水仙退化病毒巢式rt-pcr檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種水仙退化病毒巢式RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法，專用于水仙退化病毒的檢測。該試劑盒包括：外側(cè)正向引物、外側(cè)反向引物、內(nèi)側(cè)正向引物、內(nèi)側(cè)反向引物、RT?Buffer、RNA酶抑制因子、反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、PCR?Buffer、Mgcl2、Taq?DNA聚合酶、陽性對照、陰性對照和RNase-free?ddH2O。本發(fā)明利用巢式RT-PCR技術(shù)對水仙退化病毒進(jìn)行檢測，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便和檢測時間快的優(yōu)點，適用于我國進(jìn)出境口岸檢疫和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上對水仙退化病毒的快速檢測、疫情監(jiān)控及預(yù)警預(yù)報，應(yīng)用前景十分廣泛。
【專利說明】水仙退化病毒巢式RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種水仙退化病毒巢式RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法，屬于植物 檢疫【技術(shù)領(lǐng)域】，適用于進(jìn)出境及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上水仙退化病毒的快速檢測和監(jiān)測。

【背景技術(shù)】
[0002] 水仙退化病毒（Narcissus degeneration virus，NDV)為馬鈴暮Y病毒科 (Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus)成員，病毒基因組全長約9, 816bp，為正 義單鏈RNA，不含polyA尾，該病毒在受侵染的水仙葉肉細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生典型的風(fēng)輪狀內(nèi)含 體。該病毒最早在英國多花水仙變種（Narcissus tazetta cv. Grand Soleil d' Or)上 發(fā)現(xiàn)，在受侵染的水仙葉片上表現(xiàn)為褪綠條紋癥狀。NDV實驗寄主較窄，主要局限在石 蒜科（Amaryllidaceae)的幾種植物上，可以摩擦接種的植物包括中國水仙（Narcissus tazetta var. chinensis Roem)、紅口水仙（Narcissus poeticus)、喇機(jī)7_K仙（Narcissus pseudonarcissus)三種水仙和石蒜（Lycoris radiata)植物。NDV的基因組全序列大小 為9816個核苷酸，具有馬鈴薯Y病毒屬病毒典型的基因組結(jié)構(gòu)，含一個大的開放閱讀框 (0RF)，編碼的一個3184個氨基酸殘基的多聚蛋白，分子量為363. 4KDa。NDV病毒粒體為 細(xì)絲狀，主要經(jīng)由蚜蟲介體在其植株間進(jìn)行傳播。NDV在血清學(xué)關(guān)系上與馬鈴薯Y病毒 (Potato virus Y，PVY)、完菁花葉病毒（Turnip mosaic virus, TuMV)具有血清學(xué)相關(guān)性， 但與另一同為馬鈴薯Y病毒屬病毒的水仙遲黃病毒（Narcissus late season yellows virus, NLSYV)沒有血清學(xué)關(guān)系。此外，NDV還能夠與其他植物病毒復(fù)合侵染水仙，影響水仙 的品質(zhì)，造成水仙商品價值在不同定程度上降低。
[0003] 目前，NDV主要分布在英國、德國、新西蘭、澳大利亞、中國等水仙栽培區(qū)。NDV的 遠(yuǎn)距離傳播主要依靠攜帶該病毒的植株及其產(chǎn)品的運輸，因此加強該病毒的檢測，有利于 預(yù)防該病毒的發(fā)生和擴(kuò)散。由于NDV寄主范圍窄，且常出現(xiàn)復(fù)合侵染，利用傳統(tǒng)的生物學(xué) 檢測方法檢測尚未發(fā)現(xiàn)有效的鑒別寄主；利用電鏡檢測方法觀察病毒粒具有直接而準(zhǔn)確的 優(yōu)點，但其需專門的技術(shù)人員和昂貴的儀器設(shè)備，使其在口岸的應(yīng)用上具有較大的局限性； ELISA檢測方法靈敏度高、特異性強、操作簡便，是目前廣泛應(yīng)用的一種血清學(xué)檢測技術(shù)，但 其局限性在于需要穩(wěn)定性好、特異性強的病毒抗體。近年來，PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物病毒 的檢測，靈敏度高、特異性強。基于普通RT-PCR的巢式RT-PCR方法，能夠降低多個靶標(biāo)被 擴(kuò)增的可能，減少假陽性的出現(xiàn)，提高檢測的靈敏度和可靠性，具有突出優(yōu)點。但到目前為 止，關(guān)于水仙退化病毒（NDV)巢式RT-PCR檢測方法的報道甚少，至今尚未見專門應(yīng)用于該 病毒快速檢測的巢式RT-PCR檢測試劑盒。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種水仙退化病毒巢式RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方 法，克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷和不足，能夠?qū)M(jìn)出境及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上水仙退化病毒進(jìn)行快 速、準(zhǔn)確的檢疫鑒定。
