一種人類hla-b27基因分型試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種人類HLA-B27基因分型試劑盒，包括PCR擴增引物、DNA聚合酶和反應(yīng)緩沖液，所述的DNA聚合酶為經(jīng)聚乙二醇（PEG）修飾的可耐受血液中PCR反應(yīng)抑制物的熱啟動Taq聚合酶，還提供了PCR擴增引物的核苷酸序列。本發(fā)明具有如下技術(shù)效果：所用的DNA聚合酶為經(jīng)聚乙二醇（PEG）修飾的可耐受血液中PCR反應(yīng)抑制物的熱啟動Taq聚合酶，能夠?qū)崿F(xiàn)對人類全血（無需進行核酸提?。┑腜CR擴增，直接經(jīng)血液進行PCR擴增，無需進行DNA提??；本試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)樣本的HLA-B27陰陽性鑒定；同時能得出HLA-B27陽性樣本的基因亞型結(jié)果，每8孔（8聯(lián)管）可檢測出24種HLA-B27基因亞型及13種HLAB位點其它基因亞型。
【專利說明】-種人類HLA-B27基因分型試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種人類HLA-B27基因分型試劑盒，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 人類白細胞抗原（Human Leukocyte Antigen，HLA)位于6號染色體短臂的21. 31 區(qū)，是目前已知的人類染色體中基因密度最高、多態(tài)性最豐富的區(qū)域，分為HLA- I、II和III 類基因。HLA-B27是經(jīng)典的HLA- I類分子，表達于所有有核細胞和血小板表面，具有高度多 態(tài)性，已知有105種亞型，命名為HLA-B*27:01?HLA-B*27:105。
[0003] 強直性脊椎炎（Ankylosing Spondylitis，AS)是一種多發(fā)于青壯年男性，并以中 軸關(guān)節(jié)慢性炎癥為主的原因不明的自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)以腰部疼痛、僵直不適為最 常見癥狀。我國AS的總發(fā)病率為0. 3%，約450萬例，男性多于女性，男女發(fā)病率比例約為 10 :1。研究報道，HLA-B27抗原的表達與AS呈高度相關(guān)性，這是目前唯一有臨床價值的相 關(guān)抗原，在迄今已知的HLA與疾病的關(guān)聯(lián)中是最強和最典型的。臨床研究顯示，AS患者的 HLA-B27陽性率高達96 %，普通人群中僅5 %?10 %為陽性，HLA-B27抗原攜帶者發(fā)生AS的 相對危險率達70%。AS的癥狀與許多疾病相似而難以確診，在患有炎癥性的腰背痛且未觀 察到經(jīng)典的放射學(xué)特征以及不明的寡關(guān)節(jié)炎或附著點炎時，HLA-B27的檢測將避免臨床醫(yī) 師對患者病情診斷不清的困境。由此可見，HLA-B27的檢測在脊柱相關(guān)疾病的診斷中有著 重要意義。
[0004] 已知HLA-B*27的等位基因達105種之多，從人群分布看，B*2705多見于白種人和 美洲印第安人，B*2704常見于亞洲人，B*2702多見于地中海人群，B*2706見于東南亞人群， B*2709見于意大利南部撒丁島人群。其中，B*2705基因分布最廣，幾乎見于所有人種，一般 認為B*2705為B27的遺傳祖先，其他基因都是由其進化而來。研究顯示與AS發(fā)病有關(guān)的基 因亞型主要有 B*2702、B*2703、B*2704、B*2705、B*2706、B*2707、B*2708、B*2710、B*2714、 B*2715和B*2719,其中以B*2704與AS的關(guān)聯(lián)性最強，其次是B*2705、B*2702和B*2707。
[0005] 除研究較多的AS外，HLA-B27與許多其他疾病也存在著一定的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)， 較多青少年風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者HLA-B27抗原呈陽性，且在HLA-B27陽性的患者中，B*2705占 60%左右，其余為B*2704、B*2702和B*2707。在急性葡萄膜炎患者中也發(fā)現(xiàn)了 HLA-B*27陽 性，且主要為HLA-B*2704和B*2705基因型。此外，HLA-B27與白塞氏病、銀屑病、關(guān)節(jié)炎型 腸炎、白血病及心臟疾病也存在一定的相關(guān)性。
[0006] 由此可見，HLA-B*27等位基因的檢測及進一步分型對臨床診斷、疾病鑒別及醫(yī)學(xué) 研究具有重要意義。
[0007] 目前國內(nèi)市場上常用的HLA-B27檢測方法主要有MLCT法、ELISA法、FCM法及 PCR-SSP法。其中，MLCT法、ELISA法、FCM法都是基于抗原抗體反應(yīng)的血清學(xué)方法，只能檢 測HLA-B27抗原的存在與否，無法檢測其等位基因，無法進行HLA-B27基因分型。
