一種桉樹焦枯病原菌的lamp檢測試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種桉樹焦枯病原菌的LAMP檢測試劑盒及其使用方法。本發(fā)明的試劑盒包括：(1)10×Thermopol?Ⅱ；(2)100mM?MgCl2；(3)2.5mM?dNTPs；(4)5M甜菜堿溶液；(5)ddH2O；(6)40μM的內(nèi)引物FIP和BIP，10μM的外引物F3和B3；10μM的環(huán)狀引物L(fēng)ooPF和LooPB；(7)8U?Bst?DNA聚合酶大片；(8)SYBR?Green?I熒光染料。本發(fā)明能夠快速準(zhǔn)確定對(duì)桉樹焦枯病原菌引起的多種林木病害進(jìn)行分子鑒定病害的早期診斷。
【專利說明】一種桉樹焦枯病原菌的LAMP檢測試劑盒及其使用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及的是一種桉樹焦枯病原菌的LAMP檢測試劑盒及其使用方法。

【背景技術(shù)】
[0002]桉樹(Eucalyptus spp.)是桃金娘科(Myrtaceae)桉樹屬植物的總稱,是世界著名的速生樹種，也是我國重要的三大速生用材樹種之一。由于其具有品質(zhì)優(yōu)良，生長迅速，適應(yīng)性強(qiáng)，用途廣泛，以及較高的經(jīng)濟(jì)回報(bào)效率等特點(diǎn)而被在我國廣泛引種，并大量栽培于廣東、廣西、福建、四川、云南、海南等南方地區(qū)。目前，由Cylindrocladium scoparium(桉樹焦枯病原菌)引起的桉樹焦枯病被定義為一種世界性病害，嚴(yán)重威脅著澳大利亞、美國、中國、巴西、日本、印度尼西亞、泰國、越南等幾十個(gè)桉樹種植較為密集的國家。桉樹焦枯病主要侵害桉樹4齡及其以下的苗木，桉樹焦枯病原菌侵染植株林區(qū)后，輕者易造成植株萎蔫及落枝、落葉等現(xiàn)象；重者則會(huì)出現(xiàn)感病苗木葉片全部脫落、頂枯、植株枝條全部枯死等現(xiàn)象，危害十分嚴(yán)重。由于桉樹焦枯病可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響桉樹生產(chǎn)林的建設(shè)，因此我國在1996年I月5日便將其列入森林植物檢疫對(duì)象。因此檢測桉樹是否攜帶焦枯病原菌對(duì)于桉樹焦枯病的防治意義重大，同時(shí)也是減少桉樹經(jīng)濟(jì)損失的重要保障。
[0003]目前，經(jīng)報(bào)道，在中國廣西、福建、海南、四川等多個(gè)省市和地區(qū)具有桉樹焦枯病的發(fā)生，其病原菌主要以Cylindrocladium scoparium(桉樹焦枯病原菌)為主。桉樹焦枯病發(fā)生面積甚廣，已嚴(yán)重威脅著中國現(xiàn)今桉樹的林業(yè)生產(chǎn)建設(shè)。為此，亟需建立快速靈敏的檢測方法，為桉樹焦枯病的防治提供依據(jù)。
[0004]近年來，分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，已廣泛應(yīng)用于植物病原真菌的分類鑒定中。PCR技術(shù)及基于PCR的檢測方法快速、準(zhǔn)確、靈敏，在植物病害的檢測上發(fā)揮著不可替代的作用。LAMP (Loop-mediated isothermal amplificat1n),又稱“環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)”,是日本學(xué)者Notomi等發(fā)明的一種新型、快速、簡便的核酸擴(kuò)增方法，其原理是利用一種鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件(一般在60-65°C之間)反應(yīng)30-75分鐘，即可實(shí)現(xiàn)核酸的快速擴(kuò)增，目前已被廣泛的應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、寄生蟲的快速檢測，但在真菌上的應(yīng)用報(bào)道相對(duì)較少。與常規(guī)的PCR反應(yīng)相比，LAMP方法操作簡單，不需昂貴的PCR反應(yīng)儀器即可實(shí)現(xiàn)病原菌的快速檢測，且判斷結(jié)果更為人性化，僅需加入熒光染色劑用肉眼判斷，特異性和靈敏度也相對(duì)常規(guī)PCR反應(yīng)高。
