專利名稱：適于在酵母中表達的重組甜蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用重組DNA技術(shù)表達植物甜蛋白Monellin及其制備方法，特別是用釀酒酵母表達植物甜蛋白的方法。
背景技術(shù)：
甜蛋白Monellin是存在于非洲植物Dioscoreophyllum cumminsii中的一種甜蛋白，1972年首次由美國賓州化學味覺中心分離純化。Monellin的甜度是同種重量蔗糖的3000-4000倍，1μg的量就可使人感到甜味。近年來對這種甜蛋白進行了大量研究，其一級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列已經(jīng)測定，三級結(jié)構(gòu)也已十分清楚(范長勝.甜蛋白的開發(fā)與應用研究.食品與發(fā)酵工業(yè).2001，27(12)50～54，崔洪志，李敏，郭三堆.植物甜蛋白的研究進展.生物技術(shù)通報.1997，(2)10～13，F(xiàn)aus，I.Characterization ofmonellin，a protein that tastes sweet.Appl microbial Biotechnol.2000，53145～147)。天然的Monellin由二條肽鏈靠非共價鍵，主要是氫鍵相連(其中A鏈44個氨基酸，B鏈50個氨基酸)，分子量為10700道爾頓。X-射線晶體衍射分析表明，該蛋白的分子結(jié)構(gòu)相對緊密，分子內(nèi)沒有大的環(huán)狀結(jié)構(gòu)?？臻g結(jié)構(gòu)由一個β折疊片及位于β折疊片內(nèi)的α螺旋構(gòu)成，分子借助于兩條鏈之間的氫鍵和疏水鍵使其結(jié)構(gòu)得以穩(wěn)定。
多年來用于增加食物、飼料或其它消費產(chǎn)品甜度的物質(zhì)多是低分子量的甜味物質(zhì)，稱之為傳統(tǒng)甜味劑，其中蔗糖是應用最廣泛的一種。然而，蔗糖作為甜味劑有許多不足之處，如易被細菌所利用，特別是幼兒食用過多易產(chǎn)生齲齒；蔗糖代謝后產(chǎn)生大量的熱量，食用過多會導致肥胖，不符合當今的消費觀念；食用蔗糖后還會誘發(fā)體內(nèi)胰島素的需要量增加，對于糖尿病人尤其不利。隨著生活水平的提高，人們對健康、天然食品的要求越來越高，對傳統(tǒng)甜味物質(zhì)的替代品研究也是人們一直感興趣的課題。甜蛋白Monellin是理想的新型甜味劑，與化學合成的甜味劑相比，其口味純正、純天然，無毒性。Monellin甜度高，熱量低，可提高食品的風味，又不易被細菌所利用，適于糖尿病、心血管病等患者食用，且能預防兒童齲齒，因此其在食品及醫(yī)藥等行業(yè)有很高的應用價值。在美國、歐洲和日本等國家主要用在食品加工、飲料、口香糖、蜜餞、糖果、乳制品、保健品、寵物飼料中作為添加劑或藥品輔料。但由于其自然資源少、產(chǎn)地偏僻、產(chǎn)量低，無法滿足市場需求，使甜蛋白難以實現(xiàn)大規(guī)模的商品化生產(chǎn)。
對甜蛋白的研究和商業(yè)開發(fā)是30年前才開始的。日本采用固相合成蛋白質(zhì)的方法進行生產(chǎn)，成本很高，難以實現(xiàn)工業(yè)化水平。從20世紀80年代開始，進行了基因工程表達Monellin的研究，人們開始嘗試通過甜蛋白基因的克隆及表達，獲得這種蛋白質(zhì)。利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)甜蛋白不僅可提高甜蛋白的產(chǎn)量，還可降低成本、擴大其在工業(yè)上應用的范圍。天然的Monellin由兩條鏈組成，使分子結(jié)構(gòu)易在熱和酸的環(huán)境下變性，失去自然風味。同時，雙鏈結(jié)構(gòu)造成了基因工程改造蛋白的困難，在原核生物和植物中不易表達出具有正確結(jié)構(gòu)的Monellin。1989年Kim等根據(jù)Monellin甜蛋白氨基酸序列，將編碼A、B兩條肽鏈的核苷酸連接在一起，在E.coil中成功地表達出了具有生物活性的單鏈Monellin(Kim，S.H.，Kang，C.H.，Kim，R.et al.Redesigning asweet proteinincreased stability and renaturability.Protein Engineering.1989，2(8)571～579)。單鏈Monellin甜度與天然Monellin相近，熱穩(wěn)定性和復性能力有所提高，但Monellin的表達效率很低。以后于學紅等在畢赤酵母中表達Monellin，表達量為每升發(fā)酵液為18g甜蛋白(于學紅，袁漢英，高卜渝等甜蛋白Monellin在巴斯德畢赤氏酵母中的胞內(nèi)表達，復旦學報，2002，41650-654)。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述情況，本發(fā)明解決了基因工程表達Monellin效率不理想的問題。采用釀酒酵母偏愛密碼子，用PCR方法合成Monellin基因，并在釀酒酵母中高效表達植物甜蛋白Monellin。且選用工藝簡單、成本低的提取純化方法，為工業(yè)化大生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
