利用羅倫隱球酵母jyz4提取抗菌蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及到一種利用羅倫隱球酵母JYZ4提取抗菌蛋白的方法及應用，利用酵母菌可以產(chǎn)生一些蛋白質(zhì)類的嗜殺因子，對一些敏感的微生物具有殺滅作用，從羅倫隱球酵母JYZ4提取一種抗菌蛋白，對某些敏感的革蘭氏陽性細菌如芽孢桿菌以及金黃色葡萄球菌等具有殺滅作用的，但對革蘭氏陰性細菌抑菌作用不明顯。本發(fā)明具有如下優(yōu)點：抑菌效果好，在室溫條件下對芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌具有很好的抑菌效果，但在溫度高于45℃無抑菌作用。由于該抗菌物質(zhì)屬于蛋白質(zhì)類，對人體無毒副作用，所以在醫(yī)療與食品保鮮領(lǐng)域具有重要的實用意義。
【專利說明】利用羅倫隱球酵母JYZ4提取抗菌蛋白的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于抗菌藥物制備【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地說，特別涉及一種利用羅倫隱球酵 母JYZ4提取抗菌蛋白的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 在現(xiàn)有技術(shù)中，主要依賴抗生素對細菌進行抑制。但是，由于抗生素等藥物的廣泛 使用，使細菌產(chǎn)生抗藥性的現(xiàn)象非常普遍。例如，金黃色葡萄球菌由于可自身合成內(nèi)酰 胺酶，能夠?qū)ΜF(xiàn)有的青霉素與頭孢霉素產(chǎn)生抗藥性。
[0003] 此外，由于抗生素非常容易在人體內(nèi)產(chǎn)生殘留，對人體的副作用明顯。
[0004] 綜上所述，應對微生物在醫(yī)學以及食品保鮮方面的需求，開發(fā)新的藥物，找到新的 途徑具有十分重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種利用羅倫隱球酵母JYZ4提取抗菌蛋白的方 法，用以解決控制有害細菌的技術(shù)問題。
[0006] 為此，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案。
[0007] 本發(fā)明提供一種利用羅倫隱球酵母JYZ4提取抗菌蛋白的方法，包括步驟：
[0008] S1、菌種篩選，從果皮上分離出一株酵母菌，菌種鑒定為羅倫隱球酵母；
[0009] S2、菌種培養(yǎng)，以羅倫隱球酵母菌為培養(yǎng)菌種，以ΥΕΗ)為培養(yǎng)基，在30°C下中培養(yǎng) 2-5 天；
[0010] S3、制備抗囷蛋白，將發(fā)酵囷液進打尚心作用，在上清液中加入硫酸按沉淀蛋白， 4°C離心進行收集蛋白質(zhì)沉淀，將收集到的蛋白沉淀溶解于緩沖液中，可得到抗菌蛋白。 [0011] 優(yōu)選地，在所述步驟1中，所用提取抗菌蛋白的菌種是從果皮上分離到的羅倫隱 球酵母（Cryptococcus laurentii)JYZ4,現(xiàn)保藏于中科院微生物所，其保藏中心登記號為 CGMCC No. 9128,保藏時間2014年5月8日。
[0012] 優(yōu)選地，在所述步驟2中，以70-90%硫酸銨為沉淀劑制備蛋白沉淀。
[0013] 優(yōu)選地，在所述步驟3中，收集硫酸銨飽和度為的70-90%沉淀的蛋白，并溶解于 pH2. 5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中并對其進行透析純化，得到抗菌蛋白。
[0014] 優(yōu)選地，對枯草芽孢桿菌以及對金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌有較好的抑制作 用。
[0015] 在本發(fā)明中，以羅倫隱球酵母菌為菌種在培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，能夠產(chǎn)生嗜殺因子， 本項發(fā)明利用特定酵母菌（在本發(fā)明中采用羅倫色隱球酵母菌）可以產(chǎn)生一些蛋白質(zhì)類 的嗜殺因子，對一些敏感的微生物（例如對枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌等具有抑制作 用。）具有殺滅作用，而對酵母菌本身沒有危害。由于嗜殺因子為蛋白質(zhì)類的抗細菌物質(zhì)， 由于可以被蛋白酶所降解，對人體的毒副作用都較小，而且沒有殘留，不易產(chǎn)生抗藥性。相 對于現(xiàn)有技術(shù)中的抗生素而言，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0016] 1、抑菌效果好，特別是在室溫條件下對芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌具有很好的抑菌 效果，并且可以在4°C的低溫環(huán)境中保存60天仍然有抗菌作用，在食品保鮮領(lǐng)域具有重要 的實用意義；
[0017] 2、屬于蛋白質(zhì)抗菌物質(zhì)，能夠被蛋白酶分解，對人體無毒副作用；在高溫下，就可 使之失活，使用安全。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以 根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0019] 圖1為本發(fā)明一種實施例中利用羅倫隱球酵母JYZ4提取抗菌蛋白的方法的流程 圖。

【具體實施方式】
[0020] 為了使本【技術(shù)領(lǐng)域】的人員更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本 發(fā)明作進一步的詳細說明。
