microRNAs基因及其在提高綠藻脂肪酸含量的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種microRNAs基因及其在提高綠藻脂肪酸含量的應(yīng)用。本發(fā)明以microRNAs及其靶基因作為工具，調(diào)控綠藻代謝關(guān)鍵酶(PEPC酶)的活性，控制藻細(xì)胞內(nèi)碳源的積累，從而使綠藻細(xì)胞積累更多的脂肪酸。
【專(zhuān)利說(shuō)明】microRNAs基因及其在提高綠藻脂肪酸含量的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種microRNAs基因及其在提高綠藻脂肪酸含量 的應(yīng)用，通過(guò)利用調(diào)控microRNAs對(duì)其靶基因的調(diào)控的原理，通過(guò)光照、溫度等誘導(dǎo)綠藻細(xì) 胞microRNAs的表達(dá)水平，最終提高綠藻細(xì)胞脂肪酸含量的技術(shù)。

【背景技術(shù)】：
[0002] 目前世界能源主要依賴(lài)于石油、煤炭和天然氣等不可再生資源，它們的日益枯竭 已成為影響全球經(jīng)濟(jì)發(fā)展的主要因素。同時(shí)，這些石化能源的使用這些能源遲早會(huì)枯竭，開(kāi) 發(fā)新能源已經(jīng)成為經(jīng)濟(jì)發(fā)展的必然趨勢(shì)，生物柴油（脂肪酸甲酯）以其易于生物降解、可再 生以及類(lèi)似于石化柴油的動(dòng)力和燃燒特性得到了肯定。微藻作為一種新型的生物柴油生產(chǎn) 原料，因其具有生物量大、生長(zhǎng)快、油脂含量高等特點(diǎn)而成為目前生物能源研究的熱點(diǎn)，具 有很好的開(kāi)發(fā)潛力?；趍icroRNAs調(diào)控技術(shù)，通過(guò)對(duì)脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶基因或轉(zhuǎn)錄因 子進(jìn)行調(diào)控來(lái)增加微藻細(xì)胞內(nèi)油脂的積累，是目前最具潛力的代謝調(diào)控途徑。
[0003] 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC)存在于所有能夠進(jìn)行光合作用的有機(jī)體和大 多數(shù)非光合作用的細(xì)菌和原生動(dòng)物中。在微藻中，通過(guò)光合作用固定的C0 2形成的3-磷 酸甘油醛既可以進(jìn)入葡萄糖和氨基酸的合成途徑，也能通過(guò)糖酵解形成丙酮酸再經(jīng)由乙 酰輔酶A進(jìn)入脂類(lèi)代謝或參與不完整的三羧酸循環(huán)。PEPC可以催化C0 2與磷酸烯醇式 丙酮酸（PEP)的羧化反應(yīng)，最后生成草酰乙酸（0ΑΑ)和無(wú)機(jī)磷酸，而PEP可轉(zhuǎn)化成乙酰 CoA，后者是脂肪酸合成的主要原料。PEPC在碳代謝途徑中將碳源導(dǎo)向三羧酸循環(huán)，使得 碳源流向非脂類(lèi)積累的方向而不易于油脂的積累。研究表明，PEPC的活性對(duì)脂類(lèi)的合成 具有重要影響。80年代末，日本學(xué)者杉木博士發(fā)現(xiàn)大豆籽粒中蛋白質(zhì)含量和PEPC的酶 活性密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道，C3植物中PEPC可能在促進(jìn)TCA循環(huán)中間代謝物的回補(bǔ)、協(xié)調(diào) 碳和氮的代謝等方面有重要作用，即：當(dāng)對(duì)氨基酸合成所用碳骨架的需要量增大時(shí)，增 加三羧酸循環(huán)中草酰乙酸的再生，協(xié)調(diào)C和N的代謝，提供氨基酸合成所需要的碳骨架 【GonzalezM. C, Sanehez R, Cejudo F. J. Abiotic stresses affeeting water balance induce Phosphoenolpyruvate carboxylase expression in roots of wheat seedlings J. Planta.，2003, 216 ￠) : 985-992.】。陳錦清提出"底物競(jìng)爭(zhēng)"假說(shuō)，認(rèn)為籽粒油脂和蛋白 質(zhì)的合成需要同一底物一丙酮酸，兩者存在底物競(jìng)爭(zhēng)，而平衡點(diǎn)取決于兩類(lèi)物質(zhì)代謝的關(guān) 鍵酶，PEPC和乙酰輔酶A羧化酶（ACCase)的相對(duì)活性。