大多數(shù)氨基酸由一個以上的密碼子所編碼，即存在密碼子的簡并性。而密碼子的使用頻率與細胞內(nèi)的tRNA含量呈正相關(guān)，特別是對于表達量高的蛋白質(zhì)。本發(fā)明采用酵母偏愛的密碼子，完成了單鏈Monellin甜蛋白基因序列的設(shè)計及全序列人工合成，并構(gòu)建重組表達載體，導入酵母宿主中。由于設(shè)計序列均采用酵母偏愛密碼子，故該基因在酵母中，尤其在釀酒酵母中可獲得相對高的表達量，產(chǎn)量可達24g/L發(fā)酵液，適用于用發(fā)酵方法大批量生產(chǎn)Monellin甜蛋白。
為了合成能夠在釀酒酵母中高效表達甜蛋白的Monellin基因，本發(fā)明合成了F1、F2、R1、R2四條單鏈DNA片段以及PCR引物P1、P2寡核苷酸片段，按圖1所示用PCR方法合成Monellin基因。先經(jīng)過兩組PCR反應，分別合成兩個DNA片段。然后以這兩個DNA片段為模板，以P1、P2為引物，再次經(jīng)PCR反應合成出全長為294bp的Monellin甜蛋白基因。
可供選擇使用的在釀酒酵母中表達的質(zhì)粒載體有很多。這些載體都帶有完整的閱讀框架，即含有一個啟動子和一個終止子，或另外帶有其它的表達調(diào)控元件。在啟動子和終止子之間有一段多克隆位點，這些多克隆位點分別包含有若干單一酶切位點，選用限制酶將載體切成線狀，并用DNA連接酶將Monellin蛋白基因連接到所選載體上，從而構(gòu)建成一個在啟動子和終止子之間含有目的基因的重組載體。
本發(fā)明所述的與重組甜蛋白基因連接的酵母表達載體一般具有以下特征一是要具有在酵母中表達能力較強的啟動子，且具有良好的調(diào)節(jié)控制系統(tǒng)；二是要具有一個有較強復制能力的復制子。它可以使該質(zhì)粒進入宿主后，能隨著宿主菌的分裂而復制，從而不會丟失，并在宿主菌中保持高的拷貝數(shù)；三是具有選擇標記，可通過施加選擇壓力，使雜菌和未轉(zhuǎn)入外源基因的空宿主菌的生長受抑制，保證發(fā)酵過程中菌體的選擇性擴增，以提高蛋白的得率。
本發(fā)明使用酵母表達載體pYES(購自invitrogen公司)，插入本發(fā)明人工合成的Monellin甜蛋白DNA編碼序列以后得到重組表達載體，它除了攜帶有所說的甜蛋白DNA編碼序列外，還帶有T7啟動子、GAL1啟動子、CYC1終止轉(zhuǎn)錄信號、URA3基因、f1復制基因、pUC復制基因、酵母2μm復制序列、氨芐青霉素抗性基因，以及為外源蛋白高效表達所需的各種調(diào)控元件。
本發(fā)明設(shè)計了含有酵母偏愛密碼子的294bp植物甜蛋白基因，其DNA序列如下ATGGGCGAAT GGGAAATCAT CGACATCGGT CCGTTCACCC AGAACCTGGG TAAGTTCGCTGTTGACGAAG AAAACAAAAT CGGCCAGTAC GGTCGTCTGA CCTTCAACAA GGTTATCCGTCCGTGCATGA AAAAGACCAT CTACGAAGAA AACGGTTTCC GTGAAATCAA GGGTTACGAATACCAGCTGT ACGTTTACGC TTCCGACAAG CTGTTCCGTG CTGATATCTC CGAAGATTACAAGACTAGAG GTAGAAAGTT GCTGAGATTC AACGGTCCAG TTCCACCACC ATAA需要說明的是所述的甜蛋白DNA序列由酵母偏愛密碼子組成，其中所述酵母是釀酒酵母、假絲酵母、克魯維酵母、雅魯瓦酵母等；其中所述酵母優(yōu)選的是釀酒酵母；還包括DNA序列的酵母重組表達載體；重組載體除包括編碼甜蛋白的DNA序列外還包括在酵母中表達甜蛋白所需的調(diào)控元件；還包括重組表達載體轉(zhuǎn)化的重組體細胞，即釀酒酵母、假絲酵母、克魯維酵母、雅魯瓦酵母重組體細胞；其重組體細胞優(yōu)選的是重組體釀酒酵母細胞。
適于在酵母中表達的重組甜蛋白的制備方法，包括以下步驟·基于甜蛋白的氨基酸序列，合成由酵母偏愛密碼子組成的甜蛋白的DNA序列；·將上述的DNA序列與適當?shù)妮d體相連，得到攜帶甜蛋白DNA序列的重組表達載體；·將重組表達載體轉(zhuǎn)化到適當?shù)慕湍杆拗髦校玫街亟M體細胞；·在適于表達所需甜蛋白的條件下，將重組體細胞進行發(fā)酵。每升發(fā)酵液可生產(chǎn)甜蛋白達24g。
·分離并純化甜蛋白。具體步驟為先將發(fā)酵液進行50～70℃pH4～5處理，分離其它蛋白質(zhì)，再過柱純化。
其中所述的甜蛋白DNA序列由酵母偏愛密碼子組成；所述的重組載體適于在釀酒酵母、假絲酵母、克魯維酵母、雅魯瓦酵母中表達；尤其適于在釀酒酵母中表達；所述的重組體細胞是重組體釀酒酵母細胞。
可使用任何已知的轉(zhuǎn)化方法，如氯化鈣法、電轉(zhuǎn)化法等將本發(fā)明的重組表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞中，以實現(xiàn)甜蛋白的表達?？晒┻x擇的宿主細胞包括釀酒酵母、假絲酵母、克魯維酵母、雅魯瓦酵母等在細胞內(nèi)不含有能降解Monellin甜蛋白的外源蛋白酶的酵母宿主細胞。本發(fā)明所提供的重組表達載體pYESM特別適合在釀酒酵母中表達，所以本發(fā)明優(yōu)先使用釀酒酵母作為宿主細胞。本發(fā)明人用電轉(zhuǎn)化法將重組載體轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，獲得了重組體菌株。
