一種菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)序列的制作方法
【專利摘要】一種菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)序列，屬于食品生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明涉及以微生物ArthrobacterchlorophenolicusSK33.001基因組為模版，設(shè)計(jì)一對特異性引物P1和P2，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增了特異性片段，測序后得到了全新的長度為1335bp的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶基因核苷酸序列SEQIDNO：1和它對應(yīng)的氨基酸序列SEQIDNO：2。獲得的1335bp的核苷酸序列SEQIDNO：1可進(jìn)一步用于基因克隆和異源表達(dá)，表達(dá)獲得的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶在較高的溫度下具有較優(yōu)的活性和穩(wěn)定性，應(yīng)用前景廣泛。
【專利說明】一種菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)序列 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及一種菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)序列，更具體地說涉及編碼菊糖果糖轉(zhuǎn) 移酶的1335 bp的核苷酸序列和它對應(yīng)的氨基酸序列，屬于食品生物【技術(shù)領(lǐng)域】。 【背景技術(shù)】
[0002] 雙果糖酐III (Difructose anhydride)是一種微量存在于自然界的非還原性雙 糖。它存在于石蒜等植物和蜂蜜、咖啡、焦糖的加工過程中。雙果糖酐III是近年發(fā)現(xiàn)的 一種新型天然功能甜味劑，它的相對甜度為蔗糖的52%，而熱量值只有蔗糖的1/15 (0. 263 kcal/g);具有促進(jìn)礦物質(zhì)元素吸收、增進(jìn)骨骼生長和抗齲齒的作用；體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雙果糖 酐III可以促進(jìn)腸道有益微生物菌群的生長繁殖、改善便秘和預(yù)防結(jié)腸癌；與乳果糖、塔格 糖、麥芽糖醇相比，不會(huì)引起諸如腹瀉、腹鳴的腹部癥狀，安全性較高。這些優(yōu)點(diǎn)使其在食品 工業(yè)中有廣闊的應(yīng)用前景。
[0003] 由于雙果糖酐III在自然界的含量極低，天然提取分離成本高，不適宜工業(yè)化大 生產(chǎn)的要求，化學(xué)催化法有形成許多副產(chǎn)物和化學(xué)污染物等不利的因素，使得價(jià)格低廉，轉(zhuǎn) 化率高的生物轉(zhuǎn)化技術(shù)成為生產(chǎn)雙果糖酐III的研究熱點(diǎn)。
[0004] 用生物轉(zhuǎn)化法制備雙果糖酐III的研究已經(jīng)有30余年的歷史，1973年Uchiyama 首次從產(chǎn)脲節(jié)桿菌中發(fā)現(xiàn)了一種新型菊糖酶（inulase Π )，它將菊糖降解為雙果糖酐 III和少量的低聚果糖。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)十余種微生物可以產(chǎn)生此酶，主要集中在節(jié)桿 菌屬，包括H65-7 (Carbohydrate Polymers, 2010，82: 742-746·)、 Arthrobacters\>. L68-1 (Agricultural and Biological Chemistry 1988, 52: 291-292.)等，另外在三種其他菌屬中也發(fā)現(xiàn)了此酶，如LC-413 (Carbohydrate Polymers 2002, 50(2): 117-121.)^Bacillus sp. snu~7(Biotechnology Letters, 2003, 25, )^ Leifsonia sp. T88-4 (Carbohydrate Polymers, 2006，66(1): 75-80·)。
[0005] 本發(fā)明以實(shí)驗(yàn)室保藏獲得的微生物 AriAroAacier SK33. 001 的基因組為模版，通過設(shè)計(jì)引物、基因擴(kuò)增、序列測定，成功獲得全新的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的 表達(dá)基因。該基因可以在大腸桿菌中高效誘導(dǎo)表達(dá)，并表達(dá)具有活性的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶；該 表達(dá)的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶最適溫度65°C，最適作用pH 5. 5 ;在較高的溫度下具有較優(yōu)的活性 和穩(wěn)定性，70°C下相對酶活達(dá)到86%，于70°C下保溫4h，其殘留酶活仍有55%以上，顯著高于 已報(bào)道的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶家族蛋白，顯示了其在雙果糖酐III工業(yè)化應(yīng)用中的巨大潛力。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種從微生物獲得的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的基因序列。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案：一種從微生物 AriAroAacier SK33. 001 的基因組中擴(kuò)增獲得的編碼菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的基因序列，其核苷酸序列為SEQ ID NO :1。
[0008] 所述編碼菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的基因序列，其氨基酸序列為SEQ ID NO :2。