PEPC催化丙酮酸合成草酰乙酸進(jìn) 入蛋白質(zhì)代謝;ACCase催化丙酮酸合成乙酰輔酶A進(jìn)入脂肪酸代謝。據(jù)此，陳錦清等提出 利用反義PEPC技術(shù)抑制油菜中蛋白質(zhì)合成關(guān)鍵酶PEPC的基因表達(dá)以增加脂肪酸生物合成 底物TOP的供應(yīng)，轉(zhuǎn)基因油菜含油量較對(duì)照提高了 6. 4% - 16. 7%，單株含油量最高達(dá)到 49. 54%【陳錦清，郎春秀，胡張華等.反義p印c基因調(diào)控油菜籽粒蛋白質(zhì)/油脂含量比率 的研究J.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào).，1999, 7(4) :316-32】。侯李君等用藍(lán)藻正反義p印cA基因轉(zhuǎn) 化大腸桿菌，與野生型細(xì)胞相比較，轉(zhuǎn)反義P印cA段的大腸桿菌中PEPC酶活性降低到野生 菌的30. 2%，蛋白合成減少23. 6%，脂類(lèi)的合成增加了 46.9% :而轉(zhuǎn)正義p印cA片段大腸 桿菌的PEPC酶活性是野生菌的2. 38倍，蛋白合成增加了 14. 5 %，脂類(lèi)合成減少了 49. 6 %， 轉(zhuǎn)基因菌中十八碳酸的含量明顯增加【侯李君，施定基，蔡澤富等.藍(lán)藻正反義pepcA基 因?qū)雽?duì)大腸桿菌中脂類(lèi)合成的調(diào)控J.中國(guó)生物工程雜志，2008,（5) :52-58】。
[0004] 萊茵衣藻中含有兩種形式的PEPC的編碼基因 CrPpcl和CrPpc2,并推測(cè)出PEPC1 為同源四聚體，PEPC2 為復(fù)合體【Eric R.Moellering，Yexin Ouyang. The two divergent PEP-carboxylase catalytic subunits in the greenmicroalga Chlamydomonas reinhardtii respond reversibly to inorganic-N supply and c〇-exist in the high -molecular-mass, hetero-oligomeric Class-2 PEPC complex. E. R. Moellering et al. / FEBS Letters.，581 (2007) :4871 - 4876.】。能否通過(guò)調(diào)控PEPC酶的活性讓綠藻積累更多 的脂肪酸？本專(zhuān)利技術(shù)正是針對(duì)萊茵衣藻中兩種亞型的PEPC酶（PEPC1和PEPC2)，設(shè)計(jì)合 適的microRNAs，參與調(diào)控PEPC酶的活性。發(fā)明了一種基于microRNAs調(diào)控綠藻積累脂肪 酸的技術(shù)。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0005] 本發(fā)明提供一種基于microRNAs調(diào)控綠藻脂肪酸合成代謝的技術(shù)。構(gòu)建能夠通過(guò) 光強(qiáng)或溫度等手段調(diào)控microRNAs表達(dá)的轉(zhuǎn)基因藻，以microRNAs對(duì)其靶基因的抑制作為 手段，調(diào)控綠藻脂肪酸的合成。通過(guò)microRNAs抑制萊茵衣藻中PEPC酶的活性，從而使綠 藻細(xì)胞能夠積累更多的脂肪酸。本發(fā)明的具體內(nèi)容如下：
[0006] 本發(fā)明一方面涉及一種萊茵衣藻microRNAs基因，其特征在于其序列為SEQ ID Ν0· 1 或者 SEQ ID Ν0· 2。
[0007] 本發(fā)明還涉及上述的microRNAs在提高綠藻脂肪酸含量中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明另一方面還涉及基于上述萊茵衣藻microRNAs基因調(diào)控的綠藻脂肪酸合 成的方法，構(gòu)建能夠通過(guò)光強(qiáng)或溫度等手段調(diào)控microRNAs表達(dá)的轉(zhuǎn)基因藻，以microRNAs 及其靶基因作為工具，調(diào)控綠藻蛋白質(zhì)的合成代謝，增加藻細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的合成，從而提高 綠藻細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸含量。