應用本發(fā)明所獲得的重組體菌株可以進行Monellin甜蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)。在有選擇壓力的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組體細胞，然后收集裂解菌體，最后進行純化得到Monellin甜蛋白晶體。本發(fā)明采用玻璃珠法破碎細胞，經(jīng)高溫處理后，再調(diào)節(jié)pH值至酸性，中和后過CM-Sephadex柱層析純化，真空冷凍干燥后即得到所需的甜蛋白。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明使用重組PCR技術(shù)，選用酵母偏愛密碼子，特別是釀酒酵母偏愛密碼子，人工合成了Monellin甜蛋白基因，并構(gòu)建了重組表達載體，轉(zhuǎn)化入酵母宿主中，使Monellin甜蛋白得以高效表達，且選用工藝簡單、成本低的提取純化方法，產(chǎn)量可達24g/L發(fā)酵液。為工業(yè)化大生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。選用釀酒酵母作為宿主，安全性好，更利于甜蛋白這種食用添加劑的大量生產(chǎn)，為甜蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)提供一條可行途徑。
下面結(jié)合附圖與具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細描述。


圖1甜蛋白基因的PCR擴增示意圖；圖2甜蛋白基因的PCR擴增結(jié)果；圖3重組質(zhì)粒的酶切鑒定；圖4重組質(zhì)粒中Monellin基因的PCR檢測；圖5甜蛋白Monellin的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測；圖6編碼甜蛋白的DNA序列。
具體實施例方式
實施例1Monellin甜蛋白基因的合成人工合成編號為R1、R2、F1、F2的單鏈DNA片段及PCR引物P1、P2寡核苷酸片段(由上海生工合成)，然后按圖1所示合成甜蛋白基因。R1、R2、F1、F2人工合成的各片段序列如下R15’-TCGTAGATGGTCTTTTTCATGCACGGACGGATAACCTTGTTGAAGGTCAGACGACCGTACTGGCCGATTTTGTTTTCTTCGTCAACAGCGAACTTACC-3′R25’-TTATGGTGGTGGAACTGGACCGTTGAATCTCAGCAACTTTCTACCTCTAGTCTTGTAATCTTCGGAGATATCAGCGCA-3’F15′-ATGGGCGAATGGGAAATCATCGACATCGGTCCGTTCACCCAGAACCTGGGTAAGTTCGCTGTTGACG-3′F25’-ATGAAAAAGACCATCTACGAAGAAAACGGTTTCCGTGAAATCAAGGGTTACGAATACCAGCTGTACGTTTACGCTTCCGACAAGCTGTTCCGTGCTGACATCTCCGAAG-3′P15′-CGGGATCCATGGGCGAATGGGAAATCATCG-3′P25’-CGGAATTCTTATGGTGGTGGAACTG-3’按下述程序，用重組PCR技術(shù)擴增甜蛋白基因。采用20μL擴增體系先進行兩次擴增(1)雙蒸水7μL，10倍緩沖液2μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，引物F1(20mmol/L)4μL，引物R1(20mmol/L)4μL，Taq DNA聚合酶1μL。擴增條件為95℃3分鐘，1個循環(huán)；94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，20個循環(huán)；最后一個循環(huán)為72℃5分鐘，得到產(chǎn)物W1。(2)雙蒸水7μL，10倍緩沖液2μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，引物F2(20mmol/L)4μL升，引物R2(20mmol/L)4μL，Taq DNA聚合酶1μL。擴增條件同上，得到產(chǎn)物W2。再進行PCR擴增雙蒸水28μL，10倍緩沖液5μL，dNTP(2.5mmol/)2μL，5μL產(chǎn)物W1，5μL產(chǎn)物W2，Taq DNA聚合酶1μL。擴增條件為95℃3分鐘，1個循環(huán)；94℃30秒，48℃30秒，72℃30秒，20個循環(huán)；最后一個循環(huán)為72℃3分鐘。最后加入2μL上游引物P1，2μL下游引物P2，1μL Taq DNA聚合酶，進行PCR擴增，條件為95℃3分鐘，1個循環(huán)；94℃30秒，65℃30秒，72℃30秒，25個循環(huán)；最后一個循環(huán)為72℃5分鐘，之后取2μL PCR反應液，用1％瓊脂糖凝膠進行電泳分析，檢測294bp的PCR產(chǎn)物。
甜蛋白基因的PCR擴增結(jié)果見圖2，圖2中1為DNA分子量標準；2為PCR擴增的Monellin基因。