[0005] 本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0006] (一）一種用于水仙退化病毒檢測的巢式RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試 劑盒包括：
[0007] 1)外側(cè)正向引物：10 μ mol/L，引物序列為 5' -ACCGTTGGCATCACTAAG-3' ；
[0008] 2)外側(cè)反向引物：10 μ mol/L，引物序列為 5' -ACTGGTTCCACGCTCCTA-3' ；
[0009] 3)內(nèi)側(cè)正向引物：10ymol/L，引物序列為 5' -GCGGTGATAACAATTCGAGA-3' ；
[0010] 4)內(nèi)側(cè)反向引物：10ymol/L，引物序列為 5' -GCTAAGTCCTTCAATTTCCGTC-3' ；
[0011] 5)RT Buffer ：5X ；
[0012] 6)RNA 酶抑制因子：4〇υ/μ L ;
[0013] 7)反轉(zhuǎn)錄酶：200U/yL;
[0014] 8) dNTPs : 10mmol/L ;
[0015] 9)PCR Buffer ：10X ；
[0016] 10)Mgcl2 ：25mmol/L ；
[0017] ll)Taq DNA 聚合酶：5U/y L ;
[0018] 12)水仙退化病毒的陽性對照樣品；
[0019] 13)不含水仙退化病毒的陰性對照樣品；
[0020] 14)RNase-free ddH20〇
[0021] (二）上述水仙退化病毒巢式RT-PCR檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括以 下步驟：
[0022] 1)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：在PCR管中加入待測樣品總RNA3 μ L、濃度為10 μ mol/L的外側(cè)反 向引物1 U L和RNase-free ddH207 μ L，70°C水浴10min，迅速冰浴5min，再加入下列試劑： 5\町81^€612.5 4 1^、濃度為10臟〇1/1(1階1^14 1^、濃度為20(^/^1^反轉(zhuǎn)錄酶0.5 4 1^、濃 度為 40U/μ L RNA 酶抑制因子 0· 5 μ L。42°C水浴 60min，70°C水浴 10min，合成 cDNA ;
[0023] 2)第1輪PCR反應(yīng)：取步驟1)合成的cDNA3yL，按每管加濃度為5U/yL Taq DNA 聚合酶 0.5yL、濃度為 10mmol/L dNTPs0.5yL、10XPCR Buffer2.5yL、濃度為 25mmol/L MgCl22 μ L、濃度為10 μ mol/L外側(cè)正向引物1 μ L、濃度為10 μ mol/L外側(cè)反向引物1 μ L、 RNase-free ddH2014. 5 μ L，使反應(yīng)總體積為25 μ L ;混合后的反應(yīng)液，94°C預(yù)變性3min，然 后94°C變性30s、 56t：退火45s、72°C延伸lmin，如此共30個循環(huán)，最后一個循環(huán)結(jié)束后 72°C繼續(xù)延伸10min，反應(yīng)結(jié)束；
[0024] 3)第2輪PCR反應(yīng)：取0. 2 μ L稀釋100倍后的第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物，按每管加濃度 為 5U/yL Taq DNA聚合酶0.5yL、濃度為 10mmol/L dNTPs0.5yL、10XPCR Buffer2.5yL、 濃度為25mmol/L MgCl22 μ L、濃度為10 μ mol/L內(nèi)側(cè)正向引物1 μ L、濃度為10 μ mol/L內(nèi)側(cè) 反向引物1 μ L、RNase-free ddH2017. 3μ L，使反應(yīng)總體積為25μ L ;混合后的反應(yīng)液，94°C 預(yù)變性3min，然后94°C變性30s、58°C退火45s、72°C延伸lmin，如此共30個循環(huán)，最后一 個循環(huán)結(jié)束后72°C繼續(xù)延伸10min，反應(yīng)結(jié)束；
