一種高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)安絡小皮傘菌絲體多糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)安絡小皮傘菌絲體多糖的方法，該方法是將安絡小皮傘發(fā)酵液分離的菌絲體通過超聲波和復合酶解進行處理、分離得到安絡小皮傘多糖。本發(fā)明改變了傳統(tǒng)的多糖“水提醇沉”的提取方式，提高了安絡小皮傘多糖的提取收率和產(chǎn)品品質(zhì)，減少了生產(chǎn)中純化水用量和能源消耗，增加了經(jīng)濟效益。
【專利說明】一種高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)安絡小皮傘菌絲體多糖的 方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物【技術領域】，具體是一種高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)安絡小皮傘 菌絲體多糖的方法。

【背景技術】
[0002] 安絡小皮傘，學名為Marasmius androsaceus (L. ex Fr. ) Fr.別名鬼毛針、茶褐 小皮傘等，屬于擔子菌綱、傘菌目（Agaricales)、白蘑科（ThichoLomataceae)、小皮傘屬 (Marasmius)。生于深山密林、陰冷潮濕、酸性土壤上面的枯枝上，主要分布于我國吉林、湖 南、湖北、廣東等省。我國民間早有用野生安絡小皮傘的根狀菌索來治療骨折疼痛、跌打損 傷等。據(jù)廣東微生物研究所（1975)報道，該所與廣州第一制藥廠等用人工發(fā)酵培養(yǎng)方法， 獲得安絡小皮傘發(fā)酵培養(yǎng)物，再將其濃縮制成的"安絡痛膠囊"和藥酒，經(jīng)臨床驗證600例， 證明對三叉神經(jīng)痛、坐骨神經(jīng)痛、偏頭痛、眶上神經(jīng)痛、面部神經(jīng)麻痹、面肌痙攣及風濕性關 節(jié)炎等均有一定的療效。對中、輕麻瘋神經(jīng)痛、腰肌勞損等也有一定緩解作用，是對人體安 全、無毒副作用的鎮(zhèn)痛和抗風濕藥物。目前用其制成的藥品，除"安絡痛膠囊"外，還有"安 絡痛酊"、"安絡痛注射液"和"安絡解痛片"等。臨床和市場效果很好。近年來的研究表明 安絡小皮傘的營養(yǎng)保健價值也很高，能促進神經(jīng)組織和纖維結(jié)締組織的炎癥消失，改善局 部的血流循環(huán)和組織營養(yǎng)狀況，恢復神經(jīng)功能。菌內(nèi)含有的氨基酸、糖類等成分可以作為食 品和保健品的添加成分，對人體的免疫力提高和抗衰老有一定的作用。安絡小皮傘其它組 分的功能還處于正在研究的階段。
[0003] 目前國內(nèi)關于液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)安絡小皮傘的功效成分多糖的相關報道很少。目前關 于真菌類原料多糖的提取工藝多為傳統(tǒng)的水提醇沉法，即向干燥后的菌絲體加入8-20倍 重量的水，控制溫度80-KKTC浸泡2-4h，靜止l-2h，然后反復浸提2-3次，然后合并上清液 進行濃縮，再用50-85%的酒精進行醇沉，最終烘干即可得到粗多糖。此工藝的缺點是需加 入大量水長時間進行浸提，并且為提高收率需反復浸提2-3次，操作周期較長、勞動強度偏 大，多糖的提取收率多在2-3%，產(chǎn)品成本比較昂貴。并且分離的上清液作為廢液直接棄液 排掉，增加了治污成本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了解決傳統(tǒng)多糖的水提醇沉的技術瓶頸，采用此發(fā)明能夠快 速、高效生產(chǎn)出安絡小皮傘多糖。
[0005] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明主要按照下述步驟進行：
[0006] 本發(fā)明的高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)安絡小皮傘菌絲體多糖的方法，包括下述步 驟：
[0007] 1)分離：將安絡小皮傘發(fā)酵液經(jīng)分離，得到安絡小皮傘上清液和濕菌絲體；
[0008] 2)超聲處理：向步驟1)所得的濕菌絲體中加入步驟1)所得2-5倍質(zhì)量的安絡小 皮傘上清液進行稀釋，攪拌均勻后進行超聲處理10_40min，得到超聲處理液；
[0009] 3)復合酶解：將步驟2)所得超聲處理液調(diào)節(jié)pH值為4-7,控制溫度30_70°C，然 后向其加入相當于干菌絲體重量〇. 2-3%的纖維素酶、0. 2-3%的蛋白酶，進行酶解l-4h， 得到酶解液；
[0010] 4)分離、濃縮：將步驟3)所得的酶解液進行分離，將分離所得到的上清液經(jīng)低溫 濃縮，得到濃縮比重為1. 25?1. 40(50°C熱測）的濃縮漿；