實施例2表達載體的制備在含氨芐青霉素(50μg/mL)的LB培養(yǎng)基中接種攜帶質(zhì)粒pYES的大腸桿菌DH5α菌株(本實驗室保存)，于37℃振蕩培養(yǎng)過夜。將1.5mL菌液轉(zhuǎn)入微量離心管中，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30秒收集菌體，棄上清，空干殘液。將沉淀重懸于100μL預冷的溶液I(50mmol蔗糖，25mmol Tris，10mmol EDTA，pH8.0)，混合均勻。加入200uL新配的溶液II(0.2mol NaOH，1％SDS)，蓋緊管口，輕輕搖勻，放置冰上1-2分鐘至液體清亮。加入150μL預冷的溶液III(3mol乙酸鉀，pH4.8)，輕輕轉(zhuǎn)動離心管，使溶液III在粘稠的細菌裂解液中混合均勻，冰浴3-5分鐘。12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一管中，加等體積用Tris飽和的酚-氯仿-異戊醇混合液(三者的體積比為25∶24∶1)，混合均勻，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，再將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。加入2-2.5倍體積的無水乙醇，混勻，冰浴(或-20℃)放置30分鐘。12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，收集質(zhì)粒DNA沉淀。用70％乙醇洗滌沉淀2-3次，棄去殘液，空氣中干燥10-20分鐘，用20μL滅菌的雙蒸水溶解沉淀。
在微量離心管中加入5μL按上述方法制備的質(zhì)粒DNA，2μL 10倍濃度酶切緩沖液，0.5μL EcoRI，0.5μL BamHI，加入雙蒸水至總體積為20μL，于37℃保溫3-4小時，然后于65℃保溫20分鐘，使限制酶失活。取2μL樣品用瓊脂糖凝膠電泳檢測，超螺旋的pYES載體被切成線性的DNA分子。
上述酶切片段采用DNA純化試劑盒(promega公司)進行純化。具體方法是用前充分混合Wizard DNA純化樹脂，如有結(jié)晶或沉淀出現(xiàn)，可將樹脂放入37℃保溫10分鐘，用前冷卻到25-30℃。每個樣品使用一個Wizard柱。取出3mL注射器的活塞，將注射器管體部分連接到Wizard柱的外接口上。取1mL Wizard DNA純化樹脂加到1.5mL離心管中。再加入樣品(50μL)，輕柔地顛倒幾次混勻。將結(jié)合有DNA的純化樹脂加入到注射器管中，插入活塞，緩慢地推動活塞，將樹脂與DNA的混合物壓入Wizard柱。將注射器從Wizard柱上取下，取出活塞，重新將注射器管體部分連接到Wizard柱的外接口上，向注射器管內(nèi)加入2mL異丙醇，插入活塞，輕柔推動活塞使溶液流經(jīng)Wizard柱。取下注射器，將Wizard柱放入1.5mL離心管中，10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心2分鐘，干燥樹脂。將Wizard柱移入新的1.5mL離心管中，向柱中加入50μL預先加熱到65-70℃的去離子水或TE緩沖液，靜置1分鐘。17000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20秒洗脫DNA片段。丟棄Wizard柱，純化好的DNA保存在4℃或-20℃條件下。所獲得的線性純化pYES即可用作連接monellin甜蛋白基因的載體。
實施例3Monellin甜蛋白表達載體的構(gòu)建先將人工合成的Monellin基因的PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒(TaKaRa公司)進行割膠純化。具體操作如下用TAE緩沖液或TBE緩沖液制作1％的瓊脂糖凝膠，然后對目的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳。在紫外燈下切下含有目的DNA條帶的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體，切碎膠塊。稱量膠塊重量，計算膠塊體積(按照1mg相當于1μL計算)。向膠塊中加入膠塊融化液DR-I緩沖液，DR-I緩沖液的加入量為膠塊體積的3倍。均勻混合后75℃加熱融化膠塊，同時間斷振蕩，使膠塊充分融化(約6分鐘)。向膠塊融化液中加入DR-I緩沖液量的1/2體積的DR-II緩沖液，均勻混合。分離小于400bp的DNA片段時，在此溶液中加入終濃度為20％的異丙醇。將試劑盒中的Spin Column安置與CollectionTube上。將溶液轉(zhuǎn)移至SpinColumn中，3600轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，棄濾液。將500μL的RNase A加入Spin Column中，3600轉(zhuǎn)/分鐘，離心30秒，棄濾液。將700μL的RNase B加入Spin Column中，3600轉(zhuǎn)/分鐘，離心30秒，棄濾液。重復上一步驟，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘。將Spin Column安置于新的1.5mL離心管上，在SpinColumn膜的中央加入25μL水或洗脫液，室溫靜置1分鐘。12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘洗脫DNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測純化效果。
取26μL純化的PCR產(chǎn)物，加入5μL 10倍濃度的酶切緩沖液，2μL EcoRI，2μLBamHI，加入雙蒸水至50μL總體積，于37℃保溫3小時，然后于65℃保溫20分鐘，使限制性內(nèi)切酶失活。用實施例2所述的方法對酶切片段進行純化。在1.5mL管中加入3μL純化的DNA，1μL線形pYES載體，1μL連接緩沖液，1μL T4 DNA連接酶，加水至總體積為10μL，16℃連接過夜。所得到的連接混合物用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。