[0025] 4) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測：第2輪PCR反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物10yL用1.5 %瓊脂糖 凝膠電泳進(jìn)行檢測，溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄實驗結(jié)果；含有水仙退 化病毒樣品的電泳檢測結(jié)果為在393bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶。
[0026] 根據(jù)已報道的水仙退化病毒基因序列設(shè)計兩對特異性引物，以提取RNA為模板反 轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為模板，進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，再以第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物作為模板進(jìn) 行第二輪PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。較現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明所提供 的水仙退化病毒巢式RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法有益效果在于：1)特異性強：通過使 用內(nèi)外側(cè)兩對引物進(jìn)行巢式PCR，極大提高了病毒檢測的特異性。內(nèi)側(cè)引物（第二對引物） 的擴(kuò)增位點位于外側(cè)引物（第一對引物）的擴(kuò)增位點內(nèi)部，非目的片段同時包含這兩套引 物結(jié)合位點的可能性極小，因此有效避免了多個靶標(biāo)位點的出現(xiàn)。本發(fā)明能夠從感染水仙 退化病毒的樣品上擴(kuò)增到大小為393bp的特異性目的片段，而從健康樣品及其他病毒樣品 上均未擴(kuò)增到大小為393bp的特異性目的片段，結(jié)果證實本發(fā)明具有很強的特異性。2)靈 敏度高：本發(fā)明經(jīng)過2輪PCR反應(yīng)，使檢測靈敏度呈數(shù)量級增長，從而實現(xiàn)對微量模板樣品 的檢測。本發(fā)明相對于普通PCR技術(shù)，檢測水仙退化病毒的靈敏度是其10 2-103倍，對于不 表現(xiàn)癥樣品或攜帶水仙退化病毒含量少的檢測具有重要應(yīng)用價值。3)操作簡便、周期短： 本發(fā)明提供的檢測方法操作簡便、周期短，克服傳統(tǒng)生物學(xué)測定、電鏡觀察和血清學(xué)檢測方 法存在靈敏度不高的缺點，實現(xiàn)對水仙退化病毒的快速、準(zhǔn)確和高效檢測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1為實施例2的水仙退化病毒檢測結(jié)果。其中M :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（100bp) ;1 : 陽性對照；2 :陰性對照；3 :空白對照；4-5 :攜帶有水仙退化病毒的樣品；6-7 :未攜帶有水 仙退化病毒的樣品。
[0028] 圖2為實施例3的特異性測定結(jié)果。其中M :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（100bp) ;1 :水仙退 化病毒（NDV)樣品；2 :水仙花葉病毒（NMV)樣品；3 :水仙黃條病毒（NYSV)樣品；4 :水仙遲 季黃化病毒（NLSYV)樣品；5 :水仙潛隱病毒（NLV)樣品；6 :南芥菜花葉病毒（ArMV)樣品； 7 :陰性對照。
[0029] 圖3為實施例4的第1輪PCR測定結(jié)果。其中M :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（100bp) ;1 :RNA 原液；2 :10 1稀釋；3 :102稀釋；4 :10 3稀釋；5 :104稀釋；6 :10 5稀釋；7 :106稀釋；8 :10 7 稀釋；9 :1(Γ8稀釋；10 :1(Γ9稀釋；11 :10, ；12 :陰性對照。
[0030] 圖4為實施例4的第2輪PCR測定結(jié)果。其中M :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（100bp) ;1 :RNA 原液；2 :10 1稀釋；3 :102稀釋；4 :10 3稀釋；5 :104稀釋；6 :10 5稀釋；7 :106稀釋；8 :10 7 稀釋；9 :1(Γ8稀釋；10 :1(Γ9稀釋；11 :10, ；12 :陰性對照。

【具體實施方式】
[0031] 以下通過具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0032] 實施例1 :水仙退化病毒巢式RT-PCR檢測試劑盒的配置（10次檢測量）
[0033] 1)外側(cè)正向引物：10ymol/L，l 管（30yL);
[0034] 2)外側(cè)反向引物：10ymol/L，l 管（30yL);
[0035] 3)內(nèi)側(cè)正向引物：10ymol/L，l 管（30yL);
[0036] 4)內(nèi)側(cè)反向引物：10ymol/L，l 管（30yL);
[0037] 5) RT Buffer :5 X，1 管（30 μ L);