[0009] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，通過(guò)microRNAs抑制綠藻蛋白質(zhì)合成途徑中的 靶基因一磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC)基因來(lái)提高脂肪酸的含量。
[0010] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，其特征在于構(gòu)建能夠通過(guò)光強(qiáng)或溫度等手段調(diào) 控microRNAs表達(dá)的轉(zhuǎn)基因藻，具體方法如下：
[0011] 轉(zhuǎn)基因受體藻的篩選與培養(yǎng)：采用TAP、BBM等綠藻培養(yǎng)基，在光照90?200 μ E/ m2 · s的條件下通氣培養(yǎng)真核綠藻（如萊茵衣藻等）；
[0012] 根據(jù)權(quán)利要求3的方法確定的序列，人工合成調(diào)控祀基因的microRNAs ;
[0013] 構(gòu)建綠藻表達(dá)載體：將microRNAs插入帶有特異性啟動(dòng)子（強(qiáng)光誘導(dǎo)或熱激誘導(dǎo) 等）的綠藻表達(dá)載體；
[0014] 表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因藻的篩選：將帶有microRNAs基因的表達(dá)載體導(dǎo)入 綠藻基因組中進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)"珠磨法"、基因槍法或電擊轉(zhuǎn)化法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。通過(guò)抗性 平板篩選或營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選，獲得陽(yáng)性藻落，進(jìn)行分子檢測(cè)和表達(dá)產(chǎn)物分析，確定得到帶有 microRNA的轉(zhuǎn)基因藻，且該轉(zhuǎn)基因藻能夠被強(qiáng)光或高溫所誘導(dǎo)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】：
[0015] 圖1 :amicroRNAs-cre_MIRpepcl調(diào)控的轉(zhuǎn)化子與對(duì)照組脂肪酸含量的比較（轉(zhuǎn)化 子B、C表示轉(zhuǎn)入了調(diào)控PEPC1基因表達(dá)的microRNAs的轉(zhuǎn)化子）；
[0016] 圖2 :amicroRNAs-cre_MIRpepc2調(diào)控的轉(zhuǎn)化子與對(duì)照組脂肪酸含量的比較（轉(zhuǎn)化 子H、V、Z表示轉(zhuǎn)入了調(diào)控PEPC2基因表達(dá)的microRNAs的轉(zhuǎn)化子）。 具體實(shí)施例：
[0017] 以萊茵衣藻作為綠藻的代表物種。
[0018] 實(shí)施例1
[0019] (1)轉(zhuǎn)基因受體藻株的選擇與培養(yǎng)
[0020] 選擇細(xì)胞壁缺陷型萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii, cc-849,購(gòu)自美國(guó) Duck大學(xué)衣藻遺傳中心）和細(xì)胞色素 b缺陷型萊茵衣藻（cc-2654,購(gòu)自美國(guó)Duck大學(xué) 衣藻遺傳中心）作為轉(zhuǎn)基因的受體藻株。使用TAP培養(yǎng)基作為萊茵衣藻的培養(yǎng)基，其配 方及成分如下所示：2.42g Tris，25mL4XBeijerinck salts(16g NH4Cl，2g CaCl2.2H20,4g MgS04. 7H20溶于水中，定容至1L)，lmLIM (K) P04, lmL Trace微量元素混合液（11. 4g H3BO3, 5. 6g MnCl2. 4H20, 22g ZnS04. 7H20, 4. 99g FeS04. 7H20, 1. 61g CoCl2. 6H20, 1. 57g CuS04. 5H20, 1. lg(NH4)6Mo7024. 4H20, 50gNa2EDTA,溶于水中，20% KOH 調(diào) pH6. 5-6. 8,定容至 1L),溶 解到975mL水中，使用冰醋酸調(diào)pH6. 95-7. 05,定容至1L。
[0021] 萊茵衣藻的培養(yǎng)條件：在22?25°C，90 μ E/m2 · s光照條件下連續(xù)培養(yǎng)，藻細(xì)胞對(duì) 數(shù)生長(zhǎng)期濃度為1?2X 106cells/mL。