[0011] 5)醇沉、烘干：加入濃縮漿重量3-5倍量的體積濃度為95%的酒精，至混合液酒 精度為65-80 % (v/v)，靜置2-6h，將沉淀物進行真空烘干；烘干至干燥物水分含量為3? 8%，即得菌絲體多糖提取物。
[0012] 其中，步驟1)、4)所述的分離為離心分離，采用三足離心機或高速離心機等離心 設備進行，轉(zhuǎn)速為1500_5000rpm。
[0013] 步驟2)超聲所用的設備為超聲波細胞粉碎機，其他同等超聲設備均可；超聲的功 率為 0. 5-2. 5kw。
[0014] 步驟3)所述的纖維素酶的單位酶活為15000 μ /g?25000 μ /g，所述的蛋白酶的 單位酶活為47000 μ /g?53000 μ /g。
[0015] 所述的低溫濃縮過程均要求控制溫度不高于75°C，真空度不低于0. 085Mpa。
[0016] 所述的真空烘干的溫度50_75°C，真空度不低于0. 085Mpa。
[0017] 本發(fā)明中醇沉次數(shù)越多，多糖的含量越高。真空烘干采用的真空干燥箱，本發(fā)明提 取的多糖含量在30-60%。
[0018] 本發(fā)明具有以下幾個突出的優(yōu)點：
[0019] 傳統(tǒng)的工藝是至少用菌絲體干重的20倍的純化水進行稀釋，而本工藝采用上清 液進行稀釋，并且添加量只為菌絲體干重的2-5倍；具有以下優(yōu)點：1、本發(fā)明利用上清液替 代純化水進行稀釋，減少了廢液排放，減少了治污成本；2、因上清液中含部分胞外多糖，作 為溶液稀釋時，其中所含的多糖也可被回收利用。3、用上清液替代純化水，節(jié)約了純化水， 降低生產(chǎn)成本。
[0020] 本發(fā)明提取路線簡潔，節(jié)約了大量的能源消耗：因減少了純化水的加入量，相應的 在后期的分離、濃縮等工序減少了大量的電、蒸汽能源的消耗；
[0021] 縮短了操作周期，減少了勞動強度：本發(fā)明改變了傳統(tǒng)的多次浸提，采用一次短時 間處理，是傳統(tǒng)處理時間的1/3-1/6,減輕了工人的勞動強度。
[0022] 提高了提取收率：傳統(tǒng)的水提多糖的提取收率在2-3%，此發(fā)明用特定功率和時 間的超聲處理和酶解加劇了菌絲體胞內(nèi)產(chǎn)物的溶出度，本發(fā)明提取多糖收率在4-6%，比傳 統(tǒng)工藝提升了1倍多；
[0023] 提升了產(chǎn)品品質(zhì)：因本發(fā)明采用超聲和復合酶解處理菌絲體，將部分菌絲體的蛋 白降解成可溶性的小分子物質(zhì)，減少了在醇沉過程中雜質(zhì)蛋白的含量，提升了多糖的產(chǎn)品 品種，采用本發(fā)明提取多糖含量多在40%以上，比傳統(tǒng)工藝提升了 30%以上；
[0024] 采用本發(fā)明可根據(jù)市場需求和產(chǎn)品標準，制得不同含量的高品質(zhì)的多糖，多糖含 量可在30-60%。

【具體實施方式】
[0025] 以下通過具體實施例進一步說明本發(fā)明。但實施例的具體細節(jié)僅用于解釋本發(fā) 明，不應理解為對本發(fā)明總的技術方案的限定。本發(fā)明使用于普遍的安絡小皮傘菌，其來源 不受實施例的限制，實施例中使用的菌種編碼CGMCC N05. 0152的安絡小皮傘菌僅是為了舉 例說明本發(fā)明的技術方案。
[0026] 實施例1
[0027] 本發(fā)明高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)安絡小皮傘菌絲體多糖的方法按下述步驟進 行：
[0028] 1、安絡小皮傘發(fā)酵液的制備：安絡小皮傘菌種購買于中國科學院微生物研究所普 通微生物中心，菌種編碼CGMCC N05. 0152。將活化好的安絡小皮傘搖瓶菌株按接種量10% (v/V)接種于種子培養(yǎng)基（10L)，其中種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖3%、酵母粉0.3%、玉米漿 1.0%、磷酸二氫鉀0.3%、七水硫酸鎂0. 15%、消泡劑0.02%，調(diào)節(jié)pH值6. 5,通風比為1 : 1. Ovvm，罐壓0. 03Mpa，24?26°C振蕩培養(yǎng)5天即得安絡小皮傘種子液；將種子液按接種量 18% (v/v)接入發(fā)酵培養(yǎng)基（50L)，其中發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖2. 8%、酵母粉0.5%、玉 米漿1. 5%、磷酸二氫鉀0. 3%、七水硫酸鎂0. 15%、豆油0. 02%，調(diào)節(jié)pH值6. 5 ;通風比為 1 :1. Ovvm，罐壓0. 03Mpa，26?28?培養(yǎng)5天，發(fā)酵至菌球變碎、濾液渾池；還原糖降至最低 0.2并略有波動；鏡檢菌絲細碎，無雜菌污染。即得安絡小皮傘發(fā)酵液。其中上述培養(yǎng)基組 成中的" ％ "均表示g/100ml。