按下述方法制備大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細胞。接E.coli DH5α斜面菌種接種于5mL LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)物以1％接種量接種于另一裝有100mL LB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)2-3小時，使細胞達到對數(shù)生長期(OD600＝0.6)。將三角瓶轉(zhuǎn)移到冰上放置20分鐘，3000轉(zhuǎn)/分鐘，4℃離心15分鐘收集細胞。用10％甘油洗細胞3次，每次100mL，3000轉(zhuǎn)/分鐘，4℃離心15分鐘，收集細胞。最后將細胞懸浮在300μL甘油中，按每份40μL分裝到預冷的離心管并迅速在液氮中冷凍，然后置-80℃保存。
使用時將感受態(tài)細胞置冰上融化，同時將電轉(zhuǎn)化杯也放在冰上冷卻。在一管中加入5μL上述連接混合物，一管加入3μL不含甜蛋白基因的載體質(zhì)粒，混勻后加入電轉(zhuǎn)化杯中，輕擊液體以確保細菌與DNA懸液位于電轉(zhuǎn)杯底部。打開電轉(zhuǎn)化儀，調(diào)整到Ec1檔，即專為大腸桿菌轉(zhuǎn)化設(shè)置的一檔。擦干電轉(zhuǎn)化杯外面的冷凝水和霧氣，放進電轉(zhuǎn)化儀中，按上述設(shè)定的檔，啟動對細胞的電轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，盡可能快地取出電轉(zhuǎn)杯，室溫下加入1mL SOC培養(yǎng)液?；靹蚝筠D(zhuǎn)入1.5mL離心管中，于37℃培養(yǎng)1小時。按每個平板100μL涂布到含氨芐青霉素(100μg/mL)的LA平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜(16-20小時)。從平板上挑取單一菌落，接種子液體LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)12-18小時，然后小量提取質(zhì)粒DNA，用限制酶EcoRI和BamHI進行雙酶切鑒定。選擇能切下294bp片段的克隆，含有甜蛋白基因的重組質(zhì)粒命名為pYESM。
也可以用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌。大腸桿菌DH5α的培養(yǎng)同電轉(zhuǎn)化法。培養(yǎng)好的菌液置0℃冰上冷卻10分鐘，取50mL培養(yǎng)液裝入預冷的離心管中，4℃離心(4000轉(zhuǎn)/分鐘)10分鐘。倒出培養(yǎng)液，空干離心管。用30mL冰浴的MgCl2-CaCl2溶液(80mmol/LMgCl2，20mmol/L CaCl2)重懸細胞沉淀。4℃離心(4000轉(zhuǎn)/分鐘)10分鐘，倒出上清液，空干離心管。用1mL冰浴的0.1mol/L CaCl2溶液懸浮。按每管40μL分裝到1.5mL離心管中，-80℃保存。使用時將感受態(tài)細胞置冰上融化，加入5μL連接混合物，輕輕混勻，冰浴20分鐘。于42℃熱激90秒，迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中，放置2-3分鐘。加入SOC培養(yǎng)基1mL，37℃緩慢搖動45分鐘。按每個平板100L涂布到含氨芐青霉素(100g/mL)的LA平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜(16-20小時)。從平板上挑取單一菌落，接種于液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-18小時，然后小量提取質(zhì)粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI進行雙酶切鑒定。選擇能切下294bp片段的克隆，含有甜蛋白基因的重組質(zhì)粒命名為pYESM。
重組質(zhì)粒的酶切鑒定見圖3，在圖3中1為DNA分子量標準；2為重組質(zhì)粒的EcoRI+BamHI酶切，產(chǎn)生2個片段，5900bp片段為質(zhì)粒載體，294bp片段為Monellin基因。
委托TaKaRa公司對目的基因進行序列測定，所得結(jié)果與設(shè)計的Monellin基因序列完全相同。該基因的核苷酸序列和編碼的氨基酸序列如下M G E W E I I D I G P F T Q N1 ATG GGC GAA TGG GAA ATC ATC GAC ATC GGT CCG TTC ACC CAG AACL G K F A V D E E N K I G Q Y46 CLG GGT AAG TFC GAT GVT GDC GEA GEA ANC AAA AIC GGC CAG TYCG R L T F N K V I R P C M K K91 GGT CGT CTG ACC TTC AAC AAG GTT ATC CGT CCG TGC ATG AAA AAGT I Y E E N G F R E I K G Y E136 ACC ATC TAC GAA GAA AAC GGT TTC CGT GAA ATC AAG GGT TAC GAAY Q L Y V Y A S D K L F R A D181 TAC CAG CTG TAC GTT TAC GCT TCC GAC AAG CTG TTC CGT GCT GACI S E D Y K T R G R K L L R F226 ATC TCC GAA GAC TAC AAG ACC CGT GGT CGT AAG CTG CTG CGT TTCN G P V P P P *271 AAC GGT CCG GTT CCG CCG CCG TAA實施例4表達載體pYESM轉(zhuǎn)化釀酒酵母在含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB培養(yǎng)基中接種攜帶質(zhì)粒pYESM的大腸桿菌DH5α菌株，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。按實施例2的方法提取質(zhì)粒。