[0022] (2)萊茵衣藻人工microRNAs的合成
[0023] 通過(guò)基因公司合成可抑制PEPC酶基因表達(dá)的microRNAs序列，分別為 amicroRNAs-cre-MIRpepcl 和 amicroRNAs-cre_MIRpepc2,其序列信息如下：
[0024] >amicroRNAs-cre-MIRpepcl(SEQ ID NO. 1)
[0025] GCTAGCGCGGGGCCCUGACACCACUGCGGCCGCuagcgaccaaacaauccaauaCCGCGCCUGGACCC GAGGGAGGACCCCUCGGGACCCGGUACGUCGUAUUGGAUU⑶UUGGUCGCUAGGUCGCGGUGGGGUCAG⑶CCUUC CGCCACGTG
[0026] >amicroRNAs-cre-MIRpepc2(SEQ ID NO. 2)
[0027] GCTAGCGCGGGGCCCUGACACCACUGCGGCCGCgugccgaaaauguuugguuaaCCGCGCCUGGACCC GAGGGAGGACCCCUCGGGACCCGGUACGUC⑶UAACCAAACAUUUUCGGCACG⑶CGCG⑶GGGGUCAG⑶CCUUC CGCCACGTG
[0028] (3) amicroRNAs-cre-MIRpepcl, 2基因衣藻核基因組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0029] 通過(guò) Nhe I 和 Pmac I 雙酶切獲得調(diào)控 amicroRNAs-cre-MIRpepcl 和 amicroRNAs-cre-MIRpepc2 基因。載體 pH105【W(wǎng)u JX et al. Efficient expression of green fluorescent protein(GFP)mediated by a chimeric promoter in Chlamydomonas reinhardtii. Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2008 (26) : 242-247]克隆 有HSP70A-RBCS2啟動(dòng)子序列和RBCS2終止子序列，中間攜帶有Pmac I、Nhe I、Xba I和 Sal I等多克隆酶切位點(diǎn)，可以插入外源基因并在衣藻核基因組中表達(dá)。載體pSP124((購(gòu) 自美國(guó) Duck 大學(xué)衣藻中心））【Lambreras v，Stevens DR，Purton S. Efficient foreign gene expression in Chlamydomonas reinhardtii mediated by an endogenous intron. Plant J. 1998 ;14(4) :441-447】含有表達(dá)盒RBCS2 :: ble :: RBCS2,可使轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞獲 得腐草霉素和Zeomycin抗性，在本發(fā)明中作為衣藻轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記。
[0030] 將 amicroRNAs-cre-MIRpepcl 和 amicroRNAs-cre_MIRpepc2 基因分別插入經(jīng)Pmac I 和 Nhe I 消化的 pH105 載體，獲得 pH105-amicroRNA。經(jīng) EcoR I 酶切 pH105-amicroRNA， 獲得表達(dá) amicroRNA 基因的表達(dá)框架（HSP70A-RBCS2 :: amicroRNAs-cre-MIRp印cl :: RBC S2 和 HSP70A-RBCS2 :: amicroRNAs-cre-MIRp印c2 :: RBCS2)插入 pSP124 的 EcoR I 位 點(diǎn)，獲得可調(diào)控pepcl和pepc2基因的衣藻表達(dá)載體pH105-amicroRNAs-cre_MIRpepcl和 pH105-amicroRNAs-cre_MIRpepc2〇
[0031] (4) amicroRNAs-cre-MIRpepcl, 2基因衣藻葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建