[0005]迄今為止，國內(nèi)外對(duì)桉樹焦枯病原菌在快速檢測方面的報(bào)道仍處于空白，因此建立高效、快速的桉樹焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)LAMP檢測技術(shù)勢在必行，同時(shí)為桉樹焦枯病的發(fā)生和防治提供重要的技術(shù)手段。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)在檢測桉樹焦枯病原菌中存在的不足，提供了一種桉樹焦枯病原菌的LAMP檢測試劑盒及其使用方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]一種桉樹焦枯病原菌的LAMP檢測試劑盒，其包括:
[0009](I) 10 X Thermopol II ；
[0010](2) 10mMMgCl2 ；
[0011](3) 2.5mMdNTPs ；
[0012](4) 5M甜菜堿溶液；
[0013](5) ddH20;
[0014](6)40μΜ的內(nèi)引物FIP和ΒΙΡ，10μΜ的外引物F3和Β3 ;10μΜ的環(huán)狀引物L(fēng)ooPF 和 LooPB ;其中，前內(nèi)引物 FIP 的序列為 5 ' — TGCGCGCTCTTTCGCTACATACACAACGGTACCTCCGACC - 3 ;，后內(nèi)引物 BIP 的序列為 5 ' — CGCTCACCCTGCGAGAAACAGCGCGAGGAACATACTTGTT - 3 ;，前外引物 F3 的序列為 5 ' — CTCGACAGCAATGGTGTCT - 3 ;，后外引物B3的序列為5 ' - GCTCAAGATCGACGAGGAC - 3 ;，環(huán)狀引物L(fēng)ooPF的序列為5 '—GTAGACGTTCATGCGCTCC — 3 ;，環(huán)狀引物 LooPB 的序列為 5 ; — ATTATTTGTGAGTGTGATAG —3丨；
[0015](7)8UBstDNA 聚合酶大片；
[0016](8) SYBRGreenI 熒光染料。
[0017]所述的LAMP檢測試劑盒的使用方法，其步驟如下:
[0018](I)提取純培養(yǎng)菌株基因組DNA或所取植物組織樣總DNA ；
[0019](2)所述的反應(yīng)體系 50 μ L，包含:10 X Thermopol II 2.5 μ I ； 10mM MgCl22 μ I ；
2.5mM dNTPs3.5 μ I ;5M 甜菜堿溶液 3.0μ I ；ddH2033.Ομ I ;40 μ M 內(nèi)引物 FIP/BIP 各 I μ I ；ΙΟμΜ 外引物F3/B3各 0.5μ I ;10μΜ環(huán)狀引物L(fēng)ooPF/LooPB各 1μ I ;8U Bst DNA 聚合酶大片I μ I ;加純培養(yǎng)菌株基因組DNA或所取植物組織樣總DNA提取液2.0 μ L，組成反應(yīng)混合液；
[0020](3)PCR反應(yīng)條件為:將反應(yīng)混合液置于65°C的水浴鍋中反應(yīng)65min，隨后80°C滅活3min結(jié)束反應(yīng)；
[0021](4)結(jié)果判定:①用肉眼觀察反應(yīng)液是否為白色渾濁，白色渾濁即為陽性，否則為陰性；②將反應(yīng)產(chǎn)物PCR管放在紫外燈下照射，若有白色則說明樣品中存在桉樹焦枯病原菌，無白色則說明不含桉樹焦枯病原菌；③在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBR GreenI熒光染料觀察顏色變化，反應(yīng)液顏色由橙色變成綠色為陽性，顏色保持不變?yōu)殛幮?；④擴(kuò)增結(jié)束后取
5.0 μ LPCR產(chǎn)物上樣于含0.5μ g/mLEB的2 %瓊脂糖凝膠上電泳，電壓為9V/cm、時(shí)間為30min，在凝膠成像系統(tǒng)上檢測并拍照，觀察是否產(chǎn)生特征性梯狀電泳條帶，有條帶則說明樣品中存在桉樹焦枯病原菌，無條帶則說明不含桉樹焦枯病原菌。