[0008] MLCT法即微量淋巴細胞毒試驗，又稱補體依賴性細胞毒實驗?；痉椒ㄊ侨LA 分型血清，加入被檢者淋巴細胞，在補體的參與下可以使攜帶與分型血清型相同抗原的淋 巴細胞死亡，倒置顯微鏡觀察并計數(shù)，通常死細胞大于40%判為HLA-B27陽性。MLCT法成本 低，易普及，但操作步驟多，結(jié)果判讀時存在主觀性，血清、補體以及分離淋巴細胞的質(zhì)量， 均會影響結(jié)果的準確性。
[0009] ELISA法即酶聯(lián)免疫吸附試驗，通常采用雙抗體夾心法測定樣本中HLA-B27水平。 基本方法是用純化的HLA-B27抗體包被微孔板，制成固相抗體；往包被單抗的微孔中依次 加入HLA-B27,再與HRP標記的HLA-B27抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過 徹底洗滌后加底物TMB顯色；用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（0D值），通過標準曲線 計算樣品中HLA-B27濃度。ELISA法成本低，結(jié)果數(shù)據(jù)客觀，但操作復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較 多，結(jié)果準確性差，且固相載體的包被難達到各個體之間的一致，因此每次測定均需作標準 曲線。
[0010] FCM法即流式細胞術(shù)法，是利用流式細胞儀對細胞或其他生物粒子進行定量分析 和分選的檢測手段，可用于HLA-B27的檢測?；痉椒ㄊ菍颖局瞥蓡渭毎x冶，與熒光標 記特異性HLA-B27抗體結(jié)合，運用設(shè)置好的HLA-B27自動檢測分析軟件測定。FCM法檢測 速度快，準確性較好，但其分辨率低，操作技術(shù)要求高，儀器校準和維護難度大，對樣品要求 高，所選抗體的好壞直接影響結(jié)果，且結(jié)果的重復(fù)性欠佳，故在HLA-B27基因檢測方面的應(yīng) 用尚未得到廣泛普及。
[0011] PCR-SSP法即序列特異引物引導(dǎo)的PCR反應(yīng)，是目前從基因?qū)用鏅z測HLA-B27的方 法之一，其基本方法是從血液中提取基因組DNA，設(shè)計HLA-B27序列特異性引物，通過特定 PCR反應(yīng)體系擴增各等位基因型特異性DNA片段，產(chǎn)生相對應(yīng)的特異性擴增產(chǎn)物條帶，并用 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。PCR-SSP法所需儀器簡單，項目容易開展，結(jié)果容易判讀，準 確性較好，但全血DNA提取操作步驟多，耗時長，且增加了檢測時間和影響結(jié)果的因素。
[0012] 雖然，上述4種方法在臨床HLA-B27檢測上扮演著重要角色，但卻各有其缺陷，一 種操作簡便、快速，且準確度高的檢測方法的開發(fā)將起到關(guān)鍵性臨床作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種人類HLA-B27基因分型試劑 盒。
[0014] 本發(fā)明的人類HLA-B27基因分型試劑盒，包括PCR擴增引物、DNA聚合酶和反應(yīng)緩 沖液，所述的DNA聚合酶為經(jīng)聚乙二醇（PEG)修飾的可耐受血液中PCR反應(yīng)抑制物的熱啟 動Taq聚合酶，所述的PCR擴增引物的核苷酸序列如下 ：
[0015]
[0016]

【權(quán)利要求】
1. 一種人類HLA-B27基因分型試劑盒，包括PCR擴增引物、DNA聚合酶和反應(yīng)緩沖液， 其特征在于，所述的DNA聚合酶為經(jīng)聚乙二醇（PEG)修飾的可耐受血液中PCR反應(yīng)抑制物 的熱啟動Taq聚合酶，所述的PCR擴增引物的核苷酸序列如下 ：
還包括一對內(nèi)對照引物，用以擴增600bp的產(chǎn)物，內(nèi)對照引物序列如下：
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類HLA-B27基因分型試劑盒，其特征在于，所述的反應(yīng)緩沖 液的組成及各組分含量如下：〇. 18mM脫氧核苷酸（dNTP)，1. 8mM氯化鎂（MgCl2)，60. 3mM氯 化鉀（KC1)，18. 9mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl)，甘油（glycerol)O. 6% (v/v)，作 為PCR反應(yīng)增強劑及穩(wěn)定劑的二甲基亞砜（DMS0)5% (v/v)、甲酰胺2.5% (v/v)和甜菜堿 5% (v/v) 〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類HLA-B27基因分型試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中 還包括 DNA Loading dye。
【文檔編號】C12Q1/68GK104109716SQ201410337737
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月15日
【發(fā)明者】陳炤源, 王浩 申請人:江蘇偉禾生物科技有限公司