[0029] 2、安絡小皮傘發(fā)酵液分尚：取上述安絡小皮傘發(fā)酵液lOKg通過1?速尚心機 3000rpm進行分離，得到安絡小皮傘上清液液9. 2Kg和0. 80Kg的濕菌絲體（含水量為 80% )；
[0030] 3、超聲處理：向步驟2所得的0. 80Kg濕菌絲體中加入2. 5Kg的安絡小皮傘上清液 進行稀釋，攪拌均勻后進行超聲處理20min，超聲功率1. 5kw，得到超聲處理液3. 3Kg ;
[0031] 4、復合酶解：將步驟3所得超聲處理液調(diào)節(jié)pH值為5. 5,45°C水浴，然后向其中緩 慢加入纖維素酶2. 5g (購自棗莊杰諾生物酶有限公司，單位酶活20000 μ /g，下同）、蛋白酶 2. 5g (購自棗莊杰諾生物酶有限公司，單位酶活50000 μ /g，下同）并不斷攪拌，攪拌均勻后 計時進行酶解2h，得到酶解液；
[0032] 5、分離、濃縮：將步驟4所得的酶解液用高速離心機5000rpm進行分離，將分離所 得到的上清液2. 6Kg用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低溫濃縮，濃縮過程均要求控制溫度不高于75°C，真空 度不低于〇. 〇85MPa，得到濃縮比重為1. 3(50°C熱測）的濃縮漿75g ;
[0033] 6、醇沉、烘干：向75g濃縮漿的中加入270ml的95%酒精，用酒精計檢測混合液 酒精度71 % (v/v)，緩慢攪拌均勻后靜置3h，將底部沉淀物分離用真空干燥箱進行烘干，溫 度60°C，真空度0. 09MPa ;烘干lh得安絡小皮傘菌絲體多糖提取物22g。檢測水分含量為 3. 1 %，多糖含量為45 %，折合純多糖提取收率為6. 19 %。
[0034] 本發(fā)明中的多糖提取收率是按干菌粉計算的，即純多糖提取收率=菌絲體多糖提 取物質(zhì)量*多糖含量/ [濕菌絲體質(zhì)量* (1-含水量）]*100 %。
[0035] 實施例2
[0036] 本發(fā)明高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)安絡小皮傘菌絲體多糖的方法按下述步驟進 行：
[0037] 1、安絡小皮傘發(fā)酵液的制備：安絡小皮傘菌種購買于購買于中國科學院微生物研
【權(quán)利要求】
1. 一種安絡小皮傘菌絲體多糖的提取方法，其特征在于該方法包括下述步驟： 1) 分離：將安絡小皮傘發(fā)酵液經(jīng)分離，得到安絡小皮傘上清液和濕菌絲體； 2) 超聲處理：向步驟1)所得的濕菌絲體中加入步驟1)所得2-5倍質(zhì)量的安絡小皮傘 上清液進行稀釋，攪拌均勻后進行超聲處理10_40min，得到超聲處理液； 3) 復合酶解：將步驟2)所得超聲處理液調(diào)節(jié)pH值為4-7,控制溫度30-70°C，然后向 其加入相當于干菌絲體重量〇. 2-3%的纖維素酶、0. 2-3%的蛋白酶，進行酶解l-4h，得到 酶解液； 4) 分離、濃縮：將步驟3)所得的酶解液進行離心分離，將分離所得到的上清液經(jīng)低溫 濃縮，得到濃縮比重為1. 25?1. 40的濃縮漿； 5) 醇沉、烘干：加入濃縮漿重量3-5倍量的95%酒精，至混合液酒精度為65-80% (v/ v)，靜置2-6h，將沉淀物進行真空烘干；烘干至干燥物水分含量為3?8 %，即得菌絲體多糖 提取物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的安絡小皮傘菌絲體多糖的提取方法，其特征在于所述的分離 為離心分離，轉(zhuǎn)速控制在1500-5000rpm。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的安絡小皮傘菌絲體多糖的提取方法，其特征在于所述的纖維 素酶酶活為15000 μ /g?25000 μ /g，所述的蛋白酶的單位酶活為47000 μ /g?53000 μ / g°
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的安絡小皮傘菌絲體多糖的提取方法，其特征在于步驟4)所述 的低溫濃縮過程均要求控制溫度不高于75°C，真空度不低于0. 085Mpa。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的安絡小皮傘菌絲體多糖的提取方法，其特征在于步驟5)所述 的真空烘干的溫度控制在50-75°C，真空度不低于0. 085Mpa。
【文檔編號】C12P19/04GK104087635SQ201410337924
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月15日
【發(fā)明者】王文風, 徐國華, 徐玲, 王英燕, 張芙蓉, 楊亞威, 高巖 申請人:江蘇神華藥業(yè)有限公司