[0009]本發(fā)明人以微生物 AriAroAacier cA/oro/7A<9/7〇/icw5· SK33. 001 (已保藏于中 國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M 2013387)的基因組為模版，通過設(shè)計(jì) 引物、基因擴(kuò)增、序列測定，獲得了菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的編碼基因1335 bp片段，并且確定 了它的核苷酸序列和由此推測的氨基酸序列。本發(fā)明人設(shè)計(jì)了一對用于通過PCR方法 擴(kuò)增AriAroAacier 菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶基因片段(上游引物稱為P1, 下游引物稱為P2)，并應(yīng)用這對引物擴(kuò)增出了特異性片段，測序后得到了 JriArohcter 菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶基因的編碼序列，該序列被驗(yàn)證為全新的基因序列。同 時(shí)，本發(fā)明人利用該基因序列，通過PET-22M+)載體質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，并構(gòu)建大腸桿菌 重組菌，實(shí)現(xiàn)了 菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中的過量 重組表達(dá)，表達(dá)出的活性酶最適溫度65°C，最適作用pH 5. 5 ;在較高的溫度下具有較優(yōu)的 活性和穩(wěn)定性，70°C下相對酶活達(dá)到86%，于70°C下保溫4h其殘留酶活仍有55%以上，顯著 高于已報(bào)道的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶家族蛋白。
[〇〇1〇] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明獲得的這1335 bp的核苷酸序列，可以進(jìn)一步用于菊 糖果糖轉(zhuǎn)移酶基因的克隆表達(dá)，也可以用于重組表達(dá)得到菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶后應(yīng)用于功能性 糖雙果糖酐III的生物制備，其表達(dá)的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶在較高的溫度下具有較高的活性和 穩(wěn)定性，70°C下相對酶活達(dá)到86%，于70°C下保溫4h其殘留酶活仍有55%以上，顯著高于已 報(bào)道的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶家族蛋白。 【專利附圖】

【附圖說明】
[〇〇11] 圖1溫度對菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶酶活的影響。
[0012] 圖2 pH對菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶酶活的影響。
[0013] 圖3菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的熱穩(wěn)定性。
[0014] 圖4菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶對不同底物濃度的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。 【具體實(shí)施方式】
[0015] 在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步說明了本發(fā)明，但不限制本發(fā)明的范圍。
[0016] 實(shí)施例 1 總 DNA 的提取 取AriAroAacier SK33.001 濕菌體 20g，懸于 10mL 50mM Tris-HCl 緩沖液中（pH 8.0)。
[0017] 加入少量溶菌酶和8mL 0. 25mM乙二胺四乙酸EDTA (pH 8. 0)，混勻后37°C靜置 20min〇
[0018] 再加入2mL 10%十二烷基磺酸鈉（505)，551：靜置51^11。
[〇〇19] 分別依次用等體積酚、氯仿再抽提一次。
[0020] 取最后一次的上清，加入2倍體積的乙醇，回收DNA。
[0021] 用70%乙醇、無水乙醇分別依次洗滌沉淀。
[0022] 沉淀溶于 0· 5mL TE 緩沖液（10mL Tris，ImM EDTA，pH 8. 0)，加入 3μ L 10mg/L RNase，37°C 保溫 1 h，-20°C 保存?zhèn)溆谩?br> [0023] 實(shí)施例2 driAroAac?er cA菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶編碼基因的核苷酸 序列及基因克隆 1.取AriAroAacier 總DNA溶液3 μ?，以其基因組為模版，使用 特異性引物Ρ1 (加入#也1酶切位點(diǎn)）和Ρ2 (加入通〇1酶切位點(diǎn))，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到所要的 DNA片段。
[〇〇24] 引物設(shè)計(jì)如下： 上游引物 Ρ1 :5' -TTATCATATG ACCAACAGGA CTGCGGAAAC C-3'， 下游引物 Ρ2 :5' -TTATCTCGAG CTACGGGGTT GGGCGGATGG-3' PCR反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性5min，一個(gè)循環(huán)；94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸 90S，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
[0025] PCR反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳（Goldview染色)，電泳結(jié)束 后置于凝膠成像儀觀察照相。
[0026] 2.將電泳分離的特異性目的片段進(jìn)行切膠，然后利用膠回收試劑盒回收目的片 段。回收的PCR產(chǎn)物，經(jīng)限制性內(nèi)切酶和通〇1進(jìn)行雙酶切，與經(jīng)過同樣雙酶切的質(zhì)粒 pET-22b (+)，在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pET-22b (+) -Da-dpe。
[0027] 3.將重組質(zhì)粒pET-22b (+) -Da-dpe轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)中，涂布在 含有100 μ g/L氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)過夜，得到初步陽性菌落。