[0032] 質(zhì)粒p423 (購(gòu)自美國(guó)Duck大學(xué)衣藻中心）上攜帶有aadA基因表達(dá)盒 (5' atpA : : aadA : : 3' rbcL)，aadA基因作為衣藻遺傳轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記，賦予宿主細(xì)胞壯觀 霉素抗性。以萊茵衣藻cc-124 (購(gòu)自美國(guó)Duck大學(xué)衣藻遺傳中心）基因組DNA為模板，設(shè) 計(jì)引物Prchl和Prch2擴(kuò)增5'chlB基因（490bp)，作為衣藻遺傳轉(zhuǎn)化的右端同源序列。設(shè) 計(jì)引物Prch3和Prch4擴(kuò)增3' chlB基因（630bp)，作為衣藻遺傳轉(zhuǎn)化的左端同源序列。
[0033] 擴(kuò)增5' chlB基因的引物為：
[0034] Prchl ：5, ~CCTGAATTCCTGCCATTGGTGTCCATTGC~3,
[0035] EcoR I
[0036] Prch2 ：5, ~GGAGATATCCATTTCCAGGCTGATAGTG~3,
[0037] EcoR I
[0038] PCR 程序：94°C 變性 lmin，56°C 復(fù)性 lmin，72°C 延伸 lmin，30 個(gè)循環(huán)。
[0039] 擴(kuò)增3' chlB基因的引物為：
[0040] Prch3 ：5, -GCGGTACCGCCATTGTATGGTCTCCAG-3'
[0041] Κρη I
[0042] Prch3 ：5, ~CGCTGCAGCGGGTACATTAGTAGCGGTG~3,
[0043] Pst I
[0044] PCR 程序：94°C 變性 lmin，56°C 復(fù)性 lmin，72°C 延伸 lmin，30 個(gè)循環(huán)。
[0045] 分別使用EcoR I酶切擴(kuò)增獲得的5' chlB基因和p423質(zhì)粒，連接并構(gòu)建得到 p423c質(zhì)粒。分別使用Κρη I和Pst I酶切擴(kuò)增獲得的3' chlB基因和p423c質(zhì)粒，連接 并構(gòu)建得到衣藻葉綠體表達(dá)載體p423chl。
[0046] 通過(guò)Nco I和Pst I雙酶切可以切下aadA基因，并插入外源目 的基因 amicroRNAs-cre-MIRpepcl 或 amicroRNAs-cre_MIRpepc2,構(gòu)建得到 amicroRNAs-cre-MIRpepcl 和 amicroRNAs-cre_MIRpepc2基因表達(dá)盒（5'atpA :: amicroRNA s-cre-MIRpepcl :: 3，rbcL 和 5，atpA :: amicroRNAs-cre-MIRpepc2 :: 3，rbcL)。使用 EcoR V和 Sma I 雙酶切，獲得 amicroRNAs-cre-MIRpepcl 和 amicroRNAs-cre_MIRpepc2 基因表 達(dá)盒，并與經(jīng)EcoR V雙酶切的p423chl質(zhì)粒連接，通過(guò)Xho I酶切篩選正向連接的質(zhì)粒， 構(gòu)建得到含有 aadA基因表達(dá)盒和 amicroRNAs-cre-MIRpepcl 或amicroRNAs-cre_MIRpepc2 基因表達(dá)盒的 PamicroRNAs-cre-MIRpepcl-chl 和 PamicroRNAs-cre-MIRpepc2_chl 質(zhì)粒。 衣藻葉綠體表達(dá)載體 PamicroRNAs-cre-MIRpepcl-chl 和 PamicroRNAs-cre_MIRpepc2 上 攜帶有chlB基因外顯子5'和3'端序列，在衣藻遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，作為同源轉(zhuǎn)化片段，可 使 amicroRNAs-cre-MIRpepcl 或 amicroRNAs-cre_MIRpepc2 基因定點(diǎn)整合入葉綠體 DNA 的 chlB基因的5'和3'端序列之間的位置。
[0047] (5)amicroRNAs-cre-MIRpepcl 和 amicroRNAs-cre-MIRpepc2 基因在萊茵衣藻細(xì) 胞的遺傳轉(zhuǎn)化
[0048] (1) "珠磨法"遺傳轉(zhuǎn)化