[0038] 6) RNA 酶抑制因子：40U/ μ L，1 管（5 μ L);
[0039] 7)反轉(zhuǎn)錄酶：200U/ μ L，1 管（5 μ L);
[0040] 8) dNTPs : 10mmol/L，1 管（30 μ L);
[0041] 9) PCR Buffer : 10 X，1 管（60 μ L);
[0042] 10)Mgcl2 :25mmol/L，1 管（50 μ L);
[0043] ll)Taq DNA 聚合酶：5υ/μ L，1 管（10μ L);
[0044] 12)水仙退化病毒的陽性對照樣品，1管（50 μ L);
[0045] 13)不含水仙退化病毒的陰性對照樣品，1管（50 μ L);
[0046] 14) RNase-free ddH20,1 管（lmL)。
[0047] 實施例2 :水仙退化病毒巢式RT-PCR檢測試劑盒的檢測方法
[0048] 上述水仙退化病毒巢式RT-PCR檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：
[0049] 1)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：在PCR管中加入待測樣品總RNA3 μ L、濃度為10 μ mol/L的外側(cè)反 向引物1 U L和RNase-free ddH207 μ L，70°C水浴lOmin，迅速冰浴5min，再加入下列試劑： 5\町81^€612.5 4 1^、濃度為10臟〇1/1(1階1^14 1^、濃度為20(^/^1^反轉(zhuǎn)錄酶0.5 4 1^、濃 度為 40U/μ L RNA 酶抑制因子 0· 5 μ L。42°C水浴 60min，70°C水浴 10min，合成 cDNA ;
[0050] 2)第1輪PCR反應(yīng)：取步驟1)合成的cDNA3 μ L，按每管加濃度為5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0.5yL、濃度為 lOmmol/L dNTPs0.5yL、10XPCR Buffer2.5yL、濃度為 25mmol/L MgCl22 μ L、濃度為10 μ mol/L外側(cè)正向引物1 μ L、濃度為10 μ mol/L外側(cè)反向引物1 μ L、 RNase-free ddH2014. 5 μ L，使反應(yīng)總體積為25 μ L ;混合后的反應(yīng)液，94°C預(yù)變性3min，然 后94°C變性30s、 56t：退火45s、72°C延伸lmin，如此共30個循環(huán)，最后一個循環(huán)結(jié)束后 72°C繼續(xù)延伸10min，反應(yīng)結(jié)束；
[0051] 3)第2輪PCR反應(yīng)：取0. 2 μ L稀釋100倍后的第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物，按每管加濃度 為 5U/yL Taq DNA聚合酶0.5yL、濃度為 10mmol/L dNTPs0.5yL、10XPCR Buffer2.5yL、 濃度為25mmol/L MgCl22 μ L、濃度為10 μ mol/L內(nèi)側(cè)正向引物1 μ L、濃度為10 μ mol/L內(nèi)側(cè) 反向引物1 μ L、RNase-free ddH2017. 3μ L，使反應(yīng)總體積為25μ L ;混合后的反應(yīng)液，94°C 預(yù)變性3min，然后94°C變性30s、58°C退火45s、72°C延伸lmin，如此共30個循環(huán)，最后一 個循環(huán)結(jié)束后72°C繼續(xù)延伸10min，反應(yīng)結(jié)束；
[0052] 4) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測：第2輪PCR反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物10yL用1.5 %瓊脂糖 凝膠電泳進(jìn)行檢測，溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄實驗結(jié)果；含有水仙退 化病毒樣品的電泳檢測結(jié)果為在393bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶（圖1)，否則無。
[0053] 實施例3 :水仙退化病毒巢式RT-PCR檢測試劑盒的特異性測定
[0054] 1)水仙樣品總RNA的提?。悍謩e以攜帶有水仙退化病毒（NDV)、水仙遲季黃化病 毒（NLSYV)、水仙花葉病毒（Narcissus mosaic virus，NMV)、水仙黃條病毒（Narcissus yellow stripe virus，NYSV)、水仙潛隱病毒（Narcissus latent virus，NLV)、南芥菜花 葉病毒（Arabis mosaic virus，ArMV)的水仙樣品為材料，各取O.lg置于研缽中，加入lmL PBST緩沖液研磨，4°C，10000g離心5min，取上清并將上清液迅速轉(zhuǎn)移至滅菌的1. 5mL離 心管中，加入lmL TrizoL試劑，劇烈振蕩后，室溫靜置5min ;4°C，12000g離心10min，取上 清；加入氯仿300yL，劇烈震蕩15s，室溫靜置5min，4°C，12000g離心15min，取上層水相； 加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后室溫下靜置15min，4°C，12000g離心10min，棄上清；加入 lmL75 %的乙醇洗滌沉淀2次，每次4°C，7500g離心3min，棄上清；RNA沉淀干燥后，用20 μ L RNase-free ddH20 溶解；
