用于檢測(cè)人類egfr基因突變的引物及方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是基因突變的檢測(cè)。更具體而言，本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)人類表皮生長(zhǎng)因子EGFR基因41種突變的9組引物及使用其進(jìn)行檢測(cè)的方法。
【專利說(shuō)明】用于檢測(cè)人類EGFR基因突變的引物及方法
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及基因突變的檢測(cè)，特別涉及檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子EGFR基因突變的引物及其方法。

【背景技術(shù)】
[0003]表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)是上皮生長(zhǎng)因子(EGF)細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)的受體。EGFR屬于HER或ErbB受體家族的一員，該家族包括EGFR (ErbB-1)、HER2/c-neu(ErbB-2)、Her 3 (ErbB-3)和 Her 4 (ErbB-4) ? EGFR 也常被稱作HERl或ErbBl。EGFR及其家族成員能夠調(diào)控細(xì)胞分化、凋亡、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、新血管生成、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等多項(xiàng)生理過(guò)程，同時(shí)在大部分的人類腫瘤中都有表達(dá)，因此EGFR已經(jīng)被證明在眾多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后過(guò)程中發(fā)揮了重要調(diào)控作用。
[0004]EGFR是典型的具有酪氨酸激酶(Tyrosine Kinase, TK)活性的受體，TK在EGFR的活性中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。美國(guó)FDA批準(zhǔn)對(duì)擬采用易瑞沙、特羅凱等EGFR-TKI治療的患者，進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)。需要指出，檢測(cè)EGFR基因突變并不能作為患者是否患癌的依據(jù)。在我國(guó)《NCCN:非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南(中國(guó)版)》中只是明確提出了臨床實(shí)踐中EGFR-TKI治療前需要針對(duì)EGFR編碼區(qū)第18、19、20和21外顯子的突變位點(diǎn)開(kāi)展檢測(cè)。確定患者是否攜帶有EGFR突變?cè)谝欢ǔ潭壬媳苊鉄o(wú)效用藥和社會(huì)經(jīng)濟(jì)資源的浪費(fèi)。近年來(lái)，EGFR 酪氨酸激酶抑制劑(Epidermal Growth Factor Receptor-TyrosineKinase Inhibitor, EGFR-TKI)類藥物(包括吉非替尼和厄洛替尼等)已經(jīng)在非小細(xì)胞肺癌等腫瘤的特定患者的臨床治療中被證明效果顯著(Paez JG, et al.Science.2004;304:1497-1500)。EGFR-TKI能夠有效延長(zhǎng)患者的生存期，但研究表明患者個(gè)體EGFR的第18、19、20和21號(hào)外顯子的突變狀態(tài)(尤其是19號(hào)外顯子的插入缺失以及21號(hào)外顯子L858R點(diǎn)突變最為常見(jiàn))和療效密切相關(guān)，占到突變總數(shù)的90%以上(Chan SK et al.EurJ Cancer 42，1，2006, 17-23)。因此，在引物設(shè)計(jì)時(shí)包含核心突變區(qū)的高頻突變點(diǎn)和盡可能多的突變點(diǎn)，檢測(cè)時(shí)將會(huì)最大程度上降低EGFR突變檢測(cè)的假陰性。