[0022]本發(fā)明提供了用于桉樹焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)LAMP檢測的特異性引物組F3(前外引物)、B3(后外引物)、FIP(前內(nèi)引物)、BIP(后內(nèi)引物)、LooPF(環(huán)狀引物)、LooPB (環(huán)狀引物)及含有該引物組的LAMP試劑盒。本發(fā)明可快速準(zhǔn)確定對(duì)桉樹焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)引起的多種林木病害進(jìn)行分子鑒定病害的早期診斷，對(duì)控制桉樹焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)的檢疫及病害的防治具有重要意義。
[0023]本發(fā)明利用beta-tubulin gene保守區(qū)序列，比對(duì)后通過LAMP在線軟件4.0 (https://primerexplorer.jp/e/)進(jìn)行桉樹焦枯病原菌LAMP特異性引物組的設(shè)計(jì)。該方法可以克服傳統(tǒng)病菌鑒定所存在的可靠性較低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要較高的專業(yè)技術(shù)知識(shí)，難掌握，不能準(zhǔn)確判定等缺點(diǎn)，提高了病害檢測的準(zhǔn)確性，為其它病害的分子檢測提供技術(shù)參考，為桉樹焦枯病原菌為對(duì)象的鑒定和檢測提供重要參考價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為桉樹焦枯病原菌LAMP檢測技術(shù)實(shí)現(xiàn)圖。
[0025]圖2為LAMP紫外燈照射下檢查結(jié)果；圖中，1_4為桉樹焦枯病原菌，5-12分別為表I中所對(duì)應(yīng)參試菌，13為陰性對(duì)照。
[0026]圖3為電泳檢查結(jié)果；圖中，泳道M為DL2000Marker，泳道1_4為桉樹焦枯病原菌，泳道5-12分別為表1中所對(duì)應(yīng)參試菌，泳道CK為陰性對(duì)照。
[0027]圖4為靈敏度電泳檢查結(jié)果；圖中，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量大小，泳道CK為陰性對(duì)照，泳道1-6的桉樹焦枯病原菌Cylindrocladium scoparium基因組DNA濃度分別為400ng/μ L,40ng/μ L,4.0ng/μ L,400pg/μ L,40pg/μ L,4.0pg/μ L。
[0028]圖5為桉樹焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)的LAMP檢測流程。
[0029]圖6為紫外燈照射檢查結(jié)果；圖中，1-7分別為樂山、攀枝花、雅安、廣元、新津、重慶、資陽7個(gè)地區(qū)的桉樹焦枯病組織樣品，8為健康組織樣品，9為陰性對(duì)照。
[0030]圖7為電泳檢查結(jié)果；圖中，1-7泳道分別為樂山、攀枝花、雅安、廣元、新津、重慶、資陽7個(gè)地區(qū)的桉樹焦枯病組織樣品，8為健康組織樣品，泳道CK為陰性對(duì)照。

【具體實(shí)施方式】
[0031]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0032]實(shí)施例1
[0033]圖1為桉樹焦枯病原菌LAMP檢測技術(shù)實(shí)現(xiàn)圖。
[0034]主要試劑:DNA提取試劑盒及回收試劑盒均購自天根生化科技公司，引物合成及PCR產(chǎn)物測序交由上海生工生物工程公司完成。
[0035]1、桉樹焦枯病原菌的LAMP檢測引物組的設(shè)計(jì)
[0036](I)beta-tubulin gene區(qū)引物設(shè)計(jì):對(duì)分離自四川雅安,攀枝花,廣元、樂山桉樹栽培區(qū)的桉樹焦枯病原菌純化培養(yǎng)，其桉樹焦枯病原菌及其他參試菌株信息詳見表1。將菌株接種在PDA平板，28°C培養(yǎng)5d，使用打孔器取直徑為5mm的菌餅分別轉(zhuǎn)接至含有200mL馬鈴薯-葡萄糖液體(PDB)的錐形瓶中，置于28°C搖床振蕩(轉(zhuǎn)速140r/min)培養(yǎng)8d。用滅菌紗布過濾菌絲體后，收集菌絲，滅菌蒸餾水沖洗3次，冷凍干燥，存入滅菌EP管中于-20°C冰箱備用。