[0028] 4.分別挑取初步陽性克隆于4 mL LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素沖，37°C搖床振 蕩培養(yǎng)12-16 h。提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶和通〇1進(jìn)行雙酶切，根據(jù)電泳結(jié)果判斷 具有特異性DNA片段的質(zhì)粒，該質(zhì)粒即確定為陽性重組質(zhì)粒，將該質(zhì)粒送至上海生物工程 有限公司測序，目的基因序列測定結(jié)果如SEQ ID N0 :1，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID N0: 2〇
[0029] 實(shí)施例3 lAriAroAacier 菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的異源表達(dá)和分離 純化 1. 將重組質(zhì)粒pET-22b(+)-Da-dpe轉(zhuǎn)化至凡co/i BL21感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含有 100 μ g/L氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)過夜，得到陽性克隆菌落； 2. 挑取重組大腸桿菌單克隆至含氨芐青霉素50yg/mL的LB培養(yǎng)基，37°C 200 rpm培 養(yǎng)12 h。以1:50比例將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵LB培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)至0D6QQ 0. 6?0. 8,加 IPTG 至終濃度〇. 5mlL28°C 200rpm培養(yǎng)72h，收集菌液；4°C lOOOOrpm離心4min棄去沉淀，收 集上清。
[0030] 3.利用離子交換和分子篩等層析方法，獲得AriAroAacier 菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶純酶。
[0031] 實(shí)施例4 :pH和溫度對JriAroAacier 菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶酶活的 影響 1、底物菊糖濃度為40g/L，菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶濃度為0. 06μΜ，反應(yīng)溫度65°C，反應(yīng)時(shí) 間15min，分別以檸檬酸鹽緩沖液（100mM，pH 4. (Γ6. 0 )和磷酸鹽緩沖液（100mM，pH 6. (Γ8.0)進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果表明，菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的最適pH為5. 5,在pH 4. 5~7之間可保留 最大酶活的80%，結(jié)果如圖2所示。
[0032] 2、底物菊糖濃度為40g/L，pH 5. 5檸檬酸鹽緩沖液，菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶濃度為 0. 06μΜ，反應(yīng)時(shí)間15min，分別在不同溫度進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果表明，菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的最適溫度 為65°C，在6(T70°C之間可保留較大的酶活，結(jié)果如圖1所示。
[0033] 實(shí)施例5 lAriAroAacier 菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的熱穩(wěn)定性 測定菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的熱穩(wěn)定性在如下條件中進(jìn)行：將一定體積的酶液置于pH 5. 5 的檸檬酸鹽緩沖液中，分別在60°C、70°C及80°C保溫廣4 h，再與菊糖在65°C反應(yīng)15 min， 測定各溫度下菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的殘留酶活。
[0034] 結(jié)果表明，AriAroAacier 菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶在70°C下保溫4h 的殘留酶活為55%(如圖3所示)，具有很好的熱穩(wěn)定性，顯著高于已報(bào)道的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶 家族蛋白。
[0035] 實(shí)施例6 :雙果糖酐III的生物制備 在pH 5. 5檸檬酸鹽緩沖液，菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶濃度為75nM，反應(yīng)溫度為65°C，分別在50、 100及200 g/L不同菊糖濃度下進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)行雙果糖酐III的生物制備實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該酶具 有高效的生物合成雙果糖酐III的能力，見圖4。例如，在以初始濃度50g/L菊糖大規(guī)模生 產(chǎn)雙果糖酐ΠΙ時(shí)，雙果糖酐III產(chǎn)量為40g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到80%。 <160> 2 <210> SEQ ID NO: 1 〈211〉 1335 〈212〉 DNA 〈213〉菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶 <400> 1
【權(quán)利要求】
1. 一種從微生物AriAroAacier cA/oro/7A<9/7〇/icw5· SK33. 001的基因組中擴(kuò)增獲得的 編碼菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的基因序列，其核苷酸序列為SEQ ID NO :1。
2. 權(quán)利要求1所述編碼菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的基因序列，其氨基酸序列為SEQ ID NO :2。
【文檔編號】C12N15/54GK104087604SQ201410327010
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】沐萬孟, 江波, 汪瀟, 張濤 申請人:江南大學(xué)