[0049] 采用 QIAGEN& Plasmid Purification Kit 分別提取重組質(zhì)粒 pH105-amicroRNAs-cre-MIRpepcl 和 pH105-amicroRNAs-cre-MIRpepc2。 "珠磨法"具 體步驟如下：（1)將細(xì)胞壁缺陷型萊茵衣藻cc-849(購(gòu)自美國(guó)Duck大學(xué)衣藻中心）在 連續(xù)光照和TAP培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，細(xì)胞數(shù)約為l-2X10 6cells/ml。5000rmp室 溫離心5min，收集藻細(xì)胞；棄上清；（2)用滅過(guò)菌的新鮮TAP培養(yǎng)液重懸藻細(xì)胞沉淀，調(diào) 整細(xì)胞濃度至2X10 8cells/ml;(3)吸取270μ1藻細(xì)胞懸浮液到1.5mlEP管里（里面 有滅過(guò)菌的合金錫珠），加入1 μ g酶切成線狀的pH105-amicroRNAs-cre_MIRpepcl和 pH105-amicroRNAs-cre-MIRpepc2 以及 30μ 150% PEG6000 加到 EP 管中；同時(shí)建立一個(gè)不 添加 PEG6000的樣品組；此外，還建立一個(gè)不添加 DNA的對(duì)照組；（4)把衣藻細(xì)胞/合金錫珠 /外源DNA混合物在振蕩器上以最高速振蕩25s ; (5)把混合液轉(zhuǎn)移到含有10ml新鮮TAP培 養(yǎng)基的離心管中，在l〇〇rpm搖床弱光下過(guò)夜培養(yǎng)（22-25°C )，使細(xì)胞恢復(fù)；（6)3000rmp室 溫離心5min，收集細(xì)胞，棄上清；用500 μ 1新鮮TAP培養(yǎng)液小心重懸細(xì)胞，加入3. 5ml0. 5% TAP培養(yǎng)基，混勻后倒在含有10 μ g/ml的Zeomycin TAP固體平板上，置于22-25°C光照培 養(yǎng)箱里倒置培養(yǎng)約3周，待平板上長(zhǎng)出綠色的單克隆。
[0050] (2) "基因槍法"遺傳轉(zhuǎn)化
[0051] "基因槍"遺傳轉(zhuǎn)化在無(wú)菌超凈工作臺(tái)中使用基因槍?zhuān)˙io-Rad)進(jìn)行。具體步驟 如下：（1)萊茵衣藻cc-2654(購(gòu)自美國(guó)Duck大學(xué)衣藻中心）在TAP培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù) 生長(zhǎng)期（1 -2X 106cells/ml)，5000rmp室溫離心5min，收集藻細(xì)胞；棄上清；用滅過(guò)菌的新 鮮TAP培養(yǎng)液重懸藻細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度至2X 108cellS/mL ;吸取300 μ L藻細(xì)胞懸 浮液涂布于TAP固體平板中央（直徑?3cm) ;22 - 25°C光照培養(yǎng)（?90μ E/m2/s)24h， 待平板表面形成一層細(xì)胞層。（2)取100 μ L金粉懸浮液（60mg/mL)，依次加入5 μ g質(zhì) 粒（PamicroRNAs-cre-MIRpepcl-chl 或 PamicroRNAs-cre-MIRpepc2-chl)(100μ g/μ L)、 100Μ1 2. 5Μ 0&(：12和4(^〇). 1Μ亞精胺，通過(guò)漩渦振蕩器振蕩2-3分鐘，靜置1分鐘， 8, OOOrpm室溫離心2秒，棄上清；加入280 μ L 70%乙醇清洗，棄上清；加入280 μ L無(wú)水乙 醇清洗，棄上清；加入l〇〇yL無(wú)水乙醇，輕輕重懸。（3)取10yL DNA金粉包被液用于轟擊； 轟擊參數(shù)如下所示：可裂膜氦氣壓力ll〇〇psi，真空度25inches *Hg，轟擊距離9cm，金粉顆 粒直徑l〇〇nm ;⑷把轟擊后的平板放置于22-25°C光照培養(yǎng)箱中，光照培養(yǎng)8h。用lmL新鮮 TAP培養(yǎng)液將衣藻細(xì)胞洗下，涂布于抗生素篩選平板（轉(zhuǎn)PamicroRNAs-cre-MIRpepcl-chl 或PamicroRNAs-cre-MIRpepc2_chl質(zhì)粒）培養(yǎng)約3周，待平板上長(zhǎng)出綠色單克隆。
[0052] (6)轉(zhuǎn)人工microRNAs基因藻的篩選與鑒定
[0053] 萊茵衣藻轉(zhuǎn)化涂板后，約一個(gè)月左右長(zhǎng)出單克隆。挑選轉(zhuǎn)化子接種到空白平板TAP 培養(yǎng)基上，待單克隆子長(zhǎng)出來(lái)之后，再接種到液體培養(yǎng)基，待生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期之后，提取基因 組DNA，按調(diào)控amicroRNAs-cre-MIRpepcl 和 amicroRNAs-cre_MIRpepc2 設(shè)計(jì)引物對(duì)其進(jìn)行 基因組PCR實(shí)驗(yàn)。