[0037] 表1桉樹焦枯病原菌及其它參試菌株
[0038]

【權(quán)利要求】
1.一種桉樹焦枯病原菌的LAMP檢測試劑盒，其特征在于，其包括:
(1)10 X Thermopol II ；
(2)10mMMgCl2；
(3)2.5mMdNTPs ； (4)5M甜菜堿溶液；
(5)ddH20 ； (6)40 μ M的內(nèi)引物FIP和BIP，10 μ M的外引物F3和B3 ; 10 μ M的環(huán)狀引物L(fēng)ooPF和 LooPB ;其中，前內(nèi)引物 FIP 的序列為 5 ' - TGCGCGCTCTTTCGCTACATACACAACGGTACCTCCGACC - 3 ;，后內(nèi)引物 BIP 的序列為 5 ' — CGCTCACCCTGCGAGAAACAGCGCGAGGAACATACTTGTT - 3 ;，前外引物 F3 的序列為 5 ' — CTCGACAGCAATGGTGTCT - 3 ;，后外引物Β3的序列為5 ' - GCTCAAGATCGACGAGGAC - 3 ;，環(huán)狀引物L(fēng)ooPF的序列為5 '—GTAGACGTTCATGCGCTCC — 3 ;，環(huán)狀引物 LooPB 的序列為 5 ; — ATTATTTGTGAGTGTGATAG —3丨； (7)8UBstDNA聚合酶大片；
(8)SYBRGreenI 熒光染料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的LAMP檢測試劑盒的使用方法，其特征是，其步驟如下: (1)提取純培養(yǎng)菌株基因組DNA或所取植物組織樣總DNA；
(2)所述的反應(yīng)體系50 μ L，包含:10 X Thermopol II 2.5 μ I ； 100mMMgCl22 μ I ；.2.5mMdNTPs3.5 μ I ;5M 甜菜堿溶液 3.0 μ I ；ddH2033.0 μ I ;40 μ M 內(nèi)引物 FIP/BIP 各 I μ I ;.1(^]?外引物？3/83各0.5 4 I ;10μΜ 環(huán)狀引物 LooPF/LooPB 各 I μ I ;8UBstDNA 聚合酶大片I μ I ;加純培養(yǎng)菌株基因組DNA或所取植物組織樣總DNA提取液2.0 μ L，組成反應(yīng)混合液； (3)PCR反應(yīng)條件為:將反應(yīng)混合液置于65°C的水浴鍋中反應(yīng)65min，隨后80°C滅活3min結(jié)束反應(yīng)； (4)結(jié)果判定:①用肉眼觀察反應(yīng)液是否為白色渾濁，白色渾濁即為陽性，否則為陰性；②將反應(yīng)產(chǎn)物PCR管放在紫外燈下照射，若有白色則說明樣品中存在桉樹焦枯病原菌，無白色則說明不含桉樹焦枯病原菌；③在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBRGreenI熒光染料觀察顏色變化，反應(yīng)液顏色由橙色變成綠色為陽性，顏色保持不變?yōu)殛幮?；④擴(kuò)增結(jié)束后取.5.0 μ LPCR產(chǎn)物上樣于含0.5μ g/mLEB的2 %瓊脂糖凝膠上電泳，電壓為9V/cm、時(shí)間為.30min，在凝膠成像系統(tǒng)上檢測并拍照，觀察是否產(chǎn)生特征性梯狀電泳條帶，有條帶則說明樣品中存在桉樹焦枯病原菌，無條帶則說明不含桉樹焦枯病原菌。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104164486SQ201410273167
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月18日
【發(fā)明者】朱天輝, 張靜, 朱涵明月, 李姝江, 譙天敏, 韓珊, 王淋敏, 張麗娜 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)