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，得到含重組表達(dá)質(zhì)粒的重組菌株大腸桿 菌 BL21(DE3)- pET-32a-CNA。
[0022] 將重組大腸桿菌BL21(DE3)_ pET-32a-CNA菌株和對照菌株即含有pET-32a質(zhì) 粒的大腸桿菌BL21(DE3) - pET-32a，接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，200 rpm、37°C培養(yǎng)過夜，再按1%的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，20°C培養(yǎng)至0D_為 0. 6-0. 8時，加入ITPG至終濃度為ImM，對含有CNA目的基因的表達(dá)載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；分 別收集誘導(dǎo)他、211、411、611、811后的表達(dá)菌體21111，收集后的菌液于4 1：、12 000印111離心1 min，棄上清液，沉淀用2M尿素100 μ 1重懸，之后再加20 μ 1 SDS凝膠加樣緩沖液，煮沸5 -lOmin后，12 000 rpm離心1 min,取20 μ 1上清進(jìn)行SDS-PAGE分析，確定菌體的最優(yōu)表 達(dá)時間。本實驗以含有目的基因的表達(dá)菌誘導(dǎo)〇 h和含pET-32a空載體的大腸桿菌誘導(dǎo)表 達(dá)6 h作為對照。隨后，對收集的菌體進(jìn)行超聲波破碎，4°C，12000rpm離心20min，收集上 清與沉淀，SDS-PAGE檢測蛋白的表達(dá)形式。SDS-PAGE分離膠的濃度為12%，濃縮膠濃度為 4%。SDS-PAGE結(jié)果表明，CNA基因編碼的蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中大量表達(dá)，且在上清 和沉淀中都有表達(dá)（圖3)。重組蛋白的最佳表達(dá)條件為20°C，lmM IPTG，誘導(dǎo)時間為6h。
[0023] 實施例4 : CNA轉(zhuǎn)基因酵母的構(gòu)建及檢測 將測序正確的PMD18-T-CNA質(zhì)粒用fe?HI和班/7dIII酶切，回收CNA片段，用fe?HI 和班/7dIII酶切pYES3/CT質(zhì)粒，回收得到帶有fe?HI和班/7dIII酶切位點的線性pYES3/CT 片段，然后將二者進(jìn)行連接反應(yīng)，得到PYES3/CT-CNA質(zhì)粒。用fe?HI和班/7dIII對pYES3/ CT-CNA質(zhì)粒酶切，酶切產(chǎn)物電泳檢測到了目的條帶（圖4A)，說明外源基因成功插入到酵母 表達(dá)載體上。
[0024] 將檢測正確的PYES3/CT-CNA質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSc 1感受態(tài)細(xì)胞，在 SD-Trp平板上長2-3天，挑取單菌落，30°C培養(yǎng)過夜，收集菌體后提取總蛋白，用CNA抗體進(jìn) 行Western blotting檢測，在轉(zhuǎn)基因酵母中檢測到了與目的蛋白大小的條帶，結(jié)果如圖4B 所示，這進(jìn)一步驗證了外源基因在釀酒酵母細(xì)胞得到了成功表達(dá)。
[0025] 實施例5 :轉(zhuǎn)基因酵母耐鋁能力檢測 配制鋁濃度為〇、〇. l、〇. 2、2mM的Yro誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基(碳源為半乳糖)，將活化的 菌體按初始〇D6(?為1，稀釋倍數(shù)分別為10° UCT1、10_2、10_3、10_4,將稀釋的菌液5μ1 點種到平板上，48h后觀察生長情況，從圖5中看出，隨著鋁濃度的增加，轉(zhuǎn)基因酵母 INVScl-pYES3/CT-CNA耐鋁能力都明顯高于對照酵母INVScl-pYES3/CT。在含有0. ImM鋁的 固體平板上，與對照酵母相比，轉(zhuǎn)基因酵母菌落較大，表明對照酵母生長受到抑制。在含有 2mM鋁的固體平板上，稀釋倍數(shù)為10_ 4時，pYES3/CT-CNA轉(zhuǎn)基因酵母生長良好，對照酵母 基本不生長。隨著鋁濃度的增加，轉(zhuǎn)基因酵母生長狀況比對照酵母好，說明在鋁脅迫下CNA 基因有促進(jìn)生長的作用。
[0026] 實施例6 :轉(zhuǎn)基因酵母吸附(或吸收）鋁的檢測 通過檢測培養(yǎng)基中剩余活性鋁的含量，進(jìn)而檢測PYES3/CT-CNA轉(zhuǎn)基因酵母吸收或吸 附鋁的能力。分別用含有〇. 2mM和2mM鋁的培養(yǎng)基作為對照，其培養(yǎng)基中剩余鋁含量定義 為100%。在含有0. 2mM鋁時，pYES3/CT-CNA轉(zhuǎn)基因酵母培養(yǎng)基中活性鋁剩余量為33. 54%， 與轉(zhuǎn)空載體PYES3/CT酵母相比，pYES3/CT-CNA轉(zhuǎn)基因酵母的培養(yǎng)基中剩余的活性鋁明顯 減少。在含有2mM鋁時，pYES3/CT-CNA轉(zhuǎn)基因酵母培養(yǎng)基中活性鋁剩余量為74. 19%，與轉(zhuǎn) 空載體PYES3/CT酵母相比，pYES3/CT-CNA轉(zhuǎn)基因酵母的培養(yǎng)基中剩余的活性鋁也明顯減 少（圖6)。這些結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因酵母中，CNA基因可能通過增加菌體對鋁的吸附或者吸 收來達(dá)到耐鋁的目的。
【權(quán)利要求】
1. 一種鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，編碼如SEQ ID NO :2所不氣基酸序列的蛋白質(zhì)。
2. -種含有權(quán)利要求1所述的鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因的重組表達(dá)載體。
3. -種釀酒酵母工程菌株，所述工程菌株含有權(quán)利要求1所述的鈣調(diào)磷酸酶催化亞基 基因或權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體。
4. 權(quán)利要求1所述的鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因在吸附環(huán)境中活性鋁中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N9/16GK104195152SQ201410423663
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月26日
【發(fā)明者】年洪娟, 張磊, 張晶晶, 陳麗梅 申請人:昆明理工大學(xué)