[0054] 將PCR產(chǎn)物回收純化之后，送去上海生工進(jìn)行測(cè)序，將分子生物學(xué)確認(rèn)的轉(zhuǎn)化子 經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室繼代培養(yǎng)數(shù)月后，按上述方法進(jìn)一步證實(shí)其轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性。
[0055] (7)轉(zhuǎn)基因藻脂肪酸產(chǎn)量的調(diào)控及檢測(cè)
[0056] 將轉(zhuǎn)基因藻液接種到TPA液體培養(yǎng)基內(nèi)，接種后培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期 的藻液，進(jìn)行〇. 5小時(shí)熱激后光恢復(fù)生長(zhǎng)，離心收集藻細(xì)胞，干燥后，提取脂肪酸并甲酯化。 將提取好的脂肪酸甲酯樣品打入GC-MS氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)。
[0057] 本研究利用GC-MS氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)提取的脂肪酸樣品進(jìn)行分析。首先需要對(duì) 脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)所使用的標(biāo)準(zhǔn)品是在上海安普公司購(gòu)買(mǎi)的37種脂肪酸 甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品。檢測(cè)脂肪酸樣品前，需要先設(shè)定合適的程序，使混合標(biāo)準(zhǔn)品中的37種脂 肪酸甲酯得到較好的分離效果，使所有的峰為單峰且在基線處分離。
[0058] 確定了檢測(cè)流程與方法之后，對(duì)對(duì)照組與轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了檢測(cè)。通過(guò)參考37種脂肪 酸甲酯混標(biāo)的出峰時(shí)間和質(zhì)譜結(jié)果，檢測(cè)出萊茵衣藻cc849脂肪酸主要由C16:0(棕櫚酸甲 酯）、C16:1、C18:0(硬脂酸）、C18:1T(油酸）、C18:2T(亞油酸）和 C18:3n3( α -亞麻酸） 組成。轉(zhuǎn)化子與照組與的各組分出峰時(shí)間基本一致，表明脂肪酸組份一致。研究中利用熱 激以及強(qiáng)光恢復(fù)等處理手段進(jìn)行檢測(cè)。在不同的處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)化子與對(duì)照組的脂肪酸含 量隨之不同。
[0059] 實(shí)驗(yàn)采用熱激的方法，40°熱激30min，熱激后光恢復(fù)生長(zhǎng)24h，5000rpm離心5min 收集藻細(xì)胞。冷凍干燥后，提取總脂樣品并甲酯化。對(duì)樣品使用GC-MS檢測(cè)。從圖1和圖 2可以看到轉(zhuǎn)化子的脂肪酸含量有一個(gè)較大的提高，相較與對(duì)照組（在圖中使用*表示；* 表示與對(duì)照組相比具有顯著性差異；**表示對(duì)照組相比具有極顯著差異），最高提升了近 20 %。通過(guò)人工microRNAs對(duì)于藻細(xì)胞進(jìn)行著預(yù)期的調(diào)控作用，本研究為日后微藻制備生 物柴油的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