[0021] 羅倫隱球酵母（Cryptococcus laurentii)JYZ4,現(xiàn)保藏于中科院微生物所，其保 藏中心登記號為CGMCC No. 9128,保藏時間2014年5月8日。
[0022] 請參考圖1，圖1為本發(fā)明一種實施例中利用羅倫隱球酵母JYZ4提取抗菌蛋白的 方法的流程圖。
[0023] 本發(fā)明提供了一種利用羅倫隱球酵母JYZ4提取抗菌蛋白的方法，包括步驟： S1、菌種篩選，以分離于果皮的酵母菌JYZ4,菌種鑒定為羅倫隱球酵母（Cryptococcus laurentii)，現(xiàn)保藏于中科院微生物所，其保藏中心登記號為CGMCCNo.9128,保藏時間 2014年5月8日；
[0024] S2、菌種培養(yǎng)，以羅倫隱球酵母菌為培養(yǎng)菌種，以YEH)為培養(yǎng)基，在30°C下中培養(yǎng) 2-5 天；
[0025] S3、制備抗菌蛋白，將發(fā)酵菌液進行離心后，在上清液中加入飽和度為70-90%的 硫酸銨沉淀蛋白，4°C離心進行收集蛋白質(zhì)沉淀，將收集到的蛋白沉淀溶解于pH2. 5的磷酸 氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，可得到抗菌蛋白。
[0026] 實施例一：抗菌蛋白對不同種類細菌的抑菌作用
[0027] 將制取的抗菌蛋白，用濾紙片法對其抑菌效果進行測定，實驗證明：通過本發(fā)明制 取的抗菌蛋白對于革蘭氏陽性菌有較好的抑菌作用，對枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌等 的抑菌圈直徑達1〇_，但對革蘭氏陰性菌如大腸桿菌無抑制作用。
[0028] 實施例二：不同pH對抗菌蛋白抑菌效果的影響
[0029] 采用本發(fā)明制取的抗菌蛋白，用濾紙片法對其抑菌效果進行測定，結(jié)果pH為2. 5 的抑菌圈最大，而到pH5. 6時，幾乎無抑菌效果。
[0030] 實施例三：不同溫度對抗菌蛋白抑菌效果的影響
[0031] 將提取的抗菌蛋白在不同溫度下用濾紙片法測定其抑菌圈大小，發(fā)現(xiàn)在30°C時抑 菌圈最大，超過45 °C時無抑菌作用。
[0032] 實施例四：抗菌蛋白的穩(wěn)定性實驗
[0033] 用濾紙片法發(fā)現(xiàn)，在室溫15_25°C下，提取的抗菌蛋白的抑菌作用可以保持到50 天。在4°C下保持抑菌活性60天左右。
[0034] 通過本發(fā)明提供的抗菌蛋白，能夠達到如下效果：
[0035] -、對革蘭氏陽性菌有很好的抑菌效果
[0036] 該抗菌蛋白是從羅倫隱球酵母菌（Cryptococcus laurentii)JYZ4中提取，由于提 取的抗菌蛋白對革蘭氏陽性細菌特別是芽孢桿菌如枯草芽孢桿菌等有很好的抑制作用，特 別其對一些抗生素不敏感的細菌有較強的抑制作用，所以酵母菌中的抗菌蛋白可以與其他 的抗菌物質(zhì)如抗生素有互相補充的作用，在醫(yī)學與食品方面都將有很好的應用前景。
[0037] 二、抗菌蛋白比較穩(wěn)定
[0038] 該抗菌蛋白在常溫下的抑菌作用非常明顯，而且抗菌蛋白在4°C下條件下可以保 存60天，仍然有抑菌效果，表明該抗菌蛋白的穩(wěn)定性較好。
[0039] 對所公開的實施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用發(fā)明。對 這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一 般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將 不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致 的最寬的范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種利用羅倫隱球酵母JYZ4提取抗菌蛋白的方法，其特征在于，包括步驟： 51、 菌種篩選，從果皮上分離出一株酵母菌，經(jīng)形態(tài)與微生物自動鑒定儀鑒定為為羅倫 隱球酵母（Cryptococcus laurentii); 52、 菌種培養(yǎng)，以羅倫隱球酵母菌為培養(yǎng)菌種，以YEH)為培養(yǎng)基，在30°C下中培養(yǎng)2-5 天； 53、 制備抗菌蛋白，將發(fā)酵菌液進行離心作用，在上清液中加入硫酸銨沉淀蛋白，4°C離 心進行收集蛋白質(zhì)沉淀，將收集到的蛋白沉淀溶解于緩沖液中，可得到抗菌蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用羅倫隱球酵母JYZ4提取抗菌蛋白的方法，其特征在于， 在所述步驟1中，篩選到菌種采用從果皮上分離到的一株酵母菌，菌種鑒定為羅倫隱 球酵母，羅倫隱球酵母（Cryptococcus laurentii) JYZ4,現(xiàn)保藏于中科院微生物所，其保藏 中心登記號為CGMCCNo. 9128,保藏時間2014年5月8日。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用羅倫隱球酵母JYZ4提取抗菌蛋白的方法，其特征在于， 在所述步驟3中，收集硫酸銨飽和度為的70-90%沉淀的蛋白，并溶解于pH2. 5的磷酸 氫二鈉-檸檬酸緩沖液中并對其進行透析純化，得到抗菌蛋白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用羅倫隱球酵母JYZ4提取抗菌蛋白的方法，其特征在于， 對枯草芽孢桿菌以及金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌有較好的抑制作用。
【文檔編號】C12R1/645GK104087636SQ201410326719
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】張海予, 艾啟俊, 韓濤, 程晉霞 申請人:北京農(nóng)學院