釀酒酵母感受態(tài)細胞的制備方法如下。從活化好的斜面上挑取菌株，YPD平板上劃線分離(YPD培養(yǎng)基配方酵母提取物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，固體培養(yǎng)基加1.2％瓊脂粉)，平板在28-30℃培養(yǎng)2天。接種單菌落到裝有50mL YPAD培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28-30℃，250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)過夜。然后轉(zhuǎn)接到裝有200mL YPD液體培養(yǎng)基的1000mL三角瓶中，使OD600＝0.3，28-30℃，200-250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)4小時；再測定培養(yǎng)液的OD600值，應在0.6-1之間，如果小于0.6，繼續(xù)培養(yǎng)1小時，如果大于1，用滅菌的YPD培養(yǎng)基稀釋到OD600＝0.6，繼續(xù)培養(yǎng)1小時，使其處于對數(shù)生長期。3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘收集細胞。細胞懸浮在40mL無菌的KD緩沖液中(50mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH＝7.5)，25mmol/L DTT，在使用前新配，過濾除菌)。細胞懸浮液于30℃溫育15分鐘。4℃，3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心收集菌體，細胞重新懸浮在50mL冰冷的STM緩沖液(270mmol/L蔗糖，10mmol/L Tris(pH7.6)，1mmol/L MgCl2，過濾除菌，4℃保存)中。3000轉(zhuǎn)/分鐘，4℃離心，棄上清。用緩沖液重復洗兩次，最后細胞懸浮在1mL冰冷的STM緩沖液中。按每管100μL分裝，-80℃保存。
用重組質(zhì)粒pYESM轉(zhuǎn)化釀酒酵母。利用Bio-Rad Genepulser II電轉(zhuǎn)化儀和2mm電轉(zhuǎn)化杯，在電壓1500V，電容25μF，電阻200Ω條件下轉(zhuǎn)化釀酒酵母。轉(zhuǎn)化之前將電轉(zhuǎn)化杯置于冰上冷卻。將100μL感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入1-3μg pYESM，輕輕混勻，冰浴2分鐘。將細胞、DNA混合物轉(zhuǎn)入冰凍電轉(zhuǎn)化杯中，電轉(zhuǎn)化儀經(jīng)預熱后，設(shè)定參數(shù)，按照說明書進行電轉(zhuǎn)化。用不加pYESM的感受態(tài)細胞和只加pYESM不加感受態(tài)細胞的離心管作對照。電轉(zhuǎn)化后立即加入1mL室溫的YPD培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，28-30℃靜止培養(yǎng)1小時。室溫，3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘，收集菌體。棄上清液，細胞懸浮在100μL YPD培養(yǎng)基中。取50μL涂SC-U平板(0.67％酵母提取物，2％葡萄糖，含微量元素，不加尿嘧啶)，28-30℃培養(yǎng)3-4天，待菌落長出。
提取轉(zhuǎn)化子總DNA接種轉(zhuǎn)化子單菌落到裝有10mL YPD培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30℃培養(yǎng)至OD600＝5-10。室溫，3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，收集菌體。用10mL無菌水洗滌菌體，室溫，3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，收集菌體。細胞懸浮在2mL的SCED緩沖液(1mmol/L山梨醇，10mmol/L檸檬酸鈉(pH7.5)，10mmol/L EDTA，10mmol/L DTT，pH7.5)。加入0.1-0.3mg的Zymolyase，37℃溫育50分鐘，使原生質(zhì)體形成率小于80％。加入2mL 1％SDS，輕輕混勻，冰浴5分鐘。加入1.5mL 5mol/L醋酸鉀(pH8.9)，混勻。4℃，5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，收集上清液。將上清液轉(zhuǎn)入另一支離心管，加入等體積無水乙醇，室溫放置15分鐘。