[0005]目前，使用最多的臨床基因突變檢測(cè)方法是PCR測(cè)序法，PCR測(cè)序法是目前默認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。其它常用的方法還包括PCR-RFLP法、PCR-SSCP法、Real time PCR法、DHPLC和ARMS法等。PCR測(cè)序法敏感度較低，對(duì)低質(zhì)量或含量較低的樣本檢測(cè)會(huì)產(chǎn)生較大的假陽(yáng)性和假陰性。ARMS法能將突變檢測(cè)的選擇性提高到1%，但是對(duì)于質(zhì)量低或含量低的DNA樣品，這樣的選擇性依然偏低。另外，ARMS法依靠常規(guī)凝膠電泳或探針雜交來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物，對(duì)于因樣品含量較低導(dǎo)致擴(kuò)增效率較低的突變產(chǎn)物，在電泳條帶上可能不能顯示。同時(shí)，該方法不能對(duì)樣品所含突變進(jìn)行定量或半定量分析。本領(lǐng)域需要可高靈敏度和高選擇性地進(jìn)行突變檢測(cè)的PCR技術(shù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明使用了一種加熒光并結(jié)合毛細(xì)管電泳的阻滯PCR技術(shù)方法(AMP-MDS)。
[0007]具體而言，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)人類表皮生長(zhǎng)因子EGFR基因41種突變的基于人工修飾的引物及PCR方法。其中，所述PCR方法包括如下步驟:
1)對(duì)于EGFR基因的41種突變(位于18、19、20和21號(hào)的外顯子)，對(duì)每一個(gè)點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)包括一對(duì)外引物和兩個(gè)內(nèi)引物的組合；對(duì)每一個(gè)缺失突變或者插入突變，設(shè)計(jì)一對(duì)外引物，其中所述兩個(gè)內(nèi)引物方向相向，3’端位于突變位置處，一個(gè)內(nèi)引物的3’端和正常堿基互補(bǔ)，另一個(gè)內(nèi)引物的3’端與突變位置的突變堿基互補(bǔ)；所述兩個(gè)外引物分別和一個(gè)內(nèi)引物可以配對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，它們自身也可以進(jìn)行配對(duì)擴(kuò)增；所述兩個(gè)外引物配對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物以及所述兩個(gè)外引物分別和所述兩個(gè)內(nèi)引物所配對(duì)產(chǎn)生的兩個(gè)產(chǎn)物的長(zhǎng)度差均須在5 bp以上；在所述內(nèi)引物3’端倒數(shù)5個(gè)堿基的區(qū)域引入錯(cuò)配，按照熱力學(xué)穩(wěn)定性高低相間的模式引入(低熱力學(xué)穩(wěn)定性是指引物與模板結(jié)合能力弱，不穩(wěn)固，例如含有兩個(gè)氫鍵的AT配對(duì)，或者AC，AG等錯(cuò)配；高熱力學(xué)穩(wěn)定性是指引物與模板結(jié)合能力強(qiáng)，比較穩(wěn)固，如含有三個(gè)氫鍵的CG配對(duì))；將熒光加在外引物的5’端，且使用不同顏色的熒光染料對(duì)兩個(gè)內(nèi)引物進(jìn)行標(biāo)記；
2)用步驟I)中的各組引物分別擴(kuò)增來(lái)自待測(cè)樣品的模板序列，對(duì)于點(diǎn)突變，得到所述兩個(gè)外引物配對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物I以及所述兩個(gè)外引物分別和所述兩個(gè)內(nèi)引物所配對(duì)產(chǎn)生的產(chǎn)物2和產(chǎn)物3 ;對(duì)于插入突變或者缺失突變，得到長(zhǎng)度有差異的兩條產(chǎn)物；
3)將上述產(chǎn)物通過(guò)熒光毛細(xì)管電泳進(jìn)行分析，對(duì)于點(diǎn)突變，在產(chǎn)物1、產(chǎn)物2和產(chǎn)物3均有峰值時(shí)，表示在突變位置有突變堿基；對(duì)于插入突變或缺失突變，如果有兩個(gè)峰值時(shí)，表示有插入突變或缺失突變。
[0008]在一個(gè)實(shí)施方案中,所述PCR方法還包括定量步驟:
4)進(jìn)一步計(jì)算每一個(gè)峰值與標(biāo)準(zhǔn)品的峰值的比值，得到突變堿基的含量和正常堿基的含量的定量比值。
[0009]共41種突變
在本發(fā)明中，肺癌患者表皮生長(zhǎng)因子(EGFR)基因的41種突變具體詳見(jiàn)表1。
[0010]表1肺癌患者表皮生長(zhǎng)因子(EGFR)基因的41種突變

【權(quán)利要求】
1.用于檢測(cè)人類EGFR基因突變的引物，包括下列9組引物:
(1)G719S_0UT_FP: SEQ ID N0.1、
G719S_0UT_RP: SEQ ID N0.2、
G719S_IN_FP: SEQ ID N0.3、
G719S_IN_RP: SEQ ID N0.4 ；
(2)G719C_0UT_FP: SEQ ID N0.1、
G719C_0UT_RP: SEQ ID N0.2、
G719C_IN_FP: SEQ ID N0.5、
G719C_IN_RP: SEQ ID N0.6 ；
(3)G719A_0UT_FP: SEQ ID N0.7,
G719A_0UT_RP: SEQ ID N0.8、
G719A_IN_FP: SEQ ID N0.9、
G719A_IN_RP: SEQ ID N0.10 ；
(4)Exl9-del_OUT_FP: SEQ ID N0.11、
Exl9-del_OUT_RP: SEQ ID N0.12 ；
(5)S768I_OUT_FP: SEQ ID N0.13、
S768I_OUT_RP: SEQ ID N0.14、
S768I_IN_FP: SEQ ID N0.15、
S768I_IN_RP: SEQ ID N0.16 ；
(6)T790M_0UT_FP: SEQ ID N0.17、
T790M_0UT_RP: SEQ ID N0.18、
T790M_IN_FP: SEQ ID N0.19、
T790M_IN_RP: SEQ ID N0.20 ；
(7)Ex20-1ns_0UT_FP: SEQ ID N0.21、
Ex20-1ns_0UT_RP: SEQ ID N0.22 ；
(8)L858R_OUT_FP: SEQ ID N0.23、
L858R_OUT_RP: SEQ ID N0.24、
L858R_IN_FP: SEQ ID N0.25、
L858R_IN_RP: SEQ ID N0.26 ；
(9)L861Q_OUT_FP: SEQ ID N0.27、
L861Q_OUT_RP: SEQ ID N0.28、
L861Q_IN_FP: SEQ ID N0.29、
L861Q_IN_RP: SEQ ID N0.30。
2.一種檢測(cè)人類EGFR基因突變的方法，包括以下步驟: 用權(quán)利要求1所述的9組引物擴(kuò)增來(lái)自待測(cè)樣品的模板； 使用通過(guò)熒光毛細(xì)管電泳進(jìn)行分析，對(duì)于點(diǎn)突變，如果出現(xiàn)三個(gè)峰值時(shí)，表示在突變位置有突變堿基；對(duì)于插入突變或缺失突變，如果有兩個(gè)峰值時(shí)，表示有插入突變或缺失突變。
3.權(quán)利要求2的方法，還包括步驟:進(jìn)一步計(jì)算每一個(gè)峰值與標(biāo)準(zhǔn)品的峰值的比值，得到突變堿基的含量和正常堿基的含量的定量比值。
4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于:步驟2)所述的待測(cè)樣品包括手術(shù)切除的新鮮病理組織、甲醛固定石蠟包埋病理組織、石蠟切片、全血、血漿、血清或胸腔積液。
5.如權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述的方法，其中擴(kuò)增用包括如下的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行: PCR緩沖液、rTaq酶、dNTP-MIX、MgCl2、外引物和甲酰胺。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中用于擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系包括: PCR緩沖液
rTaq 酶 2.5 μ L
1X緩沖液5 μ L
dNTP-MIX 200 μ mol/L
MgCl2 1.5-2.0 mmol/L
外引物各I μ L
甲酰胺I yL。
7.一種試劑盒，包括:權(quán)利要求1所述的9組引物。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，還包括PCR反應(yīng)緩沖液。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，還包括rTaq酶、dNTP-MIX、MgCl2、外引物和甲酰胺。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104131091SQ201410346892
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月21日
【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請(qǐng)人:思博奧科生物信息科技（北京）有限公司