[0060] 以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來(lái) 說(shuō)，在不脫離本發(fā)明所述原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0061] 序列表 Application Project <120〉Title : microRNAs基因及其在提高綠藻脂肪酸含量的應(yīng)用 <130> AppFileReference : <140> CurrentAppNumber : <141> CurrentFilingDate : Sequence <213> OrganismNamc : <400> PreSequenceString : gctagcgcgg ggcccugaca ccacugcggc cgcuagcgac caaacaaucc aauaccgcgc 60 cuggacccga gggaggaccc cucgggaccc gguacgucgu auuggauugu uuggucgcua 120 ggucgcggug gggucagguc cuuccgccac gtg 153 <212> Type : DNA <211> Length : 153 SequenceName : 1 SequenceDescription : Sequence <213> OrganismName : <400> PreSequenceString : gctagcgcgg ggcccugaca ccacugcggc cgcgugorga aaauguuugg uuaaccgcgc 60 GUggacccga gggaggaccc cucgggaccc gguacgucgu uaaccaaaca uuuucggcac 120 ggucgcggug gggucagguc cuuccgccac gtg 153 <212> Type : DNA <211〉 Length . 153
[0062] SequenceName : 2 SequenceDescription ;
【權(quán)利要求】
1. 萊茵衣藻microRNAs基因，其特征在于其序列為SEQ ID NO. 1或者SEQ ID NO. 2。
2. 權(quán)利要求1所述的microRNAs基因在提高綠藻脂肪酸含量中的應(yīng)用。
3. -種基于權(quán)利要求1所述的萊茵衣藻microRNAs基因通過(guò)調(diào)控綠藻代謝關(guān)鍵酶的活 性來(lái)促進(jìn)脂肪酸合成的方法，構(gòu)建能夠通過(guò)光強(qiáng)或溫度等手段誘導(dǎo)microRNAs基因表達(dá)的 轉(zhuǎn)基因藻，以microRNAs及其靶基因作為工具，調(diào)控綠藻代謝關(guān)鍵酶的合成代謝，從而使綠 藻細(xì)胞積累更多的脂肪酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于影響綠藻合成代謝的關(guān)鍵酶靶基因一磷酸 烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于構(gòu)建能夠通過(guò)光強(qiáng)或溫度等手段誘導(dǎo) microRNAs基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因藻，具體方法如下： 1) 轉(zhuǎn)基因受體藻的篩選與培養(yǎng)：采用TAP、BBM等綠藻培養(yǎng)基，在光照90?200 μ E/ m2 · s的條件下通氣培養(yǎng)真核綠藻（如萊茵衣藻等）； 2) 根據(jù)權(quán)利要求3的方法確定的序列，人工合成可調(diào)控祀基因的microRNAs ; 3) 構(gòu)建綠藻表達(dá)載體：將microRNAs插入帶有特異性啟動(dòng)子（強(qiáng)光誘導(dǎo)或熱激誘導(dǎo) 等）的綠藻表達(dá)載體； 4) 表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因藻的篩選：將帶有microRNAs基因的表達(dá)載體，通過(guò) "珠磨法"、基因槍法或電擊轉(zhuǎn)化法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，通過(guò)抗性平板篩選或營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選，獲 得陽(yáng)性藻落，進(jìn)行分子檢測(cè)和表達(dá)產(chǎn)物分析，確定得到能夠誘導(dǎo)表達(dá)microRNAs基因的轉(zhuǎn) 基因藻。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于應(yīng)用基于microRNAs調(diào)控的轉(zhuǎn)基因藻提高綠 藻脂肪酸的含量。
【文檔編號(hào)】C12N1/13GK104099334SQ201410320221
【公開(kāi)日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月7日
【發(fā)明者】胡章立, 王潮崗, 陳曦 申請(qǐng)人:深圳大學(xué)