4℃，5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，收集沉淀。沉淀懸浮在0.7mL的TE緩沖液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH7.4)。加入等體積苯酚-氯仿溶液(1∶1，v/v)，4℃，10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘。上清液轉(zhuǎn)移到另一個離心管中，再加入等體積的氯仿-異戊醇溶液(24∶1，v/v)，4℃，10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘。上清液轉(zhuǎn)移到另一個離心管中，加入1/2體積7.5mol/L的醋酸銨(pH7.5)，兩倍體積無水乙醇，干冰中放置10分鐘或-20℃放置60分鐘，4℃，10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，用1mL 70％乙醇洗滌沉淀兩次。真空干燥沉淀。每支離心管中加入50μL TE緩沖液(pH7.5)溶解沉淀。以總DNA為模板，用實施例1設(shè)計的外端引物進行PCR擴增。PCR條件為94℃ 4分鐘；94℃ 30秒，65℃ 30秒，72℃ 30秒，25個循環(huán)；72℃ 5分鐘。瓊脂糖凝膠電泳檢測證明，Monellin基因已插入釀酒酵母的染色體上。
重組質(zhì)粒中Monellin基因的PCR檢測見圖4，在圖4中1為DNA分子量標準；2為294bp的Monellin基因。
實施例5釀酒酵母重組菌株中Monellin甜蛋白基因表達的鑒定先少量提取菌體蛋白，檢測是否有外源蛋白的表達。挑取上面獲得的攜帶重組表達載體pYESM的單菌落，接種于15mL含有2％葡萄糖的SC培養(yǎng)基中，同時分別接種同樣量的攜帶質(zhì)粒pYES的釀酒酵母和未攜帶任何質(zhì)粒的釀酒酵母作為對照。28-30℃培養(yǎng)過夜。然后按1％的接種量接入誘導培養(yǎng)基中(其他配方同SC，但含半乳糖)，于30℃振蕩培養(yǎng)3個小時。
將上述方法培養(yǎng)的分別攜帶質(zhì)粒pYESM的釀酒酵母和未攜帶任何質(zhì)粒的釀酒酵母的細胞懸浮液分別轉(zhuǎn)入離心管中，4℃，5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，除去上清液，收集細胞。將細胞用破壁緩沖液(50mmol/L磷酸緩沖液，1mmol DTT，10％甘油，pH7.4)懸浮于離心管中，加入15g 0.25-0.5mm玻璃珠，振蕩20次(振蕩1分鐘，冰上冷卻1分鐘)，4℃，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，上清液含有表達的甜蛋白蛋白。取10μL上清液，用15％的聚丙烯酰氨凝膠電泳進行分析。結(jié)果表明，在誘導表達的條件下攜帶有pYES的釀酒酵母樣品中檢測到一條約11kD的蛋白帶，這表明在誘導表達的條件下外源Monellin甜蛋白基因得到了表達。
甜蛋白Monellin的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測見圖5，在圖5中1為未攜帶任何質(zhì)粒的釀酒酵母；2為攜帶pYES重組質(zhì)粒的釀酒酵母；3為蛋白質(zhì)分子量標準。
實施例6Monellin甜蛋白的提取和純化將攜帶質(zhì)粒pYESM的釀酒酵母接種于15mL含有2％葡萄糖的SC培養(yǎng)基中，28-30℃培養(yǎng)過夜。然后按1％的接種量接入誘導培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)3小時。培養(yǎng)液在4℃下10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，除去上清液，收集細胞。用20mL磷酸破壁緩沖液(50mmol/L磷酸緩沖液，1mmol/L DTT，10％甘油，pH7.4)重新懸浮于Beater的容器中，加入15g 0.25-0.5mm玻璃珠，振蕩20次(振蕩1分鐘，冰上冷卻1分鐘)，在4℃，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，上清液含有表達的甜蛋白。將獲得的蛋白制備液在60℃熱處理10分鐘，用0.2mol乙酸鈉溶液(pH3.0)調(diào)pH到4.5，4℃放置1小時。12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，收集上清液。用0.2mol/L的磷酸鈉溶液(pH7.0)將其中和至pH6.0。用10mmol pH7.0的磷酸緩沖液在4℃透析過夜，然后用經(jīng)磷酸緩沖液平衡的CM-Sephadex柱進一步層析純化，用50mmol/L pH7.4的磷酸緩沖液(含0.1mol/L NaCl)進行洗脫，用蛋白紫外監(jiān)測儀檢測并收集含甜蛋白的洗脫物。然后透析脫鹽，用15％的聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測表達產(chǎn)物。制備物經(jīng)真空冷凍干燥后得到甜蛋白Monellin結(jié)晶體。每升發(fā)酵液可得甜蛋白結(jié)晶體24g。用雙蒸水稀釋蛋白產(chǎn)物，用品嘗法檢測其甜度。結(jié)果表明，按上述方法所制備的甜蛋白Monellin的甜度約為同等重量蔗糖的3000倍以上。
序列列表SEQUENCE LISTING<110>天津科技大學<120>適于在酵母中表達的重組甜蛋白及其制備方法<130>041012<160>1