[0055] 2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：在PCR管中加入待測樣品總RNA3 μ L、濃度為10 μ mol/L的外側(cè)反 向引物luL和RNase-free ddH207yL，70°C水浴lOmin，迅速冰浴5min，再加入下列試劑： 5\町81^€612.5 4 1^、濃度為10臟〇1/1(1階1^14 1^、濃度為20(^/^1^反轉(zhuǎn)錄酶0.5 4 1^、濃 度為 40U/μ L RNA 酶抑制因子 0· 5 μ L。42°C水浴 60min，70°C水浴 lOmin，合成 cDNA ;
[0056] 3)第1輪PCR反應(yīng)：取步驟1)合成的cDNA3yL，按每管加濃度為5U/yL Taq DNA 聚合酶 0.5yL、濃度為 10mmol/L dNTPs0.5yL、10XPCR Buffer2.5yL、濃度為 25mmol/L MgCl22 μ L、濃度為10 μ mol/L外側(cè)正向引物1 μ L、濃度為10 μ mol/L外側(cè)反向引物1 μ L、 RNase-free ddH2014. 5 μ L，使反應(yīng)總體積為25 μ L ;混合后的反應(yīng)液，94°C預(yù)變性3min，然 后94°C變性30s、 56t：退火45s、72°C延伸lmin，如此共30個循環(huán)，最后一個循環(huán)結(jié)束后 72°C繼續(xù)延伸10min，反應(yīng)結(jié)束；
[0057] 4)第2輪PCR反應(yīng)：取0. 2 μ L稀釋100倍后的第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物，按每管加濃度 為 5U/yL Taq DNA聚合酶0.5yL、濃度為 10mmol/L dNTPs0.5yL、10XPCR Buffer2.5yL、 濃度為25mmol/L MgCl22 μ L、濃度為10 μ mol/L內(nèi)側(cè)正向引物1 μ L、濃度為10 μ mol/L內(nèi)側(cè) 反向引物1 μ L、RNase-free ddH2017. 3μ L，使反應(yīng)總體積為25μ L ;混合后的反應(yīng)液，94°C 預(yù)變性3min，然后94°C變性30s、58°C退火45s、72°C延伸lmin，如此共30個循環(huán)，最后一 個循環(huán)結(jié)束后72°C繼續(xù)延伸10min，反應(yīng)結(jié)束；
[0058] 5) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測：第2輪PCR反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物10yL用1.5 %瓊脂糖 凝膠電泳進(jìn)行檢測，溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄實驗結(jié)果（圖2)。從圖 2可見，僅水仙退化病毒樣品在393bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶，其他病毒樣品和健康水仙樣 品均無，說明本發(fā)明試劑盒具有很強的特異性。
[0059] 實施例4 :水仙退化病毒巢式RT-PCR檢測試劑盒的靈敏度測定
[0060] 將水仙退化病毒（NDV)樣品的 RNA 稀釋成 ΚΓ1，ΚΓ2, ΚΓ3,1〇Λ ΚΓ5, ΚΓ6, ΚΓ7, ΚΓ8 和1〇_9倍，分別作為模板，按實施例2方法進(jìn)行檢測，試驗同時設(shè)置陰性對照和空白對照。 從圖3和圖4可見，經(jīng)第2輪PCR，可將靈敏度提高10 4倍，即巢式RT-PCR可以檢測稀釋到 ΚΓ9倍的NDV樣品RNA，表明本發(fā)明試劑盒具有很高的靈敏度。
[0061] 實施例5 :進(jìn)境水仙、中國水仙上水仙退化病毒的檢測
[0062] 選取我國口岸截獲的水仙樣品15份，提取所有樣品總RNA后按實施例2方法進(jìn)行 檢測。結(jié)果采用本發(fā)明能夠從11份水仙樣品中檢測出水仙退化病毒，檢出率達(dá)73. 3%。 〈11〇>福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心 〈120>水仙退化病毒巢式RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法 <130> <160> 4 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 18 <212> DNA 〈213>人工序列 <400> 1 accgttggca tcactaag 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA 〈213>人工序列 〈400> 2 actggttcca cgctccta 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA 〈213>人工序列 〈400> 3 gcggtgataa caattcgaga 20 <210> 4 <211> 22 〈212> DNA 〈213>人工序列 <400> 4 gctaagtcct tcaatttccg tc 22