<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>294<212>DNA<213>釀酒酵母<220>
<221>CDS<222>(1)..(294)<400>1atgggcgaat gggaaatcat cgacatcggt ccgttcaccc agaacctggg taagttcgct 60gttgacgaag aaaacaaaat cggccagtac ggtcgtctga ccttcaacaa ggttatccgt120ccgtgcatga aaaagaccat ctacgaagaa aacggtttcc gtgaaatcaa gggttacgaa180taccagctgt acgtttacgc ttccgacaag ctgttccgtg ctgatatctc cgaagattac240aagactagag gtagaaagtt gctgagattc aacggtccag ttccaccacc ataa 29權(quán)利要求
1.適于在酵母中表達的重組甜蛋白，其特征在于，編碼該甜蛋白的DNA序列如下ATGGGCGAAT GGGAAATCAT CGACATCGGT CCGTTCACCC AGAACCTGGG TAAGTTCGCTGTTGACGAAG AAAACAAAAT CGGCCAGTAC GGTCGTCTGA CCTTCAACAA GGTTATCCGTCCGTGCATGA AAAAGACCAT CTACGAAGAA AACGGTTTCC GTGAAATCAA GGGTTACGAATACCAGCTGT ACGTTTACGC TTCCGACAAG CTGTTCCGTG CTGATATCTC CGAAGATTACAAGACTAGAG GTAGAAAGTT GCTGAGATTC AACGGTCCAG TTCCACCACC ATAA
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適于在酵母中表達的重組甜蛋白，其特征在于，所述的甜蛋白DNA序列由酵母偏愛密碼子組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的適于在酵母中表達的重組甜蛋白，其特征在于，其中所述酵母是釀酒酵母、假絲酵母、克魯維酵母、雅魯瓦酵母。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的適于在酵母中表達的重組甜蛋白，其特征在于，其中所述酵母是釀酒酵母。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的適于在酵母中表達的重組甜蛋白，其特征在于，還包括DNA序列的酵母重組表達載體；重組表達載體除包括編碼甜蛋白的DNA序列外，還包括在酵母中表達甜蛋白所需的調(diào)控元件。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的適于在酵母中表達的重組甜蛋白，其特征在于，還包括重組表達載體轉(zhuǎn)化的重組體細胞，即釀酒酵母、假絲酵母、克魯維酵母、雅魯瓦酵母重組體細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的適于在酵母中表達的重組甜蛋白，其特征在于，其重組體細胞為重組體釀酒酵母細胞。
8.權(quán)利要求1所述的適于在酵母中表達的重組甜蛋白的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟·基于甜蛋白的氨基酸序列，合成由酵母偏愛密碼子組成的甜蛋白的DNA序列；·將上述的DNA序列與載體相連，得到攜帶甜蛋白DNA序列的重組表達載體；·將重組表達載體轉(zhuǎn)化到酵母宿主中，得到重組體細胞；·將重組體細胞進行發(fā)酵制備甜蛋白；·分離并純化甜蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的適于在酵母中表達的重組甜蛋白的制備方法，其特征在于，所述的甜蛋白DNA序列由酵母偏愛密碼子組成；所述的重組載體適于在釀酒酵母、假絲酵母、克魯維酵母、雅魯瓦酵母中表達。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的適于在酵母中表達的重組甜蛋白的制備方法，其特征在于，所述的載體特別適于在釀酒酵母中表達；所述的重組體細胞是重組體釀酒酵母細胞。
全文摘要
適于在酵母中表達的重組甜蛋白及其制備方法，屬于用重組DNA技術(shù)表達植物甜蛋白，特別是用釀酒酵母表達重組甜蛋白的方法。本發(fā)明解決了基因工程表達重組甜蛋白Monellin效率不理想的問題。其技術(shù)方案是采用酵母偏愛密碼子，用PCR方法合成甜蛋白基因，并在釀酒酵母中高效表達植物甜蛋白。包含該序列的重組表達載體以及攜帶該載體的重組體細胞。其中酵母可以是釀酒酵母、假絲酵母、克魯維酵母、雅魯瓦酵母等。選用釀酒酵母作為宿主，安全性好，更利于甜蛋白這種食用添加劑的大量生產(chǎn)，產(chǎn)量可達24g/L發(fā)酵液，為工業(yè)化大生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/29GK1603416SQ20041007232
公開日2005年4月6日 申請日期2004年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月14日
發(fā)明者路福平, 陳忠軍, 杜連祥, 戚薇, 王敏, 黎明, 蔡恒 申請人:天津科技大學