【權(quán)利要求】
1. 一種水仙退化病毒巢式RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：1)外 側(cè)正向引物：1 〇 μ mo 1 /L，引物序列為5 ' -ACCGTTGGCATCACTAAG-3 ' ； 2)外側(cè)反向引物： 10 μ mol/L，引物序列為 5' -ACTGGTTCCACGCTCCTA-3' ；3)內(nèi)側(cè)正向引物：10 μ mol/L， 引物序列為5' -GCGGTGATAACAATTCGAGA-3' ；4)內(nèi)側(cè)反向引物：10 μ mol/L，引物序列為 5' -GCTAAGTCCTTCAATTTCCGTC-3' ；5)RT Buffer :5X ;6)RNA 酶抑制因子：4〇υ/μ L ;7)反 轉(zhuǎn)錄酶：20〇υ/μ L ;8)dNTPs :10mmol/L ;9)PCR Buffer :10X ;10)Mgcl2 :25mmol/L ;ll)Taq DNA聚合酶：5U/yL;12)水仙退化病毒的陽性對照樣品；13)不含水仙退化病毒的陰性對 照樣品；14)RNase_free ddH20。
2. 利用權(quán)利要求1所述的水仙退化病毒巢式RT-PCR檢測試劑盒的檢測方法，其特征在 于，包括以下步驟： 1) 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：在PCR管中加入待測樣品總RNA3yL、濃度為lOymol/L的外側(cè)反向引 物1 μ L和RNase-free ddH207 y L，70°C水浴lOmin，迅速冰浴5min，再加入下列試劑：5XRT Buffer2. 5yL、濃度為 10mmol/L dNTPslyL、濃度為 200U/yL 反轉(zhuǎn)錄酶 0. 5yL、濃度為 4〇υ/μ L RNA 酶抑制因子 0· 5μ L。42°C水浴 60min，70°C水浴 lOmin，合成 cDNA ; 2) 第1輪PCR反應(yīng)：取步驟1)合成的cDNA3yL，按每管加濃度為5U/yL Taq DNA 聚合酶 0.5yL、濃度為 10mmol/L dNTPs0.5yL、10XPCR Buffer2.5yL、濃度為 25mmol/L MgCl22yL、濃度為10ymol/L外側(cè)正向引物lyL、濃度為10ymol/L外側(cè)反向引物lyL、 RNase-free ddH2014. 5 μ L，使反應(yīng)總體積為25 μ L ;混合后的反應(yīng)液，94°C預(yù)變性3min，然 后94°C變性30s、 56t：退火45s、72°C延伸lmin，如此共30個循環(huán)，最后一個循環(huán)結(jié)束后 72°C繼續(xù)延伸lOmin，反應(yīng)結(jié)束； 3) 第2輪PCR反應(yīng)：取0. 2 μ L稀釋100倍后的第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物，按每管加濃度為 5U/yL Taq DNA聚合酶0.5yL、濃度為 10mmol/L dNTPs0.5yL、10XPCR Buffer2.5yL、濃 度為25mmol/L MgCl22 μ L、濃度為10 μ mol/L內(nèi)側(cè)正向引物1 μ L、濃度為10 μ mol/L內(nèi)側(cè) 反向引物1 μ L、RNase-free ddH2017. 3μ L，使反應(yīng)總體積為25μ L ;混合后的反應(yīng)液，94°C 預(yù)變性3min，然后94°C變性30s、58°C退火45s、72°C延伸lmin，如此共30個循環(huán)，最后一 個循環(huán)結(jié)束后72°C繼續(xù)延伸10min，反應(yīng)結(jié)束； 4. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測：第2輪PCR反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物10 μ L用1. 5 %瓊脂糖凝膠 電泳進(jìn)行檢測，溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄實驗結(jié)果；含有水仙退化病 毒樣品的電泳檢測結(jié)果為在393bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶。
【文檔編號】C12R1/94GK104120192SQ201410294845
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月26日
【發(fā)明者】沈建國, 蔡偉, 金晶, 廖富榮, 高芳鑾, 林雙慶 申請人:福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心